Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang nano pamam dendrimer ứng dụng trong mang thuốc chống ung thư

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG NANO PAMAM DENDRIMER ỨNG DỤNG TRONG MANG THU

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG NANO PAMAM DENDRIMER ỨNG DỤNG TRONG MANG

THUỐC CHỐNG UNG THƯ

Mã số: 112014

Chủ nhiệm đề tài: ThS.Nguyễn Thị Trâm Châu

TP HỒ CHÍ MINH, 10/2015

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG NANO PAMAM DENDRIMER ỨNG DỤNG TRONG MANG

NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

Họ và tên lĩnh vực chuyên môn Đơn vị công tác và Nội dung nghiên cứu cụ thể được giao ThS.NCS Nguyễn

Thị Trâm Châu

- Trường ĐHCN TPHCM, CSQN

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Bảng số liệu PAMAM dendrimer các thế hệ 164

Bảng 2 Trọng lượng phân tử dựa trên 1 H-NMR của PAMAM thế hệ -0.5, 2.0, 3.0 và 4.0 253

Bảng 3 Khối lượng phân tử của PEG, PAMAM G4 và G4-PEG 286

Bảng 4 Dữ liệu xây dựng phương trình đường chuẩn 308

Bảng 5 Kết quả lượng 5-Fu được mang trong G4-PEG-5-FU 319

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Cấu tạo dendrimer 2

Hình 2 Cấu trúc của PAMAM dendrimer 3

Hình 3 Cấu trúc dendrimer các thế hệ .3

Hình 4 Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer các thế hệ 153

Hình 5 Quy trình tổng hợp PAMAM G 0.5 175

Hình 6 Quy trình tổng hợp PAMAM G 2.0 186

Hình 7 Quy trình tổng hợp PAMAM G 3.0 197

Hình 8 Quy trình tổng hợp PAMAM G4.0 208

Hình 9: Sơ đồ tổng hợp NPC-PEG-NPC (a), NPC-PEG-TA (b), PAMAM G4-PEG (c) 219

Hình 10 Cơ chế mang thuốc trong cấu trúc PAMAM G4-PEG 20

Hình 11 Minh họa PAMAM G4 với một số ghi chú proton đặc trưng trong mỗi thế hệ 231

Hình 12 Phổ 1 H-NMR của PAMAM dendrimer thế hệ G-0.5, G2.0, G3.0, G4.0 242

Hình 13 Kết quả 1H NMR của NPC-PEG-NPC (a) và NPC-PEG-TA (b) 264

Hình 14 Kết quả FT-IR của PAMAM G4 (a) và G4-PEG (b) 275

Hình 15 Kết quả 1H NMR của PAMAM G4 (a) và G4-PEG (b) 286

Hình 16 Kết quả GPC của G4-PEG 297

Hình 17 Hình ảnh TEM của PAMAM G4 (a), PAMAM G4-PEG (b) 297

Hình 18: Biểu đồ đường chuẩn của 5-FU 308

Hình 19: Biểu đồ sắc ký của 5-FU không được mang trong G4-PEG 308

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI Ở TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC .2

1.1 Giới thiệu đề tài 2

1.2.Tình hình nghiên cứu biến tính PAMAM dendrimer nhằm giảm độc tính 6

1.3 Tình hình nghiên cứu tăng cường hiệu quả mang thuốc củar hệ PAMAM dendrimer biến tính với PEG Error! Bookmark not defined 2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 12

3 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU, CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Đối tượng nghiên cứu 12

