Biến thể ebnai ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Việt Nam, Trung Quốc và ở người Việt Nam bình thường Nguyễn Văn Đô 1 , Trần Thị Chính 1 , Phan Thị Phi Phi 1 , Ingemar Ernberg 2 , Li Fu
Trang 1Biến thể ebnai ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Việt Nam, Trung Quốc và ở người Việt Nam bình thường
Nguyễn Văn Đô 1 , Trần Thị Chính 1 , Phan Thị Phi Phi 1 ,
Ingemar Ernberg 2 , Li Fu Hu 2
1 Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh trưởng đại học Y Hà Nội
2 MTC, Viện Karolinska, Stockholm, Thuỵ Điển
EBNA (EBV - nuclear antigen1) là một protein duy nhất được biểu lộ ở tất cả các tế bào bị nhiễm virut Epstein - Barr Biến thể của EBNA1 đã được định nghĩa dựa vào acid amin ở vị trí thuộc mã bộ ba 487 của DNA và bao gồm các dưới nhóm là P (prototype): P- ala (B95 -8) và P- thr; V (variant): V - val, V - leu và V - pro
Chúng tôi đã phân tích trình tự DNA ở đầu cacboxy của EBNA1 từ sản phẩm PCR Các mẫu DNA cho kỹ thuật PCR được chiết tách từ khối u vòm họng và máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư vòm họng người Việt Nam và Trung Quốc, thể biểu mô không biệt hoá; máu ngoại vi của người cho máu Việt Nam
Kết quả cho thấy EBNA1 ở người bình thường và bệnh nhân ung thư vòm mũi họng có các đột biến điểm dẫn đến thay đổi các acid amin và các biến thể này thuộc dưới nhóm của V - val: V - val
- v1 (9/10 cặp mẫu và 5 người bình thường) và V - val - v2 (1/10 cặp mẫu) Trong số 15 cặp mẫu của bệnh nhân ung thư vòm họng người Trung Quốc, ở khối u có dưới nhóm là V - val - v1 (15/15), còn máu ngoại vi chỉ có 2 mẫu (2/15) là P - ala và một mẫu nghi ngờ có cả P - ala và V- val - 1
I Đặt vấn đề
Virút Epstein - Barr (EBV), một virut thuộc
nhóm herpes, được lây nhiễm ở hầu hết các
quần thể dân cư trên thế giới Sự tồn tại của
virut trong cơ thể bị nhiễm có hai dạng là thể
dung giải và thể tiềm ẩn Khởi đầu của chu kỳ
dung giải là sự xâm nhập của các virut vào liên
bào lympho B ở vòm họng nhờ các rêxepơ
thích hợp Virut được nhân lên trong tế bào và
tạo ra các hạt virut Các hạt virut này lại được
giải phóng ra và lây nhiễm sang các tế bào
lành khác hoặc các cơ thể khác qua con đường
nước bọt Thể nhiễm tiềm ẩn xuất hiện sau khi
nhiễm dung giải ở các cơ thể bị nhiễm Thể này
gồm các hình thái I, II, III và sự biểu lộ gen của
EBV khác nhau tuỳ theo hình thái nhiễm, ở các
bệnh khác nhau ở thể nhiễm tiềm ẩn I chỉ có
EBER và EBNA1, hình thái II có thêm các gen
khác biểu lộ như LMP1, LMP2 và hình thái III
tất cả các gen của hình thái I và II và thêm
EBNA2 - 6 biểu lộ EBV là nguyên nhân gây ra bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn và
là virut có liên quan đến một số bệnh lý ác tính
ở người như u lympho Burkitt (BL) [1], ung thư vòm mũi họng (UTVMH) [2,3]
EBNA1 là một protein của EBV được biểu lộ
ở tất cả các thể nhiễm tiềm ẩn trong tế bào nhiễm EBV Nó có vai trò rất quan trọng là yếu
