BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc Neoscytali[.]
Trang 1BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG
Tên đề tài: Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây
ra bệnh đốm nâu trên cây thanh long của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7
Mã số đề tài: 19.2TP06SV
Chủ nhiệm đề tài: Hồ Nguyễn Hoàng Yến
Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm
Tp Hồ Chí Minh, 2021
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu này, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình và những lời động viên sâu sắc của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè trong suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, Ban lãnh đạo Viện, Ban quản lý phòng thí nghiệm và quý Thầy
Cô của Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác Quốc tế đã hỗ trợ về kinh phí, cơ sở vật chất và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài nghiên cứu
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Ngọc Ẩn đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn giúp em kịp thời giải quyết vấn đề, động viên em những lúc khó khăn và luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài nghiên cứu này
Em xin chân thành cảm ơn TS Phạm Tấn Việt và TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh đã luôn quan tâm, chỉ bảo và luôn sẵn lòng hỗ trợ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài
Em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể sinh viên làm việc tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ
Vi sinh thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã giúp đỡ, san sẻ và tạo động lực
để em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này
Cảm ơn gia đình đã luôn chia sẻ, hỗ trợ và là nguồn động viên to lớn đối với con trong suốt thời gian qua
Tuy đã cố gắng rất nhiều nhưng vì vốn kiến thức, kinh nghiệm của bản thân còn hạn chế, do đó trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài, em không tránh khỏi những thiếu sót nên rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý Thầy Cô để em có thể hoàn thiện hơn
Cuối cùng, em xin kính chúc quý Thầy Cô luôn dồi dào sức khỏe và gặt hái được nhiều thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống Em xin chân thành cảm ơn!
Trang 3PHẦN I: THÔNG TIN CHUNG
1.1 Tên đề tài: Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra
bệnh đốm nâu trên cây thanh long của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7
1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài:
1 Hồ Nguyễn Hoàng Yến Trường ĐHCN Nghiên cứu đề tài
2 TS Nguyễn Ngọc Ẩn Trường ĐHCN Cố vấn khoa học
1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm
1.5 Thời gian thực hiện:
1.5.1 Theo hợp đồng: Từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020
1.5.2 Gia hạn: 12 tháng
1.5.3 Thực hiện thực tế: Từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 3 năm 2021
1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Không có
1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 05 triệu đồng (số tiền bằng chữ: Năm
triệu đồng)
2.1 Đặt vấn đề
Thanh long là một loại cây ăn quả nhiệt đới và cận nhiệt đới quan trọng Thanh long
thuộc họ Xương rồng (Cactaceae), xuất hiện ở các vùng nhiệt đới bản địa của châu Mỹ
Latinh, bao gồm Mexico, Trung và Nam Mỹ Hiện nay, nó cũng được trồng rộng khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước châu Á, như Malaysia, Việt Nam, Thái Lan, Philippines và Trung Quốc [1, 2]
Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất Châu Á, xuất khẩu thanh long hàng đầu thế giới Diện tích trồng thanh long ở Việt Nam tăng nhanh từ 5.512
Trang 4ha năm 2000 lên đến 35.665 ha năm 2014 với tổng sản lượng đạt khoảng 614.346 tấn [3] Theo số liệu ước tính sơ bộ năm 2015, diện tích trồng mới thanh long gần 5.000 ha, sản lượng đạt khoảng 686.195 tấn [3] Theo thống kê, sản lượng thanh long ở Việt Nam đạt khoảng 1,2 triệu tấn vào năm 2019 và dự kiến sẽ đạt 1,7 triệu tấn vào năm 2025, dự báo tốc độ tăng trưởng đạt 6,0% [4] Do đó, việc xuất khẩu thanh long mang lại nguồn thu nhập lớn cho nông dân nước ta
