Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) trên đa dạng nền mẫu sử dụng kỹ thuật real-time PCR.pdf

 Thẩm định các thông số kỹ thuật của ộ sinh phẩm - Xác định tỷ lệ lưu hành của ệnh  Xử lý mẫu tiền ly trích  Thu nhận DNA tổng số từ mẫu thử  Thực hiện phản ứng real – time PCR phát

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN VIỆT QUỐC

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI (ASF) TRÊN ĐA DẠNG NỀN MẪU SỬ DỤNG

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS.BS Phạm Hùng Vân

Luận v n thạc s được ảo vệ tại Hội đồng ch m ảo vệ Luận v n thạc s Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày16 tháng 6 n m 2022

Thành phần Hội đồng đánh giá luận v n thạc s gồm:

1 TS Nguyễn Thị Kim Anh - Chủ tịch Hội đồng

TS NGUYỄN THỊ KIM ANH

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN VIỆT QUỐC MSHV: 19000191

Ngày, tháng, n m sinh: 18/03/1982 Nơi sinh: Trà Vinh

- Xây dựng phương pháp nghiên cứu

- Thu thập mẫu nghiên cứu

- Xây dựng và hoàn thiện quy trình phát hiện ASFV ằng kỹ thuật real-time PCR

 Kiểm tra các thiết kế primer – pro e được OIE khuyến cáo in silico

 Tổng hợp hoá học trình tự primer – pro e phát hiện ASFV

 Tổng hợp hoá học trình tự primer – pro e cho chứng nội tại ổ sung vào phản ứng real-time PCR

 Thẩm định các thông số kỹ thuật của ộ sinh phẩm

- Xác định tỷ lệ lưu hành của ệnh

 Xử lý mẫu tiền ly trích

 Thu nhận DNA tổng số từ mẫu thử

 Thực hiện phản ứng real – time PCR phát hiện ASFV

 Thống kê tỷ lệ dương tính

- Xác định yếu tố nguy cơ lây nhiễm trên nền mẫu môi trường, ề mặt

 Xử lý mẫu tiền ly trích

 Thu nhận DNA tổng số từ mẫu thử

 Thực hiện phản ứng real – time PCR phát hiện ASFV

 Thống kê tỷ lệ dương tính trên các yếu tố nguy cơ và môi trường ch n nuôi

- Xác định genotype ASFV

 Khuếch đại trình tự 478 p trên vùng ảo tồn của gen mã hoá VP72

 Giải trình tự gen ảo tồn được khuếch đại

- Xây dựng phương pháp kiểm soát yếu tố nguy cơ để phòng, chống ệnh ASF

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 29/9/2021

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 16/6/2022

IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS PHẠM HÙNG VÂN

Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 6 năm 2022

Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Nam Khoa đã hỗ trợ kinh phí và tạo mọi điều kiện thuận để tôi thực hiện và hoàn thành đề tài

Đồng cảm ơn t t cả anh chị phòng Kiểm tra Ch t lượng, phòng RD và phòng Sinh học Phân tử Công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, vợ và con gái của tôi vì đã luôn hỗ trợ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Thành tựu này sẽ không thể có được nếu không có họ

Xin chân thành cảm ơn!

có khả n ng chống ức chế Tỷ lệ lưu hành của ASF trên 7713 mẫu chiếm 7.47% (538/6665 mẫu ệnh phẩm dương tính với ASFV chiếm 8,07% và 38/1048 mẫu môi trường ch n nuôi để xác định các yếu tố nguy cơ có tỷ lệ nhiễm là 3,63%) Trong đó khi phân tích so sánh tỷ lệ lưu hành ệnh trên các mẫu như máu, nội tạng hoặc dịch

cơ thể trực tiếp từ lợn cho th y tỷ lệ nhiễm ASFV ở trại có quy mô vừa và nhỏ lên đến 23.93%, còn trại lớn là 6.41% Tương tự, khi xác định yếu tố nguy cơ lây nhiễm trên nền mẫu quệt môi trường, quệt nền chuồng, ề mặt chuồng, đ t, nước sinh hoạt

và nước thải ghi nhận tỷ lệ phát hiện ASFV ở trại vừa và nhỏ chiếm 7.37% nhưng ở trại lớn chỉ là 1.69% Mặt khác khi phân tích trình tự của 13 mẫu dương tính với ASFV cho th y t t cả đều thuộc genotype II Tóm lại, đã xây dựng và ứng dụng thành công ộ xét nghiệm real-time PCR để phát hiện ASFV (NK ASFVquant PCR kit) trên các đối tượng mẫu thử khác nhau tại phòng xét nghiệm Tuy nhiên để được

sử dụng rộng rải thì ộ xét nghiệm này cần được khảo nghiệm ởi một đơn vị có thẩm quyền và được c p phép lưu hành ởi Cục Thú Y

ABSTRACT

African Swine Fever (ASF) is a high mortality rate epidemic, which leads to severe economic damage and a lack of worldwide food supplies No vaccine or drug is available to treat ASF Additionally, veterinarians have not been able to distinguish African Swine Fever (ASF) from Classical Swine Fever (CSF) based solely on clinical manifestations and necropsies Hence, real-time PCR tests could be an important tool for supporting the country's disease prevention A real-time PCR reaction was conducted in this study using the OIE-recommended primer pair to amplify the VP72 gene while the White Spot Syndrome Virus specific primer was used as an internal control The obtained parameters indicate that the sensitivity is 1,854 copies per reaction (95%CI: 1,073 - 3,205), the specificity is 100%, repeatability is good, and reproducibility is with a coefficient of variation of 10%; PCR inhibition was avoided Infection rates of ASFs were observed on 7713 samples for 7.47% (538/6665 ASF positive samples represented 8.07% and 38/1048 farm-related samples demonstrated a 3.63% infection rate) Furthermore, a positive rate of specimens (related to body fluids or organs) collected from small and average farms equals 23.93%, while that of large farms is 6.41% We also measured the risk of infection from the environment by sampling the cage floor, cage surface, soil, and domestic water and wastewater ASFV accounted for 7.37% of small and medium-sized farms, and 1.69% of large farms We also sequenced 13 positive samples of ASFV using DNA sequencing and found that all these samples belonged

to genotype II strains As a result, a real-time PCR kit has been developed to detect ASFV (NK ASFV quant PCR kit) on various specimens received in the laboratory

It is important, though, that this test kit be tested by a competent unit before it can

be widely used It also needs to be licensed by the Department of Veterinary Medicine to circulate

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận v n tốt nghiệp: ―NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI (ASF) TRÊN ĐA DẠNG NỀN MẪU

SỬ DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR‖ là công trình nghiên cứu của ản thân tôi Việc tham khảo các nguồn tài liệu trong luận v n đã được nêu rõ trong phần tài liệu tham khảo và đã được thực hiện trích dẫn đúng quy định Các số liệu, kết quả trình ày trong luận v n là hoàn toàn trung thực, không sao chép từ t kỳ một nguồn nào và dưới t kỳ hình thức nào

Học viên

(Chữ ký)

Nguyễn Việt Quốc

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH ẢNH x

DANH MỤC BẢNG BIỂU xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiv

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt v n đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu 3

5 Ý ngh a thực tiễn của đề tài 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 African Swine Fever Virus (ASFV) 5

1.1.1 Phân loài ASFV 5

1.1.2 C u trúc ASFV 6

1.1.2.1 Hình thể và cấu trúc phân tử của ASFV 6

1.1.2.2 Cấu trúc hệ gen của ASFV 7

1.1.3 Quá trình xâm nhiễm của ASFV 10

1.2 Các con đường lây nhiễm của ASFV 13

1.2.1 Chu trình lây nhiễm hoang dại 13

1.2.2 Chu trình lây nhiễm ve – lợn 14

1.2.3 Chu trình lây nhiễm lợn nuôi 15

1.2.4 Khả n ng tồn tại của vi rút ASF 15

1.3 Diễn iến lâm sàng của ệnh ASF 17

1.3.1 Quá c p 18

1.3.2 C p tính 18

1.3.3 Á c p 19

1.3.4 Mãn tính 20

1.4 Các kỹ thuật chẩn đoán cận lâm sàng hiện có 20

1.4.1 Phát hiện vi rút 20

1.4.1.1 Phát hiện hệ gen ASFV bằng phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR) 20

1.4.1.2 Phân lập vi rút 23

1.4.1.3 Phát hiện kháng nguyên ASF bằng thử nghiệm kháng thể phát quang trực tiếp (FAT – Direct fluorescent antibody test) 24

