Đề tài: " Cấu trúc mô của một số hệ cơ quan trên cá tra" pdf

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu2006…nhưng chưa có nghiên cứu nào nghiên cứu hoàn thiện cấu trúc mô của cá tra khỏe làm cơ sở cho nghiên cứu mô bệnh học.. D

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

PHẦN 1 GIỚI THIỆU

Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là một trong những vùng kinh tế trọng điểm nằm ở cực Nam của đất nước Bên cạnh lúa gạo, ĐBSCL còn là vùng nuôi trồng thủy sản lớn nhất nước Với hệ thống sông ngòi chằn chịt, ĐBSCL

là nơi rất thuận lợi cho ngành nuôi trồng thủy sản phát triển, sản lượng thủy sản của vùng đã đóng góp 1 phần đáng kể vào sản lượng thủy sản xuất khẩu của cả nước, góp phần tăng thu nhập cho người dân Sản lượng thủy sản của ĐBSCL chiếm khoảng 50%, diện tích nuôi trồng khoảng 60% và giá trị xuất khẩu thủy sản chiếm đến 51% của cả nước (Dương Nhựt Long, 2003)

Chính vì thế phong trào nuôi trồng thủy sản đã và đang rất thu hút người dân, cùng với chính sách của nhà nước chuyển đổi cơ cấu ngành nghề loại bỏ đất nông nghiệp lạc hậu để chuyển sang nuôi thủy sản thì các mô hình nuôi: nuôi thâm canh, bán thâm canh, nuôi ao mươn vườn, nuôi kết hợp cá-lúa…đang phát triển rầm rộ Bên cạnh con tôm Sú thì cá Tra cũng là mặt hàng xuất khẩu rất quan trọng của vùng, được nuôi phổ biến ở Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp…và được xuất khẩu sang các nước như: EU, Nga, ASEAN, Ucraina,

Mỹ, Trung Quốc…Tổng sản lượng cá tra, basa xuất khẩu của Việt Nam năm

2007 đạt 383.2 nghìn tấn với kim ngạch đạt 974.12 triệu USD, tăng 31% về

(http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=26125735&News_ID=26385208)

Tuy nhiên trong nuôi cá tra thâm canh thường nuôi với mật độ dày và sử dụng thức ăn nhiều nên lâu ngày dẫn đến nguồn nước bị ô nhiễm, mầm bệnh dễ có

cơ hội tấn công và tình trạng dịch bệnh xuất hiện ngày càng nhiều và khó điều trị Để điều trị có hiệu quả cao thì phải chuẩn đoán đúng được bệnh, phương pháp mô học có vai trò quan trọng trong khâu này Nếu chỉ dựa vào những hình thái tổn thương bên ngoài mà không có các dữ kiện khác có liên quan đến

cá tôm bệnh thì thường có những kết luận sai lầm vì những hình thái tổn thương của vài bệnh có thể giống nhau và gây nhầm lẫn trong chẩn đoán (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)

Hiện nay có nhiều nghiên cứu về mô bệnh học trên cá tra như: Bước đầu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

(2006)…nhưng chưa có nghiên cứu nào nghiên cứu hoàn thiện cấu trúc mô

của cá tra khỏe làm cơ sở cho nghiên cứu mô bệnh học Do đó đề tài: “Cấu

trúc mô của một số hệ cơ quan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện nhằm:

Mục tiêu:

Xác định đặc điểm, cấu trúc mô của các hệ cơ quan trên cá tra khỏe từ đó làm thành bộ sưu tập hình ảnh mô học làm cơ sở cho việc chẩn đoán, phát hiện tác nhân gây bệnh thông qua việc so sánh mô cá tra bệnh với các mô cá tra khỏe

Nội dung:

Dùng phương pháp mô học để xác định đặc điểm, cấu trúc của các hệ cơ quan như: da, cơ, dạ dày, ruột, gan, mang, bóng hơi, tim, thận, tỳ tạng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

PHẦN 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra

Cá tra có tên khoa học là Pangasianodon hypophthalmus trước đây còn có tên gọi là Pangasius micronemus, cá tra phân bố ở lưu vực sông Mêkông, có mặt

ở cả 4 nước Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan Trước đây khi chưa có sinh sản nhân tạo, cá bột và cá tra giống được vớt trên sông Tiền, sông Hậu và

cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp trong điều kiện tự nhiên địa phận Việt Nam, do đó cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê-kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên Về đặc điểm hình thái cá tra thuộc dạng cá

da trơn, nhẵn, không có vẩy Cá tra có đầu lớn, thân thon và hẹp dần về phía đuôi, vây lưng cao có 1 gai cứng và có răng cưa, vây ngực có ngạnh và có độc

tố, cá tra thường có màu xám đen trên lưng và phần bụng màu trắng bạc Cá tra là loài sống đáy, ăn tạp Trong tự nhiên, cá ăn được mùn bã hữu cơ, rễ cây thủy sinh, rau quả, tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá Cá tra không đẻ trong

ao nuôi cũng không có bãi đẻ tự nhiên ở Việt Nam, cá tra đẻ ở Cam-pu-chia,

cá bột theo dòng nước về Việt Nam Cá tra còn có cơ quan hô hấp phụ là ruột nên cá có thể sống được trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, oxy hoà tan thấp và có thể nuôi với mật độ rất cao Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, sau 6 tháng nuôi cá đạt trọng lượng 1-1,2 kg/con Cá nuôi trong ao có thể đạt trọng lượng 25 kg ở cá 10 năm tuổi (Dương Nhựt

