hiệu quả của môi trường GEYC trong bảo quản lạnh sâu tinh trùng người Trịnh Bình, Trịnh Sinh Tiên Nguyễn Ngọc Hùng và Nguyễn Thị Bình Đại học Y Hà Nội Sử dụng môi trường GEYC được tự
Trang 1hiệu quả của môi trường GEYC trong bảo quản
lạnh sâu tinh trùng người
Trịnh Bình, Trịnh Sinh Tiên Nguyễn Ngọc Hùng và Nguyễn Thị Bình
Đại học Y Hà Nội
Sử dụng môi trường GEYC được tự pha tại phòng thí nghiệm bảo quản 30 mẫu tinh trùng người bằng lạnh sâu cho kết quả chất lượng tinh trùng sau bảo quản đảm bảo theo tiêu chuẩn của AATB Môi trường GEYC có thể chủ động tự pha tại phòng thí nghiệm có giá thành phù hợp với điều kiện Việt Nam
(Từ viết tắt: GEYC: Glycerol-Egg Yolk-Citrat; CSF: Cryosurvival factor; TT: tinh trùng)
I đặt vấn đề
Theo thời gian, nhiều môi trường đã được sử
dụng để bảo quản lạnh tinh trùng người Những
công bố về hiệu quả của các môi trường trong
bảo quản lạnh tinh trùng rất khác nhau
Theo các tác giả Silva A.L, Yamasaki R, de
Sala M.M, Cabrera M da G, de Sa M.F (1996)
[6], qua nghiên cứu “Đánh giá hiệu quả khi
thêm sodium citrate và fructose hoặc sodium
citrate vào môi trường có egg yolk, glycerol và
TEST trong bảo quản lạnh tinh trùng người” đã
có nhận xét: tỷ lệ tinh trùng di động và tỷ lệ tinh
trùng sống đều giảm ở cả 2 khoảng thời gian
bảo quản so với trước khi bảo quản Các chỉ số
này không có sự khác biệt khi so sánh 3 loại
môi trường và ở 2 khoảng thời gian bảo quản
Sau tan đông 2 giờ, các chỉ số đều giảm so với
phân tích ngay sau khi tan đông
Năm 1999, J.K Sherman [5] kết luận: tỷ lệ
tinh trùng sống sau bảo quản nếu sử dụng môi
trường bảo quản là glycerol-egg yolk hay
glycerol đơn thuần đều không có sự khác nhau
Năm 2000, các tác giả Hallak J, Sharma
R.K, Wellstead C, Agarwal A [3] đã nghiên cứu
so sánh khi sử dụng môi trường bảo quản là
TEST-Yolk và glycerol ở các khoảng thời gian
bảo quản 0; 60; 120; 180 phút Kết quả cho
thấy: tỷ lệ tinh trùng di động giảm ở cả hai
nhóm, nhưng tỷ lệ tinh trùng di động nhóm
TEST-Yolk cao hơn ở các khoảng thời gian bảo
quản so với nhóm glycerol Về mặt hình thái, tỷ
lệ tinh trùng bình thường ở nhóm TEST – Yolk cũng cao hơn (p < 0,05) Kết quả đã khẳng định
sử dụng TEST – Yolk là môi trường bảo quản lạnh tinh dịch sẽ đem lại mẫu tinh dịch sau bảo quản lạnh có chất lượng tốt hơn so với việc sử dụng glycerol Do đó, các tác giả đã có khuyến cáo TEST – Yolk là môi trường được lựa chọn
đầu tiên để bảo quản lạnh tinh trùng người
ở Việt Nam, bảo quản lạnh tinh trùng người
để phục vụ cho việc chăm sóc sức khoẻ sinh sản là vấn đề rất cần thiết và mới mẻ Trong số các môi trường được các nhà chuyên môn trên thế giới cũng như trong nước đã sử dụng để bảo quản lạnh tinh trùng, môi trường nào phù hợp với điều kiện, hoàn cảnh Việt Nam? Như vậy, môi trường bảo quản có ý nghĩa quan trọng đến chất lượng bảo quản tinh trùng Để
có thể vừa chủ động được môi trường, vừa đảm bảo được chất lượng bảo quản tinh trùng cũng như với giá thành hợp lý chúng tôi mạnh dạn nghiên cứu “Hiệu quả của môi trường GEYC trong bảo quản lạnh sâu tinh trùng người” với mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của môi trường GEYC trong bảo quản tinh trùng người bằng