1.4.1.4 Phát hiện kháng nguyên bằng thử nghiệm ELISA kháng nguyên 24

1.4.2 Phát hiện kháng thể ASF 25

1.4.2.1 Phát hiện kháng thể bằng thử nghiệm ELISA 25

1.4.2.2 Phát hiện kháng thể ASF bằng thử nghiệm kháng thể phát quanh gián tiếp (IFA – indirect fluorescent antibody test) 26

1.4.2.3 Phát hiện kháng thể bằng thử nghiệm hoá mô miễn dịch xúc tác peroxidase (IPT – indirect immunoperoxidase test) 27

1.5 Kiểm soát và phòng chống ệnh ASF 27

1.6 Vắc xin 28

1.7 Tình hình nghiên cứu 29

1.7.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 29

1.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 31

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Vật liệu nghiên cứu 32

2.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 32

2.1.2 Hoá ch t 32

2.1.2.1 Hoá chất xử lý tiền ly trích 32

2.1.2.2 Hoá chất tách chiết DNA tổng số 33

2.1.2.3 Hoá chất thực hiện phản ứng PCR 33

2.1.2.4 Hoá chất khuếch đại trình tự gen VP72 của ASFV 34

2.1.2.5 Hoá chất điện di 34

2.1.2.6 Hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR 34

2.1.2.7 Hóa chất sử dụng cho PCR Sequencing mix 34

2.1.2.8 Hóa chất sử dụng tinh sạch và hòa tan sản phẩm PCR Sequencing 35

2.1.3 Thiết ị và vật tư tiêu hao 35

2.1.3.1 Thiết bị 35

2.1.3.2 Vật tư tiêu hao 36

2.2 Phương pháp xây dựng ộ xét nghiệm real-time PCR phát hiện ASFV 36

2.2.1 Primer và Taqman probe 36

2.2.2 Xây dựng các thành phần ộ xét nghiệm real-time PCR phát hiện ASFV 37 2.2.3 Phương pháp xây dựng ASF TQPCR master mix 37

2.2.4 Phương pháp xây dựng chứng dương và chứng chuẩn 39

2.2.4.1 Phương pháp xây dựng chứng dương ASFV 39

2.2.4.2 Phương pháp xây dựng chứng chuẩn 39

2.2.4.3 Chứng nội tại 40

2.2.4.4 Chứng âm 41

2.3 Phương pháp đánh giá thông số kỹ thuật của ộ xét nghiệm real-time PCR trong phòng thí nghiệm 41

2.3.1 Các thông số kỹ thuật cần đánh giá trong phòng thí nghiệm 41

2.3.2 Phương pháp đánh giá các thông số kỹ thuật trong phòng thí nghiệm 41

2.3.2.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 41

2.3.2.2 Độ chính xác 42

2.3.2.3 Độ đặc hiệu phân tích (SP) 43

2.3.2.4 Khả năng chống ức chế 44

2.3.2.5 Độ ổn định sử dụng 44

2.4 Phương pháp thực hiện real-time PCR phát hiện ASFV trên mẫu thật 45

2.4.1 Thu nhận mẫu 45

2.4.2 Quy trình thực hiện 46

2.4.2.1 Mẫu 47

2.4.2.2 Xử lý mẫu 47

2.4.2.3 Quy trình tách chiết DNA tổng số 48

2.4.2.4 Thực hiện real-time PCR phát hiện tác nhân ASFV 50

2.4.2.5 Đọc và phân tích kết quả real-time PCR phát hiện tác nhân ASFV 51

2.5 Phương pháp giải trình tự 13 mẫu dương tính với ASFV 52

2.5.1 PCR khuếch đại phân đoạn gen mã hoá protein p72 52

2.5.2 Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại 53

2.5.3 Tinh sạch sản phẩm khuếch đại 54

2.5.4 Thực hiện phản ứng PCR sequencing 55

2.5.5 Tinh sạch sản phẩm PCR sequencing 56

2.5.6 Chạy điện di mao quản trên máy ABI 3130XL 57

2.5.7 Xác định genotype của ASFV dựa trên vùng ảo tồn của gen mã hoá p72 57 2.6 Thống kê và phân tích số liệu 58

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 59

3.1 Kết quả xây dựng các thành phần của ộ xét nghiệm phát hiện DNA của ASFV 59

3.1.1 Kết quả xây dựng chứng dương 59

3.1.2 Kết quả xây dựng chứng nội tại 59

3.1.3 Kết quả đánh giá khả n ng hoạt động của ASFV TQPCR master mix 60

3.1.4 Kết quả đánh giá khả n ng cạnh tranh của chứng nội tại với DNA mẫu thử

61

3.2 Kết quả đánh giá các thông số kỹ thuật của ộ xét nghiệm phát hiện ASFV trong phòng thí nghiệm 62

3.2.1 Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) 62

3.2.2 Kết quả khảo sát độ chính xác 63

3.2.2.1 Độ lặp lại 63

3.2.2.2 Độ tái lập 64

3.2.3 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu 65

3.2.4 Kết quả khảo sát khả n ng chống ức chế 66

3.2.5 Kết quả khảo sát độ ổn định sử dụng 67

3.3 Kết quả thực hiện xét nghiệm real-time PCR phát hiện ASFV trên các loại mẫu thật 70

3.3.1 Xác định tỷ lệ lưu hành của ệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) 70

3.3.2 Xác định tỷ lệ lưu hành của ệnh ASF trong khu vực trên đối tượng là các

mẫu ệnh phẩm trực tiếp từ lợn 71

3.3.3 Xác định yếu tố nguy cơ lây nhiễm trên nền mẫu môi trường, ề mặt 72

3.3.4 Yếu tố nguy cơ giữa các trại quy mô khác nhau 75

3.3.5 Các yếu tố nguy cơ khác 75

3.3.6 Kết quả xác định genotype lưu hành 77

3.4 Xây dựng quy trình an toàn sinh học kiểm soát yếu tố nguy cơ 79

3.5 Hoàn thiện quy trình phát hiện ASFV ằng kỹ thuật real-time PCR 80

3.5.1 Mục đích sử dụng 80

3.5.2 Tên, thành phần và thông số kỹ thuật ộ thử nghiệm 80

3.5.3 Kiểm soát ch t lượng 81

3.5.4 Trang thiết ị 81

3.5.5 Lưu trữ 82

3.5.6 Cảnh áo và đề phòng 82

3.5.7 Nguyên tắc hoạt động 83

3.5.8 Phương pháp tiến hành 83

3.5.8.1 Mẫu thử 83

3.5.8.2 Phương pháp 84

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 87

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA HỌC VIÊN 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO 91

PHỤ LỤC 98

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 125

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 C u trúc tổng thể ASFV A, ảnh chụp cryo của phân tử vi rút B, hình ảnh

giả lập ề mặt vi rút C, hình ảnh giả lập cắt lớp nửa dưới vi rút cùng mô phỏng tái tạo ảng đồ 3D các thành phần c u trúc D, giản đồ vị trí sắp

xếp các lớp của vi rút ASFV [8] 7

Hình 1.2 Tổ chức hệ gen của ASFV Sự sắp xếp các ORF trên hệ gen được mô tả theo chủng phân lập Georgia 2007/1 [16] 9

Hình 1.3 Quá trình xâm nhập và nhân lên của ASFV trong tế ào [7] 12

Hình 1.4 Sơ đồ mô tả a chu trình lây nhiễm ASFV 14

Hình 1.5 Một số thể lâm sàng của ASFV dựa trên tải lượng vi rút 18

Hình 2.1 Thiết ị tách chiết DNA/RNA tự động KingFisher Flex 49

Hình 2.2 Nguyên tắc hoạt động quy trình tách chiết sử dụng công nghệ nano từ trên thiết ị KingFisher Flex 49

Hình 3.1 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ đường chuẩn dãy pha loãng chứng dương ASFV có nồng độ từ 100 đến 108 ản sao/ phản ứng 59

Hình 3.2 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ đường chuẩn của chứng nội tại ở 6 nồng độ plasmid pha loãng từ 100 đến 105 ản sao/ phản ứng 60

Hình 3.3 (A) Biểu đồ ên trái khuếch đại dãy chứng dương ASFV pha loãng có (màu đỏ) và không có (màu xanh) ổ sung 20µl chứng nội tại trước khi tách chiết DNA khi đọc ở kênh màu Fam (B) Biểu đồ ên phải khuếch đại của dãy chứng dương ASFV pha loãng có ổ sung 20µl chứng nội tại trước khi tách chiết DNA khi đọc ở kênh màu Hex 61