Long, 2003) 2.2 Lịch sử mô học

Chúng ta đã biết, bệnh trên cá xuất hiện ngày càng nhiều và càng khó điều trị

Vì cá sống trong môi trường nước nên tốc độ lây lan rất nhanh làm cho cá chết hàng loạt gây thiệt hại rất nghiêm trọng về kinh tế cho người dân Dó đó công tác chữa trị kịp thời là điều rất cần thiết Để điều trị với chi phí thấp nhất nhưng hiệu quả cao nhất thì việc quan trọng đầu tiên là phải chẩn đoán đúng bệnh Phương pháp mô học là một phương pháp có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong khâu này

Người được xem là cha đẻ của ngành tế bào học và mô học là nhà phân loại học đồng thời cũng là nhà giải phẩu học người pháp Xanvier Bichat Ông đã xác định mô là đơn vị cơ bản của sự sống và có 21 loại mô trong cơ thể (Trần

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

bằng kính hiển vi Phương pháp này cho phép người phân tích kết luận tính chất của các vùng bị tổn thương

Theo Roberts (1995) phân tích mô bệnh học là nghiên cứu những thay đổi hiển vi diễn ra trong mô của cơ thể trong suốt quá trình bệnh Những thay đổi này thường là những đặc điểm đặc trưng của bệnh và nó cho phép chẩn đoán chính xác bệnh

Việc nghiên cứu tế bào học và mô học được tiến hành từ rất sớm từ cuối thế

kỷ XII nhưng mãi đến thế kỷ XIX thì tế bào học và mô học mới được xem là một môn khoa học Sau khi học thuyết tế bào ra đời năm 1839, đặc biệt là lĩnh vực mô học mô tả ra đời thì những thành phần cấu tạo khác nhau của cơ quan

và các mô được nghiên cứu cẩn thận, tỉ mỉ hơn Thành tựu lớn nhất của giai đoạn này là chế tạo ra máy cắt lát mỏng (microtome) cho phép nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc vi thể của tế bào và mô (Nguyễn Quốc Thịnh, 2002)

Ngoài ra theo Phạm Trần Nguyên Thảo (2003) lịch sử mô học bắt đầu từ khi chiếc kính hiển vi đầu tiên được chế tạo bởi Antoni Van Leuwenhoek (1632-1723) người Hà Lan và đến cuối thế kỷ XVIII nhà khoa học người Anh Robert Hooke (1635-1703) đã xác định tế bào là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật Vào cuối thế kỷ XIX, Rudolf Virchow (1821-1902) nhà giải phẩu học người Đức

đã khẳng định: “ Bệnh tật là do tổn thương rối loạn tế bào” Trên cơ sở đó mà người ta đã hiểu được rằng bệnh tật không chỉ là do tổn thương, rối loạn ở các

cơ quan, nội tạng mà còn ở mức độ mô và tế bào

Mô học có thể định nghĩa như một hệ thống các tế bào và chất gian bào có cùng nguồn gốc, cấu tạo và chức năng, chúng được hình thành trong quá trình tiến hoá sinh học và xuất hiện ở một cơ thể đa bào do quá trình biệt hoá (Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003)

Ở nước ta hiện nay mô học đã trở thành một môn khoa học quan trọng và từ lâu đã được đưa vào giảng dạy trong các trường Đại học trên cả nước Và mô học cũng đã được nghiên cứu nhiều trên người, gia súc, gia cầm, thủy sản …

2.3 Ứng dụng mô bệnh học trong chẩn đoán bệnh thủy sản

Young (1959), Johnson (1980) đã ứng dụng giải phẩu học và mô học trong việc hệ thống các bệnh thường gặp trên tôm nuôi ở Châu Mỹ, Châu á (Lightner và ctv, 1992); năm 1997 Wang, Tang và Chen chứng minh sự hiện

diện của vi rút đốm trắng trên tôm Giant tiger shrimp, Penaeus monodon, Kuruma shrimp, Penaeus japonicus bằng việc quan sát tiêu bản mô học dưới

kính hiển vi quang học và điện tử (trích dẫn bởi Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trong quyển “Histopathology of walking catfish” của Chinabut và Limsuwan

(1983) tác giả đã nghiên cứu mô học của cá trê trắng (Clarias batrachus) bị nhiểm khuẩn Aeromonas hydrophyla Kết quả thấy được khi cá bị nhiểm khuẩn Aeromonas hydrophyla thì gan, thận bị thoái hoá và hoại tử; tỳ tạng bị

và hoại tử dữ dội, các tế bào bị viêm, sưng, chứa đầy các khuẩn lạc lớn gram

âm Trên thận và tỳ tạng xuất hiện những vùng mô tạo máu bị hoại tử mất hết các tế bào máu trưởng thành, viêm cầu thận và có sự xâm nhập của lympho bào Gan, tuyến tụy xuất hiện dịch viêm, hoại tử rãi rác và các trung tâm hoại

tử Ở gan, thận tỳ tạng và tuyến tụy đều có sự gia tăng của các trung tâm đại thực bào sắc tố Tắt nghẽn mạch máu ở tim và xuất hiện dịch viêm ở vách bóng hơi Rukyani (1990a) nghiên cứu thay đổi mô bệnh học trên mang cá

chép (Cyprius carpio) bị nhiểm thích bào tử trùng (Myxobolus) Nghiên cứu

mô cho thấy mang cá bị túi thích bào tử trùng ký sinh nhiều thì các phiến mang sẽ bị dính lại, sưng viêm, xung huyết và hoại tử (trích dẫn bởi Bùi Châu Trúc Đan, 2003)

