Protein CagA xâm nhập tế bào ung thư dạ dày AGS qua con đường dịch thể của Helicobacter pylori Juanita.. M 1 , Nguyễn Thị Hồng Hạnh 2 1 Trường Đại học tổng hợp Michigan Mỹ 2 Viện Công
Trang 1Protein CagA xâm nhập tế bào ung thư dạ dày AGS qua con đường dịch thể của Helicobacter pylori
Juanita L M 1 , Nguyễn Thị Hồng Hạnh 2
1 Trường Đại học tổng hợp Michigan (Mỹ)
2 Viện Công nghệ Sinh học
Các dịch thể của vi khuẩn Helicobacter pylori chứa các protein độc chất được hình thành từ lớp màng ngoài của vi khuẩn Helicobacter pylori Sự xâm nhập của chúng vào tế bào ung thư dạ dày AGS C120 đã làm tăng tổng hợp của interleukin IL-8
I Đặt vấn đề
Vi khuẩn Helicobacter pylori sống trong
lớp niêm mạc dạ dày của người và của một số
động vật Chúng là các “vi khuẩn chậm”, vì
không có xu hướng tấn công vật chủ Các bệnh
như viêm loét và ung thư dạ dày, loét hành tá
tràng …là kết quả tương tác giữa vi khuẩn và
vật chủ kéo dài tới hàng chục năm [3]
Các nghiên cứu cho thấy, 90% vi khuẩn H
pylori “bơi “ trong lớp niêm mạc của dạ dày
mà không tương tác trực tiếp với dạ dày Năm
1999, Fiocca phát hiện: vi khuẩn Helicobacter
pylori có thể tiết ra thể dịch chứa protein toxin
vacA [5] ít nhất hai protêin nữa là CagA và
HP1125 [7] cũng được tìm thấy trong các dịch
thể [Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cs các kết quả
chưa công bố]
Helicobacter pylori được chia thành hai
loại: Loại I mang đảo bệnh lý cag dài ~ 40 kb
và loại II không mang cag Các chủng vi
khuẩn thuộc loại I thường làm tăng tổng hợp
interleukin IL-8 trong tế bào dạ dày [10]
Stefano tìm thấy protein cagA được mã hoá bởi
gien cagA nằm trong đảo bệnh lý cag đã thâm
nhập vào trong tế bào chủ qua một cầu tiếp
hợp Bên trong tế bào, protein được phospho
hoá bởi các Kinase [4]
Không rõ, sự tổng hợp của interleukin IL-8
trong tế bào biểu mô dạ dày là do cagA của vi
khuẩn H pylori thâm nhập vào tế bào qua cầu
nối hay còn do những lý do khác như tương tác với cagA của dịch thể? Câu trả lời sẽ giúp hiểu
rõ mối tương tác của vi khuẩn với vật chủ trong quá trình bệnh lý
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xem xét tương tác giữa dịch thể của vi khuẩn
Helicobacter pylori, chủng VNH85 với tế bào
ung thư AGS C120 Chúng tôi đã xác nhận, các protein cagA trong dịch thể đã xâm nhập vào tế bào ung thư dạ dày AGS và làm tăng quá trình tổng hợp interleukin IL- 8 của tế bào
II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
1 Đối tượng
- Vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng
VNH-85
- Tế bào AGS (có nguồn gốc từ ung thư dạ dày người nhận từ ACTT (American Type culture)
2 Phương pháp
2.1 Nuôi vi khuẩn H pylori và tách chiết các thể dịch của vi khuẩn
Vi khuẩn Helicobacter pylori, dòng
VNH-85 [1] được nuôi trong môi trường Brucella lỏng có bổ sung 5% huyết thanh bò và các
Trang 2kháng sinh tương ứng Sau 3-4 ngày, các thể
dịch được thu nhận bằng ly tâm dịch nổi ở
100.000g trong hai giờ ở 4o C
2.2 Nuôi cấy tế bào
Tế bào AGS [2] nhận từ ACTT (American
Type culture) được nuôi trên đĩa Petri 35 mm
(Corning Glas Works, Corning, NY) trong môi
trường Dulbecco / Eagle (Gibco-BLR) có bổ
sung 10% huyết thanh bò, penicillin (100
àg/ml) và streptomycin (100 àg/ml) trong điều
kiện 5% CO2 ở 37o C AGS C120 là dòng các tế
bào ung thư AGS được biến nạp 240 Gastrin
contruct (240 GasLuc) chứa phần điều khiển
của gen IL-8 và đã được chọn lọc trên môi
trường G418 (Gibco-BLR)
