PHÂN TÍCH MỘT SỐ PHẨM MÀU HỮU CƠ TỔNG HỢP BẰNG HPLC-DAD.pdf

Tuy nhiên, Các phẩm màu tổng hợp thường đạt độ bền màu cao, với một lượng nhỏ đã cho màu đạt với yêu cầu đặt ra, nhưng chúng có thể gây ngộ độc nếu dùng loại không nguyên chất, kh

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM

LIÊU VĂN PHÚ

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ PHẨM MÀU HỮU CƠ TỔNG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM

Mã chuyên ngành: 52540106

BÁO CÁO TỐT NGHIỆP

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

Tên đề tài : Phân tích hàm lượng một số phẩm màu hữu cơ bằng phương pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao

Người hướng dẫn: TS Lê Nhất Tâm

i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho phép tôi được bày tỏ lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm – Trường Đại học Công Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và làm quen với môi trường làm việc Cùng với đó là được rèn luyện các kỹ năng phòng thí nghiệm, trau dồi và thực hiện hóa các kiến thức chuyên môn Tôi xin được cảm ơn thầy TS Lê Nhất Tâm đã hướng dẫn tận tình và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm báo cáo khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3, anh Nguyễn Thành Bảo – Trưởng phụ trách phòng Hóa đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến anh Đào Trí Nguyên đã giao đề tài, chỉ dẫn tận tình, trao đổi, định hướng về phương pháp và giúp đỡ tôi xuyên suốt quá trình nghiên cứu Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị trong phòng Hóa, phòng Sắc ký, quang phổ – Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành báo cáo này Đồng thời, giúp tôi được trực tiếp tiếp cận hơn với ngành nghề và cung cấp nhiều kiến thức cũng như những kỹ năng quan trọng trong phòng thí nghiệm

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên cũng không tránh những sai sót, rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và cán bộ hướng dẫn để báo cáo khóa luận này được hoàn thiện hơn

TP HCM, Ngày 23 tháng 05 năm 2021

Sinh viên

Liêu Văn Phú

ii

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Phẩm màu thực phẩm là một trong số những nhóm phụ gia thực phẩm được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Chúng được bổ sung vào thực phẩm với mục đích tạo cho sản phẩm có màu sắc đẹp, tăng tính hấp dẫn đối với người tiêu dùng, hoàn toàn không có giá trị

về mặt dinh dưỡng [1] Tuy nhiên, Các phẩm màu tổng hợp thường đạt độ bền màu cao, với một lượng nhỏ đã cho màu đạt với yêu cầu đặt ra, nhưng chúng có thể gây ngộ độc nếu dùng loại không nguyên chất, không được phép dùng trong thực phẩm hay vượt ngưỡng dùng cho phép

Trong nghiên cứu này, tôi tập trung vào việc thẩm định phương pháp đối với một số màu hữu cơ phổ biến: Sunset Yellow FCF, Allura Red AC, Erythrosine, Ponceau 4R, Amaranth, Tartrazine Từ đó ứng dụng vào mẫu phụ gia thực phẩm tạo màu Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và thẩm định phương pháp, thu được các thông số như

- Bước sóng cực đại hấp thu của Tartrazine, Sunset Yellow FCF, Allura Red AC, Ponceau 4R, Amaranth, Erythrosine lần lượt là 420 nm, 484 nm, 502 nm, 505

nm, 520 nm, 527 nm

- Tối ưu hóa lượng cân mẫu ở khoảng cân từ 40-100 mg

- Chương trình gradien của hệ dung môi CH3COONH4 20 mM - MeOH có thời gian lưu các chất tương đối ngắn, tách rời nhau, đỉnh các peak nhọn

- Khoảng tuyến tính từ 0,5 ppm – 50 ppm với hệ số tương quan R2>0,999

- Giới hạn định lượng của phương pháp là 1 ppm

- Độ lặp lại có %RSD nằm trong khoảng 0,92-1,46% và độ tái lập nộ bộ phòng thí nghiệm phù hợp với phương pháp phân tích có %RSD (lý thuyết) nhỏ hơn %RSD (thực nghiệm)

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT KHÓA LUẬN ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH HÌNH ẢNH vi

DANH SÁCH BẢNG BIỂU vii

DANH SÁCH SƠ ĐỒ viii

DANH SÁCH KÝ HIỆU – CHỮ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về phụ gia thực phẩm 3

1.1.1 Phụ gia thực phẩm là gì ? 3

1.1.2 Phân loại phụ gia thực phẩm 3

1.1.3 Vai trò của các loại phụ gia thực phẩm 6

1.1.4 Ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khỏe con người 7

1.2 Tổng quan về phẩm màu thực phẩm 8

1.2.1 Phẩm màu thực phẩm là gì ? 8

1.2.2 Phân loại phẩm màu thực phẩm 8

1.2.3 Hiện trạng sử dụng phẩm màu hữu cơ tổng hợp 9

1.2.4 Tổng quan một số phẩm màu hữu cơ tổng hợp thường dùng trong thực phẩm 10

1.2.5 Các nghiên cứu về phân tích hàm lượng phẩm màu hữu cơ 15

1.2.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 18

iv

1.2.7 Các thuật ngữ/định nghĩa liên quan đến thẩm định phương pháp thử

32

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34

2.1 Vật liệu 34

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ phân tích 34

2.2.1 Hóa chất 34

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 35

2.3 Phương pháp và nội dung thực hiện 35

2.3.1 Xây dụng quy trình xử lý mẫu 35

2.3.2 Phương pháp phân tích tổng hàm lượng màu bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis 37

2.3.3 Phương pháp phân tích định lượng chất màu hữu cơ bằng HPLC đầu dò DAD 37

2.3.4 Phương pháp phân tích và xử lý kết quả 38

2.3.5 Bố trí thực nghiệm 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45

3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp phân tích 45

3.1.1 Bước sóng cực đại hấp thu 45

3.1.2 Tối ưu lượng cân mẫu 46

3.1.3 Chương trình gradient pha động 48

3.2 Thẩm định phương pháp 50

3.2.1 Khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 50

v

3.2.2 Giới hạn định lượng (LOQ) 55

3.2.3 Độ lặp lại và độ tái lập nội bộ phòng thí nghiệm 58

3.3 Tổng hàm lượng chất màu bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis 62

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

4.1 Kết luận 66

4.2 Kiến nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

PHỤ LỤC 71

vi

DANH SÁCH HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Tartrazine 10

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Amaranth 11

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Ponceau 4R 12

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của Sunset Yellow 12

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của Allura red 13

Hình 1.6: Công thức cấu tạo của Erythrosine 14

Hình 1.7: Cấu tạo hệ thống HPLC 19

Hình 1.8: Sơ đồ hệ thống HPLC, 1 – Bể chứa dung môi, 2 – Hệ thống Gradient, 3 – Bơm cao áp, 4 – Bộ phận tiêm mẫu, 5 – Cột sắc ký, 6 – Detector, 7 – Chất thải, 8 – Bộ phận ghi nhận tính hiệu 22