Angka (1990) đã nghiên cứu bệnh trên cá trê trắng (Clarias batrachus) bị nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophyla Tác giả đã nghiên cứu mô tả về đặc

điểm bệnh lý, LD50 và mô bệnh học Kết quả cho thấy khi cá bị nhiễm vi

khuẩn Aeromonas hydrophyla thấy xuất hiện những vùng xuất huyết, hoại tử

trên gan, thận, tỳ tạng và cơ quan sinh dục Tác giả còn cho rằng nguyên nhân

có thể là do chất Cytoxin do vi khuẩn tiết ra

Sisi Hla Bu và Leong Tak Seng (1997) nghiên cứu mô bệnh học trên cá bống

mú bị bệnh “Sleepy Gouper Desease” mỗi điểm cá bệnh lấy 3 mẫu cá khoẻ và

6 mẫu cá bệnh và khảo sát trên 9 cơ quan: mang, tim, thận, tỳ tạng, não, da, dạ dày và ruột các cơ quan này được cố định, xữ lý nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi quang học kết quả có 5 cơ quan có sự thay đổi cấu trúc hiển vi khi so sánh giữa cá khoẻ và cá bệnh là gan, mang, tim, thận và tỳ tạng (trích dẫn bởi Nguyễn Quốc Thịnh, 2002)

Nguyễn Quốc Thịnh (2002) đã nghiên cứu mô bệnh học bệnh đốm trắng trong

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

nhất là gan, thận và tỳ tạng và kế đến là mang và cuối cùng bị ảnh hưởng nhẹ nhất là tim và cơ Nguyên nhân làm cho cá chết có thể là do gan, thận, tỳ tạng, mang bị hư hại dẫn đến mất chức năng của các cơ quan này

Bùi Châu Trúc Đan (2003) đã nghiên cứu đặc điểm mô học bệnh phù mắt trên

cá tra Tác giả đã nghiên cứu trên 10 cơ quan gồm: gan, thận, tỳ tạng, tim, mang, ruột, dạ dày, bóng hơi, mắt, da và cơ Kết quả về đại thể đặc điểm đặc trưng của bệnh là: một hoặc hai mắt phù to, ổ mắt chứa đầy chất dịch màu trắng đục, xuất huyết trong và ngoài cơ thể, về vi thể tổn thương chủ yếu là sung huyết, xuất huyết Nguyên nhân làm cá chết là do những thay đổi cấu trúc mô của gan, thận, tỳ tạng với các vùng hoại tử và cấu trúc thay đổi và do tổn thương ở mắt dẫn đến rối loạn các hoạt động sinh lý, sinh hóa trong cơ thể Các cơ quan khác thì bình thường

Trần Hồng Ửng (2003) bước đầu xác định sự thay đổi của tế bào bạch cầu và

mô tỳ tạng trên cá tra bị bệnh trắng gan Kết quả cho thấy khi cá tra bị bệnh trắng gan thì thành phần bạch cầu thay đổi, tế bào lymphocyte thấp hơn so với

cá khỏe, neutrophil và monocyte tăng cao hơn Cấu trúc tỳ tạng biến đổi và thành phần tủy trắng nhiều hơn tủy đỏ

“Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng hồng cầu trên cá tra bị bệnh vàng da” của Phan Thị Hừng (2004), tác giả đã khảo sát cấu trúc mô của

3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng Kết quả khi cá bị bệnh vàng da thì cấu trúc mô của 3 cơ quan này không thay đổi so với cá khỏe và số lượng tế bào hồng cầu giảm đi hơn 50% so với cá khỏe

Nguyễn Quốc Thanh (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của Aflatoxin lên tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống trên cá tra và cá basa Kết quả cho thấy khi cá bị nhiểm độc tố Aflatoxin thì cấu trúc gan, thận bị sung huyết, xuất huyết, nhân

tế bào bị hoại tử…

Phạm Thị Như Sang (2006) đã khảo sát mô học trên một số cơ quan của cá tra nuôi ao và bè thâm canh Tác giả đã phân tích mô học trên 3 cơ quan: gan, thận và tỳ tạng Kết quả cho thấy cả 3 cơ quan trên đều có trùng bào tử sợi ký sinh Ngoài ra còn phát hiện giun tròn ở mô gan cá Cùng thời gian này, Trần Thị Ngọc Hân (2006) cũng đã khảo sát mô học cá tra bị bệnh mủ gan trong điều kiện gây cảm nhiễm Kết quả phân tích mô bệnh học trên 9 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng, dạ dày, bóng hơi, cơ, mang, tim, ruột cho thấy khi cá bị bệnh mũ gan thì thận và tỳ tạng là cơ quan biến đổi đầu tiên, gan biến đổi chậm hơn thận và tỳ tạng Các cơ quan tim và dạ dày, bóng hơi, ruột ít biến đổi

Tung et al (1999) nghiên cứu mô học và quan sát bằng kính hiển vi điện tử trên tôm càng xanh bị bệnh vi rút trên cơ Macrobrachium muscle virus

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

(MMV) ở Đài Loan Dấu hiệu bệnh lý tôm có màu trắng đục ở phần bụng, ăn yếu, bơi lờ đờ Mô bệnh học tương tự bệnh hoại tử cơ (IMP) và tác giả đã tìm thấy thể vùi trong cơ bị hoại tử ; Bhavan and Geraldine (2002) nghiên cứu mô

bệnh học trên gan tuỵ và mang tôm Macrobrachium malcolmsonii khi tiếp xúc

với endosulfan Kết quả có nhiều biến đổi về mô học trên gan tụy và mang tôm Những biến đổi bao gồm: sự tích tụ của các tế bào hồng cầu trong khe của các xoang, ống gan tụy bị hoại tử, tấm mang không bình thường và phát

triển quá mức, bị hoại tử; Andersen et al (2000) nghiên cứu bệnh mới trên vỏ cua (Sylla serrata) ở Queensland (Australia) Dấu hiệu mô bệnh học của

những ống bị hư bên trong thấy có sự lây nhiễm ký sinh trùng và cho rằng đây

là nguyên nhân gây ra đốm nâu trên vỏ cua (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Cương, 2006)