lạnh sâu
II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
1 Đối tượng nghiên cứu
- 30 mẫu tinh dịch có tinh dịch đồ bình
- Công trình được thực hiện tại Lao bảo quản Mô - Phôi của trường Đại học Y Hà Nội
Trang 2thường được xét nghiệm và bảo quản lạnh sâu
tại phòng bảo quản Mô - Phôi, Trường Đại học
Y Hà Nội
- Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu:
+ Nam giới trong độ tuổi sinh sản
+ Đã không xuất tinh từ 3 đến 5 ngày
+ Không sốt, không dùng thuốc, không
uống rượu tại thời điểm lấy mẫu
2 Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp nghiên cứu can
thiệp Đánh giá trước và sau can thiệp tại các
thời điểm khác nhau
2.1 Xét nghiệm tinh dịch
a Khảo sát đại thể
b Khảo sát vi thể: Đánh giá mật độ và
độ di động tinh trùng bằng kính hiển vi quang
học và buồng đếm Makler Tiến hành sau khi
mẫu tinh dịch đã ly giải hoàn toàn
- Đánh giá tỷ lệ tinh trùng di động
+ Tinh trùng di động tiến tới nhanh
+ Tinh trùng di động chậm và tại chỗ
+ Tinh trùng không di động
Đếm tổng cộng 200 tinh trùng trên vi trường
bằng máy bách phân bạch cầu Sau đó tính tỷ
lệ phần trăm mỗi loại
- Đánh giá mật độ tinh trùng
Không cần pha loãng tinh dịch, bất động
tinh trùng bằng nhiệt trước khi đếm
- Đánh giá hình thái
+ Kỹ thuật nhuộm Giemsa
+ Kỹ thuật nhuộm phiến đồ theo phương
pháp Papanicolaou
- Đánh giá tỷ lệ tinh trùng sống: phương
pháp nhuộm eosin
c Đánh giá mẫu tinh dịch bình thường:
Theo tiêu chuẩn chọn mẫu tinh dịch có tinh
dịch đồ bình thường theo WHO 1999 [8]
2.2 Chuẩn bị môi trường bảo quản lạnh
Glycerol - egg yolk - citrat (GEYC) [1]:
* Pha theo công thức của Ackerman
- Thành phần:
Thành phần để pha 200 ml môi trường
1 Penicillin 1triệu UI 01 lọ
2 Streptomycin 1 gam 01 lọ
3 Egg yolks Bột khô 40 gam
7 Natri citrat PA 2,3 gam
8 Nước cất 2 lần,
khử ion kim loại
130 ml
- Kỹ thuật pha:
1 Lấy 30 ml nước cất hoà tan hết tinh thể (5; 6;7) được dung dịch A
2 Lọc vô khuẩn dung dịch A Lỗ màng lọc < 0.22 àm
3 Cho Glycerol và Egg yolks vào dung dịch
đã lọc, lắc đều bằng máy
4 Cho đủ nước cất để được 200ml
5 ủ ở tủ sấy 56oC trong 30 phút
6 Chuẩn độ pH #7,2 bằng NaHCO3 hoặc HCl 1N là đạt được dung dịch cần pha
* Kỹ thuật bảo quản tinh trùng
- Cho môi trường bảo quản lạnh vào tinh dịch:
- Đóng gói
- Hạ nhiệt độ: Sử dụng máy hạ nhiệt độ từ
từ -Nicool 10
- Lưu trữ
- Tan đông: Tan đông các mẫu tinh dịch
được bảo quản lạnh sâu để kiểm tra ở các thời
điểm sau bảo quản 1 ngày, 2 ngày, 30 ngày và
90 ngày
2.3 Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý theo phần mềm Epi-Info Version 6.0 của WHO Kiểm định sự khác biệt bằng test t và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05
3 Chỉ tiêu đánh giá
- Tỷ lệ tinh trùng di động nhanh
- Tỷ lệ tinh trùng di động (nhanh & chậm)
- Tỷ lệ tinh trùng sống
Trang 31.2 Tỷ lệ % tinh trùng di động (nhanh & chậm) trước và sau bảo quản:
- Chỉ số CSF di động nhanh = % tinh trùng
di động nhanh sau bảo quản: % tinh trùng di
động nhanh trước bảo quản ì 100 Bảng 2: Tỷ lệ % tinh trùng di động