Hình 2.1: Mẫu phẩm màu hữu cơ tổng hợp 34

Hình 3.1: Phổ đồ của các chất phân tích 46

Hình 3.2: Ảnh hưởng của lượng cân đến hàm lượng (%) của hợp chất trong mẫu 47

Hình 3.3: Sắc ký đồ HPLC của hệ dung môi CH3COONH4 20 mM – MeOH 49

Hình 3.4: Sắc ký đồ của hỗn hợp 6 chất ở nồng độ 0,5ppm 50

Hình 3.5: Sắc ký đồ của hỗn hợp 6 chất ở nồng độ 5ppm 51

Hình 3.6: Sắc ký đồ của hỗn hợp 6 chất ở nồng độ 20 ppm 51

Hình 3.7: Sắc ký đồ của hỗn hợp 6 chất ở nồng độ 50 ppm 52

Hình 3.8: Biểu đồ và phương trình đường chuẩn của 6 hợp chất 54

Hình 3.9: Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ở 3 nồng độ (0,025, 20 và 50 µg/mL)…55 Hình 3.10: Giới hạn định lượng của các phụ gia tạo màu 57

Hình 3.11: Hàm lượng (%) trung bình của 6 hợp chất 61

Hình 3.12: Biểu đồ thể hiện tổng hàm lượng trung bình chất màu 64

vii

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Phân nhóm, chức năng công nghệ và quy định của các chất phụ gia thực phẩm

3

Bảng 1.2: Phân loại chất phụ gia theo khoảng số INS 5

Bảng 1.3: Độ phân cực của một số dung môi phổ biến 30

Bảng 2.1: Chương trình gradient của pha động 38

Bảng 2.2: Bố trí thực nghiệm - Khảo sát bước sóng cực đại hấp thu 41

Bảng 2.3: Bố trí thực nghiệm - Thời gian lưu các chất 41

Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm - Tối ưu hóa lượng cân mẫu 42

Bảng 2.5: Bố trí thực nghiệm - Khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 42

Bảng 2.6: Bố trí thực nghiệm - Giới hạn định lượng 43

Bảng 2.7: Bố trí thực nghiệm – Độ lặp lại và tái lập nội bộ phòng thí nghiệm 43

Bảng 2.8: Bố trí thực nghiệm – Tổng hàm lượng chất màu 44

Bảng 3.1: Bước sóng cực đại hấp thu của các chất 45

Bảng 3.2: Hàm lượng (%) của các chất ở các lượng cân khác nhau 47

Bảng 3.3: Chương trình gradient của pha động 48

Bảng 3.4: Thời gian lưu của các chất phân tích 49

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn của 6 chất màu 53

Bảng 3.6: Giới hạn định lượng của các chất phân tích 56

Bảng 3.7: Hàm lượng (%) các phẩm màu trong nền mẫu màu hữu cơ tổng hợp 59

Bảng 3.8: Độ lặp lại và độ tái lập nội bộ phòng thí nghiệm 60

Bảng 3.9: Quy định của AOAC về độ lặp lại 61

Bảng 3.10: Độ hấp thụ của các chất chuẩn gốc 62

Bảng 3.11: Tổng hàm lượng chất màu của 6 lần lặp lại trong 2 ngày 63

Bảng 3.12: Tổng hàm lượng trung bình chất màu 64

Bảng 4.1: Hàm lượng phần trăm trung bình của các phẩm màu 67

viii

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Mối tương quan giữa chất phân tích, pha tĩnh và pha động 23

Sơ đồ 2.1: Quy trình thẩm định phương pháp phân tích 36

ix

DANH SÁCH KÝ HIỆU – CHỮ VIẾT TẮT

CAC Codex Alimentarius Committee Ủy ban mã thực phẩm

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

UV-Vis Ultraviolet–visible Quang phổ tử ngoại khả kiến

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

1

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

An toàn thực phẩm là việc bảo đảm để thực phẩm không gây hại đến sức khỏe, tính mạng con người [1] An toàn thực phẩm là vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt, được tiếp cận và sử dụng với thực phẩm an toàn đang trở thành quyền cơ bản đối với mỗi con người Trước đây, trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm con người đã biết cho thêm một số chất vào thực phẩm để bảo quản, nâng cao chất lượng hoặc làm tăng tính hấp dẫn của thực phẩm như ướp muối, trộn thính, nhuộm màu thức ăn bằng các loại lá,

củ, quả, hạt… các chất thêm vào như vậy được gọi là phụ gia thực phẩm

Những loại phẩm màu này không gây độc hại cho sức khỏe người tiêu dùng nhưng cũng cần sử dụng dưới mức giới hạn dư lượng cho phép Tuy nhiên, hiện nay vẫn có một số

cơ sở sản xuất, kinh doanh do quá ham lợi nên thường sử dụng phẩm màu vượt giới hạn cho phép, đặc biệt là màu tổng hợp hoặc sử dụng phẩm màu ngoài danh mục cho phép Thậm chí có cơ sở sản xuất thực phẩm đã liều lĩnh, xem thường tính mạng người tiêu dùng, lấy phẩm màu sử dụng trong công nghiệp đưa vào sản xuất thực phẩm gây hậu quả nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng (gây hậu quả tức thời như các trường hợp ngộ độc cấp tính, có thể dẫn đến tử vong hoặc gây độc tích luỹ từ các liều lượng rất nhỏ…) Năm 2013, Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tiến hành đánh giá hàm lượng phẩm màu trong một số thực phẩm lưu thông trên thị trường

10 tỉnh đồng bằng sông Hồng Có tổng số 28/140 mẫu bánh kẹo chứa phẩm màu gồm: tartazine, vàng sunset, xanh brilliant, ponceau 4R, amaranth, xanh lục, camoisine, carmin với hàm lượng nằm trong giới hạn cho phép của Bộ Y tế Tuy nhiên, việc sử dụng phụ gia thực phẩm, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm đã quá thời hạn sử dụng, ngoài danh mục được phép sử dụng hoặc trong danh mục được phép sử dụng nhưng vượt quá giới hạn cho phép, sử dụng hóa chất không rõ nguồn gốc, hóa chất bị cấm sử dụng trong hoạt động sản xuất, kinh doanh thực phẩm sẽ rất có hại đến sức khoẻ, có thể gây ngộ

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tối ưu hóa điều kiện phân tích chính xác hàm lượng một số phẩm màu trong phẩm màu hữu cơ tổng hợp bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò DAD

- Thẩm định phương pháp phân tích

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đôi tượng nghiên cứu: Phẩm màu hữu cơ tổng hợp dùng làm phụ gia thực phẩm như Tatrazine, Sunset Yellow FCF, Amaranth, Allura Red AC, Ponceau 4R, Erythrosine

