Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng của protein tái tổ hợp (rHIP) trên sự phát triển dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại doc

Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng của protein tái tổ hợp rHIP trên sự phát triển dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại Tạ Thành Văn 1 và M.. Để chứng minh cho giả thiết này, chúng tô

Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng của protein tái tổ hợp (rHIP) trên sự phát triển dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại

Tạ Thành Văn 1 và M C Farach - Carson 2

1 , Bộ môn Hóa - Hóa sinh, Đại học Y Hà Nội

2 , Phòng Sinh học phân tử và Nội tiết, Khoa Sinh học, Trường Đại học Delaware, Hoa Kỳ

I ĐặT VấN Đề

Heparan sulfate proteoglycans (HSPG) nằm ở trên

bề mặt tế bào hoặc trong khoảng gian bào của tất cả

các mô động vật HSPG và các protein liên kết với

chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh học của tế

bào như: sự liên kết tế bào - tế bào, quá trình phân

bào, biệt hóa, sự di chuyển và các quá trình sinh bệnh

lý của tế bào [1, 2, 6] Khoảng gian bào là nơi lưu giữ

và giải phóng các enzyme proteinase, các chất ức chế

và các yếu tố phát triển tế bào Những tác nhân gây

ra sự giải phóng các yếu tố phát triển từ khoảng gian

bào đều dẫn đến việc thúc đẩy sự phát triển của tế

bào Khi xử lý mô với enzyme thủy phân

heparin/heparan sulfate (HP/HS) hoặc với các chất ức

chế tổng hợp HSPG, tế bào phát triển mạnh và trở

nên có độ linh động cao, dễ dàng tách rời khỏi các

mô Đây chính là một trong các cơ chế di căn của

ung thư, trong đó các tế bào phát triển rất mạnh và dễ

di chuyển sang mô khác

Protein gắn đặc hiệu với heparan sulfate (HIP)

được xác định là một protein màng, nhận biết những

vị trí đặc hiệu trên phân tử HP/HS ADN của HIP mã

hóa 159 acid amine có trọng lượng phân tử khoảng

24 kDa HIP được tổng hợp nhiều ở tế bào nội mạc

và tế bào biểu mô trưởng thành [4, 5] Protein này

gắn trực tiếp, đặc hiệu với HP/HS và heparan sulfate

Chuỗi peptid ngắn được tổng hợp mô phỏng theo

vùng gắn đặc hiệu với HP/HS của HIP cũng có khả

năng gắn đặc hiệu và chọn lọc với HP/HS Thêm vào

đó, HIP còn có khả năng ức chế heparanase, thông

qua đó làm tăng cường mối liên kết tế bào - tế bào

Mối liên kết này bị ức chế bởi HP/HS cũng như một

số HSPG [4, 5] Chúng tôi giả thiết rằng bằng cách

cạnh tranh với vùng gắn đặc hiệu trên phân tử

HP/HS, HIP tham gia điều hòa sự phát triển tế bào thông qua việc điều hòa quá trình lưu giữ và giải phóng bFGF từ khoảng gian bào Để chứng minh cho giả thiết này, chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi bình thường và lợi phì đại của các bệnh nhân ghép tạng điều trị bằng thuốc ức chế miễn dịch cyclosporine A (CsA) làm mô hình nghiên cứu thực nghiệm Sự phì đại của mô lợi liên quan với việc

sử dụng CsA được cho là do sự tăng cường phát triển của các tế bào sợi Đồng thời tại các mô này có sự tăng cường tổng hợp các yếu tố phát triển cùng với các receptor của chúng và HSPG Chính vì vậy, đây

là một mô hình nghiên cứu in vitro lý tưởng để tìm

hiểu cơ chế phì đại của mô lợi ở những bệnh nhân sử dụng CsA cũng như vai trò của HIP Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng công nghệ gen để tổng

hợp HIP của người tái tổ hợp trên hệ vi khuẩn E coli

HIP tái tổ hợp đã được sử dụng trong mô hình thực

nghiệm in vivo để nghiên cứu tác dụng ức chế của

protein này trên dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi bình thường và mô lợi phì đại của bệnh nhân ghép tạng sử dụng CsA