tố hệ thống các gen khởi động của EBV giúp cho quá trình sao chép ADN và phân chia của EBV để duy trì sự tồn tại của EBV trong tế bào,
đồng thời điều hoà sự biểu lộ của chính EBNA1
và các gen khác của thể nhiễm tiềm ẩn như EBNA 2 - 6, LMP1,2
Trình tự gen của EBV thuộc dòng tế bào B95 -8 đã được phân tích hoàn chỉnh và cấu trúc của gen EBNA1 liên quan đến các chức năng của nó đã được nghiên cứu và làm sáng
tỏ Một số tác giả đã phát hiện thấy các đột biến điểm của gen EBNA1 dẫn đến sự thay đổi
Trang 2TCNCYH 25 (5) - 2003
các acid amin trong chuỗi protein ở các chủng
EBV từ các vùng địa lý khác nhau trên thế giới
và từ những bệnh lý khác nhau có liên quan
Các công trình nghiên cứu đều cho thấy các
đột biến thường xảy ra ở vùng có chức năng
gắn DNA thuộc đầu cocboxy của EBNA1 [4,5]
Bhatia và cộng sự 1996 cũng đã phân tích trình
tự gen EBNA1 của EBV thuộc dòng B95 - 8 so
sánh với một số chủng EBV khác và đã phân
loại EBNA1 thành 5 dưới nhóm khác nhau, đó
là P - ala, P - thr, V - pro, V - leu và V - val (P
là prototype thuộc chủng B95 - 8, còn V là
variant)
ở Việt Nam chưa có công trình nào nghiên
cứu về phân tích trình tự gen và phát hiện đột
biến gen EBNA1 của EBV
Mục tiêu của công trình này là:
1 Phân tích trình tự gen EBNA1 ở đầu tận
cacboxy của DNA, tách chiết từ mô sinh thiết
ung thư vòm mũi họng (UTVMH) và máu ngoại
vi người khỏe mạnh
2 So sánh trình tự gen EBNA1 của bệnh
nhân UTVMH Việt Nam với trình tự gen này ở
bệnh nhân UTVMH Trung Quốc với gen EBNA
của chủng B95 - 8 châu Âu và của máu của
người khoẻ mạnh Việt Nam
II Đối tượng và phương pháp
nghiên cứu
1 Đối tượng
1.1 Bệnh nhân ung thư vòm mũi họng
DNA được chiết tách từ 10 cặp mẫu gồm
sinh thiết khối u vòm họng được chẩn đoán xác
định bằng giải phẫu bệnh lý là ung thư biểu mô
không biệt hoá và máu của mỗi bệnh nhân
tương ứng Các bệnh nhân này được chẩn
đoán và điều trị tại bệnh viện K Hà Nội 15 cặp
mẫu bệnh nhân ung thư vòm họng thể biểu mô
không biệt hoá được lấy từ Quảng Đông, Trung
Quốc
1.2 Người bình thường
DNA được chiết tách từ 5 mẫu máu lấy từ
người cho máu tại Viện Huyết học và Truyền
máu Trung ương
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Chiết tách DNA
2.1.1 Chiết tách DNA từ máu toàn phần
5ml máu được chống đông bằng EDTA bảo quản trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ 40C Cho 10ml dung dịch phá hồng cầu (1mM NH4HCO3 115mM NH4Cl) vào falcon 15ml đã đựng sẵn máu chống đông, lắc đều và ly tâm 1200g x 10 phút Loại bỏ dịch và giữ lại phần cặn Làm tan cặn và cho 10ml dung dịch phá hồng cầu lần 2,
ly tâm lấy cặn như trên Cho 1,8ml dung dịch phá bạch cầu (100mM tris - C1, pH 7,6; 40mM EDTA, pH 8.0; 50mM NaCl; 0,2% SDS; 0,05% sodium azide) vào cặn bạch cầu thu được và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm để làm tan hết các bạch cầu, dung dịch trở nên đặc và nhầy Cho 10àl proteinase K nồng độ 20mg/mL vào bạch cầu đã được làm tan và ủ ở
500C, 2 giờ có lắc theo chu kỳ Thêm 600àl NaCl 6M, lắc 10 phút và ly tâm 1200 vòng/ phút x 5 phút, loại bỏ nước nổi Cho 5ml cồn
