NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/CAS9 TRONG TẠO ĐỘT BIẾN GEN GmGOLS03, GmGOLS19 TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) NHẰM GIẢM LƯỢNG ĐƯỜNG HỌ RAFFINOSE TRONG HẠT

Đặc biệt, các nghiên cứu gần đây trên cây đậu tương cho thấy CRISPR/Cas9 đã được áp thành công để tạo các dòng đậu tương đột biến định hướng và không mang gen chuyển.. Ý nghĩa khoa học v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

LÊ THỊ NHƯ THẢO

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/CAS9

TRONG TẠO ĐỘT BIẾN GEN GmGOLS03, GmGOLS19 TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) NHẰM

GIẢM LƯỢNG ĐƯỜNG HỌ RAFFINOSE TRONG HẠT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã sỗ: 9 42 02 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2022

Công trình được hoàn thành tại:

- Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Viện Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn khoa học 1: TS Đỗ Tiến Phát

Viện Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Phạm Bích Ngọc

Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 1: GS Chu Hoàng Mậu

Phản biện 2: TS Điêu Thị Mai Hoa

Phản biện 3: TS Lê Quỳnh Mai

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ’, ngày … tháng … năm 2022

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill), thuộc họ đậu (Fabaceae) là loại cây công nghiệp có

giàu dinh dưỡng và có giá trị kinh tế cao, được sử dụng làm thực phẩm cho người, thức ăn trong chăn nuôi, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp và xuất khẩu Cây đậu tương có tính năng cải tạo đất trồng rất tốt Hạt đậu tương là bộ phận có giá trị dinh dưỡng cao Thành phần của hạt bao gồm glucid (12,5-25%), lidpid (12,5-25%) được xem là nguồn dầu thực vật chủ lực trên toàn cầu, protein (35-50%) có giá trị dinh dưỡng tương đương với protein có nguồn gốc từ động vật và chiếm khoảng 69% lượng protein trên toàn cầu phục vụ cho ngành chăn nuôi gia súc, gia cầm Ngoài ra, thành phần hạt còn chứa các vitamin nhóm (B, D, E…), một số các axit amin thiết yếu và các thành phần muối khoáng Tuy nhiên, ngoài những thành phần dinh dưỡng giúp ích cho sức khỏe con người, trong hạt đậu tương lại có sự hiện diện của nhóm đường họ raffinose (Raffinose family oligosaccharide - RFOs) đây là nhóm đường khó tiêu chiếm 50% tổng lượng cacbon hòa tan trong hạt Nhóm đường RFOs chứa liên kết α-galactosidic (1-6) chỉ có thể phân giải bởi enzyme galactosidase, tuy nhiên trong hệ tiêu hóa của người và nhóm động vật không nhai lại không chứa enzyme này Thế nên, khi RFOs vào hệ tiêu hóa của người và nhóm động vật không nhai lại thì không được tiêu hóa ở dạ dày, đến ruột non nhóm đường này không được huyển hóa, không được hấp thu Khi RFOs vận chuyển đến đại tràng được nhóm vi sinh vật ở đây lên men tạo ra carbon dioxide, hydro và mêtan gây ra hiện tượng đầy hơi, khó chịu, ngăn cản quá trình tiêu hóa Chính nguyên nhân này đã làm giảm đi giá trị dinh dưỡng trong hạt đậu tương