Hình 3.4 (A) Biểu đồ ên trái khuếch đại các mẫu chứng dương có nồng độ 1 ản sao (màu đỏ) và 5 ản sao trong 200µl huyết thanh lợn (màu xanh), mỗi nồng độ được lặp lại 20 lần (B) Biểu đồ ên trái khuếch đại các mẫu chứng dương có nồng độ 25 ản sao (màu đỏ) và 50 ản sao trong 200µl huyết thanh lợn (màu xanh), mỗi nồng độ được lặp lại 20 lần 62

Hình 3.5 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn 3 dãy chứng dương có nồng độ 100 đến 107 ản trong 200µl huyết thanh lợn 63

Hình 3.6 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn dãy chứng dương có nồng độ 100 đến 107 ản trong 200µl huyết thanh lợn được khảo sát trong ngày 1 64

Hình 3.7 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn dãy chứng dương có nồng độ 100 đến

107 ản trong 200µl huyết thanh lợn được khảo sát trong ngày 2 64 Hình 3.8 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn dãy chứng dương có nồng độ 100 đến

107 ản trong 200µl huyết thanh lợn được khảo sát trong ngày 3 65 Hình 3.9 Biểu đồ khuếch đại 6 mẫu huyết thanh lợn lần lượt dương tính với PCV2,

PCV3, PRRSV, CSFV, FMDV, PEDV 66 Hình 3.10 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn 10 mẫu chứng dương ASFV dương

tính ở chu kỳ 26 Trong đó 5 mẫu được tách chiết DNA có ổ sung 10µl một ch t ức chế PCR (màu xanh) vào thể tích mẫu tách chiết trước khi tách chiết và 5 mẫu không cho thêm ch t ức chế PCR (màu đỏ) Các chuẩn định lượng (màu xanh lá) và chứng dương (màu vàng) 67 Hình 3.11 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn có nồng độ 102, 103 và 104 ản sao

trong 200µl huyết thanh lợn được khảo sát ngay sau khi pha chế 68 Hình 3.12 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn có nồng độ 102, 103 và 104 ản sao

trong 200µl huyết thanh lợn được khảo sát sau 3 tháng ảo quản 68 Hình 3.13 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn có nồng độ 102, 103 và 104 ản sao

trong 200µl huyết thanh lợn được khảo sát sau 6 tháng ảo quản 69 Hình 3.14 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn có nồng độ 102, 103 và 104 ản sao

trong 200µl huyết thanh lợn được khảo sát sau 9 tháng ảo quản 69 Hình 3.15 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn có nồng độ 102, 103 và 104 ản sao

trong 200µl huyết thanh lợn được khảo sát sau 12 tháng ảo quản 69 Hình 3.16 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn có nồng độ 102, 103 và 104 ản sao

trong 200µl huyết thanh lợn được khảo sát sau 15 tháng ảo quản 70 Hình 3.17 Cây phát sinh phân tử được xây dựng từ 13 mẫu dương tính với ASFV

được chọn ngẫu nhiên để giải trình tự xác định genotype (Hình tròn màu xanh) ằng phần mềm MEGA 7 sử dụng phương pháp Maximum

likelihood, kiểm tra độ lặp ằng oostrap 1000 78

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Thời gian tồn tại của ASFV trong điều kiện môi trường khác nhau [42] 16

Bảng 2.1 Thành phần nguyên liệu pha chế dung dịch PBS 1X 33

Bảng 2.2 Thành phần hoá ch t của ộ tách chiết ―BXN IVD NK DNARNAprep MAGBEAD kit‖ 33

Bảng 2.3 Thành phần thuốc thử của ―BXN IVD NK AGE kit‖ 34

Bảng 2.4 Danh sách các trang thiết ị sử dụng trong nghiên cứu 35

Bảng 2.5 Trình tự mồi và đoạn dò trong phản ứng định tính ASFV 36

Bảng 2.6 Hàm lượng các thành phần dùng pha chế cho 10 mix, 100 mix và 1000 mix ASFV TQPCR master mix 38

Bảng 2.7 Tóm tắt thành phần chi tiết của một giếng phản ứng trên các plate DW96 48

Bảng 2.8 Thông tin trình tự mồi được sử dụng trong phản ứng khuếch đại gen VP72 52

Bảng 2.9 Trình tự tham chiếu sử dụng trong đề tài 58

Bảng 3.1 Bảng ghi nhận kết quả dương tính và phần tr m dương tính của từng nồng độ chứng dương ở 20 lần lặp lại 63

Bảng 3.2 Kết quả phát hiện 3 dãy chứng dương có nồng độ 100 đến 107 ản trong 200µl huyết thanh lợn 64

Bảng 3.3 Kết quả phát hiện 3 dãy chứng dương có nồng độ 100 đến 107 ản trong 200µl huyết thanh lợn được khảo sát trong 3 ngày liên tiếp 65

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu phân tích trên 6 mẫu huyết thanh lợn lần lượt dương tính với PCV2, PCV3, PRRSV, CSFV, FMDV, PEDV 66

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá khả n ng chống ức chế ở 5 mẫu có và không có thêm ch t ức chế PCR 67

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ ổn định được thực hiện tại 6 thời điểm cách nhau 3 tháng 1 lần ở 3 102 , 103 và 104 ản sao trong 200µl huyết thanh lợn 70

Bảng 3.7 Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành của ệnh ASF 71Bảng 3.8 Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành trong khu vực của ệnh ASF trên các loại

mẫu ệnh phẩm như máu, nội tạng hoặc dịch cơ thể trực tiếp từ vật nuôi 71Bảng 3.9 Kết quả xác định sự hiện diện của ASFV trên nền mẫu trong môi trường

ch n nuôi 72Bảng 3 10 Kết quả xác định nguy cơ ệnh dịch giữa các trại quy mô vừ và nhỏ so

với trại nuôi quy mô lớn trên các mẫu ệnh phẩm 75Bảng 3 11 Kết quả xác định nguy cơ ệnh dịch giữa các trại quy mô vừ và nhỏ so

với trại nuôi quy mô lớn trên các mẫu kiểm soát môi trường 75Bảng 3 12 Kết quả xác định yếu tố nguy cơ lây nhiễm trên nền mẫu thức n, côn

trùng và chuột 76Bảng 3.13 Kết quả khảo sát các yếu tố nguy cơ mang mầm ệnh ASFV 79Bảng 3.14 Đọc và iện luận kết quả TQPCR master mix phát hiện ASFV 86

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ASF Bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African Swine Fever)

ASFV Vi rút dịch tả lợn Châu Phi (African Swine Fever Virus)

CI Khoảng tin cậy (Confidence Interval)

CPE Bệnh tích tế ào (Cytopathic pathogene effect)

CSF Bệnh dịch tả lợn cổ điển (Classical Swine Fever)

Ct Chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold)

CV Hệ số iến thiên (Coefficient of Variation)

DNA Axít deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid)

EC Ủy an châu Âu (European Commission)

EE Thể nội ào sớm (Early Endosome)

(The enzyme - linked immunosorbent assay)

FAO Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc

(Food and Agriculture Organization of the United Nations)

FAT Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (Fluorescent antibody test)

(Fluorescein isothiocyanate)

FMDV Bệnh lở mồm long móng (Foot and Mouth Disease)

HAD Phản ứng h p phụ hồng cầu (Haemadsorption reaction)

IB Lai miễn dịch (Immunoblotting)

IC Chứng nội tại (Internal control)

IFA Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

(Indirect fluorescent antibody test)

IPT Hoá mô miễn dịch xúc tác peroxidase

(Indirect immunoperoxidase test)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

MCP Major capsid protein

MGF Multigene family

Mpi Min post infection

MTOC Trung tâm tổ chức vi ống (Microtubules organizing centres)

NA Không phát hiện (Not applicable)

NCLDV Nhóm vi rút có DNA nhân và tế ào ch t lớn

(Nucleo-cytoplasmic large DNA viruses)

OIE Tổ chức Thú y Thế giới (Office International des Epizooties)

ORF Khung đọc mở (Open reading frame)

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PCV2 Hội chứng gây ra ởi vi rút Circo type 2 (Porcine Circovirus type 2)

PRRS Hội chứng rối loạn hô h p và sinh sản ở lợn

(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome)

RR Nguy cơ tương đối (relative risk)

SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

TIR Đoạn lặp lại nghịch đảo kết thúc (Tandem inverted repeat)