3.2 Phạm vi nghiên cứu 12

3.3 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu 13

4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

4.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 142

4.2 Tổng hợp PAMAM các thế hệ từ G= -0.5 đến G= 4 153

4.3 Tổng hợp PAMAM G4-PEG 208

4.4 Ứng dụng nanocarrier PAMAM G4-PEG mang thuốc điều trị ung thư 5-FU 20

5 CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẠT ĐƯỢC 231

5.1 Kết quả phổ 1 H-NMR của PAMAM dendrimer các thế hệ 231

5.2 Kết quả phổ 1 H-NMR của NPC-PEG-NPC và NPC-PEG-TA 253

5.3 Kết quả của PAMAM G4 và PAMAM G4-PEG 264

5.4 Kết quả mang thuốc 5-FU của G4-PEG 297

KẾT LUẬN 319

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DMF Dimethylformamide

EDA Ethylenediamine

5-FU 5-Fluorouracil

GPC Gel permeation chromatography

HPLC High pressure liquid chromatography

1

H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

NPC p-Nitrophenyl chloroformate

PAMAM Polyamidoamine

PEG Polyethylene glycol

TEM Transition electron microscopy

THF Tetrahydrofuran

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang nano PAMAM dendrimer ứng dụng trong mang thuốc chống ung thư

- Mã số: 112014

- Chủ nhiệm đề tài: NCS.ThS.Nguyễn Thị Trâm Châu

Điện thoại: 0905.628 268 Email: nguyenthitramchau@yahoo.com

- Đơn vị quản lý về chuyên môn (Khoa, Tổ bộ môn):

Khoa: Công nghệ - Cơ sở Quảng Ngãi

Tổ bộ môn: Hóa – Môi trường

- Thời gian thực hiện: 9 tháng

(2) Xác định thành phần cấu trúc các PAMAM dendrimer

(3) Biến tính PAMAM G4 bằng polyethylene glycol (PEG)

(4) Xác định thành phần cấu trúc PAMAM G4-PEG

4 Kết quả chính đạt được (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, .)

5 Sản phẩm khoa học: 2 bài báo khoa học

Bài báo quốc tế:

[1] Thi Bich Tram Nguyena, Thi Tram Chau Nguyen b, Hoang Chinh Tranc, Cuu Khoa Nguyenc & Ngoc Quyen Tranc* (2015) 1 H NMR Spectroscopy as an Effective Method for Predicting Molecular Weight of Polyaminoamine Dendrimers and their Derivatives, tạp chí quốc tế (SCIE) International Journal of Polymer Analysis and

Characterization, Taylor & Francis Group, No.20, pp.57-68, 2015, DOI:

10.1080/1023666X.2014.955632

Bài báo trong nước:

[2] Nguyễn Thị Trâm Châu * , Trần Ngọc Quyển**, Nguyễn Cửu Khoa**, Trần Hữu Thái***, Bùi Văn Công***, Nguyễn Quang Thắng***, Lê Thanh Lịch***, Tôn Nữ Tố Nhi***, Trần Quang Tuệ***

(2015) Tổng hợp vật liệu nanocarrier mang thuốc 5

-Fluorouracil (5-FU) hiệu quả, Tạp chí Đại học Công Nghiệp, TP.HCM (đã được

duyệt đăng 4/2015);

Trang 1

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã không ngừng nghiên cứu để tìm ra những vật liệu mới nhằm phục vụ cho nhu cầu của cuộc sống Công nghệ nano ra đời đã đáp ứng được nhu cầu cấp thiết này Trong những năm gần đây, các nanopolymer được nghiên cứu rộng rãi về phía ứng dụng y sinh Dendrimer là một trong những nanopolymer được nghiên cứu nhiều nhất với cấu trúc hình cầu có nhiều khoảng trống bên trong được ứng dụng làm chất mang thuốc, protein và phân phối gen Hiện nay có rất nhiều quốc gia, các trường đại học, các trung tâm nghiên cứu, công ty dược phẩm đang đầu tư kinh phí nghiên cứu tổng hợp dendrimer để ứng dụng nó trong y học và đời sống

Với cấu trúc đặc biệt, cho phép dendrimer trở thành phương tiện hiệu quả để vận chuyển vật liệu y sinh Ngày càng có nhiều loại thuốc đang được phát triển phải đối mặt với các vấn đề về độ hòa tan, tác dụng sinh học và độ hấp thụ kém Nhiều báo cáo chỉ ra rằng việc đóng gói các loại thuốc điều trị ung thư vào các nanocarrier đã nâng cao đáng kể độ tan trong nước và độ ổn định việc lưu trữ thuốc, giúp tăng cường hoạt động chống khối u và giảm tác dụng phụ của thuốc PAMAM dendrimer là một trong những nanocarrier có thể làm việc như một công cụ hữu ích cho việc phân phối các loại thuốc, cũng như liệu pháp gen và hóa trị