Những năm qua, các nhà khoa học đã áp dụng nhiều biện pháp nghiên cứu chọn tạo giống theo hướng truyền thống như lại tạo, đột biến, chuyển gen hay công nghệ RNAi nhằm giảm thiểu thành phần RFOs nâng cao giá trị dinh dưỡng của hạt đậu tương Tuy nhiên các phương pháp này chưa thật sự mang lại hiệu quả Gần đây, sự phát triển của công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9

mở ra cơ hội trong việc nghiên cứu chức năng gen ở mức độ DNA và được ứng dụng rộng rãi trong cải tạo giống cây trồng, đặc biệt trong đó có cây đậu tương CRISPR/Cas9 với những ưu điểm như

dễ dàng thiết kế cấu trúc chuyển gen, có thể tác động tới nhiều gen cùng một lúc với hiệu quả cao

và đặc biệt là tạo được các dòng cây đột biến không mang gen chuyển, công nghệ này đang được phát triển và ứng dụng rộng rãi trên nhiều loại thực vật Đặc biệt, các nghiên cứu gần đây trên cây đậu tương cho thấy CRISPR/Cas9 đã được áp thành công để tạo các dòng đậu tương đột biến định hướng và không mang gen chuyển

Galactinol synthase (GOLS) là enzyme quan trọng xúc tác phản ứng chuyển hóa inositiol thành galactinol Đây là phản ứng đầu tiên trong con đường sinh tổng hợp đường khó tiêu

L-myo-họ raffinose Trên đậu tương, các nghiên cứu đã xác định được 6 gen mã hóa cho enzyme GOLS,

trong đó gen Glyma.03G222000 (GmGOLS03) và Glyma.19G219100 (GmGOLS19) có biểu hiện

mạnh nhất trong quá trình hạt phát triển Việc giảm hàm lượng Galactinol thông qua đột biến định

hướng trên từng gen riêng biệt hoặc đồng thời cả hai gen (GmGOLS03, GmGOLS19) được kỳ vọng

sẽ tăng hàm lượng sucrose, đồng thời giảm hàm lượng đường khó tiêu RFOs có trong hạt đậu tương Các nghiên cứu trước đây về việc điều khiển biểu hiện gen mã hóa các enzyme xúc tác trong quá sinh tổng hợp nhóm đường RFOs nhằm giảm hàm lượng nhóm đường này trong hạt đậu tương

đã thu được những kết quả khả quan Trong đó, nghiên cứu giảm biểu hiện của các gen mã hóa cho enzyme raffinose synthase và stachyose synthase đã được thực hiện thành công trên đậu tương, ghi nhận việc giảm đáng kể hàm lượng raffinose và stachyose trong hạt Điều này là minh chứng khoa học cho việc điều khiển hoạt động của các enzyme tham gia quá trình sinh tổng hợp đường khó tiêu họ raffinose trong nâng cao chất lượng hạt đậu tương

Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tiễn về tạo giống đậu tương có hàm lượng

đường RFOs thấp, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ

CRISPR/Cas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ Raffinose trong hạt”

2 Mục tiêu của đề tài

Phát triển và ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để tạo đột biến định hướng trên gen mã hóa GOLS nhằm nâng cao chất lượng hạt đậu tương

- Phân tích đặc điểm, tính di truyền và ảnh hưởng của các đột biến định hướng trên hai gen

mã hóa enzyme GOLS đến hình thái, sinh trưởng phát triển và thành phần hạt của các dòng đột biến tiềm năng

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học khẳng định vai trò của các gen GmGOLS tới thành phần

đường trong hạt đậu tương, đồng thời cho thấy tiềm năng và hiệu quả gây tạo đột biến định hướng trên cây đậu tương thông qua hệ thống chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9

 Ý nghĩa thực tiễn

Các dòng đậu tương đột biến không mang gen chuyển là vật liệu cho công tác chọn dòng, lai tạo và phát triển các giống đậu tương Việt Nam có năng suất và chất lượng tốt

4 Những đóng góp mới của luận án

- Đã thiết kế thành công cấu trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến định hướng trên các gen mã hóa enzyme GOLS và kiểm tra hoạt động thông qua hệ thống cảm ứng rễ

tơ in vitro trên giống đậu tương ĐT22 và ĐT26

- Tạo thành công các dòng đậu tương mang đột biến định hướng trên các gen mã hóa cho enzyme GOLS và xác định được các dòng đậu tương (mang đột biến tiềm năng có hàm lượng đường khó tiêu trong hạt giảm