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Dịch tả lợn Châu Phi (ASF) là dịch ệnh nguy hiểm gây chết trên lợn, có sức tàn phá to lớn đối với nền kinh tế và an ninh thực phẩm, kể từ khi dịch tái ùng phát gần đây ở tỉnh Liêu Ninh, Trung Quốc vào tháng 8 n m 2018; dịch đã lan rộng ra toàn đ t nước và lây lan các quốc gia lân cận, 50% tổng đàn của toàn thế giới đã ị thiệt hại, ASF được OIE cảnh áo về dịch ệnh xuyên ên giới và có tác động toàn cầu Dịch tả lợn Châu Phi gây ra ởi vi rút ASFV lần đầu tiên được phát hiện ở Kenya vào n m 1921 [1], trong suốt giai đoạn đầu ệnh chỉ lưu hành ở Châu Phi

N m 2007 dịch ắt đầu lây lan ra khỏi Châu Phi xâm nhập vào vùng Kavkaz, tiêu iểu là Georgia vào n m 2014, nó đã lan đến lãnh thổ phía đông của Liên minh Châu Âu Sự phức tạp về mặt dịch tễ học của ASF đã được chứng minh rõ ràng ở miền đông và miền nam Châu Phi, nơi đặc điểm di truyền của ASFV dựa trên những iến đổi trình tự trong vùng kết thúc đầu C của gen B646L mã hóa protein capsid p72, cho th y sự hiện diện của 22 kiểu gen [2, 3]

Ở Việt Nam, ca nhiễm vi rút ASF lần đầu tiên được áo cáo vào tháng 2 n m 2019 Sau đó ệnh nhanh chóng lan rộng ra t t cả 63/63 tỉnh thành Hơn 6 triệu con lợn đã

ị tiêu huỷ ở các trại, gây ra thiệt hại lớn về kinh tế và nguồn cung thực phẩm Theo khuyến cáo tổ chức thú y thế giới (OIE), các kỹ thuật chẩn đoán ASFV trong phòng thí nghiệm được phân loại thành i) thử nghiệm vi rút học ao gồm phân lập kết hợp HAD, phát hiện hệ gen vi rút như PCR hay real – time PCR, … và ii) thử nghiệm huyết thanh học tiêu iểu là ELISA, lai miễn dịch (IB), lai huỳnh quang (IFA) Trong đó HAD được xem là ―tiêu chuẩn vàng‖ và là thử nghiệm khẳng định dương tính với ASFV, tuy nhiên điểm hạn chế của kỹ thuật là yêu cầu chuyên môn của nhân viên thực hiện, trang thiết ị và cơ sở đảm ảo an toàn sinh học động vật cũng như thời gian phát hiện đến hơn 2 tuần [4, 5] Cho đến nay vẫn chưa có vắc xin và thuốc điều trị ASF, trong khi các ác s thú y chưa thể phân iệt chính xác ệnh

dịch tả lợn Châu Phi (ASF) với ệnh dịch tả lợn cổ điển (CSF) thông qua th m khám các iểu hiện lâm sàng và mổ tử thi [6] Chính vì vậy, việc phát triển ộ xét nghiệm sử dụng kỹ thuật real-time PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện sớm ệnh được xem là công cụ chính hỗ trợ trong nhiệm vụ phòng chống dịch của quốc gia

Từ các v n đề trên, tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện

bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) trên đa dạng các nền mẫu sử dụng kỹ thuật real-time PCR”

2 Mục tiêu nghiên cứu

 Hoàn thiện quy trình phát hiện ASFV có khả n ng triển khai trong xét nghiệm thường quy

 Xác định mức độ lưu hành của dịch ệnh trong khu vực từ các mẫu thử là dịch

cơ thể của vật nuôi hay các đối tượng mẫu thử là môi trường ch n nuôi

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng mẫu:

 Cặp mồi và đoạn dò, hoá ch t real-time PCR

 Khảo sát tình hình dịch ệnh: tổng cộng thu nhận 6665 mẫu máu, nội tạng hoặc dịch cơ thể trực tiếp từ lợn nuôi được thu thập tại Phòng xét nghiệm thuộc Công

ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa

 Khảo sát tình hình vi rút tồn tại trong môi trường ch n nuôi: tổng cộng thu nhận

1068 mẫu kiểm soát môi trường, nước, ề mặt chuồng trại, đ t và mẫu véc-tơ trung gian truyền ệnh (ruồi, chuột, muỗi) được thu thập tại Phòng xét nghiệm thuộc Công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa

Thời gian thực hiện đề tài: từ 09/2019 đến 03/2022

Địa điểm nghiên cứu: Phòng xét nghiệm thuộc Công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

4.1 Hoàn thiện real-time PCR mix phát hiện ASFV

 Kiểm tra các thiết kế primer – pro e được OIE khuyến cáo in silico

 Tổng hợp hoá học trình tự primer – pro e phát hiện ASFV

 Tổng hợp hoá học trình tự primer – pro e cho chứng nội tại ổ sung vào phản ứng real-time PCR

 Giới hạn phát hiện (LOD)

 Thu nhận DNA tổng số từ mẫu thử

 Thực hiện phản ứng real – time PCR định tính ASFV

 Thống kê tỷ lệ dương tính trong quần thể

4.3 Xác định yếu tố nguy cơ lây nhiễm trên nền mẫu môi trường, bề mặt

 Xử lý mẫu tiền ly trích

 Thu nhận DNA tổng số từ mẫu thử

 Thực hiện phản ứng real – time PCR định tính ASFV

 Thống kê tỷ lệ dương tính trên các yếu tố nguy cơ và môi trường ch n nuôi

4.4 Xác định genotype ASFV

 Khuếch đại trình tự 478 p trên vùng ảo tồn của gen mã hoá VP72

 Giải trình tự gen ảo tồn được khuếch đại

4.5 Xây dựng quy trình kiểm soát yếu tố nguy cơ

 Mô tả các đối tượng liên quan đến quá trình nuôi nhốt trong chuỗi thực hành cần yêu cầu tầm soát ASFV

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

 Hình thành real – time PCR mix ở dạng ―ready – to – use‖ phục vụ xét nghiệm thường quy

 Xác định tỷ lệ lưu hành của vi rút nhằm cung c p thông tin về dịch tễ, đặc điểm quần thể lợn được nuôi

 Xác định các nguy cơ lây nhiễm thực tế từ các yếu tố trung gian tiềm ẩn từ đó khuyến cáo hộ ch n nuôi trong thực hành an toàn sinh học phù hợp

 Xác định genotype ASFV lưu hành chủ yếu ở miền Đông Nam Bộ Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 African Swine Fever Virus (ASFV)

Bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) là một ệnh xu t huyết do vi rút gây ra với khả

n ng gây chết đặc iệt cao ở lợn nhà và lợn rừng Âu Á Mặc dù phạm vi ký chủ hạn chế và không có tiềm n ng lây nhiễm từ động vật sang người, tác động kinh tế xã hội của ệnh là r t lớn Cũng chính vì lý do này, Dịch tả lợn Châu Phi đã được Tổ chức Thú Y Thế giới (OIE) cảnh áo toàn cầu Trong hầu hết các trường hợp, ệnh ảnh hưởng đến lợn nuôi, vật chủ hoang dã như là lợn rừng hoặc lợn hoang khác; vi rút gây ệnh có khả n ng tồn lưu trên các yếu tố trung gian truyền ệnh (ví dụ: xác lợn, môi trường xung quanh ị ô nhiễm, dụng cụ, các véc-tơ cơ học khác) và các véc-tơ động vật chân đốt (ve mềm) Điều đáng ngại là các iện pháp kiểm soát chủ yếu dựa vào các iện pháp vệ sinh nghiêm ngặt do hiện tại không có vắc xin phòng ệnh hoặc t kỳ phương pháp điều trị nào

1.1.1 Phân loài ASFV

Tác nhân gây ệnh ASF là vi rút dịch tả lợn Châu Phi (ASFV), một loại vi rút có

vật liệu di truyền là DNA sợi kép kích thước lớn thuộc chi Asfivirus trong họ

Asfarviridae [7] Theo công ố phân loại n m 2019 của Ủy an quốc tế về phân loại

vi rút (EC 51, Berlin, Đức, tháng 7 n m 2019), họ Asfarviridae đã được đưa vào ộ

Asfuvirales và lớp Pokkesviricetes Ngoài danh pháp chính thức này, có một số

tranh cãi khi ASFV hiện cũng được đưa vào một ộ dự kiến Megavirales chứa đơn

nhánh gồm nhóm vi rút có DNA nhân và tế ào ch t lớn (NCLDV) [8] Bộ dự kiến

này cũng sẽ ao gồm Poxviridae (hiện thuộc ộ mới của Chitovirales), Iridoviridae (hiện thuộc thứ tự Pimascovirales), Asfarviridae, Phycodnaviridae (hiện thuộc ộ