Theo Trần Thị Ngọc Hân (2006), Hibiya (1982) đã mô tả quá trình biến đổi

mô bệnh học trên tất cả các cơ quan trên cơ thể cá bệnh như cá chình, cá chép,

cá hồi

Nghiên cứu về mô bệnh học trên cá thơm (Plecoglossus altivelis) bị bệnh xuất

huyết do vi khuẩn Nghiên cứu mô học đã phát hiện những tổn thương ở tỳ tạng, thận, gan, ruột , tim và mang Những tổn thương ở tỳ tạng và mô tạo máu thì dễ nhận biết do bị tấn công bởi vi khuẩn trên Những vết hoại tử đi kèm với xuất huyết, đông máu và trương phòng xuất hiện ở phần tủy của tỳ tạng, biểu

bì mô và trong thận Trên gan cũng có hiện tượng hoại tử và sự hình thành

vùng áp-xe Tuy nhiên ruột, tim và mang chỉ bị vi khuẩn P altivelis tấn công

ở mức không đáng kể Tuy nhiên không có sự tổn thương và vi khuẩn không

(http://www.mekongfish.net.vn/modules/news/article.php?storyid=102)

Ngoài ra còn có các nghiên cứu mô học chỉ nghiên cứu trên cá khỏe như: Chinabut và ctv (1991) đã nghiên cứu về mô học trên cá trê trắng Tác giả chỉ khảo sát ở mô khỏe trên các cơ quan thuộc hệ tiêu hoá, hệ tuần hoàn, hệ sinh dục…mục đích chủ yếu là làm cơ sở để so sánh trong nghiên cứu mô học

Grizzle et al (1976) giải phẩu và nghiên cứu mô học trên cá nheo Tác giả đã

mô tả đặc điểm về mô trên nhiều cơ quan của cá nheo như hệ thần kinh, hệ cơ,

hệ tiêu hoá

Groman (1982) đã nghiên cứu mô học trên cá chẽm Ông đã quan sát cấu trúc

mô khỏe của hệ hô hấp, hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, hệ tiêu hoá, hệ sinh dục,

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

nghiên cứu trên các cơ quan như da, cơ, xương, hệ tiêu hóa, hệ hô hấp, hệ tuần hoàn, hệ bài tiết, hệ sinh dục, hệ thần kinh…

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá tra khoẻ ở giai đoạn cá thịt, thu khoảng 30 con, mỗi con khoảng 500 gram

3.2 Địa điểm và thời gian thực hiện Địa điểm thu mẫu: Cần Thơ

Địa điểm phân tích mẫu: phòng mô học, khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ

Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 2/2008 đến tháng 6/2008 3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Dụng cụ: gồm có bộ đồ tiểu phẩu, khay nhựa, kính hiển vi, lame, lamell,

keo nhựa, cốc thủy tinh (lớn, nhỏ), máy cắt lát mỏng (Microtome), khuôn đúc mẫu, cassette, máy nhuộm mẫu tự động, máy Slide warmer, máy đúc khối, tủ lạnh, tủ hút, viết chì, máy ảnh và một số vật dụng khác

3.3.2 Hóa chất: gồm có nước cất, cồn tuyệt đối, formol thương mại, Bouin

Xylem, paraffin, sáp ong, dung dịch nhuộm Haematocyline và Eosin, keo dán Enterlan cùng một số hóa chất khác

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu mô

Thu mẫu: cá tra khỏe

Về đặc điểm bên ngoài:

Cá khỏe là cá bơi lội linh hoạt, nhanh nhẹn, bắt mồi nhanh, phản ứng nhanh với các tiếng động Màu sắc cá bình thường, lưng có màu xám đen, bụng có màu trắng bạc Hình dạng bên ngoài bình thường, các vây không bị rách hay

bị xuất huyết, không có những vết lỡ loét, xuất huyết trên da cũng như ở các gốc vây Không có dấu hiệu như bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước (hình 3.1)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 3.1: Đặc điểm bên ngoài của cá tra khỏe

Về đặc điểm bên trong:

Khi mổ cá ra thì bên trong cơ thể không có chất dịch lạ, các cơ quan nội tạng phải có màu sắc bình thường, đồng nhất trên từng cơ quan, các cơ quan không

bị sưng hay bị nhũn

Lấy mẫu mô

Mẫu mô được lấy ở các cơ quan: da, cơ, hệ tiêu hoá (dạ dày, ruột), mang, bóng hơi, tim gan, thận, tỳ tạng

 Gan, thận, bóng hơi: dùng dao, kéo cắt nguyên cơ quan, sau đó cắt nhỏ

ra làm 2 phần và bỏ vào dung dịch cố định

 Da, cơ: dùng lưỡi dao bén cắt dứt khoát, lưỡi dao thẳng góc với bề mặt

cơ quan Mẫu cắt dày khoảng 2cm, bề dày khoảng 1cm

 Tỳ tạng, tim: dùng kéo cắt nguyên cơ quan

 Mang: dùng kéo cắt đứt 2 gốc xương cung mang và lấy toàn bộ cung mang

 Dạ dày, ruột: dùng kéo cắt lấy nguyên cơ quan, sau đó cắt ra làm 2 đoạn

Đối với các cơ quan có kích thướt lớn khi lấy mẫu mô nên cắt ra làm nhiều phần nhỏ để dung dịch cố định có thể ngấm tốt vào mẫu

