Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên trong tế bào pptx

Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên trong tế bào Nguyễn Kim Giao Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương Sự kết hợp các kỹ thuật miễn dịch với kỹ thuật hiển vi điện tử đã được

Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên

trong tế bào

Nguyễn Kim Giao

Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương

Sự kết hợp các kỹ thuật miễn dịch với kỹ thuật hiển vi điện tử đã được sử dụng từ lâu trong sinh học tế bào (TB) Hiện nay phương pháp miễn dịch hiển vi điện tử (MDHVĐT)

được áp dụng rộng rãi đặc biệt là nghiên cứu chẩn đoán vi sinh vật

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật đánh dấu miễn dịch bằng vàng gián tiếp sau khi đúc với tế bào Vero nuôi cấy nhiễm vi rút sởi và tế bào TVP nuôi cấy nhiễm vi rút rota SA11 Theo dõi các hạt đen trên ảnh, chúng tôi đã định vị được các vi rút rota trong tế bào TVP và nhận biết được quá trình hình thành của vi rút sởi trong TB Vero

I Đặt vấn đề

Miễn dịch hiển vi điện tử là phương

pháp kết hợp kỹ thuật miễn dịch với kỹ

thuật hiển vi điện tử để định vị các thành

phần miễn dịch đặc hiệu, các đại phân tử

sinh vật

Phương pháp định vị hiển vi điện tử các

thành phần miễn dịch trong tế bào có thể

tiến hành theo nhiều phương pháp khác

nhau Trước tiên tế bào cần cắt mỏng tại

nhiệt độ thấp (không đúc) hoặc tại nhiệt độ

phòng (có đúc) Việc đánh dấu miễn dịch

có thể thực hiện trực tiếp hoặc gián tiếp

trước khi đúc, sau khi đúc hoặc trên lát cắt

lạnh [1, 3]

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài nhằm:

1 Lựa chọn và xác định được những

điều kiện, những thông số tốt nhất làm tiêu bản miễn dịch hiển vi điện tử phát hiện kháng nguyên mặt ngoài tế bào phù hợp với điều kiện Việt Nam

2 Nghiên cứu xác định sự tồn tại của

vi rút rota trên tế bào TVP và sự nhân lên của vi rút sởi trên tế bào Vero trong quá trình nuôi cấy

II Vật liệu, mẫu, thiết bị và qui trình kỹ thuật nghiên cứu

1 Nguyên lý chung

chất đúc WF lát cắt

chất cố định (4,5% PFA

cắt lát mỏng

cố định Khử nước đúc

tím

Quan sát HVĐTTQ

parafilm rửa

đánh dấu miễn dịch Nhuộm dương bản

Hình 1: Qui trình làm tiêu bản định vị kháng nguyên trong tế bào sau đúc mẫu

Những tế bào hoặc mô được cố định và đúc trong

những khuôn đúc bằng những chất đặc biệt để giữ cấu

trúc và bảo toàn chức năng miễn dịch

Những mẫu đúc được cắt thành những lát cực mỏng

và đặt lên trên các lưới nicken Tiếp đó những lát cắt

đư-ợc bộc lộ tới cả kháng thể thứ nhất, kháng thể thứ hai rồi

được rửa và nhuộm trước khi kiểm tra ở kính hiển vi điện

tử truyền qua tại độ phóng đại cao

Kỹ thuật cắt cực mỏng không những cho phép định vị

những kháng nguyên ở phía trong mẫu mà còn tiếp cận

được tới những protein, những kháng nguyên và những

đại phân tử khác trên bề mặt của lát cắt vì chúng sẽ bị

bộc lộ trong quá trình cắt

Hình 1 là sơ đồ chung làm tiêu bản để định vị kháng

nguyên trong tế bào sau đúc mẫu

Hình 2 là sơ đồ đánh dấu miễn dịch hiển vi điện tử

trên lát cắt mỏng Điều cần chú ý ở đây là kháng kháng

thể hoặc kháng thể thứ hai được thay bằng ProteinA-Au

Hình 2: Sơ đồ định vị kháng nguyên trên lát

cắt bằng đánh dấu miễn dịch gắn vàng gián tiếp

2 Vật liệu

- Hoá chất: paraformaldehyde,

glutaraldehyde, OsO4, đệm PBS, BSA,

ethanol, uranyl acetate, lead citrate

- Lưới nicken, giấy ảnh đen trắng

Sterlin phim FUJI-FG

3 Mẫu nghiên cứu

- Tế bào nuôi cấy TVP nhiễm vi rút

Rota dòng SA11 và kháng thể đặc hiệu

(nhận từ POLYOVAC)

