Định lượng mô, tế bào bằng phân tích hình ảnh Quantifying tissues, cells by image analysis Trịnh Bình* Trường Đại học Y Hà Nội Phân tích hình ảnh bằng máy tính điện tử thường được dùng
Trang 1Định lượng mô, tế bào bằng phân tích hình ảnh
(Quantifying tissues, cells by image analysis)
Trịnh Bình*
Trường Đại học Y Hà Nội
Phân tích hình ảnh bằng máy tính điện tử
thường được dùng trong các lĩnh vực: chế tạo và
kiểm tra các sản phẩm, khoa học người máy…Với
những ưu điểm của nó, phương pháp này cũng đã
được áp dụng trong lĩnh vực y sinh học để phân
tích tế bào và mô qua kính hiển vi (sinh học, ung
thư học, huyết học, phụ khoa, di truyền tế bào, mô
bệnh học…)
Trước đây, các phương pháp định lượng mô tế
bào tốn rất nhiều thời gian vì cần phân tích trực
giác thông qua các phương pháp đo đếm thủ công
ở một lượng không nhỏ các tiêu bản hiển vi và trên
các tấm ảnh siêu hiển vi, một việc làm rất mệt mỏi
và nhàm chán Ngày nay, với sự trợ giúp của máy
tính điện tử, việc xử lý phân tích các hình ảnh và
định lượng các cấu trúc tế bào và mô đã được thực
hiện một cách nhanh chóng
Trong công việc hàng ngày của các nhà sinh
học, tế bào học và di truyền, mô bệnh học…
thường có một số yêu cầu về định lượng như sau:
• Định lượng tế bào, mô để bổ sung cho những
đánh giá về mặt định tính
• Nhận dạng những đối tượng trong các mẫu
mô bổ sung cho những quan sát chủ quan của con
người (tế bào ác tính, tế bào gián phân, các nguyên
bào, phì đại cấu trúc…)
• Hiểu được cách sắp xếp phân bố của các đối
tượng thông qua những hình ảnh của chúng (động
học tế bào, mức bội thể, loạn sản, mức biệt hoá…)
nhằm kiểm định những nhận xét trực giác theo thói
quen của người quan sát
Để đạt được những yêu cầu này, cần có một tổ
hợp kính hiển vi định lượng, bao gồm một kính
hiển vi có chất lượng cao nối với một máy dò
quang và máy vi tính kèm theo phần mềm định
lượng chuyên dụng… có đủ khả năng thu nhận, xử
lý, phân tích các hình ảnh của các tế bào và mô
A Những nguyên lý của phương pháp định lượng hiển vi
Phương pháp định lượng hiển vi là sự phối hợp của hai kỹ thuật quen thuộc, đó là kỹ thuật hiển vi
và kỹ thuật đo ánh sáng, cho phép định lượng được những hình ảnh hiển vi; trong những trường hợp nhất định, định lượng được hàm lượng của một số chất ở mức tế bào và dưới tế bào
Lĩnh vực áp dụng của phương pháp đo quang hiển vi này được chia thành 2 loại, trên cơ sở cách quan sát hiển vi, đó là:
- Quan sát bằng ánh sáng truyền qua một lát cắt mô hoặc phiến đồ, lát cắt mô này có khả năng hấp thụ
ánh sáng Sự hấp thụ ánh sáng có thể do chính chất liệu của mẫu mô (phương pháp hiển vi tương phản), hoặc do sự hấp thụ mầu sắc khác nhau của chất liệu mẫu mô (phương pháp tiêu bản nhuộm mầu)
- Quan sát bằng ánh sáng phát ra từ lát cắt mô sau khi được một nguồn sáng kích thích phù hợp (phương pháp huỳnh quang nhân tạo gắn chất huỳnh quang với các thành phần tế bào)
Phân tích hình ảnh bằng phương pháp hiển vi dựa trên cơ sở đo đếm những điểm của một cấu trúc qua kính hiển vi mà lượng ánh sáng đi qua đã
bị hấp thụ hoặc được phát ra Lặp lại việc đo đếm này bằng cách quét tất cả các điểm thuộc cấu trúc
và nền bao quanh cấu trúc Hình ảnh của cấu trúc
đó sẽ được tái hiện dưới dạng một ma trận số và sau đó được máy tính điện tử xử lý Thứ tự các bước sơ đồ hoá như sau:
• Thu nhận hình ảnh với sự trợ giúp của thiết
bị có năng lực thu nhận ánh sáng và có độ phân giải cao
• Cải thiện hình ảnh: Làm cho hình ảnh có độ
Trang 2tương phản cao hơn và tính toán các tham số trác