2.3 Xử lý tế bào AGS C120 với các dịch
thể của vi khuẩn
Các tế bào AGS đạt 80% confluence được ủ
với dịch thể ở nồng độ 3,5 àg / ml Sau các
khoảng thời gian 12 giờ, 24 và 48 giờ, tế bào
được rửa bằng 1 x PBS lạnh và được xử lý với
Trypsin-EDTA trong vòng 10 phút ở 37o C
Cũng ở các thời điểm 3, 6 và 21 giờ, 50 àl môi
trường nuôi cấy tế bào được lấy để xác định
hàm lượng IL-8
2.4 Định lượng protein: Protein được xác
định bằng Braford
2.5 Tủa miễn dịch và phân tích Western.
Tế bào AGS thu thập ở 12, 18 và 24 giờ sau
khi ủ với các dịch thể được làm tan trong dung
dịch RIPA [0.15 mM NaCl / 0.05 mM Tris-HCl
pH 7 2 / 1% Triton X-100 / 1% sodium
deoxycholate/ 0.1% SDS., 200mM vanadate, 5
mg/ml hỗn hợp protease ] 200 àl của dịch tan
được trộn với 50 àl kháng thể đa dòng kháng
cagA và ử tiếp ở 4oC qua đêm Cho thêm 50 àl
hạt Sepharose gắn protein A để tủa phức miễn
dịch Hoà tủa protein trong 1x dung dịch
Laemmili (200 mM Tris-HCl pH 8., 8% SDS.,
gel Polyacrylamid Gradient nồng độ từ 4 đến 20%, sau đó được chuyển vào màng Hybond C
và lai với kháng thể đa dòng kháng protein
cagA
2.6 Định lượng interleukin IL-8
Interleukin IL-8 có trong dịch nổi nuôi cấy
tế bào được định lượng bằng phương pháp Elisa Chế phẩm sinh học “ Quantikine “ của
R&D system, Inc được sử dụng Sản phẩm
màu của phản ứng Elisa được đo ở bước sóng
550 nm III Kết quả
1 Xây dựng đường chuẩn định lượng IL-
8
Đường chuẩn để xác định IL-8 được trình bầy ở hình 1 Lượng IL-8 nhỏ nhất có thể xác
định bởi phương pháp là 6,2 pcg
2 Sự xâm nhập của các thể dịch của vi
khuẩn Helicobacter pylori vào tế bào AGS
Các phân tích Western cho thấy, từ sau 12 giờ được ủ với các dịch thể của vi khuẩn
Helicobacter pylori, một số băng protein có
phân tử lượng 40 kDa, 35 kDa và 16 kDa đã
được phát hiện thêm trên Western đồ, chứng tỏ các dịch thể đã thâm nhập vào trong tế bào ung thư AGS
Các protêin có trọng lượng nhỏ hơn CagA chứng tỏ, protein đã bị cắt bởi một vài protease
ở bên trong tế bào (hình 2) Hai protein của tế bào ung AGS có phân tử lượng >85 kDa cho phản ứng chéo với kháng thể đa dòng kháng cagA cũng được phát hiện trên Western đồ
3 Sự tăng tiết của IL-8 dưới ảnh hưởng của các dịch thể
Các phân tích cho thấy, trong thí nghiệm
đối chứng, các tế bào ung thư dạ dày AGS
C120 tổng hợp IL-8 invitro Dưới ảnh hưởng của các thể dịch của H pylori, chúng đã gia
Trang 3thuận với thời gian ủ của dịch thể với vi khuẩn (hình 3)
OD (550nm)
1.5
1.0
0.5
6.2 12.5 25 50 (pcg)
Hình 1- Đường chuẩn xác định hàm lượng của IL-8
IV Bàn luận
Các kết quả phân tích của chúng tôi cho
thấy, dịch thể của vi khuẩn H pylori, khi thâm
nhập vào trong tế bào ung thư AGS đã làm tăng
mức độ tổng hợp của interleukin IL-8 trong tế
bào Các nhà khoa học Nhật xác nhận: mức độ
tổng hợp interleukin IL-8 của các tế bào ung
thư dạ dày có quan hệ trực tiếp với quá trình
tạo các mạch máu mới để nuôi mô ung thư
cũng như sự phát triển và di căn của các mô
ung thư [6,9] Sự tăng biểu hiện của MMP-9- một protêinase gắn liền với khả năng
tấn công của các tế bào ung thư dạ dày cũng nằm trong sự ảnh hưởng của interleukin IL- 8 [8]
Như vậy, chúng tôi đã phát hiện protein cagA có thể đi vào tế bào biểu mô dạ dày qua con đường dịch thể Những nghiên cứu tiếp sau sẽ được tập trung vào bản chất của các mối tương tác sẽ làm sáng tỏ ý nghĩa sinh học của hiện tượng vừa được miêu tả
1 2 3 4
kDa
184
121
85
68
52
40
28
22
16,8