- Khẳng định vai trò của hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19 tới con đường sinh tổng hợp

đường khó tiêu họ raffinose trên cây đậu tương

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình sản xuất và chọn tạo giống đậu tương

1.2 Sinh tổng hợp đường khó tiêu raffinose (raffinose family oligosaccharide) trong cây đậu tương

1.3 Chỉnh sửa hệ gen thông qua hệ thống CRISRP/Cas9

1.4 Hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ và ứng dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen và chỉnh sửa

hệ gen trên đậu tương

1.5 Những nghiên cứu trong và ngoài nước có liên quan trực tiếp đến luận án

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Bốn giống đậu tương: Hai giống đậu tương ưu tú của Việt Nam ĐT22, ĐT26được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ - Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm Việt Nam

và hai giống đậu tương nước ngoài Maverick (Mr), William82 (WL 82) được cung cấp từ đại học Missouri-Colombia, MO, Hoa Kỳ

Giống đậu tương ĐT26 là giống định hướng cải biến di truyền tạo cây đột biến và ứng dụng phát triển

Giống Maverick (Mr) là vật liệu bổ sung dùng để kiểm tra qui trình chuyển gen đậu tương và giống William82 (WL 82) dùng làm cơ sở so sánh trình tự gen đích của giống đậu tương thí nghiệm

Khuẩn A rhizogenes K599 mang một trong hai cấu trúc chuyển gen pFGC/gfp, pZY102/gus và khuẩn A tumefaciens AGL1 mang hệ thống vector chuyển gen CRISPR/Cas9

- Vector HBT-pcoCas9 được cung cấp từ phòng thí nghiệm Jen Sheen (RRID:

Addgene_52254), vector pBlu/gRNA được cung cấp từ phòng thí nghiệm của Robert Stupar (RRID: Addgene_59188), và vector pFGC5941 (RRID: Addgene_84084)

- Các mồi đặc hiệu và DNA oligonucleotide được đặt tổng hợp nhân tạo bởi công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu gồm 6 nội dung:

Nội dung 1: Thiết kế hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến gen GmGOLS trên đậu tương

Nội dung 2: Phát triển hệ thống cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A Rhizogenes trên một

số giống đậu tương Việt Nam, kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9

Nội dung 3: Tạo cây đậu tương mang đột biến gen mã hóa Galactinol synthase thông qua hệ

thống CRISPR/Cas9

Nội dung 4: Phân tích sự di truyền của các đột biến định hướng và gen chuyển

Nội dung 5: Phân tích sinh trưởng phát triển và thành phần hạt của các dòng đậu tương

mang đột biến định hướng

Nội dung 6: Kiểm tra đột biến ngoài định hướng và lựa chọn dòng đột biến tiềm năng không

mang gen chuyển

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện được các nội dung nghiên cứu trên Chúng tôi dùng các phương pháp sau:

- Thiết kế vector CRISPR/Cas9

- Phương pháp chuyển gen thông qua rễ tơ

- Phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương qua nốt lá mầm

- Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB

- PCR

- Điện di sản phẩm trên Agarose, PAGE

- Giải trình tự gen theo phương pháp Sanger

- HPLC

- Phương pháp thống kê phần mềm SPSS 16

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Thiết kế hệ thống chỉnh sửa CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến các gen GmGOLS

trên đậu tương

Lựa chọn trình tự gen mã hóa Galactinol synthase (GmGOLS) và thiết kế cấu trúc chỉnh sửa

hệ gen CRISPR/Cas9 Thông qua công cụ tìm kiếm BLAST, chúng tôi đã phân tích, kiểm tra mối

quan hệ phát sinh loài giữa các GmGOLS đậu tương và các loài thực vật khác Dựa trên trình tự protein Arabidopsis GOLS, 6 gen GmGOLS giả định đã được xác định từ cơ sở dữ liệu hệ gen của