II VậT LIệU Và PHươNG PHáP

1 Vật liệu

Heparin, imidazole, và bovine serum albumin

được mua từ Sigma (St Louis, MO, USA) bFGF

được mua từ Becton Dickinson Labware (Bedford,

MA, USA) Minimal essential medium (MEM), penicillin/streptomycin, Fungizoneđ, fetal bovine serum (FBS), các thành phần bổ sung cho môi trường nuôi cấy tế bào, trypsin và phosphate - buffer saline (PBS) được mua từ Gibco/BRL (Grand Island, NY, USA) Cyclosporine A mua từ Calbiochem (LaJolla, CA, USA)

2 Phương pháp

2.1 Phân lập tế bào sợi từ mô lợi bình thường

và phì đại

Mô lợi bình thường và lợi phì đại được lấy

trong các cuộc phẫu thuật lợi định kỳ cho các bệnh

nhân ghép tạng sử dụng thuốc ức chế miễn dịch

CsA tại khoa Răng, bệnh viện Trường Đại học

tổng hợp Pennsylvania (Philadelphia, PA, USA)

Mô lợi được cắt nhỏ trong điều kiện vô trùng rồi

nuôi cấy trong phiến nuôi cấy tế bào có 24 giếng

(24 - well plate) với MEM có bổ sung 10% FBS,

penicillin (100 U/ml), streptomycin (100àg/ml), và

1% Fungizoneđ ở 37 oC với thành phần không khí

ẩm có 95% không khí và 5% CO2 Các tế bào sợi

sẽ phủ kín mặt giếng trong khoảng thời gian 14 -

18 ngày Sau đó các tế bào này được chuyển sang

bình nuôi cấy 75 - cm2 sử dụng môi trường nuôi

cấy trên song không có Fungizoneđ Cuối cùng,

các tế bào này được thu hoạch, đưa nhanh về nhiệt

độ - 80 oC và bảo quản trong nitơ lỏng Tất cả các

tế bào sợi sử dụng trong nghiên cứu này đều ở thế

hệ thứ 3 đến thứ 8 Bằng cách sử dụng các kháng

thể đặc hiệu: anti - vimetin, anti - desmin, anti -

fibronectin, anti - factor VIII và anti - cytokeratin

14, chúng tôi đã khẳng định dòng tế bào sợi phân

lập được không bị nhiễm các loại tế bào khác như

tế bào biểu mô, tế bào nội mạc, tế bào cơ trơn

2.2 Tổng hợp và tinh chế HIP tái tổ hợp

Các cặp mồi có vị trí của enzyme cắt giới hạn

EcoRI cho phép nhân đoạn nucleotide của HIP từ

vị trí 25 - 508 Trình tự nucleotide của các cặp mồi

xuôi và ngược theo thứ tự là: 5’ -

CCCGAATTCGACATGGCCAAGTC và 5’ -

CCGAAGTCTCATTTCTTAAGGGG Sản phẩm

PCR chứa đựng toàn bộ các bộ ba mã hóa toàn bộ

chiều dài phân tử của HIP được đưa vào vector có

oligo - histidine với vị trí enzyme cắt giới hạn là

EcoRI Sản phẩm HIP tái tổ hợp có gắn với

oligohistidine ở đầu - N tận HIP tái tổ hợp được

tinh chế theo hai giai đoạn Giai đoạn 1 sử dụng

cột sắc ký ái lực cobalt resin và giai đoạn 2 sử

dụng cột sắc ký ái lực heparin sepharose Tất cả

các giai đoạn tinh chế đều được thực hiện ở 4 oC và

độ tinh khiết được theo dâi bằng điện di trên gel

SDS - polyarylamide và Western blot sử dụng kháng thể kháng HIP Kết quả cho thấy HIP tái tổ hợp được tinh chế với độ tinh khiết trên 95% Các

protein gắn không đặc hiệu ở E coli không mang

HIP - vector cũng được tinh chế và được sử dụng như mẫu đối chứng âm tính

2.3 Điện di trên gel polyacrylamide với sự có mặt của sodium dodecyl sulfate (SDS - PAGE) và Western blot

Các mẫu protein hòa tan được tủa bằng 10% acid trichloroacetic ở 4 oC trong 2 h hoặc để qua

