Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể potx

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể Nghiêm Xuân Dũng 1 , Trần Minh Đôn 1 , Lương Thị Yến 1 và Lê Đức Đào 2 1 Cục Kỹ thuật Hóa –

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử

xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể

Nghiêm Xuân Dũng 1 , Trần Minh Đôn 1 , Lương Thị Yến 1

và Lê Đức Đào 2

1 Cục Kỹ thuật Hóa – Sinh, Tổng cục Khoa học

kỹ thuật và Công nghệ - Bộ Công an

2 Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn trùng trung ương

Kỹ thuật huyết học xác định được 4 nhóm máu là A, B, O, AB Sử dụng kĩ thuật PCR và các loại enzym cắt giới hạn có thể xác định kiểu gen của hệ kháng nguyên này, cho phép xác định được 6 trạng thái gen là AA, BB, OO, AB, AO, BO Phương pháp mới sử dụng có độ nhạy rất cao, có thể xác định được các mẫu ADN từ vết máu, nước bọt, tóc nên được áp dụng có hiệu quả trong công tác giám định hình sự

I Đặt vấn đề

Những nghiên cứu về các dòng cADN mã

hoá kháng nguyên nhóm máu ABO [6] đã xác

định được trình tự đoạn gen ABO với kích

thước 1000bp Đồng thời qua những nghiên

cứu này, người ta chứng minh được rằng gen

mã hoá kháng nguyên A và B có một số gốc

bazơ khác nhau ở những vị trí xác định Điều

này dẫn đến những thay đổi một số trình tự axit

amin làm cho hoạt tính của A và B-transferase

khác nhau Sự khác nhau đó đã được các tác giả

tìm ra tại nucleotit 700 của gen B Tại vị trí

này, bazơ G được thay thế bằng bazơ A có ở

thể dại Vị trí đột biến này tạo ra điểm nhận

biết của enzym giới hạn AluI Đồng thời,

nghiên cứu trên gen O chứng minh sự vắng mặt

của bazơ G ở vị trí 258, do đó gen mã hoá tổng

hợp protein không có hoạt tính transferase Đột

biến này tạo thêm một vị trí nhận biết nữa đối

với gen O bởi enzym giới hạn KpnI

Tiếp theo những nghiên cứu trên, Carll Ladd

và cộng sự 1996 [2] đã đưa ra một phương pháp

nhằm xác định kiểu gen nhóm máu ABO Sử

dụng đôi mồi thứ nhất (DHF1 và DHR2) bằng

kỹ thuật PCR, nhóm tác giả đã nhân đoạn gen ABO tạo ra một sản phẩm có kích thước 209/210bp Sản phẩm này sẽ mang vị trí đột biến tại bazơ 258 nếu allen O có mặt Đôi mồi tiếp theo (DHF3 và DHR3) sẽ nhân đoạn gen ABO tạo ra một sản phẩm có kích thước 175bp Sản phẩm này mang vị trí đột biến tại bazơ 700 nếu allen B có mặt Sau đó, các tác giả sử dụng

kỹ thuật cắt sản phẩm PCR bằng hai loại enzym KpnI và AluI Đối với sản phẩm 210/209pb, nếu allen O có mặt, KpnI sẽ cắt thành các đoạn 177bp và 32bp Còn sản phẩm 175bp nếu có mặt allen B, AluI sẽ cắt sản phẩm thành các đoạn 94bp và 81bp Cuối cùng, dựa vào sự thể hiện của các băng ADN trên điện di

đồ (gel agarose), người ta có thể phân tích tính

đa hình của đoạn gen ABO thể hiện ở 6 kiểu gen khác nhau là: AA, BB, OO, AO, BO, AB Những nghiên cứu trên đã tạo cơ sở để khắc phục một loạt khó khăn gặp phải khi xác định nhóm ABO bằng kỹ thuật huyết thanh học,

đồng thời với các kỹ thuật hiện đại, có độ nhạy

và tính đặc hiệu cao của sinh học phân tử, việc xác định nhóm máu ABO không chỉ dừng lại ở mức độ xác định kiểu hình với 4 nhóm như

trước kia mà thay vào đó có thể xác định được

6 kiểu gen khác nhau, do đó tăng khả năng

phân biệt hệ thống nhóm ABO

Với những cơ sở lý thuyết và nghiên cứu

thực tế đã nêu, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu

xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể

bằng các kỹ thuật hiện đại của sinh học phân

tử Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp

phần bổ sung một phương pháp mới có độ nhạy

rất cao phục vụ việc giám định truy nguyên

nhóm dùng cho công tác giám định hình sự

Mục tiêu nghiên cứu:

- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để thực

hiện phản ứng nhân bội gen mã hoá kháng

nguyên nhóm máu ABO

- Nghiên cứu lựa chọn những phương pháp

thích hợp để tách chiết ADN từ các mẫu sinh

học (máu, lông, nước bọt ) cho phản ứng

PCR

- Phân tích tính đa hình của đoạn gen

mã hoá tổng hợp kháng nguyên nhóm máu

ABO, nghiên cứu xây dựng một quy trình ổn

định để xác định dấu vết thu được trong điều

kiện hiện tại của phòng thí nghiệm

II Đối tượng và Phương pháp

nghiên cứu

1 Đối tượng:

- Máu tươi, máu trên giấy thấm Walkman,

nước bọt trên giấy thấm Walkman, nước bọt

thấm vào bông, chân tóc

- Hoá chất: Hoá chất cho tách chiết ADN;

hoá chất dùng cho PCR; hoá chất dùng cho

enzym cắt giới hạn KpnI và AluI; hoá chất

dùng cho điện di và nhuộm gel của các hãng

Sigma và Biorad

2 Phương pháp:

a Tách ADN :

Đã có rất nhiều phương pháp được nêu ra để tách chiết ADN từ các tài liệu đã được công bố trên thế giới và trong nước Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tách chiết ADN của Banaschak S và cộng sự [1]

b Kỹ thuật PCR:

Quá trình PCR được tiến hành trong ống nghiệm eppendorf 0,5 ml Thành phần phản ứng gồm: 0,2mM dNTPs; 10mM tris HCl, 50mM KCl, 1,5 mM MgCl2; 2 đơn vị Taq polymeraza; 15 pmol mỗi mồi, nước cất khử ion; dầu khoáng

Phản ứng được thực hiện trên máy PCR tiến hành với 950C: 5 phút; 45 chu kỳ ở các nhiệt

độ: 94oC - 1 phút; 58oC - 1 phút; 72oC - 2 phút

c Sử dụng enzym giới hạn để phân tích

đoạn gen mã hoá kháng nguyên ABO:

Trên đoạn gen mã hoá tổng hợp kháng nguyên ABO, người ta tìm thấy có 2 vị trí có thể sử dụng enzym cắt giới hạn để phân tích

điểm đột biến: Vị trí bazơ 258 ở người có gen mã hoá kháng nguyên O có thể dùng enzym giới hạn Kpn I để cắt Sản phẩm cắt sẽ cho ra hai đoạn ADN nhỏ hơn có kích thước khác nhau Tương tự, tại vị trí bazơ 700 của gen mã hoá kháng nguyên B người ta sử dụng enzym Alu I cắt Kết quả cắt cũng cho ra hai đoạn ADN nhỏ hơn có kích thước khác nhau

Kỹ thuật cắt bằng hai loại enzym giới hạn Kpn I và Alu I được chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Carll và cộng sự, 1996 [2]

d Kỹ thuật điện di:

Các sản phẩm PCR được kiểm tra, phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agaroza 2,5% trong đệm TBE, nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh trên đèn cực tím III Kết quả

Tổng thể tích phản ứng là 50àl gồm:

ư dNTPs (nồng độ mỗi loại: 0,2mM)

: 5àl

ư 10 X PCR buffer (15mM MgCl2) : 5àl

ư Primer (DHF1x DHR2) hoặc (DHF3 x

DHR3) mỗi loại 1àl đến 2àl

ư 2 unit Taq ADN polymerase: 2àl

ư ADN khuôn từ 1 đến 6àl

ư H2O từ 28 àl- 33àl

Điều kiện để làm phản ứng chuỗi trùng hợp

trên máy Mastercycle 5330:

95oC - 5 phút

58oC - 1 phút

72oC - 2 phút 45 chu kỳ

94oC - 1 phút

58oC - 1 phút

72oC - 10 phút Nhiệt độ là 25oC Thời gian chạy: 4 giờ 47phút

- Primer DHF1 và DHR2 tạo ra một sản phẩm 210 / 209bp

- Primer DHF3 và DHR3 tạo ra một sản phẩm 175bp

Khi phản ứng hoàn thành chúng tôi kiểm tra sản phẩm bằng phương pháp điện di trên gen

agarose 2,5% và soi trên máy UV (ảnh 1)