Hình 2- Protein cagA của dịch thể (chỉ bằng mũi tên) xâm nhập vào trong tế bào ung thư AGS
1- tế bào AGS không ủ với dịch thể
2-4: AGS được ủ với các dịch thể sau 12, 24 và 48 giờ
Phân tử lượng của các protein chuẩn được chỉ ở phía trái của hình
1
2
3
Trang 4IL-8 (pcg/ml)
c
3 6
OD (550nm)
3
2
1
1440
960
480 240
21 giờ
Hình 3- Sự thâm nhập của các thể dịch của vi khuẩn H pylori, chủng VNH 85 vào trong tế bào
AGS C120 làm tăng quá trình tiết IL-8 vào môi trường
a) Tế bào AGS 120 được ủ với IL-1β
b) Tế bào AGS được ủ với các dịch thể của vi khuẩn
c) Tế bào AGS không bị xử lý
V Kết luận
Qua nghiên cứu này, chúng tôi xin rút ra
một số kết luận như sau:
1 Protein cagA có thể thâm nhập vào tế
bào biểu mô dạ dày bằng con đường dịch thể
của vi khuẩn Helicobacter pylori
2 Bên trong tế bào biểu mô dạ dày,
protein cagA đã làm tăng quá trình tổng hợp
của IL-8 lên gắp gần 2 lần
Tài liệu tham khảo
1 Lê Băng Sơn và Nguyễn Thị Hồng Hạnh:
Study on Helicobacter pylori, strain 85 isolated
from a Vietnamese patient International
workshop on Biology Hanoi- Viet Nam 1
2001: 414 - 417
2 Baranco, S.C., Townsend,C.M.,
Casartelli, Jr.C., Macik, B.G., Burger, N.L.,
Boerwinkle, W.R and Gourley, W.K:
Establishment and characterization of an
invitro model system for human
adernocarcinoma of the stomach Cancer Res
3 Blaser, M.J and Parsonet, J: Parasitism by
the slow bacterium Helicobacter pylori leads to altered gastric homeostatis and neoplasia J Clin Investig 1994 94: 4- 8
4 Censini, S., Stein, M and Covacci, A.: Cellular responses induced after contact with
Helicobacter pylori Current opinion in Microbiology 2000, 4: 41- 46
5 Fiocca, R., Necchi, V., Sommi, P., Ricci, V., Telford, J., Cover, T.L., Solicia, E.:
Release of Helicobacter pylori vacuolating
cytotoxin by both a specific secrection pathway and budding of outer membrane vesicles Uptake of released toxin and vesicles by gastric
epithelium J Pathol 1999, 188: 220-226
6 Kido, S., Kitadai, Y., Hattori, N et al:
Interleukin IL-8 and vascular endothelial growth factor- prognostic factors in human
gastric carcinomas? 2001, Eur J of Cancer
37 : 1482- 1487
7 Kim, J.S., Chang, J.H., Seo, W.Y., Yu, G.J., Chung, S.I and Yum, J.S.: Cloning and
Trang 5Protein (Omp22) from Helicobacter pylori
Mol Cells 2001, 10 (6): 633 - 641
8 Kitadai, Y., Haruma, K., Mukaida, N et
al: Regulation of disease – prograsion genes in
human gastric carcinoma cells by interleukin
IL-8 2000, Clin Cancer Res 6 : 2735- 2740
9 Kitadai, Y., Haruma, K., Sumii, K.,
Yamamoto, S., Ue, T., Yozaki, H., Yasui, W.,
Ohmoto, Y., Kajiyama, G., Filder, I J and
Tahara, E [1998] Expression of interleukin
IL- 8 correlates with vascularity in human
gastric carcinomas Am J Pathol 2001, 152 : 93-100
10 Stein, M., Rappuoli, R and Covacci, A:
Tyrosine phosphorylation of the Helicobacter pylori CagA antigen after cag-driven host cell translocation Proc Natl Acad Sci USA 97 :
1263 - 1268.
C«ng tr×nh nghiªn cøu nµy ®−îc tiÕn hµnh t¹i tr−êng §¹i häc Tæng hîp Michigan (Mü)
Summary
The protein cagA enters the AGS cells via the
interaction of the vesicles of Helicobacter pylori
The vesicles formed from the outer membrane of the bacterium Helicobacter pylori contain many
protein toxins such as cagA.,vacA, HP1125 The entry of the toxin-bearing particles into the gastric cancerous cells AGS led to the increased synthesis of interleukin IL-8
