Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích đầu tận cùng của các đoạn ADN bị cắt pptx

TCNCYH 23 3 2003 Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích đầu tận cùng của các đoạn ADN bị cắt Lê Thị Kim Tuyến Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội Các enzym giới hạn

TCNCYH 23 (3) 2003

Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích

đầu tận cùng của các đoạn ADN bị cắt

Lê Thị Kim Tuyến

Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội

Các enzym giới hạn cắt ADN kép ở các vị trí đặc hiệu ngoài hoặc trong trình tự nucleotid được nhận ra và để lại 3 dạng các đầu tận cùng: phẳng; chéo có ADN đơn 3’ thừa, chéo có ADN đơn 5’ thừa Nghiên cứu này dùng một phương pháp cho phép xác định kiểu cắt của các enzym giới hạn Phương pháp giải trình tự Sanger được sử dụng để phân tích ADN ở xung quanh vị trí cắt nhưng dùng chất không phóng xạ Song song các đoạn ADN tổng hợp kéo dài được cắt bằng enzym giới hạn Phản ứng Klenow mang hai hoạt tính là tổng hợp ADN 5’→ 3’ và exonucleasa 3’→ 5’ cho phép xác định kiểu cắt của enzym giới hạn Kết quả đã cho phép xác định vị trí cắt của hai enzym

mới Điểm cắt Sml I nằm trong trình tự đối xứng được nhận: 5’- C↓ TPuPy A↑G - 3’ BciV I nhận ra

một trình tự không đối xứng và cắt ngoài vị trí nhận : 5’ - GTATCC(N)6 ↓ - 3’/3’- CATAGG(N)5 ↑ - 5’

I Đặt vấn đề

Trong y học việc chẩn đoán và nghiên cứu

bệnh lý ở mức độ ADN ngày càng quan trọng

Để phân tích được các ADN genom cần dùng

đến phản ứng cắt ADN giới hạn để tạo thành

các mảnh nhỏ có kích thước nhất định Phản

ứng này được xúc tác bắng các enzym giới hạn

thuỷ phân ADN ở các vị trí quyết định sau khi

đã nhận trình tự đặc hiệu gồm từ 4 đến 8 bp

Tập hợp các enzym giới hạn là hết sức đa dạng

và có nguồn gốc phong phú là các vi khuẩn

không phân biệt loại chi Hiện nay, trên thế

giới đã thu thập hơn 200 enzym giới hạn có

tính đặc hiệu khác nhau Nếu tính đủ các loại

trình tự từ 4 đến 8 nucleotid có tính liên tục hay

không, số enzym giới hạn phải hơn 1000 [1]

Với mục đích có được enzym để có thể cắt

ADN ở bất cứ vị trí mong muốn nào, chúng tôi

tiếp tục khảo sát các enzym giới hạn có tính

đặc hiệu mới [2]

Đến nay, các enzym giới hạn được xác định

chủ yếu bằng các trình tự nucleotid được nhận

ra trên ADN Nhưng các enzym giới hạn nhận

ra cùng một trình tự có thể cắt ADN ở các vị trí

khác nhau nằm trong vị trí nhận đối với các

trình tự đối xứng hoặc ngoài vị trí nhận cách xa

và nucleotid đối với các trình tự không đối xứng Hai enzym mới được tìm ở Việt Nam,

Sml I nhận ra trình tự đối xứng

5’-CTPuPyAG-3’ [3] và BciV I nhận ra trình tự không đối

xứng 5’-GTATCC-3’/3’-CATAGG [4] được xác định vị trí cắt

Mục tiêu công trình này là xác định tính đặc hiệu các enzym giới hạn bằng phân tích vị trí cắt của nó trên ADN

II Phương pháp và vật liệu nghiên cứu

1 Các sinh phẩm

ADN đích M13 mp18 và ADN mồi ngược

có vị trí 944-924 gắn biotin

ADN đích pUC19 và ADN mồi ngược có vị trí 2627-2608 gắn biotin

Sml I và BciV I là hai enzym giới hạn mới

được tìm ở hai chủng vi khuẩn thiên nhiên phân

lập tại Việt Nam từ Stenotrophomonas

maltophilia và Bacillus circulans Sml I nhận

trình tự 5’-CTPyPuAG-3’ BciV I nhận trình tự

5’-GGATAC-3’ /5’-GTATCC-3’

TCNCYH 23 (3) 2003

2 Phương pháp giải trình tự nucleotid

Phương pháp của Sanger [5] được sử dụng

nhưng dùng các hoá chất không phóng xạ Các

đoạn ADN điện di trên gel acrylamid được

truyền lên màng nylông theo phương pháp

Southern blot [6] Các đoạn ADN hiện lên bằng

phương pháp miễn dịch học dùng avidine, cộng

hợp biotin-phosphatase và cơ chất CDP star tạo

sản phẩm phát quang của Phototope-Star

Chemiluminescent Detection kit (New England

Biolabs)