1 2 3 4 5 6 7 8

ảnh 1 Kết quả PCR đoạn gen ABO với 2 đôi mồi đặc hiệu DHF1, DHR2 và DHF3, DHR3

1,4,6: Sản phẩm PCR dùng cặp mồi DHF3, DHR3

2,5,7: Sản phẩm PCR dùng cặp mồi DHF1, DHR2

3,8 : Marker

Khi có sản phẩm PCR, dùng enzym Kpn I và Alu I cắt Cơ chế hoạt động của Kpn I và Alu I :

5’ GCT GAC ACC GTG GAA GGA TGT CCT CGT GGT(G)ACC

Primer DHF1

AGG CAG TGG CGA GTC GTG ACT GTG GAC ATT GAG GT

Primer DHR2 (A)

5’ GTG CGT GGA CGT GGA CAT GGA GTT CCC (G)GC TTC

Primer DHF3

C AAG GAC GAG GGC GAT TTC TAC TAC CTG

Primer DHR 3

“O” “B”

No 258 bp (Kpn I)

No 700bp (Alu I)

Allen O: Là kết quả của sự biến mất của Guanin (G) tại vị trí 258 Điều đó làm mất hoạt tính

β-trasferase và tạo ra điểm nhận biết của KpnI

Allen B: G thay bằng A tại vị trí 700 tạo ra vị trí nhận biết của enzym AluI

- Sản phẩm 210/209 nếu chứa dạng đa hình đặc hiệu của allen O (nếu allen O có mặt) Kpn I sẽ

cắt thành các đoạn 177 bp và 32 bp

- Sản phẩm 175 bp nếu chứa dạng đa hình đặc hiệu của allen B (nếu allen B có mặt), Alu I sẽ

cắt sản phẩm thành đoạn 94 bp và 81bp

* Tiến hành phản ứng cắt bằng enzym giới hạn: AluI và KpnI (Tổng thể tích 25àl)

Enzym Alu I

- ADN : 20àl

- Buffer A: 2,5àl

- Alu I : 1,5àl

Enzym Kpn I

- ADN: 20àl

- Tris 10X : 2àl

- BSA 10X : 0,3àl

Phản ứng enzym đ−ợc thực hiện ở nhiệt độ 37oC trong thời gian 1 giờ Sản phẩm đ−ợc điện di trên gel agarose 2.5% với điện thế 100V Thời gian chạy điện di là 2 giờ 30 phút Các kết quả đ−ợc kiểm tra bằng máy UV

Các loại genotype của gen ABO sau điện di có thể đ−ợc thể hiện trên điện di đồ theo mô hình sau:

Mẫu 1

BO

Mẫu 2

BB

Mẫu 3

AO

Mẫu 4

AA

Mẫu 5

AB

Mẫu 6

OO

bp

Enzym

cắt

Marker

KpnI AluI KpnI AluI KpnI AluI KpnI AluI KpnI AluI KpnI AluI

210

175

94

81

32

Căn cứ vào mô hình trên, chúng tôi tiến hành đọc kết quả trên bản điện di agarose và phân tích kiểu gen của các mẫu nghiên cứu (ảnh 2)

• Ghi chú:

1: Marker 2,3: AO 4,5: AO

6,7: OO 8,9: BO 10,11: AB

ảnh 2: Kết quả cắt sản phẩm PCR bằng enzym KpnI và AluI

2 Kết quả khảo sát gen ABO cuả một số cá thể người Việt Nam

Kết quả khảo sát một nhóm người Việt Nam:

- Số người có nhóm AA là 2 người

- Số người có nhóm AB là 4 người

- Số người có nhóm OB là 9 người

- Số người có nhóm OA là 7 người

- Số người có nhóm BB là 1 người

- Số người có nhóm OO là 7 người

Ngoài ra chúng tôi tiến hành lấy mẫu máu, nước bọt, chân tóc của một người để nghiên cứu Kết quả cho thấy ở cùng một cá thể các mẫu phân tích đều giống nhau (ảnh 3)