đêm Tủa được thu hồi bằng cách ly tâm 1200 ì g trong 10 phút ở 4 oC sau đó được rửa bằng 10% acid trichloroacetic và 100% acetone rồi để khô ở nhiệt độ phòng Tủa được hòa tan bởi một lượng tương đương dung dịch đệm điện di hòa tan mẫu (sample buffer) và đệm Tris - HCl, 50 mM, pH 7.0

có 4 M ure, 1% SDS, 1% β - mecaptoethanol và 0,01% phenylmethylsulfonyl fluoride Hỗn hợp này được đun sôi trong 5 phút và dùng để chạy

điện di trong điều kiện biến tính với 15% gel polyacrylamide Gel được rửa nhanh bằng đệm Tris base 100 mM và 100 mM glycine, pH 9,2 rồi

được điện di chuyển sang giấy nitrocellulose ở 4oC trong 5 h với hiệu điện thế 40 V sử dụng Transblot apparatus (Bio - Rad) Giấy nitrocellulose được ủ với kháng thể kháng HIP trong đệm PBS có 0,01% sodium azide và 0.05% Tween 20 (PAT) và 1% BSA trong 6h rồi sau đó được rửa 3 lần với PAT và

ủ với kháng thể kháng IgG của thỏ được gắn với horseradish peroxydase (pha loãng 1: 200.000 với PAT) trong 2h Sau khi rửa tiếp 3 lần với PAT, các vết protein trên tấm giấy này được phát hiện bằng dung dịch hóa phát quang (Pier Chemical, Rockford, IL, USA)

2.4 Kỹ thuật đánh giá sự phát triển của tế bào

Để đánh giá ảnh hưởng của HIP lên sự phát triển của tế bào sợi, chúng tôi sử dụng phiến nuôi cấy tế bào có 24 giếng với số lượng tế bào khởi

đầu là 3.500 tế bào/giếng Các giếng này được ủ trong tủ nuôi cấy qua đêm trong môi trường là MEM có 10% FBS để đảm bảo cho tất cả các tế bào bám vào đáy giếng Ngày hôm sau, các giếng

được tráng nhẹ nhàng 2 lần với PBS (Ca2+/Mg2+) rồi thay thế bằng môi trường MEM với 0,2% FBS

Các vệt của HIP được phát hiện bằng Western blot với việc sử dụng kháng thể kháng HIP peptide:

1, Trọng lượng phân tử chuẩn; 2, Dịch phá hủy E coli thô; 3, Dịch chảy qua cột cobalt; 4, Phân đoạn gắn với cột cobalt; 5, Dịch rửa cột heparin (0,5 M NaCl); 6, Dịch chảy qua cột heparin; 7 và 8, Các phân đoạn gắn với cột heparin sepharose được đẩy bằng dung dịch đệm với 1,5 M NaCl

(500 àl/giếng) và ủ thêm 24 giờ nữa Sau đó môi

trường trên được thay thế bằng môi trường có chứa

các yếu tố cần nghiên cứu trong đó có HIP Môi

trường của tất cả các điều kiện thí nghiệm trên đều

chứa 0,2% FBS ở các ngày 0, 3, 5, 9 và 13 tế bào

sợi được thu hoạch bằng cách xử lý với

trypsin/EDTA và đếm bằng buồng đếm tế bào

Mỗi điều kiện thí nghiệm được nhắc lại 4 lần Tốc

độ phát triển tế bào được phân tích và so sánh sử

dụng phần mềm ANOVA và Tukey - Kramer

secondary multiple - comparision test

III KếT QUả

1 Tổng hợp và tinh chế HIP tái tổ hợp của người

Bằng cách sử dụng hệ vector có oligohistidine,

tác giả đã tổng hợp thành công HIP tái tổ hợp của

người có mang oligohistidine ở đầu - N tận trên hệ

vi khuẩn E coli Hai đặc tính của protein tái tổ hợp

này đã được lợi dụng để có thể tinh chế nhanh với

số lượng lớn và đạt độ tinh khiết cao: 1) Mang

oligohistidine nên có thể sử dụng sắc ký ái lực

cobalt resin để gắn và dùng imidazole để đẩy; 2)

