NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI RÚT BEIJING-1 ĐỂ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT VẮC XIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TRÊN TẾ BÀO VERO TẠI VIỆT NAM TT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- NGUYỄN THỊ LÝ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI RÚT BEIJING-1 ĐỂ ỨNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN THỊ LÝ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI RÚT BEIJING-1 ĐỂ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT VẮC XIN VIÊM

NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TRÊN

TẾ BÀO VERO TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 9 42 01 07

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2022

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ -

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Viện Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS Huỳnh Thị Phương Liên Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Đinh Duy KhángPGS

Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Lê Khánh Hằng, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (Nihe), Bộ y tế

Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thái Sơn, Học viện Quân y

Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Đăng Hiền, Trung tâm NC sản xuất vắc xin & Sinh phẩm y tế (Polyvac), Bộ y tế

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ’, ngày … tháng

… năm 2022

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Viêm não Nhật bản (VNNB) là một trong các bệnh gây nhiễm trùng thần kinh cấp tính với nhiều mức độ khác nhau, đáng ngại hơn cả

là bệnh thường để lại di chứng thần kinh (như điếc, mù, động kinh, yếu liệt cứng toàn thân hoặc liệt tay chân…) và tỷ lệ tử vong cao [1, 2] Cho đến nay chưa có thuốc đặc trị bệnh VNNB, biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất là tiêm vắc xin

Vi rút VNNB có rất nhiều chủng, nhưng hiện nay hầu hết các chủng sử dụng để sản xuất vắc xin đều thuộc genotype 3 gồm chủng Nakayama; Beijing -1; Beijing-3 và SA-14-14-2 Nhật Bản là nước đầu tiên nghiên cứu, sản xuất thành công vắc xin VNNB Việc sử dụng vắc xin VNNB trong cộng đồng đã góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh VNNB đáng kể [3-5] Việt Nam bắt đầu nghiên cứu sản xuất và sử dụng vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất trên não chuột từ năm 1989 Tuy nhiên, vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất trên não chuột có nhiều hạn chế như chi phí sản xuất cao, đòi hỏi phải có chuột sạch bệnh, cần

có hệ thống nuôi chuột và kiểm soát phức tạp, đặc biệt là khâu tinh chế kháng nguyên vi rút thu nhận từ não chuột, hiệu suất sản xuất thấp

và nguy cơ tạo nhiễm protein từ não chuột có thể ảnh hưởng tới sức khỏe và tính mạng của người được tiêm vắc xin

Từ năm 2006, công ty vắc xin và sinh phẩm số 1 đã nghiên cứu sản xuất vắc xin bất hoạt trên tế bào Vero, sử dụng chủng Beijing-1 (JECEVAX) [6, 7] Trong đó, việc kiểm soát tốt chất lượng của chủng vi rút trước khi đưa vào sản xuất vắc xin đại trà là yêu cầu cần thiết

Chính vì vậy chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xây

dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút Beijing-1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng của chủng (chủng gốc và chủng sản xuất) vi rút Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam

3 Nội dung nghiên cứu của luận án

Nghiên cứu tính ổn định về hiệu giá, ổn định về di truyền và tính sinh miễn dịch của chủng vi rút sản xuất vắc xin VNNB theo thời gian sau sản xuất (0, 3, 4, 6, 8, 9, 10 năm) ở nhiệt độ Nitrogen lỏng; Ở các nhiệt độ bảo quản khác nhau (nhiệt độ -20oC sau 1, 3, 6 tháng bảo quản; nhiệt độ 2-8oC sau 1, 3, 5, 7 ngày bảo quản);

Nghiên cứu sự tương đồng nucleotide và axít amin Protein E của chủng sản xuất so với các chủng VNNB lưu hành ở Việt Nam từ 1964-2014;

Đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch bảo vệ của chủng trong 10 lô vắc xin JECEVAX được sản xuất từ lô WSV ở quy mô phòng thí nghiệm;