- Không gian và thời gian nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Hóa – Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 Đề tài được thực hiện từ tháng 02 – 05/2021

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Ý nghĩa khoa học: Đề tài góp phần triển khai và phát triển phương pháp mới theo xu hướng hiện đại Đồng thời, giúp vào việc định danh và phân tích chính xác hàm lượng các phẩm màu hữu cơ dùng trong phụ gia thực phẩm, sản phẩm thực phẩm một cách nhanh chóng và chính xác

- Ý nghĩa thực tiễn: Đề tài góp phần nhận thức hơn về việc lạm dụng phụ gia trong sản xuất Ngoài ra, các nhà máy, doanh nghiệp đảm bảo chất lượng đầu vào cho nguyên liệu Hạn chế được các trường hợp người tiêu dùng sử dụng vượt quá ngưỡng các cho phép các phẩm màu hữu cơ trong các sản phẩm bánh, kẹo, nước giải khát, Cung cấp kiến thức bổ ích cho việc phân tích hàm lượng các nguyên liệu phẩm màu phụ gia trong các công ty thực phẩm, trung tâm phân tích,

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về phụ gia thực phẩm

1.1.1 Phụ gia thực phẩm là gì ?

Theo định nghĩa từ sách “CRC handbook of food additives” của tác giả T E Furia

(1973), phụ gia thực phẩm (food additive) là những chất không được coi là thực phẩm hoặc một thành phần của thực phẩm [10] Luật an toàn thực phẩm 2010 [1] còn chỉ rằng: Phụ gia thực phẩm có ít hoặc không có giá trị dinh dưỡng, được chủ động cho vào với mục đích đáp ứng yêu cầu công nghệ trong quá trình sản xuất, chế biến, bao gói, bảo quản vận chuyển

1.1.2 Phân loại phụ gia thực phẩm

1.1.2.1 Phân loại theo nhóm chức năng

Bảng 1.1: Phân nhóm, chức năng công nghệ và quy định của các chất phụ gia thực

phẩm (Nguồn [24])

Chất điều vị Làm tăng hoặc khơi dậy hương vị có trong

Chất tạo xốp Một chất hoặc hỗn hợp các chất sinh khí và

làm tăng thể tích của bột nhào QCVN 4-3:2010/BYT Chất chống

QCVN 4-6:2010/BYT

Tạo hoặc giữ các mô của rau quả luôn cứng

và dòn hoặc tác động với chất tạo keo để

sinh ra hay củng cố một thể keo

Làm thay đổi hoặc kiểm soát độ acid hoặc

Chất bảo

quản

Kéo dài thời gian sử dụng của một thực phẩm bằng cách chống lại sự hư hỏng do vi sinh vật gây ra

QCVN 4-12:2010/BYT

Chất ổn định

Tạo khả năng duy trì một sự phân tán đồng nhất của hai hoặc nhiều chất không trộn lẫn được trong thực phẩm

sẵn của thực phẩm

QCVN 4-16:2010/BYT

Chất khí đẩy Một chất khí khác không khí đẩy một lượng

thực phẩm khỏi bao bì chứa thực phẩm đó QCVN 4-17:2010/BYT Chế phẩm

QCVN 4-20:2011/BYT

Chất làm dày Làm tăng độ nhớt của thực phẩm QCVN 4-21:2011/BYT

5

Chất nhũ hóa

Tạo thành hoặc duy trì một hỗn hợp đồng nhất của hai hoặc nhiều pha không trộn lẫn được trong một thực phẩm (như dầu và nước)

QCVN 4-22:2011/BYT

Chất tạo bọt

Tạo khả năng hình thành hoặc giữ một sự phân tán đồng nhất của một pha khí trong một thực phẩm ở dạng lỏng hoặc dạng đặc

QCVN 4-23:2011/BYT

1.1.2.2 Phân loại theo số INS

Để quản lý các phụ gia thực phẩm và thông tin về chúng cho người tiêu dùng thì mỗi loại phụ gia đều được gắn với một số duy nhất Ban đầu các số này là các “số E" được sử dụng ở Châu Âu cho tất cả các phụ gia đã được chấp nhận Hệ thống đánh số này hiện đã được CAC chấp nhận và mở rộng để xác định trên bình diện quốc tế tất cả các phụ gia thực phẩm mà không liên quan đến việc chúng có được chấp nhận sử dụng hay không

Mã số INS (International Numbering System) được CAC chấp nhận tại phiên họp thứ

18 (tháng 7 năm 1989) và được nhiều nước thành viên công nhận và áp dụng đến ngày nay Dưới đây là bảng phân loại các chất phụ gia thực phẩm theo số INS

Bảng 1.2: Phân loại chất phụ gia theo khoảng số INS (Nguồn: [24])

Loại chất Khoảng số INS Tên chất phụ gia

1.1.3 Vai trò của các loại phụ gia thực phẩm [1]

- Tăng giá trị dinh dưỡng: Phụ gia có thể được sử dụng như một chất để bổ sung những chất dinh dưỡng đã bị thất thoát trong quá trình chế biến, sản xuất sản

- Bảo quản thực phẩm tươi lâu: Thông thường các loại thực phẩm thường bị tấn công bởi các vi sinh vật hoặc vi khuẩn, nấm mốc gây hư hỏng hoặc phân huỷ Phụ gia bảo quản thường hoạt động dưới dạng ngăn ngừa sự phát triển của các nhân tố vi sinh vật, vi khuẩn và giữ cho thực phẩm được tươi, ngon, ổn định chất lượng, mùi vị trong thời gian dài hơn

- Phụ gia làm thay đổi cấu trúc: Có nhiều phụ gia thực phẩm được sử dụng để giúp chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu hơn ví dụ như: làm đông, làm loãng hay kích thích nở…

1.1.4 Ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khỏe con người [3]

Nếu sử dụng phụ gia thực phẩm không đúng liều lượng, chủng loại nhất là những phụ gia không cho phép dùng trong thực phẩm sẽ gây những tác hại cho sức khỏe:

- Gây ngộ độc cấp tính: Nếu dùng quá liều cho phép

- Gây ngộ độc mãn tính: Dù dùng liều lượng nhỏ, thường xuyên, liên tục, một số chất phụ gia thực phẩm tích lũy trong cơ thể, gây tổn thương lâu dài Thí dụ: Khi sử dụng thực phẩm có hàn the, hàn the sẽ được đào thải qua nước tiểu 81%, qua phân 1%, qua mồ hôi 3% còn 15% được tích luỹ trong các mô mỡ, mô thần kinh, dần dần tác hại đến nguyên sinh chất và đồng hóa các aminoit, gây ra một hội

- Rối loạn thần kinh hiếu động thái quá, mất ngủ, dễ bị kích động

- Rối loạn tiêu hoá – đau bụng tiêu chảy

- Các vấn đề về hô hấp – bệnh hen, bệnh suyễn, viêm mũi và viêm xoang…

- Các vấn đề về da – chứng phát ban, nổi mụn, ngứa và sưng

- Dị ứng và tính mẫn cảm: Một số triệu chứng chung bao gồm: nhức đầu, đau yếu, tiêu chảy, rối loạn dạ dày…