- Chỉ số CSF di động (nhanh & chậm) = %
tinh trùng di động (nhanh & chậm) sau bảo
quản: % tinh trùng di động (nhanh & chậm)
trước bảo quản ì 100
Trước bảo quản (A) 70,0 ± 10,0 So
A với B
1 ngày 48,5 ± 12,1
2 ngày 43,1 ± 11,3
30 ngày 43,1 ± 8,4
Sau bảo quản (B) GEYC
90 ngày 45,0 ± 10,2
P < 0,001
- Chỉ số tinh trùng sống = % tinh trùng sống
sau bảo quản: % tinh trùng sống trước bảo
quản ì 100
III kết quả
Từ tháng 5/2002 đến tháng 8/2002, 30 mẫu
tinh dịch đã được lấy tại phòng xét nghiệm bảo
quản Mô - Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội
Những mẫu tinh dịch này đều được kết luận là
bình thường theo tiêu chuẩn của WHO (1999)
và được bảo quản bằng lạnh sâu (-196°C) môi
trường GEYC Đánh giá tại các khoảng thời
gian bảo quản 1 ngày, 2 ngày, 30 ngày, 90
ngày Các chỉ tiêu đánh giá trước và sau bảo
quản là tỷ lệ di động và sống của tinh trùng
Kết quả trên cho thấy:
- Nhìn chung, tỷ lệ tinh trùng di động (nhanh & chậm) sau bảo quản ở tất cả các thời
điểm đánh giá đều giảm
- Tỷ lệ di động (nhanh & chậm) của tinh trùng sau bảo quản: giá trị trung bình thấp nhất
ở khoảng thời gian bảo quản 30 ngày (43,1%), cao nhất ở khoảng thời gian bảo quản 1 ngày (48,5%) và đều thấp hơn tỷ lệ tinh trùng di
động (nhanh & chậm) trước bảo quản (43,1%
so với 70,0%; 48,5% so với 70,0%) Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,001)
1 ảnh hưởng của bảo quản bằng lạnh sâu
1.1 Tỷ lệ % tinh trùng di động nhanh trước
và sau bảo quản: 1.3 Tỷ lệ % tinh trùng sống trước và sau
bảo quản:
Bảng 1: Tỷ lệ % tinh trùng di động nhanh
(X ± SD) Bảng 3: Tỷ lệ % tinh trùng sống: X ± SD
Trước bảo quản (A) 41,9 ± 20 So
A với B
1 ngày 21,4 ± 8,6
2 ngày 19,8 ± 8,6
30 ngày 20,2 ± 6,6
Sau bảo
quản (B)
GEYC
90 ngày 21,6 ± 8,2
P < 0,001
Trước bảo quản (A) 81,0 ± 6,9 So
A với B
1 ngày 61,2 ± 12,9
2 ngày 58,1 ± 11,7
30 ngày 61,0 ± 11,3
Sau bảo quản (B) GEYC
90 ngày 59,7 ± 11,1
P < 0,001
- Nhìn chung, tỷ lệ tinh trùng di động nhanh
sau bảo quản ở các thời điểm đều giảm cả các thời điểm đánh giá đều giảm - Tỷ lệ tinh trùng sống sau bảo quản ở tất
- Tỷ lệ di động nhanh của tinh trùng sau
bảo quản: giá trị trung bình thấp nhất ở khoảng
thời gian bảo quản 2 ngày (19,8%), cao nhất ở
khoảng thời gian bảo quản 90 ngày (21,6%) và
đều thấp hơn tỷ lệ tinh trùng di động nhanh
trước bảo quản (41,9%) Sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê (p < 0,001)
- Tỷ lệ sống của tinh trùng sau bảo quản: giá trị trung bình thấp nhất ở khoảng thời gian bảo quản 2 ngày (58,1%), cao nhất ở khoảng thời gian bảo quản 1 ngày (61,2%) và đều thấp
hơn tỷ lệ tinh trùng sống trước bảo quản
(58,1% so với 81,0%; 61,2% so với 81,0%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001)
Trang 42 Đánh giá tác dụng của môi trường GEYC qua các khoảng thời gian bảo
quản khác nhau
Bảng 4 Chỉ số chất lượng tinh trùng ở các khoảng thời gian bảo quản khi sử dụng
môi trường GEYC (X ± SD)
Thời gian BQ
Chỉ số (%)
1 ngày (I) 2 ngày (II) 30 ngày (III) 90 ngày (IV) P I,II,III,IV
CSF (DĐ nhanh) 56,7 ± 0,2 52,3 ± 18,3 55,7 ± 23,0 56,7 ± 18,8 p > 0,05 CSF (DĐ nhanh &