3.4.2 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

 Rửa nước

Sau khi mẫu được cố định 24 giờ ta tiến hành rửa Bouin bằng nước và cồn

500 Để mẫu dưới vòi nước chảy liên tục 1-2 giờ, rửa mẫu cho đến khi hết dung dịch màu vàng sau đó chuyển mẫu ngâm trong 24 giờ trong cồn 600

 Cắt tỉa định hướng

Sau khi mẫu được ngâm trong cồn 600, lấy mẫu ra và cắt tỉa định hướng mẫu với kích thướt rộng khoảng 0,5-1cm và chiều dày từ 0,3-0,5cm, sau đó cho mẫu vào cassete và ngâm trong cồn 700 1 ngày trước khi tiến hành xử lý mẫu

 Xử lý mẫu Loại nước

Sau khi mẫu được rửa sạch Bouin bằng nước máy, loại bỏ nước bằng cách ngâm mẫu trong dung dịch cồn với các nồng độ tăng dần từ 800, 950, 1000 để loại sạch hoàn toàn nước trong mẫu

Tẩm dung môi trung gian

Paraffin là chất nền giúp cho tế bào vẫn giữ nguyên hình dạng sau khi cắt, nhưng vì paraffin và ethanol không hòa tan vào nhau được nên phải dùng dung môi trung gian là xylen có khả năng hòa tan được cả paraffin và ethanol

Tẩm paraffin: Paraffin phải được tẩm hoàn toàn vào mẫu, khi tẩm paraffin

phải ở trạng thái nóng chảy (khoảng 650C)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Quy trình xữ lý mẫu (máy xử lý: Sproceeding tissue (MICROM, STP

120-2))

 Đúc khối: (máy đúc khối: MICROM EC 350-1)

Chuyển cassette chứa mẫu đã được xử lý vào khoang chứa paraffin nóng chảy trên máy đúc khối, để cassette trong paraffin khoảng 30 phút, tiến hành đúc khối Mẫu mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối bằng paraffin nóng chảy ở 650C

Đổ một ít paraffin vào khuôn inox, gắp mẫu bỏ vào khuôn sau đó đặt mẫu ngay ngắn và ấn sát mẫu vào đáy khuôn và đặt khuôn inox lên chổ làm lạnh trên máy đúc khối để cố định sơ bộ mẫu trên khuôn

Đặt cassette có ký hiệu mẫu lên trên, tiếp tục đỗ paraffin vào đầy khuôn inox Tiếp theo đặt khuôn inox qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn và chuẩn bị cắt mẫu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

 Cắt mẫu (máy cắt mẫu:Yamato-PR-50)

Trước khi mẫu đưa vào máy cắt, dùng lưỡi dao cắt tỉa khối paraffin sao cho khối paraffin có hình tháp (hình 3.3) Mục đích của cách làm này là để dễ cắt

mẫu và khi cắt ra, mẫu sẽ đẹp

Tiến hành cắt mẫu:

Gắn mẫu vào máy cắt mỏng (Microtome) theo chiều ngang của cassette sao cho khối mẫu ngang và thẳng đứng sau đó điều chỉnh độ dày của lát cắt Bắt đầu bằng những lát cắt 12-16m Sau khi đã cắt bằng mặt khối mẫu và đạt đến vị trí mẫu mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt về vạch 1-2m và tiến hành cắt mẫu

 Dán mẫu

Mẫu được cắt ra thành những băng dài, sau đó dùng dao thái hoặc kim mũi giáo trải mẫu lên một cốc thủy tinh lớn đựng nước ấm để cho mẫu được căng

ra

Sau khi đã chọn được đoạn mẫu đạt yêu cầu, dùng lame để vớt mẫu lên Cầm

1 đầu của lame, đầu kia cho vào cốc nước thuỷ tinh phía dưới mẫu, sau đó từ

từ nâng lên và điều chỉnh cho mẫu ngay ngắn trên lame

Để lame khô tự nhiên khoảng 15 phút sau đó chuyển lame lên máy Slide warmer ủ ở nhiệt độ 450 sau 4 giờ để cố định mẫu lên lame Sau khi dán mẫu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

 Nhuộm mẫu

Mẫu được nhuộm bằng tay, nhuộm mẫu bằng tay có thể tự điều chỉnh thời gian lại ở bất cứ giai đoạn nào trong khi nhuộm nếu nhuộm không được tốt Nhuộm mẫu bằng dung dịch Haematoxylin và Eosin (H&E) theo qui trình của Harris (1900) (có điều chỉnh) như sau:

 Dán lamelle vào lame

Để bảo quản mẫu được lâu và tăng tính chiết quang cần dùng keo dán Enterlan

để dán tiêu bản vĩnh viễn Nhỏ một giọt keo lên vùng có miếng mô, đặt lamelle nghiêng 450 và tiếp xúc với giọt keo, dùng kim mũi giáo hạ lamelle xuống từ từ để tránh tạo bọt khí Để lame khô 24 giờ sau đó đọc kết quả Thao tác này cần làm nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong không khí vào miếng mô

5 phút

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

 Đọc kết quả (kính hiển vi: Carl Zeiss)