Tuy nhiên, việc sản xuất thanh long ở Việt Nam đang gặp nhiều khó khăn do tác động của biến đổi khí hậu và dịch bệnh như bệnh đốm nâu, bệnh nám cành, bệnh thối nhũn, bệnh thán thư, bệnh nấm bồ hóng,… [5] Do khí hậu nhiệt đới ẩm là môi trường phù hợp cho nhiều loại mốc phát triển Bên cạnh đó là việc mở rộng diện tích, thâm canh cao đã tạo điều kiện cho nhiều loại sâu bệnh gây hại phát triển Từ năm 2008 đến nay, trên thanh long xuất hiện các loại bệnh mới như bệnh đốm trắng, đốm vàng, đốm nâu, bệnh loét gây hư hại trên
thân cây và quả thanh long Trong đó, bệnh đốm nâu do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra hậu quả nghiêm trọng nhất [6, 7]
Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Dothideomycetes, bộ Botrysphaeriales, họ Botrysphaeriaceae, chi Neoscytalidium [8] Nó được xác định là tác
nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng giống bệnh nấm da ở người [9], xâm nhập và làm viêm phổi dẫn đến cái chết ở cá heo [10], bên cạnh đó, chủng nấm mốc này còn gây bệnh trên nhiều đối tượng thực vật như: cà chua, cây có múi, thanh long,… [11-13]
Hiện nay, xu hướng phát triển của thế giới là hướng tới một nền nông nghiệp sạch và bền vững Tuy nhiên, nấm bệnh gây ra những hậu quả nghiêm trọng, đặc biệt là ở các vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới, bệnh đốm nâu do nấm mốc N dimidiatum gây ra làm ảnh hưởng
nặng nề tới năng suất cũng như chất lượng quả thanh long [12] Việc này gây khó khăn trong việc tiêu thụ nội địa và xuất khẩu, cũng như ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của người nông dân và ngành trồng trọt thanh long
Thuốc diệt nấm hóa học được sử dụng tràn lan trong nông nghiệp có ảnh hưởng xấu đối với sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm tăng khả năng kháng thuốc của nấm bệnh Vấn đề cấp bách hiện nay là tìm ra nguyên nhân gây bệnh, từ đó đưa ra các
Trang 5biện pháp phòng trừ hiệu quả Do đó, việc sử dụng các biện pháp sinh học như các hợp chất đối kháng từ vi sinh vật là một phương pháp thay thế hiệu quả và thân thiện với môi trường
Bacillus licheniformis là vi khuẩn Gram dương, hình que, ưa nhiệt Trong điều kiện môi
trường khắc nghiệt, nó có khả năng hình thành nội bào tử Những bào tử này có khả năng
chịu nhiệt, lạnh, bức xạ và các áp lực khác của môi trường Bacillus licheniformis có khả
năng sản sinh ra nhiều loại enzyme có hoạt tính mạnh như amylase, protease, cellulase, chitinase…, đồng thời, nó cũng có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, bao gồm cả vi khuẩn Gram âm lẫn Gram dương và nấm gây bệnh [14]
Xuất phát từ thực trạng trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát khả
năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra bệnh đốm nâu trên cây thanh long của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7” với mục đích hướng tới việc sản xuất chế
phẩm sinh học hỗ trợ cho sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp nói chung và ngành trồng thanh long nói riêng ở nước ta
Trang 6Kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh long do N dimidiatum gây ra của chủng B licheniformis D7
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Nội dung 1: Khảo sát sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc
Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7
Kiểm tra hoạt tính kháng mốc bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch của dịch nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường PGA [15]
Nội dung 2: Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên khả năng nảy mầm của bào tử Neoscytalidium dimidiatum
Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn và dịch bào tử nấm mốc theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1,
ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát sự nảy mầm của bào tử dưới kính hiển theo các mốc thời gian 4, 8, 12, 24 giờ [16]
Kiểm tra sự sinh trưởng của bào tử nấm mốc bằng phương pháp cấy trải trên môi trường PGA
Đối chứng được thực hiện tương tự với dịch bào tử nấm mốc nhưng thay thế dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường LB
Nội dung 3: Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ sợi tơ Neoscytalidium dimidiatum
Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn và dịch bào tử nấm mốc (được nuôi ủ trong môi trường PGB sau 4 giờ) theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1, ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát dưới kính hiển theo các mốc thời gian 4, 8, 12, 24 giờ [16]
Đối chứng được thực hiện tương tự với dịch bào tử nấm mốc nhưng thay thế dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường LB
Nội dung 4: Kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh long do
N dimidiatum gây ra của B licheniformis D7
Trang 7Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn và dịch bào tử nấm mốc theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1
và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ
Tiến hành tiêm 200 μL dịch gây bệnh/vết lên thân cây và quả thanh long Theo dõi thời gian xuất hiện bệnh và mức độ gây bệnh [17]
Với đối chứng (+) là dịch chứa bào tử nấm mốc; đối chứng (-) là môi trường chưa nuôi cấy vi khuẩn và dịch nuôi cấy vi khuẩn; ba tỉ lệ phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử nấm mốc (0,5:1, 1:1 và 2:1)
2.4 Tổng kết về kết quả nghiên cứu
2.4.1 Khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của Neoscytalidium
dimidiatum bởi dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7
Để chứng minh dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 có khả năng đối kháng với nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum, chúng tôi đã tiến hành khảo sát sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của N dimidiatum bởi dịch nuôi cấy B licheniformis D7 Kết quả
được thể hiện như sau (Hình 1):
Hình 1 Khả năng đối kháng Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy chủng
Bacillus licheniformis D7
Trang 8Kết quả cho thấy dịch nuôi cấy B licheniformis D7 có khả năng ức chế sự sinh trưởng
và phát triển của nấm mốc N dimidiatum và cho đường kính vòng kháng là 28.2 ± 0.9
mm
2.4.2 Tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên sự nảy mầm
của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum
Sau khi đã chứng minh được dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 có khả năng đối kháng với nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum, chúng tôi đã tiến hành khảo sát đặc điểm
kháng mốc của dịch nuôi cấy vi khuẩn Đầu tiên, chúng tôi khảo sát tác động của dịch nuôi
cấy B licheniformis D7 lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc N dimidiatum Kết quả được
thể hiện như sau (Bảng 1 và Hình 2):
Nhìn chung, ở đối chứng sau 24 giờ, bào tử nấm mốc nảy mầm tốt, kéo dài, phát triển thành hệ sợi tơ và hình thành vách ngăn Ở các tỉ lệ phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn và dịch bào tử nấm mốc, bào tử nấm mốc bị ức chế nảy mầm và bị biến dạng nặng sau 24 giờ
ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn
Bảng 1 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 đối với sự nảy
mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ở các tỷ lệ và thời gian khác nhau
Tơ nấm phát triển
và kéo dài
Tơ kéo dài, một số hình thành vách ngăn
0,5:1 Bào tử bị ức chế Một số ít bào
tử bắt đầu nảy mầm
Mầm kéo dài và hình thành tơ
Tơ kéo dài, nhưng
bị biến dạng, không hình thành vách ngăn
Trang 9Mầm phát triển chậm
Bào tử và mầm bị
ức chế và biến dạng
2:1 Bào tử bị ức chế
nảy mầm và bị
biến dạng
Bào tử bị biến dạng, một số ít bắt đầu nảy mầm
Bào tử bị biến dạng, mầm không kéo dài
Bào tử bị biến dạng nặng
4 giờ
8 giờ
12 giờ
Trang 1024 giờ