700 vào cặn DNA, ly tâm 1200 vòng/ phút x 5 phút Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng và hoà tan trong 400àl - 500àl TE
2.1.2 Chiết tách DNA từ mô sinh thiết tươi
Cho 560àl dung dịch phá huỷ tế bào (0,6% SDS; 10mM EDTA; 10mM Tris, pH 7,5; 200àg/ml RNaseA) vào cối nghiền thủy tinh vô trùng đựng sẵn mẫu sinh thiết tươi Nghiền cho
đến khi mẫu sinh thiết tan hoàn toàn sau đó ủ
600C x 1 giờ Cho 15àl proteinase K (20mg/ml), tiếp tục ủ 600C từ 1 - 1,5 giờ Thêm 640àl dung dịch phenol bão hoà và lắc nhẹ 10' Ly tâm
5000 vòng/ phút x 10' Hút lấy nước nổi chuyền sang tube mới, cho 660àl phenol/ CHISAM (1:1) lắc đều 5', ly tâm loại bỏ cặn Cho 660àl CHISAM (clorofom/ isoamyl alchohol: 24:1) lắc
đều 5', ly tâm và hút lấy phần nước nổi Thêm 40àl NaOAc, pH 5,2, cồn tuyệt đối gấp 2 lần thể tích dung dịch thu được và lắc nhẹ nhàng Tủa DNA hình thành, ly tâm lấy tủa, rửa tủa bằng cồn tuyệt đối và cồn 700 Hoà tan DNA trong TE hoặc nước cất Kiểm tra chất lượng DNA bằng điện di trên thạch agarose 0,8% có ethidium bromide Đọc kết quả bằng đèn UV
Trang 3Nồng độ và độ tinh khiết của DNA được đo
bằng quang phổ kế Các mẫu DNA đều đạt độ
tinh khiết tiêu chuẩn (OD 260/280) lớn hơn 1,7
2.2 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction)
2.2.1 Xác định gen EBNA1 từ khối u
Cặp mồi sử dụng cho kỹ thuật khuyếch đại
1 đoạn gen EBNA1 từ mô sinh thiết là: mồi
xuôi, 5' - tgg gttt gga aag cat cgt ggt c - 3'
(109339nt - 109360nt) và mỗi ngược, 5' - gtt
gtg ggc cgg gtc cag gg - 3' (109600nt -
109581nt) Thể tích của phản ứng là 25àl trong
đó 2,5àl mỗi mồi xuôi và ngược nồng độ 2àl, 1
đơn vị Taq polymerase (Perkin - Elmer), 2àl
dNPTs nồng độ 2.5àM và 200ng DNA và
H2O Trình tự các phản ứng gồm có biến tính
DNA tiền phản ứng là 950C x 2', 35 chu kỳ
nhiệt là 950C x 15'', 520C30'', 720C30'' thời gian
hoàn thành phản ứng là 5' ở 720C Sản phẩm
PCR có chiều dài 246bp Điện di sản phẩm
PCR trong thạch agarose 2% Đọc kết quả và
chụp ảnh bởi hệ thống GelDoc 2000
2.2.3 Xác định gen EBNA1 từ máu ngoại vi
Để khuyếch đại gen EBNA1 từ máu ngoại
vi, chúng tôi phải dùng 2 lần phản ứng PCR
(PCR1 và PCR2)
PCR1: Trình tự nucleotid của cặp mồi thứ
nhất giống với cặp mồi dùng cho phản ứng
PCR đối với DNA từ khối u vòm họng 25àl hỗn
hợp phản ứng chứa 2,5àl mỗi loại mồi xuôi và
ngược nồng độ 2àl, 1 đơn vị AmpliTaq DNA
polymerase (Perkin Elmer), 2.0àl dNTPs
2.5mM và 200ng DNA Biến tính DNA tiền
phản ứng ở 950C x 2', 35 chu kỳ nhiệt là: 940C
x 15'', 520C x 30'' và 720C x 30'', giai đoạn
hoàn thành việc kéo dài là 720C x 5' Kích
thước của sản phẩm là 246bp
PCR2: Kỹ thuật PCR lồng (nested - PCR)
với cặp mồi là: mồi xuôi 5' - tgg gtt gga aag cat
cgt ggt c - 3' (109339nt - 109360nt) và mồi
ngược: 5' - gcc att cca aag aga cg - 3' (109580nt - 109561nt) Nhiệt độ gắn mồi tăng lên 590C và số chu kỳ nhiệt giảm xuống còn
27 Sản phẩm PCR có kích thước là 146bp
2.3 Kỹ thuật phân tích trình tự nucleotid