1, 2, 7, 8, 14, 15, 20, 21 : Máu

3, 4, 9, 10, 16, 17, 22, 23 : Tóc

5, 6, 11, 12, 18, 19, 24, 25 : Nước bọt

ảnh 3: Kết quả khảo sát gen ABO cuả một số cá thể người Việt Nam

1-6: Người thứ 1 nhóm OO 7-12 : Người thứ 2 nhóm OO

14-19: Người thứ 3 nhóm OA 20-25 : Người thứ 4: nhóm AB

13 : Marker

IV Bàn luận

Điện di trên gel agarose 2,5% đối với sản

phẩm của chúng tôi cho thấy việc xác định

nhóm ABO từ các vết máu, tế bào củ tóc (của

1 sợi tóc) hay vết nước bọt thí nghiệm đạt kết

quả tốt Các băng mảnh, sắc, không có các

vạch phụ, đã xác định được genotype của cá

thể Như vậy, phương pháp chúng tôi đã sử

dụng là ổn định và có độ nhạy cao Do đó có

thể phân biệt được các kiểu gen nhóm ABO

với lượng mẫu rất ít mà các phương pháp trước

đây không thể thực hiện được [2, 3]

bằng kỹ thuật hiện đại của sinh học phân tử người ta có thể phân biệt các cá thể ra thành 6 nhóm gen: AA, BB, OO, AO, BO, AB Sử dụng phương pháp này còn biết được ngay gen của con cái khi biết gen của bố mẹ [5]

Sử dụng các kỹ thuật và trang thiết bị hiện

có tại các cơ sở nghiên cứu ở Việt Nam, chúng tôi đang từng bước hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu các đoạn gen đa hình phục vụ cho công tác của ngành Công an Kết quả xác định thành công đoạn gen ABO đã giúp chúng tôi khẳng định chắc chắn rằng các phương pháp sinh học phân tử có thể triển khai và mang lại

V kết luận

Chúng tôi đã lựa chọn được phương pháp

thích hợp để tách chiết ADN từ các mẫu sinh

học (máu, lông, nước bọt ) cho phản ứng

PCR

Sử dụng kĩ thuật PCR và enzym giới hạn đã

xác định được số người mang kiểu gen đồng

hợp tử (AA, OO hoặc BB) chiếm khoảng 1/3 số

lượng người khảo sát, còn lại 2/3 là dị hợp tử

[4]

Phương pháp này cho khả năng xác định

được các dấu vết nhỏ như vết máu, nước bọt, 1

sợi tóc nên có ý nghĩa lớn trong công tác

giám định pháp y

Tài liệu tham khảo

1 Banaschak S, Rolf B, Brinkmann B:

Influence of different staining techniques on

the DNA analysis of histological sections Int

J Legal Med 2000, 113: 114-116

2 Carll Ladd et al: A PCR-based strategy for ABO genotype determination, Journal of forensic science January 1996,Vol

41, No 1 :134-137

3 Cecelia Cronse and Vladimit Vincek: Identification of ABO alleles on forensic type specimen using rapid - ABO genotyping Biotechniques 1995,Vol 18, No 3

4 Gobinda Sarkar et al: Characterisation

of PCR amplication of specific alleles, Analytical biochemistry 1990, 186: 64-68

5 Fumi - Ichiro Yamato, Herrik Clansen Thayer White, John Marken: Molecular genetic basic of the histo blood group ABO system Nature 17 May, 1990,Vol 345

6 Yamamoto F., Clausen H, White T., Marken J.: Molecular genetic basic of the histo-blood group ABO system, Nature, 1990, Vol 345: 229-233

Summary

ABO genotype determination using biological

molecular methods

To overcome the problems, that serology technique allow to determine only ABO phenotype by four groups as A, B, O and AB, we have employed a new method to determine ABO genotyping using modern molecular biological techniques The method was performed by Carll Ladd et al (1996) and called " PCR-RE" typing This method is highly sensitive and specific in comparison with the immunological method Using this method six groups of ABO genotype would be determined as AA, BB, OO, AO, BO, AB So ABO typing at the DNA level yields genotypic rather than phenotypic information, thereby increasing the system’s discrimination potential

The method we used was successful in determination the ABO genotypes on a group of 30 Vietnamese individuals We also get success in ABO genotype determination on different DNA samples extracted from blood stains, saliva stains and hair root cells It showed that there’s no different of ABO genotypes between these DNA samples from an individual