Hình 2 Tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên hình thái và khả năng
nảy mầm của bào tử Neoscytalidium dimidiatum
Để làm rõ thêm sự tác động của dịch nuôi cấy chủng B licheniformis D7 lên khả năng nảy mầm của bào tử mốc N dimidiatum, chúng tôi đã cấy trải các hỗn hợp dịch nuôi cấy
vi khuẩn phối trộn với dịch bào tử nấm mốc lên đĩa môi trường PGA Kết quả thu được như sau (Hình 3):
Nhìn chung, ở tỉ lệ phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử nấm mốc 0,5:1, bào tử nấm mốc không có khả năng sinh trưởng trên đĩa môi trường sau 8 giờ ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn Đối với tỉ lệ phối trộn 1:1 và 2:1, sau 4 giờ ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn, bào tử nấm mốc không có khả năng sinh trưởng trên đĩa môi trường
Hình 3 Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự sinh trưởng
của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum
Trang 11Kết quả cho thấy, dịch nuôi cấy chủng B licheniformis D7 không chỉ có tác khả năng
ức chế sự nảy mầm mà còn ức chế sự sinh trưởng và phát triển của bào tử nấm mốc
N dimidiatum
2.4.3 Tác động của chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ
sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum
Để khảo sát đặc điểm kháng nấm mốc của dịch nuôi cấy vi khuẩn, chúng tôi đã thực
hiện khảo sát tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ
sợi tơ mốc Neoscytalidium dimidiatum Kết quả được ghi nhận ở Bảng 2 và Hình 4 như
sau:
Nhìn chung, hệ sợi tơ nấm mốc ở đối chứng phát triển mạnh mẽ, hình thành vách ngăn
và bắt đầu phân nhánh sau 12 giờ Đối với ba tỉ lệ phối trộn, hệ sợi tơ bị ức chế sự phát triển, biến dạng và bị đứt gãy sau 12 giờ xử lý với dịch nuôi cấy vi khuẩn
Bảng 2 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 đối với sự phát
triển của hệ sợi tơ mốc Neoscytalidium dimidiatum ở các tỷ lệ và thời gian khác nhau
và hình thành tơ
Tơ nấm phát triển
và kéo dài
Tơ nấm tiếp tục phát triển và kéo dài, một số hình thành vách ngăn
Tơ nấm tiếp tục phát triển, kéo dài
và hình thành vách ngăn
chế phát triển và bị biến dạng
Tơ phát triển chậm
và bị biến dạng
Tơ bị ức chế phát triển và bị biến dạng
Tơ bị biến dạng nặng và đứt gãy
chế phát
Tơ bị ức chế phát
Tơ bị biến dạng Tơ bị biến dạng
nặng và đứt gãy
Trang 12triển, bị biến dạng
và đứt gãy
triển và bị biến dạng
chế phát triển, bị biến dạng
và đứt gãy
Tơ biến dạng và đứt gãy
Tơ bị biến dạng nặng
Tơ không thể phát triển, bị biến dạng nặng và đứt gãy
4 giờ
8 giờ
12 giờ
Trang 1324 giờ
Hình 4 Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hình thái và sự
phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum Kết quả cho thấy, dịch nuôi cấy B licheniformis D7 có khả năng ức chế sự phát triển, làm biến dạng cấu trúc và làm đứt gãy hệ sợi tơ mốc N dimidiatum sau 12 giờ phối trộn
2.4.4 Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh long do
Neoscytalidium dimidiatum gây ra của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7
Dựa vào kết quả in vitro thu được, chúng tôi đã kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do Neoscytalidium dimidiatum gây ra của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 trên
mô hình quả thanh long Kết quả ghi nhận được như sau (Hình 5):
Nhìn chung, không xuất hiện bệnh tại các vị trí được tiêm đối chứng (-) cả trên vỏ và bên trong ruột quả thanh long Ở các vị trí được tiêm hỗn hợp dịch nuôi cấy vi khuẩn phối trộn với dịch bào tử nấm mốc có xuất hiện sự thối nhũn cả trên vỏ và bên trong ruột quả Tuy nhiên, mức độ bệnh giảm dần theo tỉ lệ tăng dần dịch nuôi cấy vi khuẩn và nhẹ hơn so với vị trí được tiêm đối chứng (+)
Trang 14Hình 5 Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên
quả thanh long của dich nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 1: Môi trường chưa nuôi cấy; 2: Dịch nuôi cấy chủng B licheniformis D7; 3: Dịch bào tử N dimidiatum; 4:
Tỉ lệ 0,5:1; 5: Tỉ lệ 1:1; 6: Tỉ lệ 2:1 Tiếp theo, chúng tôi đã kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do N dimidiatum gây ra của dịch nuôi cấy B licheniformis D7 trên mô hình cây thanh long Kết quả thu được
như sau (Hình 6):
Nhìn chung, bệnh chỉ xuất hiện tại vị trí được tiêm đối chứng (+) làm cho thân cây thanh long bị thối nhũn và rơi ra tạo thành một khoảng trống Các vị trí còn lại không xuất hiện bệnh
Trang 15Hình 6 Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên
thân cây thanh long của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 1: Môi trường LB; 2: Dịch nuôi cấy chủng B licheniformis D7; 3: Dịch bào tử N dimidiatum; 4: Tỉ lệ
0,5:1; 5: Tỉ lệ 1:1; 6: Tỉ lệ 2:1 Như vậy, môi trường chưa nuôi cấy và dịch nuôi cấy chủng B licheniformis D7 không gây bệnh trên cả thân cây và quả thanh long Dịch nuôi cấy B licheniformis D7 có khả năng làm giảm nhẹ mức độ bệnh đốm nâu do N dimidiatum gây ra đối với mô hình quả
thanh long và ức chế hoàn toàn bệnh đối với mô hình thân cây thanh long
2.5 Đánh giá các kết quả đạt được và kết luận
Đề tài nghiên cứu này đã được tiến hành nhằm xác định khả năng ức chế nấm mốc
Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của chủng Bacillus licheniformis D7, bao gồm sự tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên khả năng nảy mầm
bào tử và sự phát triển của hệ sợi tơ nấm cũng như hiệu quả ngăn ngừa bệnh trên thân cây
và quả thanh long Kết quả cho thấy, dịch nuôi cấy chủng B licheniformis D7 có khả năng
kéo dài thời gian nảy mầm, làm biến dạng cấu trúc bào tử mốc cũng như hệ sợi tơ nấm sau
Trang 1624 giờ khi phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử mốc với các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1 Bên cạnh đó, kết quả đánh giá hiệu quả ngăn ngừa bệnh trên cây và quả thanh long cho thấy cả ba tỉ lệ phối trộn đều có khả năng ngăn ngừa bệnh trên thân cây Tuy nhiên, trên quả thanh long vẫn xảy ra hiện tượng thối nhũn ở cả ba tỉ lệ phối trộn nhưng thời gian xuất hiện bệnh chậm hơn đến 2 ngày, mức độ bệnh nhẹ hơn so với đối chứng và giảm dần theo
tỉ lệ tăng dần dịch nuôi cấy vi khuẩn
gian nảy mầm của bào tử đến 4 giờ, làm biến dạng cấu trúc bào tử mốc cũng như tế bào hệ
sợi tơ nấm Thêm vào đó, dịch nuôi cấy của chủng B licheniformis D7 có khả năng ức chế
sự phát triển bệnh đốm nâu do N dimidiatum gây ra trong 2 ngày và làm giảm mức độ
bệnh trên quả thanh long Bên cạnh đó, dịch nuôi cấy vi khuẩn còn cho thấy có khả năng ngăn ngừa hoàn toàn sự phát triển bệnh trên thân cây thanh long trong ít nhất 21 ngày gây
nhiễm với mốc N dimidiatum Nghiên cứu này cho thấy chủng vi khuẩn B licheniformis D7 có tiềm năng trong việc ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học để kiểm soát bệnh do N dimidiatum gây ra nhằm phục vụ cho ngành trồng trọt thanh long ở nước ta
Abstract
Dragon fruit (Hylocereus spp.) is a nutritious fruit with high economic value However, the brown spot disease caused by Neoscytalidium dimidiatum has resulted in stinging rot
on both the stem and fruit, seriously loss of quality and yield of dragon fruit In order to
find an effective and eco-friendly control microorganism, the antifungal effect of Bacillus licheniformis D7 against N dimidiatum was studied The result indicated that culture fluid
Trang 17of B licheniformis D7 was capable of not only prolonging the germination time of fungal spores up to 4 hours but also deforming the spore and mycelium cell wall In addition, B licheniformis D7 culture fluid was shown to delay the development for 2 days and severity
of brown spot disease on the fruit model Interestingly, B licheniformis D7 was also proved
to be effectively inhibit the disease on the stem model for at least 21 days after fungal
pathogen infection In conclusion B licheniformis D7 has been shown to be a very potential
fungal biocontrol agent against brown spot disease of dragon fruit
III Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo
- Chủng Bacillus licheniformis
D7
Chủng vi sinh vật thuần chủng, có định danh sơ bộ (hình thái vi thể, đại thể, test sinh hóa), định danh đến loài bằng phương pháp sinh học
nhiệt độ và thời gian
- Thông số về nhiệt độ, thời
gian nuôi cấy
Trang 18IV Tình hình sử dụng kinh phí
Kinh phí được duyệt (triệu đồng)
Kinh phí thực hiện (triệu đồng) Ghi chú
- Cây thanh long
- Quả thanh long
5 Dịch vụ thuê ngoài
Trang 196 Hội nghị, hội thảo, thù lao
nghiệm thu giữa kỳ
- Nghiên cứu thêm về đặc tính kháng mốc của chủng B licheniformis D7
- Nghiên cứu thêm quy trình tạo chế phẩm sinh học kháng N dimidiatum từ chủng B licheniformis D7
- Ngoài ra, Bacillus licheniformis D7 là một loài vi khuẩn tiềm năng, do đó, cần nghiên
cứu thêm về chủng này nhằm khai thác các đặc tính hữu ích khác như khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh khác, khả năng sinh tổng hợp một số loại enzyme có hoạt tính cao như amylase, chitinase, protease, cellulase…
Trang 20VI Phụ lục sản phẩm
1 Giống vi sinh vật
1.1 Định danh của chủng Neoscytalidium dimidiatum
Sau khi phân lập và làm thuần, chủng nấm mốc HY được gửi mẫu sang Chi cục Kiểm dịch
thực vật vùng II để định danh dựa trên đặc điểm hình thái đại thể và vi thể (Hình S1 và Hình
S2) Đồng thời, chúng tôi cũng đã gửi mẫu sang trường Đại học Konkuk, Hàn Quốc để giải trình
tự vùng gen 18S-rRNA để định danh một cách chính xác đến loài
1.1.1 Hình thái đại thể
Về hình thái đại thể, khuẩn lạc của chủng nấm mốc HY có dạng sợi, có màu xám đen đến nâu đen ở mặt trên, mặt dưới có màu đen, không có vòng đồng tâm Sợi nấm phân nhánh, vươn cao như bông gòn trên bề mặt môi trường PGA
Hình S1 Hình thái khuẩn lạc của nấm mốc HY trong 7 ngày nuôi cấy trên môi trường
PGA
1.1.2 Hình thái vi thể
Về hình thái vi thể, sợi nấm của chủng HY phân nhánh, có vách ngăn, màu nâu và có khả năng phân cắt thành các bào tử đốt Bào tử có hình dạng ellipse, hình trụ hoặc tròn, chứa một hoặc hai nhân, màu sắc từ trong suốt đến nâu tối, thành bào tử dày, có 0-1 vách ngăn
Trang 21Hình S2 Hình thái vi thể của chủng nấm mốc HY (a) – (e): bào tử; (f): hệ sợi tơ
1.1.3 Định danh bằng công cụ sinh học phân tử
Sau khi giải trình tự, chúng tôi đã so sánh vùng trình tự 18S-rRNA của chủng nấm mốc HY
với ngân hàng dữ liệu trên NCBI bằng công cụ BLAST (Hình S3) và sử dụng các phần mềm
FinchTV, Seaview, ClustalX2 và MEGA5 để xây dựng cây phát sinh loài của chủng nấm mốc
HY với các loài lân cận
Hình S3 Tỉ lệ tương đồng (gene mã hóa cho 18S-rRNA) của chủng nấm mốc HY với các
loài lân cận
Kết quả cho thấy gene mã hóa cho 18S-rRNA ở chủng nấm mốc HY có tỉ lệ tương đồng
100% với gene mã hóa cho 18S-rRNA ở chủng Neoscytalidium dimidiatum CBS 251.49 Ngoài
ra để xác định rõ hơn mối quan hệ di truyền của chủng nấm mốc HY với các loài có quan hệ
Trang 22gần, chúng tôi đã xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự 18S-rRNA bằng phương pháp Neighbor
joining với bootstrap 1000 (Hình S4)
Hình S4 Cây phả hệ của chủng nấm mốc HY với các loài lân cận
Khoảng cách di truyền của chủng nấm mốc HY trên cây phả hệ gần nhất với chủng
Neoscytalidium dimidiatum CBS 251.49 với giá trị bootstrap là 98 (có độ tin cậy cao)
Từ các kết quả trên, chủng nấm mốc HY được xác định có khả năng cao là
Neoscytalidium dimidiatum
1.2 Định danh của chủng Bacillus licheniformis D7
Sau khi phân lập và làm thuần, chúng tôi đã định danh sơ bộ chủng vi khuẩn D7 Với đặc điểm vi thể là trực khuẩn Gram (+), có khả năng hình thành nội bào tử, đồng thời, chủng D7
cũng có khả năng sinh tổng hợp catalase (Hình S5 và Hình S6) Để định danh chính xác tới
loài, chúng tôi gửi mẫu sang trường Đại học Konkuk, Hàn Quốc để giải trình tự vùng gene
16S-rRNA (Hình S7 và Hình S8)
1.2.1 Hình thái đại thể
Đặc điểm hình thái đại thể của chủng Bacillus sp D7 là khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, rìa