Algavirales), Mimiviridae (thuộc ộ Imitervirales), Ascoviridae (hiện nay là Marseilleviridae (nay là Pimascovirales) [9] Do liên tục phát hiện ra các loại vi rút

kích thước ―khổng lồ‖ mới như Pandoravirus [10, 11], Faustovirus [12], Mollivirus [13], Kaumaoebavirus [14], Cedratvirus [15], và Pacmanvirus [15], nhóm này có

thể sẽ phát triển trong tương lai gần và danh pháp sẽ vẫn đang được thảo luận để hoàn thiện

1.1.2 Cấu trúc ASFV

1.1.2.1 Hình thể và cấu trúc phân tử của ASFV

Phân tử vi rút ASF có c u trúc r t phức tạp với đường kính tổng thể là 175–215 nm Cho đến nay, người ta đã ghi nhận rằng phân tử vi rút ao gồm một lõi nucleoprotein (đường kính 70-100 nm), lõi được ao quanh ởi một lớp màng trong lipid, một capsid hình tứ diện với 1892–2172 capsomers và một vỏ ngoài lipid [7] Kết quả phân tích a chiều phân tử vi rút trưởng thành ằng cryo-EM đơn hạt cho

th y virion có đường kính xuyên tâm là ∼2.080 Å, một nucleoid chứa ộ gen được

ao quanh ởi hai capsid protein hình tứ diện và hai màng lipoprotein Capsid ên ngoài tạo thành một mạng lục giác (T = 277) ao gồm 8.280 tiểu đơn vị của protein capsid chính là p72 dạng cuộn kép (MCP), được sắp xếp thành các ộ a tạo thành hình thái lục giác giả với 60 protein penton ở các đỉnh (Hình 1.1)[8] Lớp protein

ên trong, được tổ chức như một capsid T = 19, ao ọc lớp vỏ lõi được tạo thành

từ các sản phẩm polyprotein ASFV pp220 và pp62 Hơn nữa, có một màng tứ diện nằm giữa hai lớp protein, trong khi một lớp vỏ đa hình ao ọc ên ngoài toàn ộ capsid C u tạo c p cao này tạo nên một kiến trúc độc đáo cho ASFV giữa các NCLDV, điều này phần nào phản ánh sự phức tạp trong quá trình lây nhiễm của vi rút và có thể giúp giải thích những thách thức hiện tại trong việc kiểm soát nó

Hình 1.1 C u trúc tổng thể ASFV A, ảnh chụp cryo của phân tử vi rút B, hình ảnh giả lập ề mặt vi rút C, hình ảnh giả lập cắt lớp nửa dưới vi rút cùng mô phỏng tái tạo ảng đồ 3D các thành phần c u trúc D, giản đồ vị trí sắp xếp các lớp của vi rút

ASFV [8]

1.1.2.2 Cấu trúc hệ gen của ASFV

Bộ gen ASFV ao gồm một phân tử DNA sợi kép 170–190 k p chứa từ 151 đến

167 khung đọc mở (ORF), tùy thuộc vào chủng vi rút [16] Các đầu kết thúc của ộ gen hình thành c u trúc kẹp tóc (hairpin loops) tạo ởi việc lặp lại các trình tự đảo ngược [17] Bộ gen mã hóa nhiều protein tham gia vào quá trình lắp ráp vi rút, sao chép và sửa chữa DNA Đặc iệt, các protein liên quan đến quá trình lẫn tránh miễn dịch, ví dụ can thiệp vào interferon loại I và con đường chết tế ào, cũng được mã hoá [18] Khoảng một nửa số gen ASFV vẫn chưa có ghi nhận hay dự đoán về chức

n ng [19]

Cho đến hiện nay, trình tự hoàn chỉnh của 12 chủng ASFV đã được xác định [20, 21] Trình tự toàn ộ hệ gen đầu tiên được ghi nhận là của dòng tế ào nuôi c y BA71V, các gen sau đó được đặt tên dựa trên sự phân mảnh khi sử dụng enzym giới hạn EcoR I, hướng gen sang trái hoặc phải (L hoặc R) và số lượng axit amin được

mã hóa của gen đó Do sự khác iệt lớn về số lượng ản sao của các gen từ các họ

đa gen khác nhau giữa các dòng phân lập đã gây ra nhầm lẫn, gần đây người ta đã

đề xu t một danh pháp dựa trên danh pháp từ chủng phân lập BA71V cho các gen duy nh t và đặt tên các gen trong mỗi họ đa gen theo họ của chúng và vị trí từ vùng kết thúc bên trái [20] Các họ gen được mã hóa được đặt tên theo số lượng axit amin trung ình trong các protein được mã hóa ởi mỗi họ, hướng đọc và vị trí của chúng trong họ đó từ đầu ên trái của ộ gen Các họ ao gồm MGF 100, 110, 300, 360 và 505/530

Các gen được mã hóa ởi ộ gen nằm gần nhau và được mã hóa trên cả hai sợi DNA mà không có sự sai lệch rõ ràng cho việc mã hóa các gen trên một trong hai sợi trên toàn ộ ộ gen hoàn chỉnh Tuy nhiên, ở một số vùng gen, chiều hướng của các gen lân cận là giống nhau (Hình 1.2) tiêu iểu là vùng mã hóa MGF được cho là tiếp tục xúc tác quá trình sao chép gen Cũng giống như các loại vi rút được phiên

mã trong tế ào ch t, các gen ASFV không chứa các intron và sự cắt nối các trình tự phiên mã không xảy ra Thượng nguồn của mỗi gen là một chuỗi ngắn có chứa promoter được nhận iết ởi phức hợp RNA polymerase của vi rút Các trình tự promoter ngắn, giàu A + T và chúng được nhận iết ởi các yếu tố phiên mã đặc hiệu vi rút đặc trưng cho các giai đoạn iểu hiện gen khác nhau của vi rút; các nhóm gen sớm, gen trung gian và gen muộn đã được xác định Chúng được iểu hiện trong một chu trình với các gen iểu hiện sớm xảy ra từ các lõi ằng cách sử dụng các enzym và các yếu tố khác được đóng gói trong các hạt vi rút [22, 23] Một số gen được phiên mã thuộc các họ đa gen, quá trình phiên mã này ắt đầu từ các vị trí liên quan codon khởi đầu [23] Quá trình lập ản đồ các acid amin quan trọng trong promoter muộn cho gen B646L mã hóa protein capsid chính p72 cho th y vùng chức n ng của promoter nằm trong khoảng -56 và +5 so với codon khởi đầu dịch

mã Hai vùng quan trọng tại −18 đến −14 và −4 đến +2 đã đƣợc xác định Tín hiệu kết thúc phiên mã ao gồm một chuỗi ít nh t 7T đôi khi đạt 10T [22] Chúng có thể đƣợc tìm th y ở một khoảng cách đáng kể (lên đến vài k p) từ codon kết thúc dịch

mã và do đó, các ản sao có thể mở rộng qua các ORF hạ nguồn

Các trình tự kết thúc của ộ gen đƣợc liên kết cộng hóa trị chéo và hiện diện ở hai dạng nghịch đảo và ổ sung cho nhau tạo thành các vòng kẹp tóc Trình tự các vòng kẹp tóc này ở dòng phân lập BA71V đƣợc chứng minh là dài 37 nucleotide và ắt cặp azơ không hoàn toàn để tạo ra azơ ngoại lai [24] Liền kề với các c u trúc kẹp tóc này là các đoạn đảo ngƣợc chứa một số trình tự lặp lại song đôi Trong BA71V, các đoạn lặp lại nghịch đảo kết thúc (TIR) dài khoảng 2,1 k p và ao gồm a kiểu khác nhau là đoạn lặp lại trực tiếp song đôi và hai loại lặp lại trực tiếp Chúng xen

kẽ với các trình tự riêng iệt [25] Ở các dòng phân lập khác nhau trình tự và số lần lặp lại là khá đa dạng

Hình 1.2 Tổ chức hệ gen của ASFV Sự sắp xếp các ORF trên hệ gen đƣợc mô tả

theo chủng phân lập Georgia 2007/1 [16]