Có ái lực cao với heparin nên có thể dùng sắc ký ái

lực heparin sepharose để gắn và dùng nồng độ

NaCl cao (1,5 M) để đẩy Bằng cách kết hợp hai

giai đoạn trên, HIP tái tổ hợp đã được tinh chế với

độ tinh khiết cao trên 95% so với dịch chiết ban

đầu từ vi khuẩn E coli (hình 1) Nghiên cứu đánh

giá độ bền vững của protein này trong các điều

kiện bảo quản khác nhau cho thấy HIP có thể được

bảo quản trong PBS có 10% glycerol ở nhiệt độ -

80 oC trong thời gian một tháng mà hoạt tính của

HIP còn được trên 90% so với ngày đầu tiên, ngay

sau khi mới tinh chế (hình 2)

Hình 2 Độ bền vững của HIP ở - 80 o C trong PBS với 10% glycerol

1, Sau 2 tháng; 2, Sau 1 tháng; 3, Ngày 1;

4, Trọng lượng phân tử chuẩn

2 HIP ức chế sự phát triển của tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi bình thường và mô lợi phì đại của bệnh nhân sử dụng CsA giống nhau về mặt hình thái học [3] Thêm vào đó, hai dòng tế bào này có chung một sự đáp ứng với bFGF, CsA và heparin khi cho các chất này vào môi trường nuôi cấy [3] Trong nghiên cứu trước chúng tôi đã chỉ ra rằng thêm heparin với nồng độ

10 àg/ml vào môi trường nuôi cấy không ảnh hưởng đến sự kích thích tăng sinh tế bào của bFGF

ở nồng độ 10 ng/ml Khi tăng nồng độ bFGF từ 10

đến 50 ng/ml thì số lượng tế bào cũng tăng lên

đáng kể [3]

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4

Hình 1 HIP của người tái tổ hợp trên E coli được

tinh chế với độ tinh khiết cao nhờ sắc ký ái lực

0

10

20

30

40

50

Hình 3: HIP đối kháng với khả năng kích

thích phân bào của bFGF

Tế bào sợi được nuôi cấy trong MEM ở 3 điều

kiện khác nhau: 1, 0,2% FBS; 2, 0,2% FBS và 50

ng/ml bFGF; 3, 0,2% FBS, 50 ng bFGF và 5 àg/ml

HIP Số lượng tế bào được đếm ở các ngày 0, 3, 9

và 13 kể từ khi thêm các thành phần bổ sung vào

môi trường nuôi cấy Mỗi thí nghiệm được nhắc lại

4 lần, **, p < 0,001; ***, p < 0,0001

Kết quả ở hình 3 cho thấy, trong những ngày

đầu, không có sự khác biệt về số lượng tế bào giữa

hai nhóm có và không có HIP Tuy nhiên vào ngày

thứ 9 và đặc biệt là vào ngày thứ 13 thì HIP thể

hiện hoạt tính ức chế mạnh khả năng kích thích

phân bào của bFGF Tuy nhiên thí nghiệm khác

cho thấy nếu cho HIP vào môi trường nuôi cấy mà

không bổ sung bFGF thì sẽ không có sự thay đổi

về số lượng tế bào giữa hai nhóm thí nghiệm

Thêm vào đó, khi bổ sung IGF - 1, một yếu tố phát

triển tế bào không phụ thuộc HP/HS thì cũng

không làm thay đổi tốc độ phân bào giữa hai nhóm

có HIP và không có HIP [7, 8] ở nồng độ 5 g/ml,

HIP bắt đầu thể hiện hoạt tính ức chế sự phân bào

trong khi với nồng độ 100 và 10 lần nhỏ hơn, HIP không hề phát huy khả năng ức chế này (hình 4) Những kết quả trên cho phép chúng tôi đề xuất cơ chế điều hòa hoạt tính kích thích phân bào của bFGF trong mô lợi phì đại của bệnh nhân sử dụng CsA (hình 5)

***

**

0 5 10 15 20 25

Hình 4: Xác định nồng độ HIP bắt đầu có khả năng đối kháng với sự kích thích phân bào của bFGF

Tế bào sợi được nuôi cấy trong MEM ở 3 điều

kiện khác nhau: 1, 0,2% FBS; 2, có 0,2% FBS và

50 ng/ml bFGF; 3, 0,2% FBS, 50 ng bFGF và 0,05 g/ml; 4, 0,2% FBS, 50 ng bFGF và 0,5 àg/ml HIP

và 5, 0,2% FBS, 50 ng bFGF và 0,5 àg/ml HIP Số

lượng tế bào được đếm ở các ngày 0, 3 và 9 kể từ khi thêm các thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 4 lần, *, p