Xây dựng 9 chỉ tiêu, phương pháp & tiêu chuẩn chất lượng của chủng (chủng gốc và chủng sản xuất) để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam

Bố cục của luận án

Luận án gồm 114 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 30 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19 trang, kết quả và bàn luận 49 trang, kết luận và kiến nghị 2 trang, danh mục các công trình công bố 1 trang, tài liệu tham khảo 9 trang gồm 98 tài

liệu Trong luận án có 18 hình, 32 bảng và 48 trang phụ lục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Vi rút Viêm não Nhật bản

Đặc điểm, cấu trúc vi rút Viêm não Nhật Bản

Vi rút VNNB là một thành viên của vi rút Arbo (arthropod borne viruses), là những vi rút do côn trùng tiết túc truyền cho động vật có xương sống qua đường máu [8]

Vi rút VNNB có kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu (HA)

và hoạt tính trung hòa là glycoprotein trên preM và E (vỏ và tiền màng của vi rút) [1, 10] Bộ gen RNA gồm: 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc Các protein cấu trúc gồm Protein C (Capsid), Protein

M (Membrane) và Protein E (Envelope) [1, 11, 12] Các protein không cấu trúc gồm NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5 [14]

Trong quá trình vi rút phóng thích khỏi tế bào, Protein E chịu trách nhiệm tấn công đến tế bào đích và hòa màng tế bào; chính protein

E mang các kháng nguyên bề mặt là kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) và hoạt tính trung hòa để tạo kháng thể trung hòa Đây chính

là tiêu chuẩn để chọn bất kỳ chủng dự tuyển nào cho sản xuất vắc xin VNNB [14]

Dịch tễ học phân tử của vi rút Viêm não Nhật Bản

Nghiên cứu dịch tễ học phân tử vi rút VNNB tập trung nghiên cứu vùng gen E với độ dài 1500 bp, là vùng có liên quan đến độc lực

và tính sinh miễn dịch của vi rút đã được chọn là vùng gen lý tưởng

để nghiên cứu sự tiến hoá, sự phát tán, sự biến đổi, sự khác nhau của các chủng vi rút VNNB Cho đến nay có rất nhiều chủng vi rút VNNB

đã được phát hiện nhưng nhờ có sinh học phân tử mà phân ra 5 genotype Ở Việt Nam có rất nhiều chủng vi rút VNNB được phát hiện

và hầu hết đều thuộc genotype 1 và genotype 3 [17-19]

1.2 Vắc xin Viêm não Nhật Bản

Năm 1938, Takanouchi và cs đã nghiên cứu sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt từ não chuột [5, 20] Trong suốt các năm sau đó, các nghiên cứu về vắc xin VNNB đã được tiến hành tại Nhật Bản, Mỹ và nhiều nước trên thế giới nhằm tăng hiệu lực bảo vệ và giảm các độc tính không mong muốn của vắc xin [22]

Năm 1959-1981, một trường phái khác ở Trung Quốc đã nghiên cứu sản xuất vắc xin sống giảm độc lực từ chủng vi rút độc lực, thực hiện trên chủng 12.1.7 [23, 24] Sau nhiều năm nghiên cứu, các tác giả Trung Quốc đã tạo được một chủng VNNB giảm độc lực SA 14-14-2 [7] Vắc xin bất hoạt được nuôi cấy trên tế bào thận chuột hamster tiên phát, đã sử dụng chủng Beijing -3 (P3) [24, 26, 27]