3 Xác định dạng cắt của các đoạn ADN

giới hạn

Đoạn dài ADN được tổng hợp và cắt với

enzym giới hạn phân tích, 30 phút, 37°C Tiếp

theo 3 àg ADN cắt được sử lý với 2U Klenow,

ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng

III Kết quả

Sml I cắt ADN của phagơ M13mp18 tại bốn

vị trí Một trong các vị trí cắt là 868 Hình 1 chỉ

trình tự ADN của M13mp18 xung quanh vị trí

đó là:

ATGGTTT-5’

Đoạn ADN cắt với Sml I [Hình 1, (-)] kết

thúc bằng nucleotid C nằm trong trình tự nhận

ra Sau khi phản ứng với Klenow, đoạn ADN

được dài ra thêm 4 nucleotid là TTGA Sự tổng

hợp này chứng tỏ rằng đầu tận cùng do Sml I để

lại có chuỗi đơn 5’ thừa gồm có 4 nucleotid Kết quả này cho phép xác định vị trí cắt của

Sml I là: 5’- C↓ TPuPy A↑G - 3’

BciV I nhận trình tự 5’-GGATAC-3’

/5’-GTATCC-3’ và cắt pUC19 hai lần Vị trí cắt

được phân tích là 2542 (Hình 2) Trình tự được

xác định trên gel nucleotid là

5’-CGACCCTGCCGCTTACC GGATAC CC-3’

Các đoạn ADN cắt kết thúc bằng “C” nằm trước trình tự nhận ra GGATAC cách 5 nucleotid Phản ứng Klenow để lại một đoạn ADN nhỏ hơn một nucleotid kết thúc bằng G Kết quả chỉ rằng phần exonucleasa của Klenow

đã phân huỷ chuỗi ADN đơn 3’ thừa gồm có

một nucleotid Vị trí cắt của BciV I là:

5’-GTATCC(N)6↓-3’/3’-CATAGG (N)5↑-5’

+ A T G C - C - T A G C +

Hình 1 : Vị trí cắt Sml I:

5’C ↓T Pu Py A G 3’

3’G A Py Pu T ↑ C 5’

-: không có Klenow +: có Klenow

Hình 2 : Vị trí cắt BciV I:

5’GTATCC(N)6 ↓ 3’

3’CATAGG(N)5 ↑ 5’

-: không có Klenow +: có Klenow

TCNCYH 23 (3) 2003

IV Bàn luận

Đến nay, các enzym giới hạn được xác định

chủ yếu bằng các trình tự nucleotit đặc hiệu

nhận ra Nhưng vị trí cắt có thể xẩy ra ở nhiều

điểm khác nhau hoặc ngay trong các trình tự có

tính chất đối xứng hoặc ở ngoài các trình tự

không đối xứng cách vài nucleotit [7] Các

enzym giới hạn nhận cùng một trình tự có khả

năng cắt ở các vị trí khác nhau như trường hợp

của Sma I và Xma I [8] Tuy nhiên những vị trí

cắt này sẽ gần nhau cách xa một vài nucleotit

thôi Do vậy các hình vạch của một ADN

chuẩn cắt với các enzym giới hạn nhận ra cùng

một trình tự sẽ hiện lên giống nhau khi quan sát

trên gel agarose Phương pháp dùng trên cho

phép xác định dạng ADN tận cùng do enzym

giới hạn để lại, trên cơ sở đó có thể kết luận vị

trí cắt một cách chính xác

Dựa vào phương pháp giải trình tự Sanger

kết quả thu được cho phép quan sát các đoạn

ADN khác nhau một nucleotit đối với các phân

tử gồm từ 30 đến 200 nucleotit Do đó các

ADN chuẩn M13mp18 và pUC19 được tổng

hợp từ các ADN mồi nằm từ 50 đến 100

nucleotit trước vị trí cắt của enzym giới hạn

đang xác định Song song ADN được tổng hợp

kéo dài và cắt bằng enzym giới hạn cho biết

nucleotit cuối cùng của phần kép ở các tận

cùng cắt Ba dạng tận cùng có thể xuất hiện:

Phẳng do ADN là hoàn toàn kép; chéo với

ADN đơn 3’ thừa; chéo với ADN đơn 5’ thừa

Phản ứng Klenow cho phép phân biệt giữa 3

khả năng đó vì enzym mang 2 hoạt tính

exonucleasa thuỷ phân ADN đơn 3’→5’ và

endonucleasa tổng hợp ADN đơn 5’→3’ [9]