đậu tương SoyBase.org (Hình A)

Đồng thời, tham khảo cơ sở dữ liệu về mức độ phiên mã của các gen GmGOLS khác nhau

trong các mô khác nhau và ở các giai đoạn phát triển khác nhau của hạt ở Hình B, chúng tôi nhận

thấy có sáu gen GmGOLS (Glyma.03G222000, Glyma.19G219100, Glyma.03G229800,

Glyma.20G094500, Glyma.10G145300, Glyma.19G227800) được nhóm lại cùng nhau tạo thành

ba cặp tương đồng là AtGOLS1, AtGOLS2 và AtGOLS3 Trong đó, biểu hiện của

Glyma.03G222000 (GmGOLS03) và Glyma.19G219100 (GmGOLS19) tăng mạnh khi hạt chín và

cho thấy mức độ biểu hiện ở hạt cao nhất trong số tất cả các gen GmGOLS Các dữ liệu này chỉ ra rằng gen GmGOLS03 có khả năng là gen mã hóa chính cho enzyme galactinol synthase tham gia

vào quá trình sinh tổng hợp RFOs trong quá trình phát triển hạt đậu tương Do đó, nghiên cứu của

luận án đã gây đột biến gen GmGOLS03 và gen tương đồng GmGOLS19 bằng hệ thống CRISPR/Cas9 để kiểm tra chức năng của GmGOLS trong quá trình sinh tổng hợp RFOs trong hạt

đậu tương

Căn cứ vào dữ liệu của thí nghiệm trước, chúng tôi đã chọn một giống đậu tương ưu tú của

Việt Nam (ĐT26) và giống Mr làm vật liệu để gây đột biến có mục tiêu Sử dụng trình tự bộ gen

giống đối chứng Williams 82 và kết quả giải trình tự sơ bộ cho thấy các trình tự các gen GmGOLS03

và GmGOLS19 trong giống Mr và ĐT26 tương đồng 100% với các trình tự tương ứng trong bộ gen

giống đối chứng William 82 [127] Dựa trên các trình tự đã khai thác được trên hai giống vật liệu,

hai trình tự RNA định hướng (sgRNAs) đã được chọn từ các vị trí đích tiềm năng trên GmGOLS03

và GmGOLS19 Hai trình tự đích này giống nhau và nằm trong exon 2 của cả hai gen GmGOLS (Hình Cấu trúc gen GmGOLS và vị trí của các trình tự gRNA)

Hình Cấu trúc gen GmGOLS và vị trí của các trình tự gRNA

Sau khi xác định được các sgRNA, trình tự mã hóa các sgRNA này được tổng hợp nhân tạo

và ghép nối vào vector chuyển gen đã chứa trình tự mã hóa protein Cas9 để tạo thành cấu trúc chuyển gen hoàn chỉnh như sơ đồ minh họa bên dưới

Hình Sơ đồ minh họa cấu trúc vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 được thế kế để chuyển gen

vào đậu tương Sau khi thu được cấu trúc chuyển gen hoàn chỉnh, chúng tôi tiến hành xây dựng hệ thống cảm

ứng rễ tơ để kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển và chỉnh sửa gen

3.2 Kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 thông qua hệ thống cảm ứng rễ tơ

 Phát triển hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trong điều kiện in vitro trên một số giống đậu

tương

Quá trình xây dựng hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trong điều kiện in vitro được tiến hành cho

hai giống đậu tương có nguồn gốc ngoài nước là Williams 82 (WL82), Marverick (Mr) và hai giống