Năm 1971, Viện Biken được chỉ đạo của Giáo sư Fukai (nguyên Chủ tịch Hiệp Hội nghiên cứu vắc xin và Sinh phẩm của Nhật Bản) đã nghiên cứu tinh chế vắc xin để đạt độ tinh khiết với hàm lượng protein ≤ 80 µg/mL Đây là hàm lượng tiêu chuẩn của protein cho phép trong vắc xin VNNB sản xuất từ não chuột theo phương pháp hóa lý của Takaku Cho đến nay phương pháp tinh chế này vẫn là tiên tiến nhất được TCYTTG công nhận Vắc xin thế hệ 2 là vắc xin sản xuất trên tế bào (Nhật, Áo, Ấn Độ, Pháp, Trung Quốc, Thái Lan, Hàn Quốc…) Vắc xin thế hệ 3 bằng phương pháp công nghệ gen cho đến nay có rất nhiều tác giả nghiên cứu nhưng hầu hết cũng chỉ dừng lại ở mức nghiên cứu thử nghiệm ở phòng thí nghiệm [36, 56]

Tại Việt Nam, từ thập kỷ 70, Đỗ Quang Hà cũng đã nghiên cứu sản xuất thử vắc xin VNNB từ tế bào thận lợn tiên phát, nhưng thử nghiệm thực địa không có đáp ứng miễn dịch Vắc xin sản xuất trên tế bào mặc dù hiệu quả bảo vệ có thấp hơn nhưng đã khắc phục được các nhược điểm của công nghệ sản xuất trên não chuột ổ Công

nghệ tế bào cũng là công nghệ nền mở đường cho các công nghệ sản xuất hiện đại hơn như vắc xin tái tổ hợp, vắc xin vector, vắc xin ADN…trong tương lai

Hiện nay có bốn loại vắc xin đang sản xuất và sử dụng rộng rãi dựa trên các công nghệ sản xuất vắc xin đã nêu trên bao gồm (1) Công nghệ sản xuất vắc xin bất hoạt trên não chuột (chủng Nakayama

và Beijing -1); (2) Công nghệ sản xuất vắc xin bất hoạt trên tế bào Vero (chủng Beijing -1, SA14-14-2); (3) Công nghệ sản xuất vắc xin sống giảm độc lực trên tế bào PHK (chủng SA14-14-2); (4) Sản xuất vắc xin tái tổ hợp theo công nghệ khảm (chimeric –JE and YF-17D vắc xin, chủng SA14-14-2) Trong bốn loại này thì trừ loại đầu sản xuất trên não chuột (thực tế có 2 vắc xin của Việt Nam, Hàn Quốc) còn lại đều là công nghệ sản xuất trên tế bào Điều đó để thấy xu hướng chung của thế giới hiện nay chính là dần chuyển sang công nghệ sản xuất vắc xin VNNB trên tế bào

Việt Nam bắt đầu đưa vắc xin VNNB JEVAX vào chương trình tiêm chủng mở rộng quốc gia (TCMR QG) từ năm 1991 đến nay

số ca nhiễm vi rút VNNB giảm đáng kể

Sự phát triển của vắc xin Viêm não Nhật Bản trên tế bào

Trung Quốc là nước đầu tiên trên thế giới nghiên cứu sản xuất vắc xin trên tế bào, hiện nay Nhật Bản cũng đã nghiên cứu thành công công nghệ này

Vắc xin sản xuất trên tế bào mặc dù hiệu quả bảo vệ có thấp hơn nhưng đã khắc phục được các nhược điểm của công nghệ sản xuất trên não chuột ổ Điều đáng quan tâm hơn đó là công nghệ sản xuất vắc xin trên tế bào có thể mở rộng qui mô sản xuất một cách nhanh chóng, do đó có khả năng cung cấp sản lượng vắc xin lớn, giá thành

rẻ và người dân dễ dàng tiếp cận vắc xin, nhất là trong các vụ dịch

Công nghệ tế bào cũng là công nghệ nền mở đường cho các công nghệ sản xuất hiện đại hơn như vắc xin tái tổ hợp, vắc xin vector, vắc xin ADN…trong tương lai