Các sản phẩm PCR (DNA từ mô sinh thiết)
và nested - PCR (DNA từ máu ngoại vi) là nguyên liệu dùng để phân tích trình tự Chuẩn
bị mẫu để phân tích trình tự bằng một phản ứng PCR có một mồi xuôi, 5' - Thủ tướng gttt gga aag cat cgt ggt c - 3' (109339nt - 109360nt) Bộ kit sử dụng là "BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" Kết quả được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng
III Kết quả
1 Đột biến thay thế nucleotid đầu cacboxy của EBNA1 ở mô sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng và máu ngoại
vi
Phân tích trình tự 1 đoạn gen mã hoá cho các acid amin nằm ở những vị trí có các acid amin từ 487 đến 533, chúng tôi nhận thấy rằng
sự đột biến thay thế nucleotid dẫn đến thay đổi acid amin xuất hiện ở các vị trí 487, 499, 502,
524 và 533 so với EBNA1 của chủng B95 - 8 Các vị trí thay thế acid amin này giống với dưới nhóm V - val theo phân loại dưới nhóm của Bhatia 1996 và Sandvej 2000 [4,6] Nhưng trong nghiên cứu của chúng tôi, vị trí các acid amin là V - val - v1 và Va - val - v2, dưới nhóm của V - val (bảng 1)
Dựa vào acid amin số 487, chuỗi EBNA1
được xếp thành 2 loại: P (prototype) - ala (hoặc thr) và V (viriant) - val (hoặc - leu) P - ala là EBNA1 thuộc dòng B95 -8 P - ala - v1, v2, v3
là các dưới nhóm của P -ala V- val - v1 và V - val - v2 là các dưới nhóm của V - val Các nucleotide có đột biến thay thế được đánh dấu bằng gạch chân Các ô trống là các nucleotide
có trình tự giống với P -ala của B95 - 8
Trang 4TCNCYH 25 (5) - 2003
Bảng 1: Các dưới nhóm EBNA1 trong nghiên cứu của chúng tôi so với EBNA1 của B95 - 8 và
các dưới nhóm khác
P-ala CAA
Gln
AAC Agn
CCG Pro
GCT Ala
AGT Ser
GAC Asp
GAA Glu
ACT Thr
CTA Leu
ACT Thr
GCC Ala
ATT Ile
CTT Leu
Glu
Ile
Glu
val
Glu
Val
Val
Gln
ACT Thr
TGT Cys
GAT Asp
Leu
ATT Ile P-thr-v CAG
Gln
ACT Thr
TGT Cys
GAG Glu
Leu
ATT Ile
Glu
AGC Ser
CAG Gln
CTT Leu
TGT Cys
GAG Glu
GAT Asp
AAT Agn
CTC Leu
ATT Ile
GGC Gly
Val
GAG Glu
AAT Agn
CTC Leu
ATT Ile
ATT Ile
Val
GAG Glu
AAT Agn
CTC Leu
ATT Ile
GTT Val
ATT Ile
Val
GAG Glu
AAT Agn
CTC Leu
ATT Ile
CTT Leu
ATT Ile
2 Tỷ lệ các dưới nhóm của EBNA1 ở bệnh nhân UTVMH Việt Nam, Trung Quốc và người bình thường
Bảng 2: Sự phân bổ các dưới nhóm EBNA1 ở máu ngoại vi người bình thường, máu và
khối u của các bệnh nhân ung thư vòm Trung Quốc và Việt Nam
Va-val-v1
UTVMH Việt Nam
UTVMH Quảng Đông 1
T: Khối u; L : máu ngoại vi; cặp mẫu:
gồm sinh thiết và máu ngoại vi của cùng
một bệnh nhân
Trong tổng số 10 cặp mẫu của bệnh
nhân UTVMH Việt Nam có 9 cặp mẫu có
dưới nhóm là V - val - v1 và 1 cặp mẫu có V
- val - v2 Đối với các bệnh nhân UTVMH
của Trung Quốc dưới nhóm V-val-v1 cũng
có mặt ở hầu hết các cặp mẫu và không thấy một trường hợp nào có dưới nhóm V-val-v2 Trong khi đó ở máu ngoại của một
số bệnh nhân UTVMH lại có P-ala hoặc nghi ngờ có cả P-ala và V-val-v1 Sự có mặt của cả 2 dưới nhóm P-ala và V-val trong máu ngoại vi cũng đã được thông báo [7] Một
điều đáng chú ý là trong 5 mẫu DNA từ máu