1.1.3 Quá trình xâm nhiễm của ASFV

Chu trình lây nhiễm ASFV ắt đầu với sự h p thụ của vi rút lên thụ thể và xâm nhập vào tế ào chủ Các nghiên cứu an đầu về sự xâm nhập của ASFV đã mô tả

sự kiện này là một quá trình diễn ra trên nền tảng nhiệt độ và pH th p, phù hợp với môi trường nội ào trong thể trung gian nhập ào (endosome) ở tế ào Vero và đại thực ào lợn [26, 27] Có nhiều thông tin liên quan cơ chế xâm nhập của vi rút phụ thuộc vào thụ thể, chẳng hạn như quá trình nhập bào phụ thuộc vào động lực học qua trung gian clathrin [28], cũng có ằng chứng cho th y ASFV khai thác các cơ chế khác, chẳng hạn như thực ào [29] và ẩm ào [30] Ngoài ra, cholesterol là cần thiết để nhập ào thành công Các cơ chế này xảy ra cả trong tế ào đích đại thực

ào và tế ào Vero

Quá trình xâm nhiễm ASFV theo các con đường xâm nhập khác nhau đều thông qua cơ chế nhập bào [31] Một khi vi rút đã xâm nhập qua con đường nhập ào, nó phải đi qua nhóm các thể endosome khác nhau để lây nhiễm thành công (Hình 1.3)

Sự hoàn thiện theo con đường nội ào được sắp xếp cẩn thận ởi các protein và lipid được huy động đến màng của thể nhập ào Họ protein Ra GTPase là nhóm điều hoà chủ đạo của con đường trưởng thành nội bào, nơi mỗi thành viên của họ

Ra được định vị cụ thể đến một ng n khác nhau của thể nhập bào [32] Các vi rút xâm nhập mới dễ dàng quan sát trong các thể nội ào sớm (EE) được đánh d u ằng các chỉ thị Rab5 và EEA1 chỉ ít phút sau khi h p phụ Trên thực tế, các virion được

ao ọc hoàn chỉnh chỉ được tìm th y ở mức EE mà không được tìm th y trong các

ng n trưởng thành khác Việc ức chế axit hóa thể nội bào ằng afilomycin A1

ng n chặn sự phân rã của vi rút và chỉ trong điều kiện này, người ta mới có thể quan sát được vi rút hoàn chỉnh ên trong các thể nội ào hiện diện CD63 cũng như các thể nội ào muộn có sự iểu hiện của Rab7 Trong điều kiện ình thường, các thể nội ào muộn chỉ chứa các lõi vi rút mà thiếu protein capsid do quá trình tháo vỏ trong thể endosome [31]

Vỏ capsid của vi rút được loại ỏ ở điều kiện pH có tính axit trong các thể nội ào

được loại ỏ, các hạt vi rút lộ ra lớp vỏ ên trong cho phép chúng tương tác và dung hợp màng vi rút này với màng của thể nội ào và lõi vi rút có thể được giải phóng vào ào tương để ắt đầu sao chép Quá trình này phụ thuộc r t nhiều vào dòng chảy cholesterol ở trong màng thể nội ào Trên thực tế, việc ng n chặn sự vận chuyển cholesterol ở mức độ này có thể giữ lại các virion ên trong các ống thể nội

ào từ đó ức chế sự tiến triển của quá trình nhiễm trùng [33] Protein pE248R hiện diện ở vỏ trong vi rút cũng tham gia vào quá trình dung hợp vi rút Protein này có

sự tương đồng về trình tự với phức hợp dung hợp/xâm nhập của các chủng poxviral [34]

Các virion ASFV sẽ di chuyển đến vị trí sao chép của chúng trong vùng ngoại nhân gần với trung tâm tổ chức vi ống (MTOC) [35] Các gen mã hoá sớm ngay lập tức được iểu hiện trước khi ắt đầu sao chép DNA Cả hai chuỗi DNA đều có thể được

sử dụng làm chuỗi mã hóa Điều này xảy ra dựa trên hoạt động của một số enzym liên quan vào quá trình phiên mã được đóng gói trong lõi vi rút Sau quá trình nhân đôi DNA, quá trình phiên mã của các gen trung gian và gen muộn ắt đầu ASFV sử dụng khoảng 20% ộ gen của nó mã hóa các gen liên quan đến quá trình phiên mã

và sửa đổi mRNA Bộ máy phiên mã này mang lại cho ASFV một sự độc lập tương đối với vật chủ và kiểm soát chính xác vị trí cũng như thời gian đối với iểu hiện các gen của nó [36] Nhân tế ào chủ đóng vai trò trong việc cung c p các ản dịch

mã nhỏ hoặc các yếu tố khác cần thiết cho sự ắt đầu của quá trình nhân lên hay là nơi diễn ra giai đoạn sớm của quá trình sao chép DNA vi rút [37] Các vi ống cần thiết cho việc vận chuyển vi rút đến vùng ngoại nhân, nơi diễn ra quá trình sao chép Tính toàn vẹn của các vi ống là cần thiết để định hình các nhà máy sản xu t vi rút [38] và các phần tử vi rút cũng được tìm th y liên kết với các vi ống khi xâm nhập Protein c u trúc p54 tương tác với protein động cơ dynein của tế ào trong quá trình xâm nhiễm vi rút và có thể tạo thành cơ chế phân tử cho sự vận chuyển vi rút qua trung gian vi ống [35] Các nhà máy sản xu t vi rút, khu trú trong tế ào ch t gần với nhân, có thể được mô tả như một vùng ngoại nhân lớn nằm đơn lẻ tại trung tâm tổ chức vi ống Trên vị trí này, các protein và DNA của vi rút được tích lũy và

các virion mới tổng hợp được lắp ráp Một cái lồng làm ằng sợi trung gian vimentin ao quanh nhà máy sản xu t vi rút có khả n ng ng n cản sự điều hướng của các thành phần vi rút vào tế ào ch t và tập trung các protein c u trúc tại các vị trí lắp ráp [39] Vị trí chuyên iệt này tại MTOC, chứa DNA của vi rút, hầu hết các protein của vi rút, các virion chưa trưởng thành và trưởng thành, cũng như các màng

do vi rút sản xu t Các nhà máy sản xu t vi rút có chứa các tiền ch t phát triển thành các ch t trung gian hình tứ diện ằng cách lắp ráp capsid hình tứ diện và miền vỏ lõi Bước cuối cùng của quá trình hình thành virion sẽ là quá trình đóng gói DNA để tạo ra các virion trưởng thành Cuối cùng, vi rút mới được hình thành rời khỏi nhà máy và được vận chuyển đến ề mặt tế ào ằng kinesin, nơi nó được giải phóng ằng cách nảy chồi Vi rút ngoại ào được ao phủ ởi một lớp ao ên ngoài được thu nhận trong quá trình nảy chồi [32]

Hình 1.3 Quá trình xâm nhập và nhân lên của ASFV trong tế ào [7]

1.2 Các con đường lây nhiễm của ASFV

Vi rút ASF tồn tại theo các chu trình riêng iệt - theo truyền thống là chu trình hoang dại, chu trình ve – lợn và chu trình lợn nuôi (lợn-lợn) Gần đây hơn, một chu

kỳ của lợn rừng đã được mô tả, liên quan đến chu trình mới tiến triển sau này Chu trình hoang dại chỉ xảy ra ở các vùng của Châu Phi và liên quan đến các loài lợn

hoang và ve mềm thuộc quần thể Ornithodoros moubata Chu kỳ ve mềm - lợn liên quan đến lợn nuôi và ve mềm Ornithodoros spp., đã được mô tả là xâm nhập vào

các vùng của Châu Phi và án đảo I eria Sự lây truyền từ chu trình hoang dại (lợn hoang dã Châu Phi) sang chu kỳ nuôi (lợn nuôi) xảy ra thông qua lây truyền gián tiếp ởi ve mềm Điều này có thể xảy ra khi lợn hoang và lợn nuôi có chung khu vực sinh sống, đặc iệt là khi lợn hoang xâm nhập vào các trang trại, hoặc khi ve mềm được mang về làng thông qua xác của lợn hoang ị giết để làm thức n

1.2.1 Chu trình lây nhiễm hoang dại

Chu kỳ này liên quan đến các vật chủ tự nhiên của ASFV là lợn hoang và ve mềm

của nhóm Orni- thodoros moubata, chúng hoạt động như véc-tơ sinh học trung gian

ở Nam và Đông Phi Tuy nhiên, thông tin lại r t khan hiếm đối với các khu vực Châu Phi khác ASFV được duy trì ằng cách truyền từ ve mềm sang lợn hoang

(Hình 1.4) Lợn hoang ị nhiễm ASF khi ị Ornithodoros cắn trong 6-8 tuần đầu

tiên của cuộc đời, khi còn ở trong hang Sau một thời gian ngắn khi vi rút có trong máu của chúng (2-3 tuần), lợn hoang non sẽ hồi phục, không có d u hiệu lâm sàng