< 0,05

Protein

Khoảng gian

bào

bFGF (thể hoạt động)

HIP

bFGF (thể bất hoạt)

Phức hợp HIP - HS

Vị trí gắn của bFG trên HS

Hình 5 Mô hình cơ chế đối kháng của HIP với tác dụng kích thích phân bào của bFGF

đối với tế bào sợi của mô lợi phì đại

HIP ức chế enzyme thủy phân mô đồng thời

cạnh tranh với vị trí gắn của bFGF trên phân tử HS

để giải phóng bFGF ở dạng bất hoạt và tạo phức

hợp HIP/HS)

IV BàN LUậN

Các yếu tố phát triển tế bào gắn đặc hiệu với

HP/HS trong đó có bFGF tham gia thúc đẩy sự

tăng sinh phì đại của mô lợi ở những bệnh nhân sử

dụng CsA Các yếu tố phát triển này cùng receptor

của chúng và HSPG được tổng hợp nhiều trong quá

trình phát triển phì đại của mô lợi gây ra chảy máu

thường xuyên cho bệnh nhân Các nghiên cứu đã

chỉ ra rằng việc gia tăng sự phát triển của mô lợi

gây ra chủ yếu là do sự tăng sinh của các tế bào

sợi CsA được phát hiện là thủ phạm gây tăng quá

trình tổng hợp ADN của các tế bào sợi Điều này

đã khiến chúng tôi cho rằng phải chăng cơ chế tác

động của CsA thông qua con đường kích thích sự

phân bào của bFGF

HIP được xác định là một protein màng gắn đặc

hiệu với HP/HS [4] Protein này có khả năng gắn

đặc hiệu và chọn lọc với HP/HS đồng thời có khả

năng ức chế heparanase để qua đó làm tăng cường

mối liên kết tế bào - tế bào Mối liên kết này bị ức

chế bởi HP/HS cũng như một số HSPG Chính vì

vậy, chúng tôi đã giả thiết rằng HIP điều hòa sự

phát triển của tế bào thông qua việc điều hòa quá

trình lưu giữ và giải phóng bFGF từ khoảng gian

bào Thêm heparin vào môi trường nuôi cấy mà

không ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào cho

thấy các tế bào sợi phân lập được có khả năng tổng

hợp dư thừa glycosaminoglycan để có thể thúc đẩy

sự đáp ứng của tế bào đối với bFGF [8] Kết quả

cho thấy ở liều 5 àg/ml hay cao hơn HIP ức chế

mạnh sự tăng sinh của tế bào với sự có mặt của 50

ng/ml bFGF Không có bFGF, HIP không thể hiện

hoạt tính ức chế cho thấy HIP có khả năng làm suy

giảm sự đáp ứng của tế bào đối với bFGF Điều

này cũng đồng nghĩa rằng ở trạng thái nghỉ (0,2%

FBS trong môi trường nuôi cấy) thì tế bào kém

nhậy cảm với các yếu tố phát triển cũng như đáp

ứng yếu với HIP Từ kết quả trên chúng tôi cho

rằng HIP đóng vai trò như là một chất đối kháng với bFGF trong việc kích thích sự phát triển của tế bào sợi Cùng với việc HIP không ảnh hưởng đến tác dụng kích thích phân bào của IGF - 1 cho thấy cơ chế hoạt động trên của HIP phải là cơ chế phụ thuộc HP/HS Kết quả này chứng minh cho giả thuyết của chúng tôi về cơ chế hoạt động của HIP trong mô lợi phì đại của bệnh nhân sử dụng CsA Trong đó CsA kích thích tổng hợp HIP từ tế bào nội mạc hoặc tế bào biểu mô Do vậy HIP sẽ tăng khả năng cạnh tranh với vị trí gắn đặc hiệu của bFGF trên phân tử HS ở khoảng gian bào để giải phóng bFGF ở dạng bất hoạt và tạo phức hợp HIP -