Tuy nhiên, có một vài nhược điểm đi kèm với PAMAM dendrimer đó là gây ra độc tính tan trong máu và ly giải tế bào do tương tác mạnh mẽ của các nhóm -NH2 ở bên ngoài PAMAM dendrimer mang điện tích dương với các màng tế bào mang điện tích âm dẫn đến sự phá vỡ màng tế bào, gây độc cho tế bào, đồng nghĩa với hiệu quả điều trị chưa cao[12-13, 23, 27] Để giải quyết vấn đề này, trên bề mặt dendrimer được thay các nhóm -NH2 bằng các nhóm -OH của polyethylene glycol đã hoạt hóa, làm ngăn chặn sự tiếp xúc giữa các nhóm -NH2 với màng tế bào, giúp giảm độc tính tạo ra khả năng tương tác sinh học cao của chất mang, từ đó nâng cao hiệu quả mang thuốc

và điều trị [7, 24-25]

Trang 2

1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NG HIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA

ĐỀ TÀI Ở TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1 Giới thiệu đề tài

1.1.1 Dendrimer là gì?

Dendrimer bắt nguồn từ tiếng Hylạp “dendron”, có nghĩa là nhánh cây Phân tử được tạo ra bằng cách thêm tiếp các đơn vị nhánh tỏa ra ngoài từ điểm khởi đầu Nếu phân tử dendrimer đủ lớn thì có dạng hình cầu, kích cỡ từ 1-10 nm Gần đây nhất là Polymer Dendrimer được tìm thấy các tính chất đặc biệt như: có khối lượng phân tử cao, có tính chất của nhánh khác rất nhiều so với các polymer mạch thẳng Polymer dendrimers tổng hợp có khả năng phân nhánh cao, phân tử gần như đối xứng về cấu trúc

1.1.2 Cấu tạo dendrimer

Dendrimer được cấu tạo gồm 3 phần: phần lõi (ethylene diamine (EDA), diaminobutyl (DAB), polyamidoamine (PAMAM), polypropylimine (PPI)), các nhánh phát ra từ lõi tạo thành một vòng tròn đồng tâm, và nhóm chức ngoài cùng (amine, carboxyl, rượu) Dendrimer có nhiều dạng khác nhau, mỗi dạng có những đặc tính sinh học khác nhau, nên sự phân bố sinh học cũng khác nhau

Hình 1 Cấu tạo dendrimer

1.1.3 Polyamidoamine (PAMAM) dendrimer

PAMAM dendrimer được tạo ra từ core ethylenediamine (EDA) và phát triển nhánh bằng methylacrylate và ethylenediamine

Trang 3

Hình 2 Cấu trúc của PAMAM dendrimer

 Dendrimer các thế hệ:

Hình 3 Cấu trúc dendrimer các thế hệ

=> Là đối tượng nghiên cứu hấp dẫn chuyển tải các tác nhân hóa học trị liệu

vào tiếp xúc với khối u, điều trị đúng nơi có khối u, đồng thời kiểm soát được thời gian phóng thích thuốc, nhằm mục tiêu giảm tác dụng phụ không mong muốn và tăng cường hiệu quả điều trị

1.1.4 Những khó khăn trong hóa trị liệu điều trị ung thư

Ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới thì tốc độ tăng trưởng bệnh ung thư đang đến mức báo động toàn cầu Cho đến nay, đã có nhiều phương pháp điều trị ung thư được phát triển và đạt được những thành công nhất định, giúp bệnh nhân ung thư kéo dài thêm thời gian sống Ngày nay, có rất nhiều các loại thuốc chống ung thư đã được nghiên cứu và đưa vào điều trị cho các bệnh nhân Tuy nhiên, các loại thuốc chống