1.2 Tổng quan về phẩm màu thực phẩm

1.2.1 Phẩm màu thực phẩm là gì ?

Các phẩm màu hữu cơ là các chất rắn dạng hạt có màu được chia mịn, thực tế không hòa tan trong hầu hết các dung môi và trong môi trường mà chúng được kết hợp bằng các kỹ thuật phân tán thích hợp Phẩm màu hữu cơ tạo màu bằng cách hấp thụ chọn lọc và/hoặc tán xạ ánh sáng nhìn thấy [11]

Phẩm màu thực phẩm là một trong số những nhóm phụ gia thực phẩm được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Chúng được bổ sung vào thực phẩm với mục đích tạo cho sản phẩm có màu sắc đẹp, tăng tính hấp dẫn đối với người tiêu dùng, hoàn toàn không có giá trị

về mặt dinh dưỡng [1]

1.2.2 Phân loại phẩm màu thực phẩm

Phẩm màu tự nhiên là các chất màu được chiết xuất hoặc được chế biến từ các nguyên

liệu hữu cơ (thực vật, động vật) sẵn có trong tự nhiên Ví dụ: Caroten tự nhiên được

9

chiết xuất từ các loại quả có màu vàng, Curcumin được chiết xuất từ củ nghệ, màu Caramen được chế biến từ đường Nhóm phẩm màu có nguồn gốc tự nhiên có nhược điểm là độ bền kém, sử dụng với lượng lớn nên giá thành sản phẩm cao

Phẩm màu tổng hợp hoá học là các phẩm màu được tạo ra bằng các phản ứng tổng hợp

hoá học Ví dụ: Amaranth (đỏ), Brilliant Blue (xanh), Sunset Yellow (vàng cam), Tartazine (vàng chanh) Các phẩm màu tổng hợp thường đạt độ bền màu cao, với một lượng nhỏ đã cho màu đạt với yêu cầu đặt ra, nhưng chúng có thể gây ngộ độc nếu dùng loại không nguyên chất, không được phép dùng trong thực phẩm

1.2.3 Hiện trạng sử dụng phẩm màu hữu cơ tổng hợp

Hiện nay vẫn còn nhiều cơ sở sản xuất kinh doanh vì nhu cầu lợi nhuận cao nên sử dụng những chất màu vượt mức cho phép, đặc biệt là các màu tổng hợp hoặc là những phẩm màu cấm nằm ngoài danh mục cho phép Hơn thế, điều dáng báo động nhất là các của hàng sản xuất sử dụng các chất màu công nghiệp nhuộm đưa vào sản xuất gây hậu quả nghiên trọng đến sức khỏe, tính mạng của người tiêu dùng Tiêu biểu nhất trong những năm gần đây, tình trạng sử dụng chất màu nhuộm công nghiệp Rhodamine B – thuốc nhuộm gây hại đến thận gan, là chất cấm sử dụng trong thực phẩm Theo kết quả của Sở

Y Tế về việc kiểm tra mẫu ớt bột tại cơ sở sản xuất Kim Nga (quận Tân Bình, Thành phố Hồ Chí Minh) vào ngày 02/02/2010 đã phát hiện trong sản phẩm có chứa phẩm màu nhuộm Rhodamine B với hàm lượng là hơn 51 mg/Kg sản phẩm [25] Sudan – Chất màu hữu cơ được chiết từ than đá, thuộc nhóm chất màu hữu cơ cấm sử dụng trong thực phẩm, nước uống và mỹ phẩm Tuy nhiên, vẫn được tìm thấy trong cá sản phẩm bột ớt, tương ớt, mỳ ăn liền, đồ hộp, xúc xích,

Theo kết qua kiểm tra của Sở Y tế Hà Nội vào ngày 03/05/2001, trên địa bàn thành phố

có 15% ca ngộ độc do phẩm màu gây ra, 100% phẩm màu nội địa và 50% phẩm màu nhập ngoại nằm ngoài danh mục cho phép và 52,6 % người tiêu dùng quen sử dụng thực phẩm có nhuộm màu [26]

5-hydroxy-1-(4-sunfonatophenyl)-Tên hóa học: Trinatri 5-hydroxyl-1 pyrazol-3-cacboxylat

(4-sulfonatophenyl)-4-(4sunfonato-phenylazo)-H-Công thức phân tử: C16H9N4Na3O9S2

Khối lượng phân tử: 534,37 g/mol

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Tartrazine (Nguồn: [2]) Trạng thái: bột hoặc màu vàng chanh

Tính tan: tan nhiều trong nước và tan ít trong ethanol

Tartrazine được dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt trong đồ tráng miệng, bánh kẹo, kem, sản phẩm sữa, nước giải khát, rau muối chua, sốt, cá và sản phẩm nướng

1.2.4.2 Amaranth – E123 (TCVN 6457:2008) [4]

Amaranth chủ yếu gồm trisodium naphthalenedisulfonate và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat

3-hydroxy-4-(4-sulfonato-1-naphthylazo)-2,7-11

Tên hóa học: Trisodium disulfonate

3-hydroxy-4-(4-sulfonato-1-naphthylazo)-2,7-naphthalene-Công thức phân tử: C20H11N2Na3O10S3

Khối lượng phân tử: 604,48 g/mol

Công thức cấu tạo:

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Amaranth (Nguồn: [4]) Trạng thái: bột hoặc hạt màu nâu đỏ

Tính tan: tan nhiều trong nước và tan ít trong ethanol

Amaranth được dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt trong đồ tráng miệng, bánh kẹo, kem, sản phẩm sữa, nước giải khát, rau muối chua, sốt, cá và sản phẩm nướng

1.2.4.3 Ponceau 4R – E124 (TCVN 6458:2008) [5]

Ponceau 4R chủ yếu gồm trinatri-2-hydroxyl-1-(4 naphthalendisulfonat và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natrisulfat

Tên gọi hóa học: Trinatri-2-hydroxyl-1-(4

sulfonato-1-naphtylazo)-6,8-naphthalendisulfonat

Công thức phân tử: C20H11N2Na3O10S3 1,5 H2O

Khối lượng phân tử: 631,51 g/mol

12

Công thức cấu tạo:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Ponceau 4R (Nguồn: [5]) Trạng thái: bột hoặc hạt màu hơi đỏ

Tính tan: Tan trong nước và tan ít trong ethanol

Ponceau 4R có trong nước giải khát, bánh kẹo, mứt, đồ hộp, cá, lớp áo phô mai và kẹo…

1.2.4.4 Sunset yellow FCF – E110 ((TCVN 6455:2008) [6]

Sunset yellow FCF chủ yếu gồm dinatri naphthalene-6-sulfonat và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat

6-hydroxy-5-(4-sulfonatophenylazo)2-Tên hóa học: Dinatri 6-hydroxyl-5-(4-sulfonatophenylazo)-2-naphthalene-6-sulfonat Công thức phân tử: C16H10N2Na2O7S2

Khối lượng phân tử: 452,37 g/mol

Công thức cấu tạo:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của Sunset Yellow (Nguồn: [6])

13

Trạng thái: bột hoặc hạt màu vàng đỏ

Tính tan: tan trong nước và tan ít trong ethanol

Sunset yellow FCF: dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt cho nước giải khát (nhưng có thể tạo kết tủa nếu có ion calcium hiện diện), kem, bánh kẹo, đồ hộp, bánh nướng và

đồ tráng miệng

1.2.4.5 Allura red AC – E129 (TCVN 6450:2008) [7]

Allura red AC chủ yếu gồm disodium 6-hydroxy-5-(2-methoxy-5-methyl-4sulfonato phenylazo)-2-naphthalene-sulfonate và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat

Tên hóa học: disodium 6-hydroxy-5-(2-methoxy-5-methyl-4-sulfonato naphthalenesulfonate

phenylazo)-2-Công thức phân tử: C18H14N2Na2O8S2

Khối lượng phân tử: 469,63 g/mol

Công thức cấu tạo:

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của Allura red (Nguồn: [7]) Trạng thái: bột hoặc hạt màu vàng đỏ

Tính tan: tan trong nước và tan ít trong ethanol

14

Allura red: dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt cho nước giải khát, kem, bánh kẹo,

đồ hộp, bánh nướng và đồ tráng miệng…

1.2.4.6 Erythrosine – E127 (TCVN 6462:2008) [8]

Erythosine chủ yếu gồm disodium salt of

9-(o-carboxyphenyl)-6-hydroxy2,4,5,7-tetraiodo-3-isoxanthone monohydrate và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat

Tên hóa học: disodium salt của isoxanthone monohydrate

9-(o-carboxyphenyl)-6-hydroxy-2,4,5,7-tetraiodo-3-Công thức phân tử: C20H6I4Na2O5.H2O

Khối lượng phân tử: 897,88 g/mol

Công thức cấu tạo:

Hình 1.6: Công thức cấu tạo của Erythrosine (Nguồn: [8]) Trạng thái: bột hoặc hạt màu đỏ

Tính tan: tan trong nước và tan ít trong ethanol

Erythosine: dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt cho nước giải khát, kem, bánh kẹo,

đồ hộp, bánh nướng và đồ tráng miệng…

15

1.2.5 Các nghiên cứu về phân tích hàm lượng phẩm màu hữu cơ

1.2.5.1 Nghiên cứu trong nước

Tác giả Nguyễn Thị Hải Yến (2015) đã xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời một số phẩm màu bao gồm Tatrazine, Amaranth, Indiogocarmin, Ponceau 4R, Sunset Yellow, Allura Red, Fast Green, Carmoisine, Erythrosine bằng HPLC với đầu

do PDA Các phẩm màu được tối ưu hóa trong:

- Điều kiện sắc ký:

 Pha tĩnh: Cột Symmetry C18 - Waters (150 mm × 4,6 mm × 5 µm) và cột bảo vệ C18 (20 mm × 3,9 mm × 5 µm)

 Pha động: Chạy theo chương trình gradient nồng độ

 Kênh A: Dung dịch NaH2PO4 0,01M, Kênh B: MeOH

 Tốc độ dòng: 1 mL/phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µL

 Nhiệt độ buồng cột: 400C

 Detector PDA quét trong khoảng 200-800 nm

- Điều kiện xử lý mẫu để chiết các phẩm màu ra khỏi nền mẫu thực phẩm:

 Dung môi loại chất béo n-hexan

 Dung môi chiết: dung môi I (NH3 = 0,1M: MeOH = 5:95) và dung dịch amoniacetat 0,13 M, sau đó điều chỉnh pH = 7 bằng acid HCl 6 N – Nhiệt

độ chiết: 600C

- Đường chuẩn được xây dụng trong khoảng tuyến tính từ 0,1-10 ppm với hệ số tương quan R2>0,999 cho tất cả các chất Giới hạn phát hiện phương pháp trong khoảng 0,10-0,25 mg/kg và giới hạn định lượng phương pháp tương ứng từ 0,34-0,79 mg/kg Độ lặp lại RSD <10% và độ thu hồi R = 80-103% đạt yêu cầu của AOAC

16

- Ứng dụng phương pháp để phân tích 13 mẫu bánh, kẹo, thạch các loại cho thấy có trên 53,3% mẫu có hàm lượng phẩm màu gần với công bố trên nhãn Sản phẩm không chứa phẩm màu tổng hợp chiếm 6%, sản phẩm chứa 1 loại phẩm màu tổng hợp chiếm 20%, còn lại là sản phẩm chứa từ 2 loại phẩm màu tổng hợp trở lên

1.2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Tác giả L.F.Capitán-Vallvey và cộng sự (1998) đã phát triển phương pháp trắc quang sử dụng thuật toán hồi quy đa biến để xác định đồng thời các chất màu tartrazine, ponceau 4R và sunset yellow FCF trong thực phẩm [15].Các chất màu được cố định trên gel Sephadex DEAE A-25 ở pH 2,0 Đo phổ hấp thụ quang của các chất trong khoảng bước sóng 400-800 nm so với mẫu trắng và định lượng bằng phương pháp đường chuẩn Khoảng tuyến tính cho cả 3 chất màu là 50-650 mg/mL Kết quả thực nghiệm cho độ lệch chuẩn là 5,5267 cho Sunset Yellow, 6,3878 cho Tatrazine và 6,9816 cho Ponceau 4R Hệ số tương quan tuyến tính là 0,9977, 0,9978 và 0,9954 cho Sunset Yellow, Tatrazine và Ponceau 4R Phương pháp này được ứng dụng để xác định các chất màu trong thực phẩm và kết quả được so sánh với phương pháp HPLC Trong hầu hết các

trường hợp (8/9 mẫu) kết quả của hai phương pháp là tương đương nhau

Tác giả Erdal Dinç và các cộng sự (2006) đã nghiên cứu phát triển phương pháp xác định hàm lượng đồng thời hai phẩm màu Tartrazine và Allura Red trong chế phẩm thương mại bằng việc kết hợp phương pháp HPLC với đầu dò PDA và hiệu chuẩn đo hóa học [12] Phương pháp HPLC với đầu dò PAD sử dụng hệ dung dịch đệm axetat 0,2

M (pH = 5), acetonitril, methanol và nước cất hai lần (55:20:10 v/v) Giới hạn phát hiện trong phạm vi của Tatrazine và Allura Red AC tương ứng là 0,23-0,84 µg/mL và 0,73-1,03 µg/mL Giới hạn định lượng trong phạm vi của Tatrazine và Allura Red AC tương ứng là 0,78-2,81 µg/mL và 2,42-3,46 µg/mL Hiệu suất thu hồi vào khoảng 101,1-101,4% Độ lệch chuẩn tương đối <1,4%