Ở các khu vực lưu hành, có tới 100% số lợn hoang có thể có kháng thể với ASFV Các quần thể ve mềm có thể vẫn mang vi rút và lây nhiễm trong thời gian dài vì vi rút có thể ký sinh ngay cả khi không có vật chủ gây ệnh Ve mang mầm ệnh đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì nguồn ệnh, chúng có thể sống hàng tháng trong hang và đến vài n m sau khi cắn vật chủ ị nhiễm ệnh

Hình 1.4 Sơ đồ mô tả a chu trình lây nhiễm ASFV

1.2.2 Chu trình lây nhiễm ve – lợn

Ở án đảo I eria, ASFV dễ dàng tìm th y vật chủ thích hợp ở Ornithodoros

erraticus, loài ve địa phương sống trong các chuồng lợn Ve mềm đã tham gia vào

việc duy trì ASFV và lây truyền sang lợn, mặc dù không có vật chủ tự nhiên là lợn rừng Châu Phi Chu trình này cũng đã được mô tả ở một số vùng của Châu Phi, nơi

nó được ghi nhận nhiều là Malawi, Madagascar và Mozam ique, mặc dù ve mềm

có thể không đóng một vai trò nổi ật trong việc truyền vi rút trong quần thể lợn

[40, 41] Một số loài ve Ornithodoros đã được chứng minh là vật trung gian truyền ệnh ASFV trên thực địa và thực nghiệm Để ve mềm Ornithodoros trở thành vật

trung gian trong điều kiện trang trại, chúng cần lợn làm vật chủ, do đó khả n ng lây truyền tự nhiên sẽ ị hạn chế N ng lực véc-tơ cũng có thể r t khác nhau ở các loài hoặc các nhóm loài có quan hệ họ hàng gần, tùy theo các đặc điểm quần thể riêng

iệt Mặc dù ve Ornithodoros đã được áo cáo ở các khu vực hiện đang ị nhiễm ở

vùng Caucasus và các vùng phía nam của Đông Âu, không có d u hiệu nào cho th y chúng tham gia vào chu kỳ dịch ASF

1.2.3 Chu trình lây nhiễm lợn nuôi

Trong chu trình này, trường hợp được áo cáo phổ iến nh t ở lợn nhà, vi rút được duy trì ở lợn khi không có ve và ọ chét hoang dã Vi rút có thể lây lan qua tiếp xúc trực tiếp qua đường mũi họng sau khi tiếp xúc với ch t ài tiết của lợn ị nhiễm ệnh, qua việc n thịt lợn hoặc các sản phẩm khác nhau có chứa ASFV hoặc gián tiếp qua ề mặt trung gian Vi rút được truyền từ trang trại này sang trang trại khác hầu như chỉ do sự can thiệp của con người, ví dụ: sự di dời động vật hoặc thiết ị, cho n các vật liệu ị nhiễm ệnh, v.v Con đường truyền ệnh này đòi hỏi sự tồn tại của những quần thể lợn lớn và liên tục để vi rút vẫn lưu hành Tuy nhiên, ngay

cả trong trường hợp không có lợn ị nhiễm ệnh, đôi khi sự tồn tại của vi rút trong thịt lạnh hoặc đông lạnh cho phép vi rút tồn tại trong thời gian dài và xu t hiện trở lại sau khi những sản phẩm thịt đó được sử dụng làm thức n ch n nuôi

1.2.4 Khả năng tồn tại của vi rút ASF

Thời kỳ ủ ệnh iểu thị thời gian từ khi nhiễm ệnh (khi vi rút xâm nhập vào động vật) đến khi ị ệnh (khi động vật có d u hiệu lâm sàng) Đối với ASF, thời gian này là từ 4 đến 19 ngày, tùy thuộc vào vi rút, vật chủ và đường truyền Quá trình đào thải vi rút có thể ắt đầu hai ngày trước khi xu t hiện các d u hiệu lâm sàng Giai đoạn lợn ài tiết vi rút có thể thay đổi tùy thuộc vào độc lực của chủng ASFV - lợn ị nhiễm các chủng ASFV độc lực th p có thể lây nhiễm dai dẳng trong hơn 70 ngày sau khi nhiễm Vi rút này được tiết ra trong nước ọt, nước mắt, ch t tiết mũi, nước tiểu, phân và ch t tiết từ đường sinh dục Đặc iệt, máu có chứa một tải lượng lớn vi rút Do đó, lợn khoẻ mạnh có thể ị nhiễm ệnh khi tiếp xúc với nhiều nguồn ệnh khác nhau, chủ yếu là lợn ị nhiễm ệnh, thịt lợn và các sản phẩm khác có nguồn gốc từ lợn (ví dụ: phân chuồng), và các ề mặt trung gian (ví dụ như sàn chuồng) có mang mầm ệnh Những con vật ị nhiễm ệnh và vật liệu mang mầm ệnh có thể được phát tán trên một quãng đường dài ằng phương tiện vận chuyển

và con người

Bảng 1.1 Thời gian tồn tại của ASFV trong điều kiện môi trường khác nhau [42]

Mặc dù ASF có tỷ lệ gây chết cao (hầu hết các động vật ị nhiễm ệnh đều chết), nó lại không gây nguy hiểm như một số ệnh động vật xuyên iên giới và có thể lây chéo loài khác như ệnh lở mồm long móng Trong một môi trường thích hợp, giàu protein, ASFV ổn định với phạm vi nhiệt độ và độ pH rộng trong thời gian dài, cũng như khả n ng chống lại tự phân rã và các ch t khử trùng khác nhau Do đó, quá trình thối rữa, quá trình làm chín, cũng như đông lạnh của thịt không làm m t hoạt tính lây nhiễm của tác nhân Thêm nữa vi rút tồn tại trong ch t ài tiết, thịt xác, thịt tươi và một số sản phẩm thịt trong những khoảng thời gian khác nhau Nó có thể giữ khả n ng gây nhiễm ít nh t 11 ngày trong phân, 15 tuần trong thịt ướp lạnh (và có thể lâu hơn trong thịt đông lạnh) và nhiều tháng trong tủy xương hoặc d m ông và xúc xích đã được xử lý ngoại trừ trường hợp chúng đã được n u chín hoặc hun khói ở nhiệt độ cao Điều này có ý ngh a r t quan trọng đối với sự lây lan của ASF Thịt lợn hun khói, s y khô và ướp muối chưa chín kỹ, chưa được n u chín kỹ, cũng như máu, xác thịt và ột thịt có chứ mầm ệnh có thể gây ệnh cho lợn nếu cho lợn n hoặc ị vứt ỏ ở các ãi rác thải của cộng đồng nơi lợn hoặc lợn rừng có thể cho n N u ở 70°C trong 30 phút sẽ khử hoạt tính của vi rút

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến việc phát tán vi rút gây hại Trong ch n nuôi việc đưa lợn mới vào một đàn hoặc chuồng nuôi thường dẫn đến việc các cá thể cắn nhau và lây truyền vi rút Một số trường hợp động vật được thả rông hoặc đi tìm thức n trong các khu rác thải, việc lây nhiễm có thể diễn ra do tiếp xúc giữa các cá thể thả rông ị nhiễm ệnh hay tiếp xúc với lợn rừng, xác của chúng hoặc n phải thức n thừa mang mầm ệnh Ngoài ra, trong công tác ch m sóc vật nuôi việc sử dụng cùng một kim tiêm để tiêm phòng hoặc điều trị cho nhiều con lợn có thể truyền vi rút Sự lây truyền qua thụ tinh nhân tạo chưa được chứng minh, nhưng có thể xảy ra

1.3 Diễn biến lâm sàng của bệnh ASF

Bệnh có diễn iến chung quan trọng là lợn chết đột ngột Biểu hiện gây chết diễn ra