quang
• Phân đoạn và xếp loại đối tượng: Nhận diện,
đánh dấu, giới hạn của cấu trúc cần đo đếm có
trong hình ảnh
• Tham số hoá: Mô tả các đối tượng cần đo
đếm bằng một danh mục các số đo về hình dáng,
mật độ, sự phát quang, mầu sắc và cách sắp xếp
• Phân tích các dữ liệu: Từ các dãy số của
từng đối tượng nghiên cứu so sánh giữa các số liệu,
lập biểu đồ, tìm ý nghĩa
Thu nhận hình ảnh:
Hình ảnh trên kính hiển vi được một camera kỹ
thuật số (đen trắng hoặc mầu) chuyển thành dạng
một bảng trị số (được số hoá) và truyền sang máy
vi tính Gồm các bước:
• Thu nhận hình ảnh quang học chuyển thành
tín hiệu điện, do thiết bị trác quang thực hiện
• Các tín hiệu được truyền qua một card thu
nhận gắn tại máy vi tính
• Chuyển những tín hiệu điện tương đồng thành
những số tương đồng; hình thành một ma trận số
Thiết bị thu nhận và chuyển thành hình ảnh số
gồm: một máy dò quang kết hợp với hệ thống tìm
quét và thiết bị đổi tín hiệu điện tương đồng thành tín
hiệu số Thiết bị số hoá này được chế tạo tuỳ theo
chức năng và có năng lực làm việc riêng tuỳ loại
Với những ảnh siêu cấu trúc (hình ảnh đen
trắng), việc thu nhận hình ảnh được thực hiện bởi
một máy quét ảnh kỹ thuật số Sau thao tác quét
ảnh, hình ảnh siêu cấu trúc cũng được chuyển tới
máy tính dưới dạng một ma trận số và được tái
hiện lên màn hình của máy vi tính
Cải thiện hình ảnh
Thao tác trên máy vi tính theo chương trình
phần mềm xử lý hình ảnh để tăng cường chất lượng
ảnh (tăng độ tương phản, xác định ranh giới, tăng
giảm mầu sắc…); các tín hiệu số trong máy tính
cũng được tự động điều chỉnh theo
Có 4 cách cải thiện hình ảnh:
* Thay đổi về biên độ (sửa đổi dãy số của giá trị xám)
* Chuyển đổi hình ảnh trong không gian
* Chuyển đổi hình ảnh mầu theo nguyên lý phân tích của Fourier
* Chuyển đổi hình ảnh bằng phương pháp mầu giả
Lưu ý là không có một cách tổng quát để cải thiện hình ảnh Vì vậy, cần lựa chọn cách thích hợp cho mỗi loại đối tượng cần phân tích đo đếm
Phân đoạn và xếp loại các đối tượng
Việc phân đoạn các đối tượng cần định lượng trong hình ảnh, do máy tính tự hoạt động, theo lệnh của người điều khiển Các thông tin thừa của ảnh sẽ
được loại bỏ Có 2 phương pháp phân đoạn đối tượng:
• Phương pháp dò tìm vùng - Nguyên lý của phương pháp này là xem xét một đối tượng trong
ảnh như là một tập hợp các điểm giống và khác nhau trong không gian, mà biểu hiện của chúng là cường độ sáng hoặc mầu sắc đối với cùng một nguồn sáng chuẩn Phương pháp này đáp ứng yêu cầu tìm hiểu sự phân bố của những mức độ xám hoặc mức độ mầu có trong ảnh
• Phương pháp phát hiện giới hạn - Người
điểu khiển chỉ cần làm thao tác viền quanh các đối tượng cần đo đếm Mỗi đường viền quanh cấu trúc
là tập hợp các điểm giới hạn của cấu trúc đó Máy chỉ dò tìm và ghi nhận những cấu trúc có đường viền được giới hạn
Những điều cần lưu ý:
• Phân đoạn hình ảnh là bước khó khăn và đặc hiệu khi áp dụng cho từng loại đối tượng Cần có những chỉnh lý cần thiết của người đo đếm bằng cách nhắp chuột máy vi tính
• Việc phân đoạn đối tượng do máy đảm nhiệm, cho nên về kết quả không thể so sánh được với hình ảnh chính do mắt - não nhận biết
• Phân đoạn đối tượng là hình ảnh sinh học do máy thực hiện tự động, khi tái lập hình ảnh không thể hoàn hảo Nếu phối hợp các phương pháp phân đoạn khác nhau, có thể giảm bớt các nhược điểm này
Trang 3• Sau phân đoạn là bước xếp loại đối tượng theo
các tín hiệu số Những điểm tương đồng của cấu trúc
sẽ được sắp xếp lại dưới cùng một nhóm