- Tế bào vero nuôi cấy nhiễm vi rút sởi

chủng vác xin Moraten và kháng thể đặc

hiệu (nhận từ Khoa vi rút Viện VSDTTW)

4 Thiết bị nghiên cứu

4.1 Máy cắt tiêu bản siêu mỏng:

Ultramicrotome III (LKB, Thuỵ Điển)

4.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua:

JEM 1010 (JEOL, Japan) với các thông

số:

+ Điện áp gia tốc điện tử 30-100KV, + Độ phóng đại x 50-600.000, + Độ phân giải 3A0

Các ảnh chụp trên phim FUJI-FG, in trên giấy ảnh Sterlin hoặc lưu trên đĩa cứng của hệ Digital camera-Computer kèm với JEM1010

5 Qui trình kỹ thuật

Qui trình kỹ thuật gồm hai bước như

sau

5.1 Cố định, đúc và cắt mẫu

a Cố định: 3% paraformaldehyde+0,2%

glutaraldehyde trong đệm phosphate

pH 7,2-74 tại 40C trong 40 phút đến 1

giờ

b Rửa: 0,1M đệm phosphate 2 lần 10

phút

c Rửa: trong dung dịch NH4Cl 0,05M

hoặc 0,1M đệm phosphate (pH 7,2-74)

d Khử nước:

+ 30% ethanol (10 phút)

+ 50% ethanol (10 phút)

+ 70% ethanol (2 lần, 20 phút,)

+ 90% ethanol (2 lần, 20 phút,)

+ 100% ethanol (2 lần, 30phút)

e Tẩm:

+ 2/3 ethanol+1/3 LRWhite, 30 phút

+ 1/2 ethanol+1/2 LRWhite, 30 phút

+ 1/3 ethanol+2/3 LRWhite, 30 phút

f Ngâm:

+ LR White, 1 giờ

+ LR White, 18 giờ

+ LR White qua đêm

+ LRWhite, 1-3 giờ

g Đúc: trong khuôn đúc như capsule

gelatin

h Làm cứng: để tủ ấm 40-450C, từ 1-3

ngày

i Cắt tiêu bản trên máy cắt siêu mỏng

với độ dầy 400-500A0

k Đặt mảnh cắt trên lới nicken có

màng formvar phủ các bon

5.2 Thực hiện đánh dấu miễn dịch và nhuộm dương bản

a Rửa lưới nickel với lát cắt bằng 2-3 giọt PBS pH-7.2

b Đặt nổi lưới trên giọt 1% hydrogen peroxide (v/v) trong 5 phút Quá trình ăn mòn này làm bộc lộ nhiều hơn các kháng nguyên của lát cắt Rửa kỹ lưới trong nước cất

c Đặt nổi lưới trên giọt 2% PBS-BSA trong 20 phút để phóng bế các vị trí kháng nguyên không đặc hiệu

d Lưới được đặt nổi trên giọt kháng thể

đặc hiệu thứ nhất pha loãng trong 0,5%

PBS-BSA và ủ trong 20 phút

e Rửa thận trọng bằng 0,2% PBS - BSA,

f Các lưới lại được ủ tiếp trong proteinA gắn hạt vàng (d=5-10nm) trong 20 phút

h Rửa trong PBS một số lần

i Cố định nhanh bằng hơi OsO4

k Rửa kỹ với ammonium acetate 0,1%

l Nhuộm dương 2 lần theo phương pháp Reynold (uranyl acetate 5%, lead citrtate 1%) Các lưới được làm khô từ từ trước khi quan sát