ở mọi lứa tuổi và giới tính của lợn Những con được nuôi riêng hoặc cách ly với đàn

có thể giảm nguy cơ lây nhiễm do quá trình tiếp xúc được giảm thiểu Sự lây lan của dịch ệnh trong đàn (và số lượng ị ảnh hưởng) cũng có thể thay đổi r t nhiều

từ vài ngày đến vài tuần, tùy thuộc vào loại hình ch n nuôi lợn, quản lý và các iện pháp an toàn sinh học Trên thực tế, ASF, mặc dù gây chết vật nuôi cao, nhưng ít lây nhiễm hơn một số ệnh động vật gây nhiễm chéo khác như ệnh lở mồm long móng Ngoài ra, một số giống lợn ản địa ở Châu Phi đã phát triển một số mức độ chống chịu với ASF Các d u hiệu lâm sàng liên quan đến nhiễm ASFV có thể r t khác iệt, tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau: độc lực của vi rút, giống lợn ị ảnh hưởng, đường phơi nhiễm, liều lây nhiễm và tình trạng lưu hành trong khu vực Theo độc lực của chúng, ASFV được phân thành a nhóm chính: chủng độc lực cao, chủng độc lực trung ình và chủng độc lực th p Các dạng lâm sàng của ASF

ao gồm từ c p tính (hoặc nguy c p) đến không có triệu chứng (hoặc không rõ ràng) Như mô tả trong Hình 1.5, các chủng ASFV độc lực cao tạo ra thể nguy c p

và c p tính, các chủng vi rút độc lực trung ình tạo ra các dạng ệnh c p tính và á

c p tính Các chủng phân lập độc lực th p cho th y các triệu chứng nhẹ hơn và đôi iểu hiện ở thể á c p hoặc mãn tính Tỷ lệ mắc ệnh (tức là tỷ lệ động vật ị ảnh hưởng) sẽ phụ thuộc vào chủng vi rút và đường phơi nhiễm

Mặc dù không thể xác định chính xác, nhưng thời gian ủ ệnh trong các ca lây nhiễm tự nhiên đã được áo cáo là thay đổi từ 4 đến 19 ngày Các diễn iến lâm sàng của ệnh cũng iểu hiện từ dưới ảy ngày sau khi nhiễm ở dạng c p tính, đến vài tuần, hoặc thậm chí vài tháng ở dạng mãn tính Tỷ lệ gây chết phụ thuộc vào độc lực của chủng phân lập, có thể lên đến 100% cho các chủng có độc lực cao, ảnh hưởng đến toàn ộ các giai đoạn phát triển của lợn đến dưới 20% ở dạng mãn tính Trong quá trình lưu hành ệnh có thể gây tử vong chủ yếu ở lợn nái, lợn nọc và lợn thịt, lợn mắc có thể ị ội nhiễm tác nhân cơ hội khác Tỷ lệ sống sót đối với các chủng có độc lực cao được quan sát th y ở một số khu vực có dịch lưu hành có thể cao hơn do sự thích nghi của lợn với vi rút

Hình 1.5 Một số thể lâm sàng của ASFV dựa trên tải lượng vi rút

1.3.1 Quá cấp

Đặc trưng ởi sốt cao (41 – 42°C), chán n và lơ mơ, kém vận động Đột tử có thể xảy ra trong vòng 1-3 ngày trước khi xu t hiện t kỳ d u hiệu lâm sàng nào Thông thường, các d u hiệu lâm sàng cũng như tổn thương ở các cơ quan ở thể này đều không rõ ràng

1.3.2 Cấp tính

Sau thời gian ủ ệnh từ 4 – 7 ngày (hiếm khi lên đến 14 ngày), lợn nhiễm ASF ở thể

c p tính iểu hiện sốt 40 – 42°C và chán n; uể oải và mỏi mệt, nằm ủ rủ và co ro

và cường độ hô h p t ng Tử vong thường xảy ra trong vòng 6 – 9 ngày đối với các chủng có độc lực cao, hoặc 11 – 15 ngày đối với các chủng có độc lực trung ình

Tỷ lệ chết thường lên tới 90 – 100% ở lợn nuôi Các d u hiệu tương tự cũng được ghi nhận ở lợn rừng và lợn hoang Các dạng c p tính dễ ị nhầm lẫn với các ệnh

khác như ệnh dich tả lợn cổ điển, ngộ độc, nhiễm khuẩn Salmonella và các ệnh

nhiễm trùng huyết khác Lợn nhiễm ệnh có thể có một hoặc một số d u hiệu lâm sàng sau đây với tỷ lệ phần tr m thay đổi:

 Các vùng màu tím xanh và xu t huyết (giống đốm hoặc kéo dài) trên tai, ụng

và / hoặc chân sau;

 Chảy dịch mắt và mũi;

 Đỏ vùng da ở ngực, ụng, đáy chậu, đuôi và chân;

 Táo ón hoặc tiêu chảy, có thể tiến triển từ ch t nhầy thành máu (melena);

 Nôn mửa;

 Sẩy thai lợn ở lợn nái trong t t cả các giai đoạn;

 Bọt máu từ mũi / miệng và chảy nước mắt;

 Khu vực xung quanh đuôi có thể ị dính phân đẫm máu

Sự thay đổi màu sắc và xu t huyết trên da r t dễ ị ỏ sót ở lợn rừng do da sẫm màu hơn và lông dày Điều tương tự đối với các giống lợn da tối màu

Đối lợn chết trong giai đoạn c p tính của ệnh, cơ thể có thể vẫn chưa có iến đổi, nội tạng chưa tổn thương nghiêm trọng, mặc dù có thể quan sát th y các d u hiệu lâm sàng ên ngoài Các d u hiệu khi giải phẫu dễ nhận iết nh t là: các hạch ạch huyết to ra, phù nề và xu t huyết hoàn toàn tương tự như các cục máu đông; lá lách

to ra, ở và có màu đỏ sẫm đến đen ở các cạnh của lách; và xu t huyết điểm trên thận Xu t huyết dưới da; tràn dịch ở tim và xoang cơ thể; xu t huyết điểm ở ề mặt tim; àng quang tiết niệu và thận; phổi xung huyết và xu t huyết điểm, có ọt ở khí quản và phế quản, phù phổi kẽ; xu t huyết điểm trong dạ dày và ruột non và ruột già; tắc nghẽn gan và xu t huyết trong túi mật

1.3.3 Á cấp

Các dạng á c p của ệnh do các chủng phân lập có độc lực trung bình gây ra và có thể diễn ra ở các vùng đang lưu hành dịch Lợn thường chết trong vòng 7-20 ngày, với tỷ lệ chết từ 30 đến 70% Những con sống sót có thể hồi phục sau một tháng Các d u hiệu lâm sàng tương tự (mặc dù thường ít dữ dội hơn) với những d u hiệu

quan sát được ở dạng c p tính, ngoại trừ iểu hiện không quá rõ nét về xu t huyết

và phù thủng Các triệu chứng thường gặp là sốt dai dẳng kèm theo lờ đờ và chán

n Khi lợn di chuyển có thể xu t hiện các triệu chứng đau do các khớp ị sưng chứa ch t lỏng và fi rin Có triệu chứng về hô h p và viêm phổi Lợn nái ị sảy thai Viêm màng ngoài tim nghiêm trọng

1.3.4 Mãn tính

Các thể mãn tính thường có tỷ lệ chết dưới 30% D u hiệu lâm sàng xu t hiện sau

14 đến 21 ngày sau nhiễm trùng với sốt nhẹ, sau đó là suy hô h p nhẹ và sưng khớp

từ mức độ trung ình đến nặng, viêm phổi và hoại tử trong phổi, viêm màng ngoài tim và hạch ạch huyết phù nề, có thể xu t huyết một phần

1.4 Các kỹ thuật chẩn đoán cận lâm sàng hiện có

1.4.1 Phát hiện vi rút

Chẩn đoán ASF có ngh a là xác định các động vật đã hoặc đang ị nhiễm ASFV

Do đó, một phương pháp chẩn đoán thích hợp có thể hướng đến việc phát hiện các kháng nguyên đặc hiệu ASFV hoặc DNA hay kháng thể, để có được thông tin liên quan nhằm hỗ trợ các chương trình kiểm soát và loại trừ Điều quan trọng là phải cân nhắc diễn iến của ệnh khi chọn xét nghiệm chẩn đoán Vì mỗi cá thể có thể ở một giai đoạn ệnh khác nhau, nên cả xét nghiệm phát hiện vi rút và kháng thể phải được thực hiện trong các ổ dịch và các chương trình kiểm soát / loại trừ

1.4.1.1 Phát hiện hệ gen ASFV bằng phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được sử dụng để phát hiện ộ gen ASFV trong các mẫu thử từ lợn (máu, nội tạng, v.v.) hay ve mềm Các đoạn DNA nhỏ được khuếch đại ằng PCR đến số lượng có thể phát hiện được T t cả các xét nghiệm PCR được xác nhận đều cho phép phát hiện DNA của vi rút ngay trước cả khi các

d u hiệu lâm sàng xu t hiện PCR giúp chẩn đoán ASF trong vòng vài giờ sau khi mẫu đến phòng thí nghiệm PCR cung c p một giải pháp thay thế có độ nhạy, đặc hiệu và nhanh chóng so với việc phân lập vi rút để phát hiện ASFV Kỹ thuật cung

c p độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp phát hiện kháng