Tham số hoá
Đây là bước tự động của máy, cho phép xác
định các số đo đối với đối tượng mà người quan sát
quan tâm Có 4 loại tham số lớn:
• Tham số hình thái
• Tham số trác quang
• Tham số đo màu
• Tham số kết cấu
Tham số hình thái
Tham số hình thái được xác định trên hình ảnh
không gian hai chiều (hình ảnh nhị nguyên) Cứ
mỗi điểm là một thông tin về vùng (diện tích của
đối tượng hoặc chất nền) hoặc là một thông tin về
đường viền quanh đối tượng (chu vi)
Hai loại tham số hình thái được dùng nhiều là:
diện tích và chu vi của đối tượng cần nghiên cứu
Trên nguyên tắc, tham số diện tích của một đối
tượng là tổng số các điểm rơi vào bề mặt của đối
tượng; tham số chu vi là tổng số điểm rơi vào
đường xác định ranh giới của đối tượng
Tham số trác quang
Sự phát triển của phương pháp đo quang được
đánh dấu bởi công trình của Casperson vào năm
1936 (phát triển lý thuyết cơ bản về việc lợi dụng
đặc tính phát quang của các thành phần cấu tạo tế
bào (như ARN và ADN) để đo số lượng của chúng
trong các tế bào nguyên vẹn)
Phương pháp đo quang phụ thuộc vào những
đặc tính của từng máy dò quang được chế tạo sẵn
Máy dò quang sẽ tập hợp lại các tia sáng khi qua
cấu trúc bị mầu hấp thu, các chất phát huỳnh
quang, những chất đồng vị phóng xạ, những kháng
thể (gắn trực tiếp hoặc gián tiếp với enzyme hoặc
một chất phát huỳnh quang), những cơ chất sinh
mầu hoặc cơ chất sinh huỳnh quang, những acid
nucleic có khả năng lai cặp in situ với một enzyme
hoặc một chất phát huỳnh quang Thí dụ: trên tiêu
bản hiển vi huỳnh quang, cường độ phát huỳnh
quang được tính bằng tổng cường độ phát huỳnh
quang ở mỗi điểm của đối tượng Có 2 tham số huỳnh quang hay được khai thác, đó là:
• Tham số phát huỳnh quang toàn phần (tổng cường độ phát quang trên toàn bộ bề mặt đối tượng)
• Tham số phát huỳnh quang trung bình (cường độ phát quang bình quân trên một đơn vị diện tích bề mặt mẫu quan sát)
Tham số đo mầu
Trên cơ sở mô hình của Hering, Garbay (1979)
đã phát triển khái niệm đo mầu phù hợp với nguyên lý tiếp nhận mầu sắc của mắt người Người
ta nhận thấy: việc khôi phục lại một hình ảnh mầu
có thể được thực hiện khi làm chồng lên nhau của
3 hình ảnh đơn sắc đỏ, xanh lá cây và xanh da trời Khi ánh sáng đi qua một cấu trúc nhuộm mầu, chúng sẽ bị hấp thụ khác nhau Các tham số đo mầu còn liên quan đến 3 khái niệm bổ trợ đó là: độ chói, sắc thái và sự bão hoà của màu Trong đó, độ chói biểu hiện cường độ của tia phát ra từ đối tượng quan sát; sắc thái màu của đối tượng được quyết định bởi bước sóng phù hợp khi tia sáng đơn sắc đi qua chúng; sự bão hoà biểu thị yếu tố phù hợp với yếu tố loãng mầu kết hợp với bước sóng trội thu được sắc thái và ánh sáng trắng
Những tiến bộ gần đây trong lĩnh vực camera màu cho phép cùng một lúc xác định đồng thời 3
mà phát huỳnh quang
Tham số kết cấu
Đây là những tham số giúp nhận biết được sự sắp xếp, tổ chức của cấu trúc cần nghiên cứu Thí dụ: nhận biết được mật độ phát huỳnh quang các vùng khác nhau của đối tượng; tần số xuất hiện và sự phân bố trong không gian của các vùng phát quang này
Trong thực tế, các nhà tế bào học và mô bệnh học thường quan tâm đến cách sắp xếp của chất nhiễm sắc trong nhân tế bào, từ đó tìm hiểu mối liên quan giữa kết cấu và trạng thái chức năng của tế bào được quan sát Từ thí dụ này, có thể ghi nhận 3 loại thông tin có thể rút ra được (1) về độ tập trung của chất nhiễm sắc, (2) sự phân bố của chất nhiễm sắc và (3) cách sắp xếp của chất nhiễm sắc Tất nhiên cả 3 thông tin này phụ thuộc rất nhiều vào tính phức tạp của các hiện tượng sinh học