Sau khi có được tiêu bản hoàn chỉnh ta tiến hành đọc kết quả, tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi lần lượt ở các độ phóng đại 10X, 40X, 100X Lựa chọn ra các tiêu bản mô đẹp, đạt yêu cầu và chụp ảnh lại các tiêu bản đó Bằng phương pháp nhuộm H&E có thể quan sát rõ được cấu trúc mô của các cơ quan trên cá tra Tiêu bản đẹp phải có nhân bắt màu tím xanh của Haematoxylin, phần còn lại bắt màu hồng của Eosin

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

PHẦN 4 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN

4.1 Da và cơ

 Da:

Da là cơ quan bao phủ toàn bộ bề mặt cơ thể cá do đó nó tiếp xúc trực tiếp với các điều kiên môi trường bên ngoài cũng như với các loại mầm bệnh Ngoài chức năng là hàng rào vật lý chống lại mầm bệnh, da còn tham gia quá trình

hô hấp và bài tiết, tham gia điều hòa áp suất thẩm thấu và tạo ra tuyến đơn bào, tuyến đa bào, tuyến độc và tạo vẩy ở cá có vẩy (Nguyễn Bạch Loan,

2004)

Khi quan sát dưới kính hiển vi, từ ngoài vào trong cấu tạo của da gồm 2 lớp: lớp ngoài cùng là lớp biểu bì, lớp kế tiếp là lớp hạ bì (hay lớp da dưới biểu bì) (hình 4.1) Lớp biểu bì được cấu tạo chủ yếu là các tế bào hình vẩy, theo Roberts (1989) các tế bào này phân tầng với số lượng tế bào thay đổi theo loài, lứa tuổi, vị trí trên cơ thể cá và các giai đoạn của chu kì sinh sản

Lớp giữa của biểu bì là các tế bào chùy có kích thướt lớn, các tế bào này có hình tròn hoặc oval và có 1 nhân hoặc 2 nhân bên trong (hình 4.2) Lớp hạ bì nằm bên dưới lớp biểu bì và được cấu tạo bởi các mô liên kết, bên trong biểu

bì phân bố nhiều mạch máu và dây thần kinh (hình 4.3) Ngoài ra trên da cá tra còn có các tế bào sắc tố (melamin), các tế bào này tạo nên màu sắc của da cá

và thường phân bố ở nơi tiếp giáp giữa biểu bì và lớp hạ bì và một phần nằm ở bên dưới lớp hạ bì

Theo Chinabut và ctv (1991) lớp biểu bì của cá tra có thể chia làm 2 lớp, lớp mặt là các tế bào hình thoi có thể sắp xếp 2-3 tầng ở bề mặt vùng lưng và 5-6 tầng ở vùng bụng của cơ thể, đây là tầng biểu mô hình vẩy Ở giữa các tế bào này còn tìm thấy các tế bào tiết dịch nhờn hình tròn hoặc oval Lớp giữa của biểu bì là các tế bào chùy (Club cells) được bao quanh bởi các tế bào biểu bì khác

Theo Harris và ctv (1973) khi phân tích thành phần hóa học của nhớt cá cho

thấy chúng được cấu tạo từ protein và carbohydrate (trích dẫn bởi Chinabut và

ctv, 1991) Tác dụng của nhớt cá như là rào cản vật lý bảo vệ cơ thể chống lại

sự xâm nhập của vi khuẩn, làm giảm tính độc của các vết thương, giảm bớt ma sát của cá khi chúng di chuyển… (Harder, 1975 trích dẫn bởi Groman, 1982) Ngoài ra theo Nguyễn Bạch Loan (2004) các tuyến dịch nhờn có tác dụng tiết dịch nhờn làm trơn bề mặt cơ thể, lắp đầy các chỗ lõm trên cơ thể để giảm ma sát khi di chuyển Ngoài ra tuyến dịch nhờn còn có tác dụng điều hòa áp suất

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

thẩm thấu và bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh bên ngoài môi trường

Hình 4.1: Mặt cắt dọc da cá tra (H&E, 10X) A: lớp cơ; B: lớp hạ bì; C: lớp biểu bì; D: các tế bào sắc tố (melanin)

Hình 4.2: Mặt cắt dọc lớp biểu bì da cá tra (H&E, 100X) A: tế bào biểu mô; B: tế bào chùy; C: các tế bào sắc tố (melanin)

C

D

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.3: Mặt cắt dọc lớp hạ bì (H&E, 100X) A: mô liên kết; B các dây thần kinh

Có 3 loại cơ: cơ trơn, cơ vân và cơ tim

Cơ trơn được tìm thấy chủ yếu ở vách nội tạng, các tuyến, các ống dẫn, các mạch máu, cơ trơn có dạng hình thoi, ngắn, thô và chịu sự điều khiển của hệ thần kinh giao cảm nên phản ứng chậm chạp (cơ trơn sẽ được mô tả chi tiết ở phần các cơ quan nội tạng) Cơ vân thường liên kết với xương, giúp xương cử động nhịp nhàng Cơ vân chịu sự điều khiển của hệ thần kinh trung ương thuộc não và tủy sống nên phản ứng nhanh nhẹn Cơ vân có dạng hình thoi, thon dài và thường phân bố ở 2 vách thân, thực quản nên nó chiếm tỉ lệ cao trong cơ thể cá (Chinabut và ctv,1991)

Cơ tim phân bố ở tim cá, nó có đặc tính trung gian giữa cơ vân và cơ trơn Tế bào cơ tim rộng, ngắn, thô như cơ trơn, mỗi tế bào chỉ có 1 nhân Cơ tim chịu

sự chi phối của hệ thần kinh giao cảm nhưng cơ tim co giãn nhanh hơn cơ trơn nhưng chậm hơn cơ vân ( Nguyễn Bạch Loan, 2004) (cơ tim sẽ được mô tả chi tiết ở phần tim)