1.3 Chủng vi rút sản xuất vắc xin Viêm não Nhật Bản

Chủng vi rút Nakayama-NIH

Nhật Bản là nước đầu tiên phân lập được vi rút VNNB năm

1935 từ một em bé bị VNNB, đặt tên chủng là Nakayama [13, 20] Ngoài Nhật Bản, chủng Nakayama đã được một số nước chọn để sản

xuất vắc xin cho người như Hàn Quốc, Thái Lan, Việt Nam…

Chủng vi rút Beijing-1

Chủng Beijing-1 được phân lập từ người năm 1949 ở Bắc Kinh, Trung Quốc Nhật Bản bắt đầu sử dụng chủng Beijing-1 cùng với chủng Nakayama –NIH để sản xuất vắc xin VNNB cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu từ năm1989 [34, 35] Ở châu Á chủng Nakayama và Beijing-1 được chọn để sản xuất vắc xin vì khả năng nhân lên rất nhạy trên não chuột và có phản ứng chéo với các chủng khác trên chuột [16, 36-40]

Chủng SA14-14-2

Chủng vi rút VNNB nguyên thủy SA là chủng độc lực được phân lập từ muỗi năm 1954 Từ 1959-1981, chủng nguyên thủy SA độc lực được Trung Quốc nghiên cứu phát triển thành chủng vi rút sống giảm độc lực, chủng giảm độc lực đầu tiên có ký hiệu 12.1.7 [41, 42]

Chủng Beijing-3

Chủng Beijing-3 (P3) phân lập từ não một bệnh nhân ở Trung Quốc năm 1949 Chủng này được nghiên cứu sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào PHK [3] Năm 1998, vắc xin bất hoạt sản xuất trên

TB Vero, sử dụng chủng Beijing-3 đã được cấp phép ở Trung

Quốc Vắc xin tương tự dựa trên chủng Beijing-1 được cấp phép

ở Nhật Bản [48]

Dòng tế bào nuôi cấy (nhân) vi rút

Vi rút có khả năng nhân lên trên nhiều dòng tế bào Tuy nhiên được phép sử dụng để sản xuất vắc xin chỉ có một số dòng tế bào có nguồn gốc từ động vật như thận khỉ, thận bò, phôi gà; Các dòng tế bào lưỡng bội của người (MRC5, KMB17) và khỉ (WI38, FRhL2); các dòng tế bào thường trực: Vero, CHO

Tại Vabiotech, tế bào vero CCL81 của WHO đời 134 (2 ống) được nhập về Việt nam, từ đó nhân lên làm tế bào gốc MCB đời 137 (chỉ có 100 ống) để phục vụ cho nghiên cứu và sản xuất Sử dụng 2 ống đời 137 nhân lên đời 139 làm WCB (200 ống) Từ đời 139 sẽ nhân lên đến đời 142 để đưa vào sản xuất

1.4 Các khuyến cáo của TCYTTG cho sản xuất và kiểm định chủng sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt [61]

Chuột: Chuột sử dụng để nhân chủng vi rút VNNB sản xuất

vắc xin phải từ các đàn/dòng chuột khỏe mạnh và được cấp phép (kiểm

soát) bởi cơ quan kiểm định quốc gia có thẩm quyền

Tế bào thận chuột Hamster tiên phát (PHK): Tế bào thận tiên

phát được sử dụng để sản xuất vắc xin, loại động vật cũng như loại mô

tế bào tiên phát phải được phê chuẩn bởi cơ quan quốc gia có thẩm quyền Hiện có 2 dòng tế bào được phát triển và sử dụng chính là tế bào thận chuột Hamster tiên phát

Tế bào thường trực: Khi dòng tế bào thường trực được sử dụng

để sản xuất vắc xin VNNB thì ngân hàng tế bào gốc (MCB) và ngân hàng tế bào sản xuất (WCB) phải được kiểm soát và phải đáp ứng các tiêu chuẩn có nguồn gốc từ động vật sử dụng cho sản xuất các chế phẩm sinh học dùng cho người