Trang 41 Phải chuẩn hoá các phương pháp chuẩn bị các mẫu nghiên cứu (lát cắt mỏng, phiến đồ, tiêu bản áp…) ở tất cả các bước như cố định, cắt lát, nhuộm mầu, làm phản ứng…
Khi phân tích xác định tham số kết cấu một cấu
trúc, có thể dùng 3 cách tính gần đúng:
• Tính số liệu gần đúng của toàn bộ hình ảnh
quan sát (không khai thác những kết cấu cơ bản)
2 Phương pháp định lượng hiển vi dựa trên cơ
sở nguyên lý hoá sinh và vật lý, do đó các lĩnh vực
áp dụng phải hợp thức, đúng giới hạn và được kiểm soát kỹ càng (lượng mầu và các thuốc thử phản ứng, chiều dầy và khoảng cách giữa các lát cắt mang phân tích…)
• Tính số liệu gần đúng ngẫu nhiên tuỳ theo
cách sắp xếp trong không gian của những kết cấu
cơ bản, sự phụ thuộc của các kết cấu cơ bản này
với kết cấu cơ bản khác Như vậy, kết cấu đầy đủ
của một đối tượng sẽ được xác định như một thực
thể trọn vẹn
3 Để có tính chính xác khi tái hiện và so sánh kết quả trong cùng một labo và giữa các labo khác nhau, phải:
• Tính số liệu gần đúng của kết cấu đối tượng trên
cơ sở xác định rõ từng kết cấu cơ bản của đối tượng
Mỗi kết cấu cơ bản được coi là một vùng trọn vẹn
• Qui định kiểm tra định kỳ chất lượng các phương tiện, kỹ thuật…
Phân tích các dữ liệu
Các phương pháp tập hợp các số liệu và thống
kê phân loại nhằm cung cấp các thông tin phục vụ
cho việc mô tả và tái hiện một cách khái quát các
tham số đã xác định trên một lượng lớn hình ảnh
đã phân tích
Thống kê phân loại là phương pháp đặt các trị
số đã đo đếm trên các quần thể tế bào giống nhau
và khác nhau trên cơ sở một số ít đặc điểm theo
một hướng khảo sát như: phân tích các hàm số
phân bố, các số đo phối hợp (trung tuyến, trung
bình, phương thức (mode), kiểu lệch, lệch đối
xứng, tham số độ thoải…); các test so sánh các giá
trị trung bình, các tỉ lệ, các phương sai và mối
quan hệ… Mỗi phương pháp phân tích là một công
cụ đặc biệt để cho phép giải một loạt những vấn đề
đặt ra, như: (1) phán đoán những quần thể không
đồng nhất trên cơ sở phân tích so sánh, (2) so sánh
các quần thể bằng phân biệt các thừa số; (3) Xếp
loại các cấu thành của một quần thể bằng phân tích
biệt số; (4) Phân tích các quần thể bằng phương
pháp tạo cụm và phân tích đa thừa số
B Vấn đề tiêu chuẩn hoá mẫu và
chuẩn hoá phương tiện định lượng
phân tích hình ảnh
Những phương pháp định lượng hiển vi đòi hỏi tính
chính xác và tính đặc hiệu của các tham số thu được,
đối với từng lĩnh vực áp dụng Vì vâỵ, dù áp dụng
phương pháp nào, cũng phải lưu ý những yêu cầu sau:
• Đưa vào phần mềm định lượng những qui trình thao tác của các test, sự định cỡ của dụng cụ phương tiện,
• Thiết lập phương pháp định lượng thích hợp nhất chính xác nhất và có độ nhậy nhất…
• Thiết lập những mối liên hệ giữa các tham số
có ý nghĩa, xây dựng các chuẩn để chẩn đoán phân biệt và so sánh với kết quả của các tác giả khác
TàI liệu tham khảo
1 Weibel, E R And H Elias (1967)
Quantitative methode in morphology Springer, Berlin, Heidelberg New York
2 Weibel, E R (1969) Stereological
principles for morphometry in Electronmicroscopy cytology Int Rev Cytol 26, 235 - 302
3 John J Bozzola and Lonnie D Russell (1990) Quantitative Electron Microscopy
Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists Jones and Bartlett Publishers
Boston - London
Metezeau, P and M H Ratinaud (1994)
Cytometrie par fluorescence Apports comperatifs des techniques: flux, image et confocale Paris Inserm