đậu tương được trồng phổ biến tại Việt Nam là giống ĐT22, ĐT26 Chủng vi khuẩn A rhizogenes K599 mang một trong hai cấu trúc chuyển gen (pZY102/gus, pFGC/gfp) được sử dụng trong các

thí nghiệm chuyển gen vào rễ tơ đậu tương Kết quả ghi nhận về chỉ tiêu tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ sau 5

ngày nuôi cấy trên môi trường cảm ứng tạo rễ cho thấy, cả bốn giống đậu tương thí nghiệm được

biến nạp khuẩn K599- pFGC/gfp có tỉ lệ mẫu phát sinh rễ tơ đạt mức cao

Quan sát mẫu đặt trên môi trường cảm ứng tạo rễ, tại vị trí tạo tổn thương nhận thấy, mô sẹo cảm ứng sinh rễ xuất hiện ngay ở ngày thứ nhất Sau 5 ngày cảm ứng tạo rễ, tỉ lệ tạo rễ tơ từ cấu

trúc mang gen gfp trên giống ĐT22 đạt 100% và WL82 đạt 98,33% Trong khi đó, tỉ lệ này của giống Mr là 95% và ĐT26 chỉ đạt 93,33% Với cấu trúc mang gen chỉ thị gus, tỉ lệ tạo rễ tơ cao

nhất của hai giống ĐT22 và WL82 khi biến nạp chỉ đạt mức 95% Tỉ lệ này giảm xuống 88,33% với giống ĐT26 và 61,67% ở giống Mr Kết quả này cho thấy giống đậu tương cũng như cấu trúc

chuyển gen có ảnh hưởng trực tiếp tới tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ in vitro trong biến nạp sử dụng vi khuẩn

A rhizogenes

Tổng hợp kết quả trên cho thấy hai giống đậu tương ĐT22 và ĐT26 tỉ lệ ra rễ cũng như số

rễ tơ trung bình được tạo ra từ quá trình cảm ứng chuyển ở cả hai cấu trúc pZY102/gus và pFGC/gfp đạt tỉ lệ cao nhất Hiệu quả cảm ứng tạo rễ tơ in vitro thấp nhất là giống WL82

Từ kết quả nghiên cứu của thí nghiệm này, chúng tôi thiết lập và đưa ra quy trình cảm ứng

tạo rễ tơ in vitro cho các giống đậu tương nghiên cứu như Hình

 Kiểm tra hiệu quả chuyển gen của hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ

Rễ tơ của bốn giống đậu tương được biến nạp gen với cấu trúc pZY102/gus và pFGC/gfp

được cắt thành từng đoạn có chiều dài từ 1,5-2 cm và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc chứa hoạt chất chọn lọc glufosinate (1-3 mg/l) để đánh giá sự có mặt và hoạt động của gen chuyển, do các

cấu trúc chuyển gen đều có chứa gen bar kháng thuốc trừ cỏ Tiến hành soi gfp và điện di kiểm tra

sựu có mặt của gen chuyển, kết quả thể hiện tại các hình bên dưới

Trong nghiên cứu này, lá mầm đậu tương 3 ngày tuổi được dùng làm nguyên liệu biến nạp gen, toàn bộ phần cuống lá mầm được loại bỏ trước khi tạo tổn thương và nhiễm khuẩn Hiệu quả cảm ứng tạo rễ tơ và tỉ lệ chuyển gen có biến động giữa các giống đậu tương nghiên cứu Tỉ lệ chuyển

gen cao nhất mà chúng tôi thu được là 79,8% với giống ĐT26 khi sử dụng cấu trúc mang gen gfp

Tỉ lệ cảm ứng tạo rễ tơ cũng đạt trên 90% với giống đậu tương này

Như vậy, cũng giống như nghiên cứu phát triển rễ tơ trong điều kiện in vivo, chúng tôi nhận

thấy, yếu tố giống có ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu quả cảm ứng tạo rễ tơ và chuyển gen Bên cạnh

đó, tuổi lá mầm cũng như cách thức chuẩn bị mẫu lá mầm khi lây nhiễm khuẩn cũng đóng vai trò quan trọng tới hiệu quả chuyển gen thông qua rễ tơ trên đậu tương