Đơn vị nhỏ nhất của cơ là các sợi cơ (tế bào cơ), trong sợi cơ có hàng trăm dây

tơ prôtêin nhỏ được tách ra thành 2 sợi: sợi actin (mõng) và mioxin (dày) Khi

A

B

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

cơ cá cử động hay co rút là kết của của sự đan xen giữa 2 sợi này vào nhau (Chinabut và ctv, 1991)

Cơ cá tra được quan sát ở đây là cơ vân dọc 2 bên thân cá, cơ nằm dưới lớp hạ

bì của da Khi quan sát mặt cắt dọc của lớp da cơ từ ngoài vào trong ta thấy đầu tiên là lớp biểu bì của da kế đến là lớp hạ bì và trong cùng là lớp cơ (hình 4.1) Ở mặt cắt dọc ta thấy các sợi cơ chạy dọc và bên trong có 1 nhân (hình 4.4)

Hình 4.4: Mặt cắt dọc cơ vân cá tra (H&E, 100X) A: tế bào cơ; B: nhân

Ở mặt cắt ngang ra thấy các bó cơ có hình đa giác hoặc hình tròn nhưng không nhìn thấy nhân, giữa các bó cơ này là các mô liên kết (hình 4.5)

A

B

A

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.5: Mặt cắt ngang cơ vân cá tra (H&E, 40X) A: các bó cơ

4.2 Dạ dày và ruột

 Dạ dày

Dạ dày nằm nối tiếp sau thực quản và kết thúc ở cơ co thắt môn vị ở phần ruột trước Chức năng chính của dạ dày là chứa thức ăn và tiết ra các men tiêu hóa thức ăn Dạ dày có cấu trúc giống như thực quản nhưng lớp cơ bên ngoài của thực quản là lớp cơ vân còn ở dạ dày là cơ trơn

Dạ dày cá tra có hình chử J bao gồm 2 phần: phần thân vị và phần môn vị

Khi quan sát ở mặt cắt ngang của phần thân vị ta thấy từ ngoài vào là lớp thanh mạc được cấu tạo bởi mô liên kết sợi, kế đến là lớp cơ trơn bao gồm lớp

cơ dọc bao bên ngoài và lớp cơ vòng bao bên trong, đây là lớp cơ có chức năng co bóp giúp chon quá trình tiêu hóa thức ăn, tiếp theo là lớp dưới niêm mạc được cấu tạo bởi các mô liên kết và có nhiều mạch máu phân bố và trong cùng là lớp niêm mạc dạ dày được cấu tạo bởi các tế bào biểu mô trụ đơn với các tuyến thuộc dạ dày (hình 4.6) Theo chinabut và ctv, 1991 lớp dưới niêm mạc cấu tạo bởi lớp mô liên kết có chứa các lympho bào nhỏ và các tế bào hạt

ưa eosin

Phần môn vị cũng giống như phần thân vị nhưng không có tuyến dạ dày và lớp

cơ trơn bên ngoài thì dày hơn (Grizzle & Rogers , 1976)

Hình 4.6: Mặt cắt ngang của dạ dày (H&E, 10X) A: lớp thanh mạc; B: lớp cơ dọc; C: lớp cơ vòng; D: lớp dưới niêm mạc; E: mạch máu; F: tuyến thuộc dạ

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.7: Mặt cắt ngang của dạ dày (H&E, 10X) A: lớp dưới niêm mạc; B: tuyến thuộc dạ dày; C: lớp màng nhày niêm mạc; D: lớp niêm mạc

Hình 4.8: Mặt cắt ngang lớp dưới niêm mạc dạ dày (H&E, 40X) A: mô liên kết; B: Mạch máu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.9: Các tế bào tuyến dạ dày (H&E, 40X).A: tế bào tuyến

 Ruột

Ruột bắt đầu từ cơ co thắt môn vị và kết thúc ở hậu môn Ruột hình ống dài, gấp khúc hay cuộn tròn tùy thuộc vào tính ăn của loài Cá tra là loài ăn tạp nên ruột của nó có hình gấp khúc Ruột là phần rất quan trọng trong sự tiêu hóa thức ăn vì ở đây các quá trình tiêu hóa thức ăn được hoàn tất và những sản phẩm cuối cùng của tiêu hóa sẽ được hấp thụ Ruột tiết ra men tiêu hóa thức

ăn và tiếp nhận men tiêu hóa từ các tuyến tiêu hóa khác chuyển đến

Ruột còn là cơ quan hô hấp phụ của cá tra khi môi trường thiếu oxi Lúc này

cá ngoi lên mặt nước và đớp lấy không khí, không khí lấy vào đoạn ruột sau sẽ trao đổi khí với máu, khí thừa sẽ theo hậu môn ra ngoài (Đỗ Thị Thanh Hương

và Trần Thị Thanh Hiền, 2000)

Giống như dạ dày ruột được cấu tạo bởi 4 lớp: lớp thanh mạc, lớp cơ trơn, lớp dưới niêm mạc và trong cùng là lớp niêm mạc ruột (hình 4.10) nhưng lớp cơ trơn và lớp thanh mạc của ruột thì mỏng hơn của dạ dày và phần niêm mạc của ruột thì nhỏ và nhô cao hơn so với niêm mạc của dạ dày