HS Thêm vào đó HIP còn có khả năng ức chế các enzyme mô như các protease và endoglycosidase

là các enzyme làm tăng bFGF ở trạng thái tự do Tất cả điều này đều làm bFGF ở dạng hoạt động tăng cao và thúc đẩy sự nhân lên của tế bào sợi gây nên phì đại mô lợi Kết quả nghiên cứu này mở ra một triển vọng nghiên cứu ứng dụng HIP và các HSPG trong điều trị hiện tượng phì đại lợi, một tác dụng phụ của CsA và các dẫn xuất, tránh cho bệnh nhân khỏi việc phẫu thuật cắt bỏ lợi định kỳ

V KếT LUậN Những kết quả thu được từ công trình nghiên cứu này cho phép chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

1 Chúng tôi đã thiết lập thành công quy trình tổng hợp protein tái tổ hợp (HIP) của người trên hệ

vi khuẩn E coli sử dụng vector có oligo - histidine

2 HIP tái tổ hợp đã được tinh chế với độ tinh khiết cao nhờ kết hợp các kỹ thuật sắc ký ái lực sử dụng nhựa coban và heparin

3 HIP tái tổ hợp thể hiện hoạt tính ức chế mạnh lên sự nhân lên của cả hai dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi bình thường và mô lợi phì đại

được lấy từ bệnh nhân ghép tạng sử dụng CsA

4 Kết quả thu được cho phép các tác giả đưa

ra cơ chế tác dụng của HIP: HIP cạnh tranh với bFGF trên vị trí gắn đặc hiệu của yếu tố này trong phân tử heparan sulfate để giải phóng bFGF ở dạng

bất hoạt Thông qua đó HIP ức chế sự phát triển

của tế bào

TàI LIệU THAM KHảO

1 Tạ Thành Văn (1998); Heparin: Sự tương

tác với các protein Tạp chí Nghiên cứu Y học, 6

(2), 69 - 72

2 Tạ Thành Văn, Saburo Hara (2001); ái

lực của fructose 1,6 - bisphosphate aldolase với

glycosaminoglycans Tạp chí Nghiên cứu y học 16,

35 - 40

3 Tạ Thành Văn (2004); Phân lập và nghiên

cứu sự đáp ứng của dòng tế bào sợi từ mô lợi phì

đại với bFGF và heparin Y học Việt Nam (đang

in)

4 Julian, J., Van - Thanh, T., Carson, D D

et al. (2001); Expression of HIP/RPL29 during the

entrous cycle and early pregnancy in the mouse

Biological Reproduction 64 (4): 1165 - 1175

5 Rohde, L H., Julian, J., Babaknia, A.,

Carson, D D (1996); Cell surface expression of

HIP, a novel heparin/heparan sulfate binding

protein, of human uterine epithelial cells and cell

lines Journal of Biological Chemistry 271, 11824

- 11830

6 Van - Thanh, T., Takano, R., Kamei,

Hara, S et al (1999); Fructose 1,6 - bisphosphate

aldolase is a heparin binding protein Journal of

Biochemistry 125, 554 - 559

7 Van - Thanh, T., Korostoff, J., and

Farach - Carson, M C et al (2000); Heparan

sulfate interacting protein (HIP) negatively regulates growth responses to bFGF by gingival

fibroblasts Molecular Biology of the Cell 11,

244a

8 Van - Thanh, T., Carson, D D., Farach -

Carson, M C et al (2002); Heparan sulfate

interacting protein (HIP/L29) negatively regulates growth responses to basic fibroblast growth factor

in gingival fibroblasts Journal of Dental

Research 81, 247 - 252

Summary

Synthesis and study on effect of recombinant protein (HIP) on gingival fibroblast growth derived from overgrowth gingiva

Heparan sulfate proteoglycan (HSPG) locates on the cell surface and extracellular matrix (ECM) where basic fibroblast growth factor (bFGF) is captured and released in a regulated fashion by tissue proteinases and endoglycosidases bFGF implicated in gingival overgrowth Release, rather than synthesis rates, governs bFGF bioavailability We identified a heparin/heparan sulfate (HP/HS) interacting protein (HIP) that recognizes specific HS sequences We isolated and cultured fibroblasts from normal gingiva and overgrowth gingiva from

patients on cyclosporine (CsA) Recombinant human HIP fused with oligo - histidine tag expressed in E coli,

dramatically decreased bFGF - induced proliferation These results support our hypothesis that HIP modulates bFGF bioavaibility through the regulation of ECM sequestration and release