Trang 4

ung thư rất độc với cả tế bào bệnh lẫn tế bào lành Hầu hết các thuốc chống ung thư

đều có tác dụng phụ cho người bệnh, có độ hòa tan kém và khó tồn trữ

Độc tính của các thuốc trị ung thư

Tác dụng của các thuốc chữa ung thư không đặc hiệu Các thuốc chữa ung thư

có tác dụng độc, ngăn cản sự phân bào của các tế bào ung thư, nhưng đồng thời cũng gây độc với cả tế bào lành Hơn nữa, hầu hết thuốc trị ung thư có hệ số trị liệu thấp (khoảng cách giữa liều điều trị và liều gây độc tính nhỏ), chúng có thể gây ảnh hưởng cho tế bào ngay ở liều điều trị, đó là điều làm giới hạn trị liệu

Các mô tăng sinh nhanh như tủy xương, tế bào sinh sản, niêm mạc, da, nang tóc, và đặc biệt là bào thai,… là các nơi thường biểu thị độc tính của thuốc trị ung thư

Do độc tính cao nên việc sử dụng hóa trị liệu chữa ung thư là hạn chế Các biểu hiện độc thường gặp là:

 Rối loạn tiêu hóa, buồn nôn và nôn, viêm loét niêm mạc, táo bón, tiêu chảy

 Rối loạn chức năng gan, tổn thương ống thận

 Rụng tóc, ban đỏ, viêm loét da

 Với tủy xương, hầu hết các thuốc chữa ung thư đều làm suy yếu chức năng của tủy xương, hạn chế sự tạo ra hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, gây ra thiếu máu;

do đó dễ bị xuất huyết và dễ bị nhiễm khuẩn Cần kiểm tra máu thường xuyên

để điều chỉnh liều dùng hoặc ngừng thuốc

 Với hệ nội tiết, thuốc có ảnh hưởng xấu đến buồng trứng và tinh hoàn, dẫn đến

vô sinh

 Với trẻ em, thuốc làm chậm sự tăng trưởng và phát triển

 Ung thư thứ phát: do dùng thuốc lại phát sinh ra các ung thư mới, xảy ra sau nhiều tháng hoặc nhiều năm

 Gây tổn thương mạch máu và đau khi truyền thuốc đường tĩnh mạch, có thể bị ngay khi tiêm hoặc sau khi điều trị một thời gian

 Sút cân, người yếu, không còn khả năng làm việc

 Đã thấy thuốc gây quái thai trên động vật thí nghiệm Vì vậy những người đã dùng thuốc chữa ung thư thì không nên có con nữa

Những tác dụng phụ này gây sự sợ hãi và lo lắng thường xuyên, thậm chí gây rối loạn về tính cách, hành vi của bệnh nhân

Sự kháng thuốc của tế bào ung thư

Trang 5

Các tế bào ung thư có thể kháng lại các thuốc chữa ung thư cũng như các vi khuẩn kháng lại các thuốc hóa trị liệu kháng khuẩn

Cơ chế tế bào ung thư kháng thuốc gồm:

 Làm giảm sự thâm nhập của thuốc vào các tổ chức ung thư

 Làm giảm sự tích lũy của thuốc, thải trừ thuốc ra khỏi tế bào ung thư bằng các

“bơm” P - glycoprotein trên màng tế bào

 Làm giảm hoạt tính của thuốc bằng cách chuyển hóa các phân tử thuốc

 Làm biến đổi protein mục tiêu và các yếu tố cần để thuốc tác động lên tế bào ung thư

 Tăng cường sửa chữa DNA sai hỏng do tác động của thuốc

 Tăng tổng hợp protein để vẫn đảm bảo cho việc phân chia tế bào mặc dù bị thuốc tác động