 Kiểm tra hoạt động chỉnh sửa gen của CRISPR/Cas9 trên các dòng rễ tơ

Với nghiên cứu này, các dòng rễ tơ thu được mang gen chuyển thông qua việc khuếch đại gen

bằng các cặp mồi đặc hiệu của gen bar và gen Cas9 Kết quả điện di cho thấy, toàn bộ sản phẩm

PCR của mẫu rễ tơ nghiên cứu xuất hiện các băng vạch DNA khác biệt so với rễ tơ không chuyển gen ở cả hai gen quan tâm Các đột biến xảy ra ở các dòng rễ tơ đậu tương chuyển gen bằng vi

khuẩn A rhizogenes K599 mang cấu trúc vector pFGC5941-G03-19 được ghi nhận thông qua sự

xuất hiện các băng sai lệch kích thước trên gel polyacrylamide 15% so với mẫu đối chứng không mang gen chuyển (WT) Để kiểm tra đặc điểm của các đột biến, hai dòng rễ tơ số 3 và 4 được lựa chọn ngẫu nhiên để tiến hành giải trình tự vùng gen quan tâm Kết quả cho thấy các đột biến mất đoạn khác nhau dao động từ -3 bp đến -25 bp đã xảy ra trên vùng định hướng tạo đột biến của hai gen quan tâm Như vậy, hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 được thiết kế đã hoạt động tốt với

hệ thống cảm ứng rễ tơ trên giống đậu tương Việt Nam ĐT26

Trong điều kiện phòng thí nghiệm của phòng Công nghệ tế bào thực vật, hiệu quả chuyển gen thông qua rễ tơ của hai giống đậu tương trong nước thể hiện ưu việt hơn so với hai giống đậu tương nước ngoài Biểu hiện của gen chuyển cũng như hoạt động của hệ thống chỉnh sửa gen

CRISPR/Cas9 đã được kiểm chứng hiệu quả với phương pháp nuôi cấy rễ tơ in vitro Kết quả này

là cơ sở để chúng tôi tiến hành chuyển các cấu trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 vào cây đậu

tương nhằm tạo các dòng đậu tương mang đột biến định hướng trên gen GmGOLS

Hình Kiểm tra hoạt động chỉnh sửa gen của CRISPR/Cas9 trên các dòng rễ tơ

3.3 Tạo cây đậu tương đột biến gen mã hóa Galactinol synthase

 Tạo cây đậu tương mang cấu trúc chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9

Giống đậu tương ĐT26 được đánh giá là giống ưu tú của Việt Nam, được trồng phổ biến,

có khả năng kháng bệnh gỉ sắt, đốm nâu và khả năng chịu ruồi đục thân, chống đổ khá, năng suất cao để tạo cây đậu tương đột biến nhằm tăng chất lượng hạt ứng dụng trong công tác phát triển giống mới Giống đậu tương Mr được sử dụng như giống cây mô hình cho quy trình chuyển gen

Chủng vi khuẩn A tumefaciens AGL1 mang vector pFGC5941/G03-19 đã được sử dụng để chuyển

gen vào đậu tương thông qua nốt lá mầm hạt trưởng thành của hai giống đậu tương ĐT26 và Mr theo phương pháp đã được tối ưu của Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện CNSH

Hình Minh họa quá trình chuyển gen vào đậu tương thông qua nốt lá mầm

(A Mảnh lá mầm đồng nuôi cấy 5 ngày, B Mảnh lá mầm sau 14 ngày chọn lọc, C Mảnh lá

mầm sau 28 ngày chọn lọc, D Chồi kéo dài trên môi trường chọn lọc, E Lá cây DT 1.1 (+) với ppt

200 mg/l, F Lá cây ĐT26 (-) với ppt 200 mg/l, G Cây chuyển gen 25 ngày tuổi)