Hai hoạt tính đó kết thúc tạo ra các chuỗi ADN

hoàn toàn kép Như thế kết luận dựa vào 3 tình

huống có thể xảy ra là: ADN đơn 3’ thừa, phần

exonucleasa của enzym Klenow để lại sản

phẩm ADN nhỏ hơn; ADN đơn 5’ thừa, phần

endonucleasa tổng hợp để lại sản phẩm ADN

dài hơn; ADN cắt phẳng có đặc điểm hoàn toàn

kép, Klenow không có tác động và ADN vẫn giữ nguyên

Phương pháp được áp dụng trong trường hợp của hai enzym giới hạn được tìm ở Việt Nam Vị trí cắt của Sml I là 5’- C↓ TPuPy A↑G

- 3’ nằm ngay trong trình tự đối xứng được nhân ra Vị trí cắt của BciV I là: 5’- GTATCC(N)6 ↓ - 3’/3’- CATAGG(N)5 ↑- 5’ nằm phía ngoài trình tự không đối xứng cách vài nucleotit

Phương pháp này không dùng phóng xạ hoàn toàn phù hợp với nhiều phóng thí nghiệm không có điều kiện làm thí nghiệm với các chất phóng xạ

V Kết luận Phương pháp được tả trong công trình này cho phép phân tích các đầu tận cùng của các

đoạn ADN giới hạn Trên cơ sở đó có thể xác

định thêm một đặc điểm quan trọng của một enzym giới hạn nhất định là điểm cắt của nó Hai enzym giới hạn mới tìm ở Việt Nam đã

được phân tích

Vị trí cắt Sml I là 5’- C↓ TPuPy A↑G - 3’

Vị trí cắt BciV I là 5’- GTATCC(N)6 ↓ - 3’/3’- CATAGG(N)5 ↑- 5’

Tài liệu tham khảo

1 Schildkraut I (1984) Screening and

characterizing restriction endonucleases Genet

Eng., 6: 117-140

2 Lê Thị Kim Tuyến, Vũ Thị Kim Liên,

Vũ Hồng Nga (1996) Phát hiện enzym giới hạn trong vi khuẩn tự nhiên phân lập ở

Việt-Nam Hội nghị khoa học chuyên đè vi sinh học,

dịch tễ học, miễn dịch học, tháng 1/1996, Thành phố Hồ Chí Minh: 112-116

3 Lê Thị Kim Tuyến, Vũ Thị Kim Liên (1997) Sml I, một enzym giới hạn mới tách

chiết từ chủng Stenotrophomonas maltophilia

Tạp chí Y học Dự phòng, VII, 4 (34): 11-16

TCNCYH 23 (3) 2003

4 Lê Thị Kim Tuyến, Vũ Hồng Nga Phát

hiện và xác định một enzym giới hạn mới BciV

I, tách từ Bacillus circulans Tạp chí Y học Dự

phòng, 1997, VII, 4 (34): 5-10

5 Sanger F., Nicklen S and Coulson A.R

DNA sequencing with chain-terminating

inhibitors Proc Nat Acad Sci 1977,

74:5463-67

6 Southern E.M Detection of specific

sequences among DNA fragments separated by

gel electrophoresis J Mol Biol., 1975, 98 :

503-517

7 Szybalski W., Kim S C., Hasan N and Podhajska A J Class-IIs restriction enzymes-a

review Gene, 1991, 100: 13-26

8 Endow S.A., Roberts R.J Two

restriction-like enzymes from Xanthomonas

malvacearum J Mol Biol., 1977, 112:

521-529

9 Klenow H., Henningsen I Selective elimination of the exonuclease activity of the deoxyribonucleic acid polymerase from

Escherichia coli B by limited proteolysis Proc Natl Acad Sci., 1970, 65:168

Summary

Nucleotide analysis of restricted fragment DNA

extremities for characterizing the restriction enzyme

cutting activity The analysis of genomic DNA requires mostly its restriction into small fragments of definite sizes This reaction is catalyzed by restriction enzymes recognizing specific sequences 4-8 nucleotides long Each restriction enzyme is characterized by one recognition nucleotide sequence and its cut site on DNA So far, more than 200 restriction enzymes with different specificities have been found If considering all the possibilities of palindrome sequences of 4-8 nucleotides, interrupted or not, the number of restriction enzymes should be more than one thousand With the purpose to get a collection of restriction enzymes that cut DNA anywhere, we still continue to find restriction enzymes having new specificities This study presents a method able to characterize unknown restriction enzymes by analyzing the cutting extremities of restricted fragments The method is based on the Sanger sequencing of DNA around the cut site The non-radioactive chemical biotin has been used instead of 32P

The cut sites of two new enzymes have been determined For Sml I, the cut site occurs within the recognition nucleotide sequence: 5’- C↓ TPuPy A↑G - 3’ Bci VI recognizing a non-palindrome sequence cuts outside this sequence: 5’- GTATCC(N)6 ↓ - 3’/3’- CATAGG(N)5 ↑- 5’