Chú ý: Trong suốt quá trình tiến hành,

các lưới không được để khô và thận trọng giữ cho nó nổi trên mặt giọt

Iii Kết quả

100 nm

Hình 3 Một phần của tế bào TVP với vi rút rota đ−ợc nhân lên

0,5 à

Hình 4 Quá trình hình thành của vi rút sởi trong tế bào Vero

1 Tế bào nuôi cấy TVP nhiễm vi rút

rota dòng SA11

Trong một nghiên cứu về sự nhân lên

của các chủng vi rút rota trên các dòng tế

bào nuôi cấy, chúng tôi nhận đ−ợc mẫu tế

bào nuôi cấy TVP nhiễm vi rút rota dòng SA11 Thực hiện việc định vị kháng nguyên vi rút rota theo qui trình trên và nhận đ−ợc hình 3 Những hạt vàng tròn

đen đậm có tại những cấu trúc trên ảnh (x) xác nhận rằng những cấu trúc đó là

những vi rút rota được nhân lên trong tế

bào nuôi cấy TVP

2 Xác định quá trình hình thành của

vi rút sởi trong tế bào Vero

Hình 4 là lát cắt mỏng của tế bào Vero

đã bị huỷ hoại do nhiễm và nhân lên của vi

rút rota Bằng kỹ thuật đánh dấu miễn dịch

hiển vi điện tử trên lát cắt mỏng, ta có thể

theo dõi được vi rút trong quá trình hình

thành Các hạt chấm đen là hạt vàng chỉ

các kháng nguyên vi rút sởi nằm rải rác

trong bào tương Tại một số vùng bào

tương sát màng tế bào hình thành

nucleocapcid và chuẩn bị đâm chồi (→)

Các hạt vi rút sởi tách rời khỏi màng và tập

trung ở bên ngoài tế bào (x)

IV Bàn luận

Như đã trình bầy trong phần mở đầu,

miễn dịch hiển vi điện tử là kết hợp đồng

thời hai phương pháp nghiên cứu, phương

pháp hiển vi điện tử và phương pháp miễn

dịch

Đứng về mặt sinh học và sinh hoá học,

có ba yêu cầu cần thực hiện để định vị

chính xác bất cứ đại phân tử miễn dịch nào

trong mô, tế bào hoặc ngay trên các vi rút

Đó là có được các kháng thể đặc hiệu và

các chất đánh dấu, các kháng nguyên có

mặt trong mẫu với một số lượng đáng kể

và siêu cấu trúc vi sinh vật, tế bào được

giữ tốt [2, 3]

Về mặt bảo toàn siêu cấu trúc: mẫu

sinh vật sẽ giữ được siêu cấu trúc với điều

kiện là lấy mẫu và cố định mẫu tức thời và

xử lý tiếp mẫu theo phương pháp thường

qui Có một số chất cố định được sử dụng

Tuy nhiên những chất cố định này (như

OsO4) có thể làm giảm tính kháng nguyên

của các phân tử quan tâm nên trong

nghiên cứu MDHVĐT người ta thường hạn

chế sử dụng Nhưng điều bất lợi là không

chỉ các tế bào không cố định tốt mà ảnh

điện tử sẽ không có độ tương phản cao vì OsO4 là chất tán xạ điện tử mạnh [4]

Về các kháng nguyên có mặt trong mẫu: các kháng nguyên có thể còn rất ít

sau cố địmh với glutaraldehyde, do đó các mô hoặc tế bào thường cố định bằng formaldehyde (paraformaldehyde) hoặc bằng hỗn hợp của formaldehyde với glutaraldehyde (tỷ lệ formaldehyde là từ

2-8 % và glutaraldehyde là 0.1-0.5%) Một

điều quan trọng là các kháng nguyên nội bào cần dễ dàng tiếp cận được với các kháng thể bằng cách tăng tính thẩm thấu qua các màng hoặc bằng cách cắt mẫu thành các lát cắt siêu mỏng

Các tế bào có thể được làm tăng tính thấm bằng các dung môi hữu cơ như aceton, chlorofom, chất tẩy như saponin hoặc Twen80