Tác giả Katerina S.Miniotia và cộng sự (2007) đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng pha đảo để tách thành công 13 màu thực phẩm tổng hợp (Tartrazine E102, E104 Quinoline vàng, Sunset Yellow E110, Carmoisine E122, Amaranth E123, Ponceau 4R

17

E124, Erythrosin E127, Red 2G E128, Allura Red AC E129, xanh ve E131, Indigo Carmine E132, Brilliant Blue FCF E133 và Green SE E142) [14] Pha tĩnh sử dụng cột C18 và pha động chứa hỗn hợp acetonitrile-methanol với tỉ lệ (20:80 v/v) và 1% (m/v) đệm ammonium acetate (pH 7,5) Quá trình rửa giải gradient đã được tối ưu để tách thành công các chất trong vòng 29 phút Định lượng các chất màu ở bước sóng 350-800

nm Phương pháp đã được thẩm định các thông số Giới hạn phát hiện của các chất trong khoảng 1,59 Green SE (E142) và 22,1 Ponceau 4R (E124) mg/L Độ chụm trong ngày (RSDr) dao động từ 0,37% (Camoisine E122 trong trái cây uống có hương vị ở nồng độ

100 mg/L) lên 4,8% (Green SE E142 đường ở mức 0,9 mg/kg) Độ chụm giữa các ngày (RSDR) là giữa 0,86% cho camoisine E122 trong trái cây có hương vị thức uống tại 100 mg/L và 10% cho green SE E142 trong mứt ở nồng độ 9 mg/kg Độ thu hồi cao từ 94% (E142 trong mứt) đến 102% (E131 trong đồ ngọt)

Tác giả N.Yoshioka và cộng sự (2008) đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết pha đảo với mảng phát hiện photodiode để xác định thành công 40 phẩm màu tổng hợp [13] Các phẩm màu được phân tích trong vòng 19 phút sử dụng một cột phân tích ngắn (50 mm × 4,6 mm, 1,8 mm) ở 50°C với gradient rửa giải: Ponceau 6R, Tartrazine, Fast vàng AB, Amaranth, Indigotin, Naphthol vàng S, Chrysoine, Ponceau 4R, Sunset Yellow FCF, đỏ 10B, Orange G, Acid violet 7, Brilliant đen PN, Allura red AC, Yellow 2G, Red 2G, Uranine, Fast E đỏ, xanh S, Ponceau 2R, Azorubine, Orange I, Quinoline màu vàng, màu vàng Martius, Ponceau SX, ponceau 3R, Fast Green FCF, Eosine, Brilliant Blue FCF, Orange II, Orange RN, Acid blue 1, Erythrosin, Amido đen 10B, Acid đỏ 52, Patent xanh V, Acid xanh 9, Phloxine B, Benzyl tím 4B, và Rose Bengal

Độ thu hồi của các hợp chất này khi thêm chuẩn vào nước giải khát và bánh kẹo tại 5mg/g dao động 76,6-115%, và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) là trong vòng 6,0% Các giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng là 0,03 và 0,1 mg/g cho tất cả các chất

 Pha động điển hình là hexane, methylene clorua, chloroform, dietylether và hỗn hợp các chất này Các chất phân cực được giữ lại trên bề mặt cực của cột pha thuận lâu hơn, các chất không phân cực ra khỏi cột trước

- Sắc ký pha đảo (RP-HPLC) Pha tĩnh không phân cực (kỵ nước), trong khi pha động

19

và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của sắc ký pha đảo

- Sắc ký rây phân tử:

 Cột được nhồi bằng các vật liệu có kích thước lỗ rỗng chọn lọc chính xác và các hạt được phân tách theo kích thước phân tử của nó Các phân tử lớn hơn nhanh chóng được rửa qua cột; các phân tử nhỏ đi qua các lỗ rỗng của hạt nên đường đi lâu hơn và đi ra cột lâu hơn

 Tùy thuộc vào bản chất pha động là dung dịch hay dung mỗi hữu cơ mà ta có sắc ký lọc gel (gel filtration) và sắc ký thẩm thấu gel (gel permation)

- Sắc ký trao đổi ion:

 Là một quá trình cho phép phân tách các ion hay các phân tử phân cực dựa trên tính chất của chúng Độ trao đổi ion giữa các phân tử sinh chất mang điện tích và nhóm điện tích gắn trên nền cột phụ thuộc vào pH

 Sắc ký trao đổi ion dựa trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh động của pha tĩnh rắn với các ion trong dung dịch phân tích khi cho dung dịch này đi qua cột được nạp đầy pha tĩnh Bề mặt pha tĩnh được phủ bởi các điện tích ion tích điện trái dấu với các ion mẫu

1.2.6.3 Cấu tạo của hệ thống HPLC

Hình 1.7: Cấu tạo hệ thống HPLC (Nguồn: [28])

20

Trong đó:

1: Bình chứa pha động

2: Bộ phận khử khí

3: Bơm cao áp

4: Bộ phận tiêm mẫu

5: Cộ sắc ký (pha tĩnh)

6: Đầu dò 7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống

8: In dữ liệu

a Bình dung môi:

Pha động trong HPLC thường là hỗn hợp các thành phần chất lỏng phân cực và không phân cực có nồng độ tương ứng thay đổi tùy thuộc vào thành phần của mẫu Tất cả các dung môi dùng cho pha động cần phải là loại tinh khiết, ghi rõ nhãn dùng cho thiết bị HPLC Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu hay pha hệ dung môi pha động đều sử dụng tinh khiết và phải lọc qua hệ thống đầu lọc 0,45 µm nhằm mục đích tránh làm hỏng cột hay gây ra sự nhiễm đường nền, tạo các peak tạp trong quá trình phân tích

b Bộ phẩn khử khí

Nhằm loại trừ các bọt khí nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động Nếu còn sót lại các bọt khí sẽ gây ra các hiện tượng sau:

- Tỷ lệ pha động của các dụng môi lấy không chính xác sẽ làm cho thời gian lưu peak thay đổi

- Bơm không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên khiến cho cả hệ thống máy dừng

c Bơm cao áp

Bơm pittong hút pha động từ bình dung môi đẩy vào hệ thống qua các bộ phận tiêm mẫu, cột và đầu dò sau đó qua bình đựng dung môi thải Tuỳ thuộc vào các cấu hình hệ thống, áp suất vận hành ở 6000 psi (413 bar) có thể lên tới 18000 psi (1240 bar) Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại, bơm cao áp có hai pistone để luân phiên nhau đẩy dung môi liên tục

21

d Bộ tiêm mẫu:

Có thể là bộ phận tiêm mẫu tự động hoặc tiêm mẫu bằng tay có bộ phận kim phun Kim phun mẫu cho hệ thống HPLC sẽ cung cấp việc tiêm mẫu chất lỏng trong phạm vi 0,1-