Trang 5ngoại vi của người cho máu Việt Nam cũng
chỉ có một dưới nhóm là V-val-vq
Kết quả này cũng phù hợp với nhận xét
của Sandvej 2000 khi nghiên cứu trên các
đối tượng bệnh nhân ung thư vòm họng của
người Trung Quốc và chỉ đặc trưng cho biến
thể EBNA1 ở Châu á, nơi có tỷ lệ mắc bệnh
ung thư vòm họng cao như Trung Quốc Tuy
nhiên, việc nghiên cứu chức năng của đoạn
protein EBNA1 có đột biến thay thế acid
amin cũng cần được tiến hành để xem các
đột biến này có ảnh hưởng đến chức năng
của nó hay không
IV Kết luận
Dưới nhóm của EBNA1 ở bệnh nhân ung
thư vòm họng và người bình thường Việt
Nam chủ yếu là V-val-v1 Kết quả này cũng
tương tự ở các mẫu nghiên cứu lấy từ bệnh
nhân ung thư vòm họng ở Trung Quốc
Tài liệu tham khảo
Postransplantation lymphoproliferative
disorders frequently contain type A and not
type B Epstein - Barr virus Blood, 85 (5): p
1396 - 403
2 Zur Hausen H., et al., (1970), EBV
DNA in biopsies of Burkitt tumours and
anaplastic carcinomas of the nasopharynx
Nature, 228 (276): p.1056 - 8
Detection of Epstein - Barr virus DNA sequences in nasopharygeal carcinoma cells by enzymatic DNA amplification J Clin Microbiol, 28 (11): p.2398 - 402
4 Bhatia, K., et al (1996), Variation in the sequence of Epstein Barr virus nuclear antigen 1 in normal peripheral blood lymphocytes and in burkitt's lymphomas Oncogene, 13(1): p 177 - 81
5 Bhatia, K and I Magrath, EBNA - 1 sequences iin endemic and sporadic Burkitt's lymphoma J Virol, 1999, 73 (8): p.7096 - 7
S.Hamilton - Dutoit, EBNA - 1 sequence variation in Danish and Chinese EBV - associated tumours: evidence for geographical polymorphism butnot for tumour - specific subtype restriction J Pathol, 2000, 191 (2): p.127 - 31
Gutierrez, M.I., et al (1997), Sequence variations in EBNA - 1 may dictaterestriction
of tissue distribution of Epstein - Barr virus
in normal and tumour cells J Gen Virol, 78 (pt 7): p.1663 – 70
Variation of EBNA1 in Vietnamese, chinese NPC and
healthy blood donors
EBNA1 (Epstein – Barr virus nuclear antigen-1) is the only viral protein expressed consistently
in all virus-infected cells It’s sequence variations were defined based on amino acid signature at codon 487 Those are prototype containing P-ala (identical to prototype B95-8 strain) and (P)-thr and variant that has V-val, V-leu and V-pro
We analyzed DNA sequence in C-terminus of EBNA1 from PCR products DNA samples for PCR were isolated from tumours and periferal blood of Vietnamese nasopharyngeal carcinoma and from peripheral blood of healthy blood donors
The results show that there are two EBNA1 sub-subtypes in Vietnamese NPC (nasopharyngeal carcinoma), V-val-v1 (9/10 DNA matches samples and 5 DNA samples from healthy blood donors and V-val-v2 (1/10 matched samples) Among 15 Chinese matched samples, 15/15 samples from tumors contained V-val-1, only 2/15 (blood samples) contained P-ala and 1/15 (blood sample) may
be mixed P-ala and V-val-1