Sự kháng thuốc có thể đặc hiệu cho một loại thuốc nhất định nhưng cũng như

sự kháng kháng sinh, các tế bào ung thư cũng có hiện tượng kháng thuốc chéo

 Hiệu quả điều trị thấp

Do phần lớn thuốc trị ung thư ít tan trong nước nên khả năng hấp thu thuốc vào

cơ thể qua đường uống kém Lượng thuốc đi vào tuần hoàn chung ở dạng còn hoạt tính thấp Tiêm truyền là một phương pháp tốt hơn, bảo đảm được lượng thuốc xâm nhập vào tuần hoàn chung Tuy nhiên, tiêm truyền trong thời gian dài gây đau và tổn thương mạch máu cho bệnh nhân

Khi thuốc vào được tuần hoàn chung thì chỉ một phần nhỏ lượng thuốc đến được đích tác dụng, phần còn lại phân bố vào các cơ quan khác hoặc bị chuyển hóa tại gan hay bị thải trừ ở thận dẫn đến nồng độ thuốc tại cơ quan đích rất thấp, không phát huy được tác dụng

Ví dụ: đối với 5-FU, khi tiêm tĩnh mạch, nửa đời thải trừ trung bình khỏi huyết tương khoảng 16 phút (từ 8 đến 20 phút) Không còn thấy thuốc ở dạng nguyên vẹn trong huyết tương sau khi tiêm tĩnh mạch được 3 h 7-20% thuốc thải trừ ở dạng không biến đổi qua nước tiểu sau 6 h, trong số này tới hơn 90% thải trừ ngay giờ đầu Phần còn lại chuyển hóa phân giải ở gan tạo ra các chất (carbon dioxide, urea, alpha-fluoro-beta-alanine) không có hoạt tính Các chất này cũng bài xuất qua nước tiểu sau 3-4 h Trong lượng thuốc 5-FU xâm nhập được vào các tế bào ung thư thì cũng chỉ có khoảng 20% đi theo con đường đồng hóa và phát huy tác dụng Khoảng

Do đó, để tăng tốc độ sinh hóa và giảm sự đề kháng thuốc thì khoảng cách giữa các liều dùng thuốc bắt buộc phải rút ngắn Điều này càng gây ra sự bất tiện cho bệnh nhân trong quá trình điều trị ung thư và tăng chi phí điều trị

1.1.5 Tìm hiểu về kích thước mô tế bào và hệ chất mang

- Tại hầu hết các mô khỏe mạnh, kích thước các khe hở lớp nội mô thành mạch máu thường nhỏ hơn 2 nanomet (nm - là đơn vị đo bằng 1 phần tỉ mét) Các khe hở này quá nhỏ so với kích thước của hầu hết các chất mang nano

- Còn tại mô ung thư, có sự phát triển của tế bào ung thư đòi hỏi sự tăng sinh mạch máu, các vi mạch máu mới được hình thành tại các mô ung thư và có kích thước lên đến vài trăm nanomet

- Do đó, với kích thước dendrimer nhỏ hơn 10nm, khi biến tính với một số polymer tương hợp sinh học sẽ nhỏ hơn 50nm, nên khả năng khuếch tán của chất mang thuốc đến vùng mô tập trung các tế bào ung thư nhanh và khá dễ dàng

- Mặt khác, với kích thước nói trên, chất mang thuốc này còn tải được hầu hết các loại thuốc đang điều trị nhiều loại ung thư hiện nay

1.2 Tình hình nghiên cứu biến tính PAMAM dendrimer nhằm giảm độc tính

Dendrimer được Donald A Tomalia và cộng sự tổng hợp lần đầu tiên vào những năm 1980 Nó là những polymer đa nhánh, từ tâm (lõi) ở giữa người ta phát triển các nhánh dần ra bên ngoài PAMAM được tổng hợp từ ethylenediamine, methylacrylate Sau 5 năm, năm 1985 khái niệm dendrimer được Donald A Tomalia và cộng sự đưa ra đầu tiên [33]

Năm 1985, George R Newkon, chuyên gia hoá học và trung tâm ở trường Đại Học South Floride đã xuất bản bài báo về dendrimer, ông tổng hợp dendrimer từ polyamidoalcol [22]

Trong những năm tám mươi người ta đã tổng hợp dendrimer và xác định được tính