A

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.10: Mặt cắt ngang của ruột cá tra (H&E, 5X) A: lớp thanh mạc; B: lớp

cơ dọc; C: lớp cơ vòng; D:lớp dưới niêm mạc; E: lớp niêm mạc ruột

Hình 4.11: Mặt cắt ngang của ruột cá tra (H&E, 10X) A: lớp thanh mạc; B: lớp cơ dọc: C: lớp cơ vòng; D: lớp dưới niêm mạc; E: lớp niêm mạc ruột Tương tự như dạ dày, khi quan sát ở mặt cắt ngang của ruột từ ngoài vào là lớp thanh mạc mỏng được cấu tạo bởi mô liên kết sợi, kế đến là lớp cơ trơn, lớp cơ trơn cũng được chia làm 2 phần là lớp cơ dọc bao bên ngoài và lớp cơ

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.12: Mặt cắt ngang lớp cơ thành ruột cá tra (H&E, 40X) A: các sợi cơ dọc; B: các sợi cơ vòng

Hình 4.13: Mặt cắt ngang lớp dưới niêm mạc ruột cá tra (H&E, 40X) A: mô liên kết; B: hồng cầu trong xoang mao mạch

A

B

A

B

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.14: Mặt cắt ngang lớp niêm mạc ruột cá tra (H&E, 40X) A: lớp dưới niêm mạc; B: lớp niêm mạc; C: tế bào biểu mô trụ đơn

4.3 Gan

Gan cá tra là một cơ quan lớn nằm ở phần đầu của xoang nội quan gần vi ngực, gồm có 3 thùy bao quanh dạ dày Gan cá tra thường có màu nâu, nâu vàng Theo Nguyễn Bạch Loan (2004), gan có chức năng chính trong sự tiêu hóa, nó tiết ra dịch mật màu xanh hoặc xanh vàng đỗ vào túi mật và ruột non qua ống dẫn mật và gan còn là nơi giải độc cho cơ thể và tích trữ đường dưới dạng Glycogen hay nói cách khác là tham gia vào sự điều hòa lượng đường trong máu cá

Khi quan sát lát cắt ngang của gan dưới kính hiển vi, gan cá tra được bao bọc bên ngoài bởi 1 lớp tế bào biểu mô lát đơn mỏng, kế đến là các xoang mao mạch chứa hồng cầu và những dãy tế bào gan có hình đa giác, bên trong có một nhân hình cầu, các dãy tế bào này sắp xếp theo hướng lan tỏa từ tĩnh mạch trung tâm (hình 4.15) Mặt khác trong gan còn có các ống mật dẫn mật đi từ gan đến túi mật giúp cho quá trình tiêu hóa thức ăn và rất nhiều các tế bào tụy hay đảo tụy cùng với các trung tâm đại thực bào sắc tố nằm rải rác trong gan (hình 4.16) Ngoài ra trên gan còn có các tĩnh mạch cửa gan, động mạch gan, tĩnh mạch gan (Đặng Thụy Mai Thy, 2007)

A

B

C

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.15: Mặt cắt ngang của gan cá tra (H&E, 10X) A: lớp ngoài của gan; B: đảo tụy; C: xoang mao mạch; D: tế bào gan; E: trung tâm đại thực bào sắc tố

Hình 4.16: mặt cắt ngang của gan cá tra (H&E, 10X) A: đảo tụy; B: ống mật;

C: trung tâm đại thực bào sắc tố

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.17: Mặt cắt ngang của gan cá tra (H&E, 20X) A: lớp ngoài của gan;

B: tế bào gan; C: xoang tĩnh mạch

Hình 4.18: Tế bào gan cá tra (H&E, 100X) A: các tế bào gan với nhân bên trong

B

A

C

A

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.19: Mặt cắt ngang tĩnh mạch trung tâm gan cá tra (H&E, 10X) A: tĩnh mạch trung tâm; B: đảo tụy

Hình 4.20 Đảo tụy (H&E, 100X) A: các tế bào tuyến tụy; B: các hạt ưa eosin

Theo Groman (1982) các tuyến tụy ngoại tiết do tụy tạng mở rộng vào bên trong gan và kết hợp với gan tạo thành tuyến tụy hay đảo tụy Các tế bào nang của tuyến này kết hợp lại tạo thành 1 nhóm tế bào với tế bào chất ưa bazơ và chứa một lượng lớn hạt ưa eosin

A

A

B

B

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Các đảo tụy (tuyến tụy) có hình bầu dục hoặc tròn, do nhiều tế bào tuyến kết lại thành đám có chức năng tiết ra 2 loại kích thích tố là Insulin và Glucagon

để điều hòa lượng đường trong máu (Nguyễn Bạch Loan, 2004) Ngoài những chức năng trên, đảo tụy còn có vai trò tiết dịch tụy đổ vào ruột để tiêu hóa thức

ăn, các đảo tụy và trung tâm đại thực bào sắc tố thường phân bố cùng nhau tạo thành 1 lớp bao xung quanh các nhánh lớn của tĩnh mạch gan trung tâm (Bùi Châu Trúc Đan, 2003)

Ngoài ra theo Chinabut và ctv (1991) trên gan cá tra còn có ống mật hay ống dẫn mật từ gan về túi mật Theo mặt cắt ngang, cấu trúc chính của ống dẫn mật

là lớp biểu mô trụ đơn được bao quanh bởi lớp mô liên kết sợi và 1 vài tế bào

cơ trơn (hình 4.21)

Hình 4.21: Mặt cắt ngang của ống mật (H&E, 100X) A: tế bào trụ đơn; B: mô

liên kết Trên gan cá tra còn có các xoang mao mạch chứa các tế bào hồng cầu, xoang

mao mạch là nơi để gan thực hiện chức năng lọc và làm sạch máu (hình 4.23)

A

B