không đều và có nhiều nếp nhăn, gồ cao, bề mặt khô Chủng vi khuẩn này có khả năng sinh catalase
Trang 23Hình S5 Hình thái khuẩn lạc (a) và khả năng sinh catalase (b) của chủng Bacillus
Dựa trên hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey, chủng này được định danh sơ bộ
thuộc chi Bacillus [18] Do đó, chúng tôi gọi chủng D7 là Bacillus sp D7
1.2.3 Định danh bằng công cụ sinh học phân tử
Sau khi giải trình tự, chúng tôi đã so sánh vùng trình tự 16S-rRNA của chủng Bacillus
sp D7 với ngân hàng dữ liệu trên NCBI bằng công cụ BLAST và sử dụng các phần mềm
Trang 24FinchTV, Seaview, ClustalX2 và MEGA5 để xây dựng cây phát sinh loài của chủng
Bacillus sp D7 với các loài lân cận
Hình S7 Tỉ lệ tương đồng (gene mã hóa cho 16S-rRNA) của chủng Bacillus sp D7 với
các loài lân cận Kết quả cho thấy gene mã hóa cho 16S-rRNA ở chủng Bacillus sp D7 có tỉ lệ tương đồng 91% với gene mã hóa cho 16S-rRNA ở chủng Bacillus licheniformis RT8
Ngoài ra để xác định rõ hơn mối quan hệ di truyền của chủng Bacillus sp D7 với các loài có
quan hệ gần, chúng tôi đã xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự 16S-rRNA bằng phương pháp
Neighbor joining với bootstrap 1000 (Hình S8)
Hình S8 Cây phả hệ của chủng Bacillus sp D7 với các loài lân cận
Khoảng cách di truyền của chủng Bacillus sp D7 trên cây phả hệ gần nhất với chủng Bacillus licheniformis RT8 với giá trị bootstrap là 100 (có độ tin cậy cao)
Từ các kết quả trên, chủng Bacillus sp D7 được xác định có khả năng cao là Bacillus licheniformis D7
Trang 252 Quy trình khảo sát khả năng kháng mốc của vi khuẩn
2.1 Quy trình
Hình S9 Quy trình khảo sát khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của
chủng Bacillus licheniformis D7
2.2 Thuyết minh quy trình
a Nuôi ủ: 1 khuẩn lạc của chủng B licheniformis D7 được nuôi trong 10 mL môi
trường LB lỏng (10,0 g peptone; 5,0 g yeast extract; 10,0 g NaCl; nước cất 1000 mL; pH 7,0 ± 0,2) ở nhiệt độ phòng, 150 rpm trong 14-16 giờ và thu được giống tăng sinh Giống tăng sinh được cấy vào 50 mL môi trường LB với tỷ lệ giống 5%
b Ly tâm: dịch nuôi cấy được ly tâm 2 lần 13000 vòng/phút ở 4°C, 15 phút/lần để loại
bỏ tế bào, thu dịch nuôi cấy vi khuẩn
c Nuôi ủ: các ống nghiệm nuôi mốc được ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng, 7 ngày
d Bào tử: thu bào tử nấm mốc sau khi nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PGA bằng môi trường PGB
e Hệ sợi tơ: thu bào tử nấm mốc sau khi nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PGA bằng môi trường PGB, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ
Trang 26f Khảo sát sơ bộ khả năng ức chế nấm mốc: xác định bằng phương pháp khuếch tán dịch nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa thạch
g Khảo sát khả năng nảy mầm của bào tử mốc: phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử nấm mốc theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1 (mật độ bào tử nấm mốc ở các lô thí nghiệm là 106 bào tử/mL), ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát dưới kính hiển vi theo các mốc thời gian 4, 8, 12, 24 giờ
h Kiểm tra sự sinh trưởng của bào tử mốc: phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử nấm mốc theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1 (mật độ bào tử nấm mốc ở các lô thí nghiệm là 106 bào tử/mL), ủ ở nhiệt độ phòng và cấy trải trên môi trường PGA theo các mốc thời gian 4, 8, 12, 24 giờ Các đĩa được ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự sinh trưởng của nấm mốc trong 3 ngày
i Khảo sát sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc: phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch huyền phù chứa hệ sợi tơ nấm mốc theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1 (mật độ bào tử nấm mốc ở các lô thí nghiệm là 106 bào tử/mL), ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát dưới kính hiển vi theo các mốc thời gian 4, 8, 12, 24 giờ
j Kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh trên thanh long: phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử nấm mốc theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1 (mật độ bào tử nấm mốc ở các
lô thí nghiệm là 106 bào tử/mL), ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Tiêm lên thân cây
và quả thanh long ở 6 vị trí lần lượt là môi trường LB, dịch nuôi cấy vi khuẩn, dịch bào tử nấm mốc, dịch nuôi cấy vi khuẩn phối trộn với dịch bào tử nấm mốc theo các
tỉ lệ phối trộn, tiêm 200 μL/vết, ủ ở 30-35 °C và theo dõi mỗi ngày trong 21 ngày
Tp HCM, ngày…… tháng……năm 2021
Chủ nhiệm đề tài
Hồ Nguyễn Hoàng Yến
Viện trưởng (Họ tên, chữ kí)
Trang 27PHẦN II: BÁO CÁO CHI TIẾT NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
1.2 Neoscytalidium dimidiatum 33
1.2.1 Đặc điểm 33
1.2.2 Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long 34
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37 2.1 Đối tượng nghiên cứu 37
2.1.1 Chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 37 2.1.2 Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 37
2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 37 2.2.1 Hóa chất và môi trường nghiên cứu 37 2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 39 2.3 Phương pháp nghiên cứu 40 2.3.1 Phương pháp khảo sát sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc bởi vi khuẩn 40 2.3.2 Phương pháp khảo sát tác động của vi khuẩn lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc 40 2.3.3 Phương pháp khảo sát tác động của vi khuẩn lên sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc 41 2.3.4 Phương pháp kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh long do nấm mốc gây ra của vi khuẩn 42
Trang 28CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 3.1 Kết quả sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc
Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 43 3.2 Tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 44 3.3 Tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 47 3.4 Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên thanh long do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 50
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 53 4.1 Kết luận 53 4.2 Kiến nghị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
Trang 29DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc của Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường PGA 34 Hình 1.2 Các giai đoạn phát triển bệnh thối thân do Neoscytalidium dimidiatum trên thân
cây thanh long 35
Hình 1.3 Bệnh đốm nâu trên thân cây và quả thanh long 36
Hình 3.1 Khả năng đối kháng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy
chủng Bacillus licheniformis D7 43
Hình 3.2 Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hình thái và khả
năng nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 46
Hình 3.3 Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự sinh trưởng
của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 47
Hình 3.4 Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hình thái và sự
phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 49
Hình 3.5 Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên
quả thanh long của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 51
Hình 3.6 Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên
thân cây thanh long của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 52
Trang 30DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Hóa chất được sử dụng 37 Bảng 2.2 Một số nguyên liệu khác 38 Bảng 2.3 Một số môi trường dùng trong nghiên cứu 38 Bảng 2.4 Thiết bị và dụng cụ được sử dụng 39
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 đối với
sự nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ở các tỉ lệ và thời gian khác
nhau 44
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 đối với
sự phát triển của hệ sợi tơ mốc Neoscytalidium dimidiatum ở các tỉ lệ và thời gian khác
nhau 48