100 mL thể tích với độ tái lập cao và dưới áp suất cao (lên đến 18000 psi)

e Cột sắc ký:

Thường được làm bằng thép không gỉ, dài từ 50-300mm và có đường kính trong từ 2-5

mm Thông thường, cột được nhồi bằng các hạt silica/silica lai có kích thước từ 2,5-10

µm Trong quá trình hoạt động, nhiệt độ của pha động và cột nên được giữ ổn định trong quá trình phân tích Vì vậy trong thực tế, các hệ thống có thêm buồng điều nhiệt cột

f Đầu dò (Detector):

Nằm ở cuối cột có nhiệm vụ phát hiện các chất phân tích khi chúng được rửa giải từ cột sắc ký Tùy theo tính chất của chất cần phần tích để lựa chọn các đầu dò phù hợp Trên

cơ sở đó, có các loại đầu dò khác nhau như:

- Detector quang phổ tử ngoại từ 200-380 nm Thông thường dùng đèn thủy ngân cho vạch 254 nm, nhiều chất hấp thụ ở bước sóng này

- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis từ 190-900 nm

- Detector huỳnh quang dùng để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang Đây là detector có độ chọn lọc cao nhất

- Detector Diod Array (DAD), detector tán xạ bay hơi (ELSD) có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo phổ hấp thụ cực đại của các chất

- Detector điện hóa dùng để đo dòng, cực phổ, dẫn điện, điện lượng, Có thể phát hiện những lượng peakrogam (10-12 g)

- Detector chiết suất vi sai

- Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt

22

g Thiết bị thu thập dữ liệu:

Tín hiệu từ đầu dò có thể được thu thập trên máy ghi biểu đồ hoặc bộ tích hợp điện tử khác nhau với các phần mềm lưu trữ, phân tích và xử lý dữ liệu sắc ký

1.2.6.4 Nguyên tắc hoạt động

Hình 1.8: Sơ đồ hệ thống HPLC, 1 – Bể chứa dung môi, 2 – Hệ thống Gradient, 3 – Bơm cao áp, 4 – Bộ phận tiêm mẫu, 5 – Cột sắc ký, 6 – Detector, 7 – Chất thải, 8 – Bộ

phận ghi nhận tính hiệu (Nguồn: [20])

Trong quá trình sắc ký, các phân tử chất tan luôn phân bố qua lại giữa hai pha trong khi pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định Mặt khác, do cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất rắn khác nhau nên tốc độ dịch chuyển theo tốc độ pha động; còn ở pha tĩnh, phân tử chất tan sẽ bị giữ lại Do đó, thời gian lưu của các chất là khác nhau Khi pha động di chuyển với tốc độ nhất định qua cột sắc ký, chúng sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh giữ lại ra khỏi cột Tùy theo bản chất của pha tĩnh, chất tan và pha động

mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký Vì vậy, trong quá trình sắc ký, có chất bị lưu giữ lâu, có chất ít bị lưu giữ Sau qua trình tách sắc ký, ta được sắc ký đồ [17]

Hiệu quả của việc tách chất được thể hiện qua mối tương quan sau:

23

Sơ đồ 1.1: Mối tương quan giữa chất phân tích, pha tĩnh và pha động

F1 – Giữa chất phân tích và pha tĩnh

F2 – Giữa chất phân tích và pha động

F3 – Giữa chất pha động và pha tĩnh

Cả ba tương tác (ba lực F1, F2, F3) này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước Trong đó, F1 và F2 giữ vai trò quyết định, F3 là yếu tố ảnh hưởng Qua đó, nhận thấy F1 là lực giữ chất trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy, lực lưu giữ của các chất trong quá trình sắc ký là tổng đại số của ba lựa tương tác đó Trong một hỗn hợp mẫu, chất phân tích:

- Có F nhỏ nhất sẽ được ra khỏi cột tách trước tiên

- Có F lớn nhất sẽ ra sau cùng

- Những chất có F bằng nhau, hay gần bằng nhàu thi không tách được khỏi nhau, chúng trùng nhau hay chen lấn nhau

Vì thế mà tạo ra quá trình sắc ký tách các chất

1.2.6.5 Các đại lượng đặc trưng [18]

a Thời gian lưu giữ

Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nào vào cột sắc ký, chúng sẽ bị lưu giữ ở trong một cột tách theo thời gian nhất định Đó là thời gian lưu của nó trong hệ cột đã chọn Thời gian này có được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc

Chất phân tích

F3

24

chất tan được rữa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại Như vậy, gọi thời gian tRi

là thời gian lưu tổng cộng của chất tan “i” thì chúng ta luôn có:

𝑡𝑅𝑖′ = 𝑡𝑅𝑖−𝑡𝑜Trong đó:

𝑡𝑜: thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột, đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chế

𝑡𝑅𝑖′ : thời gian lưu giữ thực của chất i ở trong cột sắc ký

Nếu hai chất A và B kế tiếp nhau trong sắc ký đồ thì chúng ta có:

có chung một vùng Nghĩa là chúng chập nhau không thể tách thành hai peak riêng biệt đặc trưng cho hai chất đó

25

Hay 𝑉𝑅𝑖 = 𝑉𝑅𝑜(1 + 𝐾′)

Mặt khác ta có:

𝑉𝑜 = (𝑉𝑠+ 𝑉𝑚) Trong đó, 𝑉𝑜 là thể tích trống toàn phần của cột sắc ký, 𝑉𝑠 là thể tích thực của pha tĩnh trong cột Nhưng vì 𝑉𝑚 = 𝐹 𝑡𝑅𝑜 nên chúng ta có:

𝑉𝑠 = 𝑉 − 𝐹 𝑡𝑅𝑜Như vậy, nhờ công thức này chúng ta có thể tính được thể tích thực 𝑉𝑠 của pha tĩnh ở trong cột sắc ký

c Hệ số phân bố và hệ số dung tích

Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong quá trình sắc ký Sự phân bố này được đặc trưng bởi một đại lượng được gọi là hệ số phân bố Ki của chất i Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nồng độ của chất tan i ở trong pha tĩnh và pha động và được tính bằng công thức:

𝐾𝑖 = 𝐶𝑖(𝑠𝑝)

𝐶𝑖(𝑚𝑝)Trong đó 𝐶𝑖(𝑠𝑝) và 𝐶𝑖(𝑚𝑝) là nồng độ của chất tan ở trong pha tĩnh và trong pha động Hệ số Ki cho ta biết khả năng phân bố của chất ở như thế nào trong mỗi pha (pha động

và pha tĩnh)