Vế kỹ thuật đánh dấu: Trong nghiên

cứu này chúng tôi đã sử dụng cách đánh dấu miễn dịch gián tiếp để khắc phục những khó khăn kỹ thuật (kháng thể thứ nhất rất khó thu được nhiều, sự cộng hợp của kháng thể thứ nhất với đích điện tử lại rất khó, hiệu suất kém và có thể làm ảnh hưởng xấu tới sự kết hợp của kháng thể thứ nhất với kháng nguyên) Việc dễ dàng

có được kháng thể thứ hai mà ở đây chúng tôi sử dụng ProteinA-Au (đã gắn đích điện

tử Au với đường kính lựa chọn và có bán trên thị trường) đảm bảo cho nghiên cứu ít

bị rủi ro [3]

Xuất phát từ yêu cầu bảo toàn siêu cấu trúc sinh vật và giữ được tính kháng nguyên của mẫu đồng thời lại có thể thực hiện trong phòng thí nghiệm HVĐT của Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, chúng tôi

đã chọn cách cố định mẫu bằng dung dịch

cố định 3-4% paraformaldehyde +0,2% glutaraldehyde trong dung dịch đệm PBS, thời gian 30-40 phút tại 40

C, đúc mẫu bằng

LR White tại 37-400

C và đánh dấu miễn

dịch gián tiếp trên lát cắt mỏng với kháng

thể thứ hai thay bằng proteinA-Au là thích

hợp

Những hình ảnh HVĐTTQ của các mẫu

chụp đ−ợc xác thực việc lựa chọn của

chúng tôi là đúng đắn

V Kết luận

- Thông qua nghiên cứu áp dụng,

chúng tôi đã chọn đ−ợc cách cố định mẫu

bằng dung dịch cố định 3-4%

paraformaldehyde +0,2% glutaraldehyde

trong dung dịch đệm PBS, thời gian 30-40

phút tại 40

C, đúc mẫu bằng LR White tại

37-400

C và đánh dấu miễn dịch gián tiếp

trên lát cắt mỏng với kháng thể thứ hai

đ−ợc thay bằng proteinA-Au

- Bằng kỹ thuật định vị miễn dịch hiển

vi điện tử kháng nguyên trong tế bào, đã

xác định đ−ợc chắc chắn vi rút rota có

trong tế bào nuôi cấy TVP thông qua sự

chỉ điểm của các hạt vàng

- Thấy rõ quá trình nhân lên của vi rút

sởi trên tế bào Ve ro, từ giai đoạn tổng hợp

các thành phần acide nucleic và protein

của vi rút trong tế bào đến giai đoạn những

virion hoàn chỉnh nh− mọc chồi để tách

khỏi tế bào ở đó vỏ ngoài của vi rút sởi

đ−ợc tạo ra bởi màng tế bào

Tài liệu tham khảo

1 Bozzola, J J., and L D Russell (1992) Electron Microscopy Jones and Bartlett, Boston, MA 132 pp

2 Dawes, C J (1971) Biological Techniques in Electron Microscopy Barnes and Noble Inc., New York 240 pp

3 Hayat, M A (1989) Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications CRC Press, Boca Raton, FL 469 pp

4 Miller SE Detection and identification of viruses by electron microscopy J Electron Microsc Tech, 1986; 4:265-301

5 Payne CM Electron microscopy in the diagnosis of infectious diseases In: Connor DH, Chandler FW, Payne CM Electron microscopy in the diagnosis of infectious diseases In: Connor DH, Chandler FW

Summary Immunoelectronmicroscopic localization of

Antigen in cells The Combination between Immunological techniques and Electron microscopy had been used in cellular biology for a long time At present, Immunoelectronmicroscopic methods (IEM) are applied more, specially in the microbial diagnosis

In this study, We had used indirect immunogoldlabelling technique after embedding on Vero cells infected by measles viruses and TVP cells infected by rotavirus SA11 According to black particles in Immuno-electron microscopic figures, We localized rotaviruses in the TVP cells and realized the formaton of measles virus in the Vero cells