Chủng vi rút: Chủng vi rút sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB

bất hoạt phải là những chủng đảm bảo các tiêu chuẩn về thuần khiết,

an toàn và hiệu quả trên lâm sàng khi đã bất hoạt Hệ thống chủng vi rút gồm: Chủng gốc (Master seed lots) và chủng sản xuất (Working seed lots) Chủng đông khô có thể bảo quản ở ≤ -20oC; chủng đông băng thì bảo quản ở ≤ -60oC Chủng gốc và chủng sản xuất phải được kiểm tra từng tiêu chuẩn chất lượng quy định, phải đạt các tiêu chuẩn

cơ sở và được phê chuẩn bởi cơ quan kiểm định quốc gia có thẩm quyền

1.5 Tóm tắt quy trình thiết lập ngân hàng chủng (Beijing-1)

để sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam

Giai đoạn 1: Nghiên cứu thiết lập hệ thống ngân hàng chủng cùng với việc xây dựng quy trình sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero (năm 2006 -2012 - Đề tài cấp Bộ Y tế):

+ Từ năm 2006-2010: Nghiên cứu thích ứng chủng vi rút Beijing-1 trên tế bào Vero để tạo chủng vi rút đủ điều kiện cho phát triển và sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Vabiotech

+ Từ tháng 4/2010: bắt đầu thiết lập chủng gốc và chủng sản xuất để sản xuất thử nghiệm các loạt vắc xin nhằm xây dựng quy trình sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại VABIOTECH

Giai đoạn 2: Sử dụng hệ thống chủng đã được thiết lập sản xuất các loạt vắc xin cho các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I, II, IIB & III tại Việt Nam (Năm 2013-2018 - Đề tài cấp Nhà nước); kiểm tra đánh giá tính ổn định của chủng beijing-1 và vắc xin JECEVAX sau sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm

Giai đoạn 3: Tổng hợp các dữ liệu đã có để hoàn thiện, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho ngân hàng chủng sản xuất, vắc xin

1.5.1 Thiết lập ngân hàng chủng gốc (MSV)

1.5.2 Thiết lập ngân hàng chủng sản xuất (WSV)

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu

Chủng vi rút Viêm não Nhật bản (Beijing-1, nguồn gốc từ Viện

Kanonji thuộc Trường đại học Osaka, Nhật Bản): Lô chủng gốc

(BV-MSV-0210), lô chủng sản xuất (BV-WSV-0310)

Vắc xin Viêm não Nhật Bản JECEVAX (vắc xin bất hoạt trên

tế bào Vero, chủng Beijing-1 do Vabiotech sản xuất)

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm, QC, QM của công ty

VABIOTECH; Khoa Vi rút, Viện VSDTTƯ; Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện CNSH, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Phòng thí nghiệm của Khoa KĐVX Vi rút NICVB

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Sinh phẩm, hóa chất, thiết bị

Một số chủng gốc Beijing-1, chủng Nakayama, ngân hàng tế bào Vero, BHK21 và MRC5 đã được sử dụng trong nghiên cứu

2.2.2 Động vật thí nghiệm

Động vật thực nghiệm như chuột nhắt ổ giống

Swiss/ICR 1-3 ngày tuổi, chuột nhắt trắng 3 tuần tuổi, 4 tuần tuổi, chuột lang (Việt Nam) và thỏ (Newzealand) đã được sử dụng trong nghiên cứu

2.3 Thiết kế nghiên cứu

Hình 2 1 Sơ đồ nghiên cứu

2.4 Biến số và nội dung nghiên cứu

Bảng 2 1 Chỉ tiêu nghiên cứu trên lô chủng gốc BV-MSV-0210,

lô chủng sản xuất BV-WSV-0310

Thioglycolate

2 Vi rút ngoại lai trên chuột nhắt Thử trên chuột nhắt

3 Vi rút ngoại lai trên chuột nhắt ổ Thử trên chuột nhắt ổ

4 Vi rút ngoại lai trên chuột lang Thử trên chuột lang

5 Vi rút ngoại lai trên tế bào Tế bào Vero, BHK21,