Nhưng hệ số Ki chưa nói lên được sức chứa (dung tích) của cột sắc ký Vì thế người ta phải đưa thêm vào hệ số dung tích 𝐾𝑖′ Hệ số dung tích 𝐾𝑖′ (hay hệ số dung lượng: Capacity coefficient) là chỉ cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan i phân bố trong mỗi pha là bao nhiều nghĩa là ta có:

d Tốc độ tuyến tính của pha động

Trong kĩ thuật HPLC, tốc độ thể tích F (mL/phút) của pha động luôn liên quan đến tiết diện của cột tách Vì thế người ta ít dùng khái niệm này, khi xem xét sự di chuyển của một địa chất tan trong cột tách, mà thường dùng tốc độ tuyến tính (cm/giây) Khái niệm tốc độ này cho ta biết trong một đơn vị thời gian (1 giây hay 1 phút), thì phá động, hay một đĩa sắc ký của chất tan dịch chuyển được bao nhiêu cm trong cột Tốc độ này không phụ thuộc vào tiết diện của cột tách và cũng không phụ thuộc vào độ giảm áp trong cột tách theo chiều dài từ đầu cột đến cuối cột Tốc độ này được tính theo công thức:

𝑢 = 𝐿

𝑡𝑜Hay ta có:

𝑟2𝐸𝑇 𝜋Trong đó, L là chiều dài (cm), r là bán kính của cột sắc ký (mm), 𝐸𝑇 là hệ số về độ xếp Để đánh giá một cột tách HPLC có tốt hay không, sau khi nạp người ta phải kiểm tra lại cột theo ba yếu tố: Số đĩa của cột (hay chiều cao một đĩa), độ cân đối của peak sắc ký,

độ thấm dung môi của hệ pha

Khác với độ cân đối của peak, độ thẩm dung môi (pha động) của một hệ pha lại cho chúng ta biết độ ổn định, tính cân bằng và tính lặp lại của hệ pha đó trong quá trình sắc

(1-9)

(1-10)

(1-11)

27

ký Đồng thời cũng một phần nào mô tả sự diễn biến của các cân bằng phân bố trong hệ pha tốt hay không tốt Tất nhiện đó chỉ là một tham số, mà thực tế còn nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến vấn đề này

e Số địa và chiều cao của đĩa trong cột sắc ký

Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc ký, người ta dùng khái niệm số đĩa

N Đây là một đại lượng về hình thức có thể coi mỗi đùa trong cột sắc ký như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) là H Đây là lớp có tính chất động và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Đường kính của hạt phủ tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay minh; Độ xốp, kích thước lỗ xốp của pha tĩnh; Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (chất phân tích); Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc ký; Độ nhớt của pha động

Vì thế với một hệ pha nhất định và trong những điều kiện sắc ký đã chọn thì chiều cao

H cũng có những giá trị xác định ứng với các chất tan, chiều cao H này được xác định theo công thức:

f Khả năng phân giải

Hai đại lượng H và N đã nói ở trên là các hằng số đặc trưng cho một loại cột tách nhưng chúng chưa chỉ rõ cho chúng ta biết hai chất A và B được tách ra khỏi đến mức nào, khi nó được rửa giải ra khỏi cột sắc ký Vì thế để đánh giá độ tách của các chất trong một hệ pha, người ta còn phải cần thêm đại lượng độ phân giải R và nó được xác định theo công thức:

28

g Độ phát hiện

Độ phát hiện của một chất trong một hệ pha đã chọn là phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau của quá trình sắc ký, cụ thể như:

- Thể tích hay lượng mẫu được nạp vào cột tách

- Tính chất và các thông số đặc trưng của pha tĩnh

- Tính chất và thành phần của pha động (có khi cả giá trị pH)

- Tốc độ của phi động và kỹ thuật rửa giải

- Độ nhạy của phát hiện của Detectơ và các đặc trưng của nó

- Hệ thống đường ống dẫn (từ van mẫu đến flowcell của Detector)

- Tính chất của chất phân tích đối với kỹ thuật phát hiện

- Thiết bị để ghi do tín hiệu của chất phân tích

Các yếu tố này đều ảnh hưởng trong những mức độ khác nhau đến độ phát hiện của một chất phân tích Như vậy, nếu ta chọn được các yếu tố trên ở điều kiện thích hợp nhất, thì chúng chúng ta sẽ có độ nhạy và độ phát hiện tốt nhất, và lúc này đã phát hiện chỉ còn

do bản chất của chất phân tích quyết định

h Nồng độ chất tan trong quá trình sắc ký

Trong quá trình sắc ký, nếu ta nạp vào cột tích một thể tích mẫu là V (mL), thì lượng chất phân tích i được nạp vào cột tách đồ sẽ là:

𝑄𝑖 = 𝑉𝑠 𝐶𝑖𝑠Như thế nồng độ cực đại của chất tan i được rửa giải ra ứng với thời gian lưu 𝑡𝑅; sẽ là:

𝐶𝑖,𝑚𝑎𝑥 = 𝑄𝑖

√2 𝜋 𝜕𝑣𝑙Trong đó 𝜕𝑣𝑙, là độ lệch chuẩn theo thể tích của chất tan X

(1-15) (1-14)

29

i Độ lệch chuẩn

Độ lệch chuẩn là một đại lượng đặc trưng cho một peak sắc ký và một quá trình tách sắc

ký của một hỗn hợp Theo qui luật phân bố Gauxo, độ lệch chuẩn này được xác định bởi chiều rộng của phc sắc ký ứng với 0.607 chiều cao của peak sắc ký Hmax

1.2.6.6 Cơ sở lý thuyết lựa chọn điều kiện sắc ký

a Cột sắc ký (pha tĩnh) [19]

Pha tĩnh trong phương pháp HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một chất từ một hốn hợp nhiều thành phần Nó là một chất rắn xốp có kých thước hạt rất nhỏ, đường kýnh cỡ hạt từ 3-10 µm, diện tích bề mặt riêng từ 50-500 m2/g Pha tĩnh thường được cấu tạo trên nền sillica (SiO2), nền oxit nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (Cellulose) hay nên mạch Carbon Trong sắc ký hấp thụ, pha tĩnh trên nền Sillica có nhiều ưu điểm cà được sử dụng nhiều nhất.Yêu cầu trong pha tĩnh: phải trơ và bền trong môi trường; có khả năng tách một hỗn chất tan nhất định; tính chất bề mặt ổn định; sự tách diễn ra nhanh và tốt; cỡ hạt đồng nhất

b Pha động

Pha động là dung môi để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột, yếu tố tiên quyết quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp chất Pha động có thể là dung môi nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp các dung môi được pha theo tỉ lệ nhất định Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực (n-hexan, n-heptan, benzne, chloroform, ) và bão hòa Trong sắc ký pha đảo, pha động thường là các hệ dung môi phân cực (nước, methanol, acetonitril, ) hoặc là hỗn hợp các dung môi.Yêu cầu đối với pha động: phải trơ với pha tĩnh; hòa tan được các chất cần phân tích; có độ tinh khiết cao; phù hợp với detector; có tính kinh tế và đảm bảo môi trường