chậm) 69,0 ± 5,2 62,3 ± 16,5 62,3 ± 12,2 64,0 ± 13,5 p > 0,05
Chỉ số TT sống 76,0 ± 3,5 72,0 ± 13,0 75,3 ± 13,8 73,7 ± 13,8 p > 0,05
Qua kết quả trên cho thấy:
- Chỉ số CSF di động nhanh có giá trị trung
bình thấp nhất ở khoảng thời gian bảo quản 2
ngày (52,3%) và cao nhất ở khoảng thời gian
bảo quản 1 ngày (56,7%) Tuy nhiên, khi so
sánh từng cặp, sự khác biệt này không có ý
nghĩa thống kê (PI,II,III,IV > 0,05) Như vậy không
có sự liên quan chỉ số CSF cao hay thấp với
khoảng thời gian lưu trữ dài hay ngắn trong môi
trường GEYC ở các khoảng thời gian bảo quản
chỉ số này đều đạt yêu cầu do AATB quy định
- Chỉ số CSF di động (nhanh & chậm) có
giá trị trung bình thấp nhất ở khoảng thời gian
bảo quản 2 ngày (62,3%) và cao nhất ở
khoảng thời gian bảo quản 1 ngày (69,0%) Khi
so sánh từng cặp, sự khác biệt không có ý
nghĩa thống kê (PI,II,III,IV > 0,05) Như vậy không
có sự liên quan chỉ số CSF cao hay thấp với
khoảng thời gian lưu trữ dài hay ngắn khi dùng
môi trường GEYC ở các khoảng thời gian bảo
quản, chỉ số này đều đạt yêu cầu do AATB quy
định
- Chỉ số tinh trùng sống có giá trị thấp nhất
ở khoảng thời gian bảo quản 2 ngày (72,0%)
và cao nhất ở khoảng thời gian bảo quản 1
ngày (76,0%) Khi so sánh từng cặp, sự khác
biệt không có ý nghĩa thống kê (PI,II,III,IV > 0,05)
IV bàn luận
* Môi trường glycerol đơn thuần và các môi
trường phối hợp nhiều thành phần:
Môi trường bảo quản tinh trùng được các nhà nghiên cứu quan tâm bởi vai trò của nó để nâng cao chất lượng tinh trùng sau bảo quản Theo thời gian đã có nhiều môi trường được sử dụng, công bố về hiệu quả của các môi trường trong bảo quản tinh trùng cũng rất khác nhau Năm 1949, Polge [5] đã sử dụng glycerol là môi trường bảo quản lạnh tinh trùng đã đem lại kết quả khả quan, cho đến nay Ngân hàng tinh trường Đại học tổng hợp Arkansas vẫn sử dụng glycerol đơn thuần Các nghiên cứu 10 năm gần đây được công bố, đã đề cập nhiều đến các môi trường phối hợp bởi nhiều thành phần như: egg yolk, glycerol, glucose, fructose, glycine, citrate [Na citrate, K citrate], TES [N-tris (hydroxymethyl) aminomethane sulfonic acid], tris [(hydroxymethyl) aminomethane],…
Đã chứng tỏ rằng môi trường phối hợp đó đã
đem lại chất lượng tinh trùng sau bảo quản tốt hơn so với glycerol đơn thuần Hallak [3] đã khẳng định sử dụng môi trường TEST (TES & tris) – Yolk tốt hơn glycerol Foote R.H [2] kết luận môi trường egg yolk-citrate-glucose-glycerol và egg yolk-tris-glucose-yolk-citrate-glucose-glycerol tốt hơn rất nhiều so với glycerol đơn thuần Trong nghiên cứu này sử dụng môi trường GEYC, kết quả cho thấy:
Chỉ số CSF di động nhanh và CSF di động (nhanh và chậm) cũng như tỷ lệ % tinh trùng di
động nhanh và chậm ở các khoảng thời gian sau bảo quản đều có giảm so với trước bảo quản với p < 0,001 (bảng 1; 2 và 3) Tuy nhiên mức độ giảm có khác nhau
Trang 5Kết quả trên cho thấy sử dụng môi trường
GEYC bảo quản tinh trùng người phù hợp với
nhận xét của các tác giả trong và ngoài nước
* Môi trường có egg yolk và các môi trường
phối hợp không có egg yolk:
Môi trường nhiều thành phần có egg yolk đã
được khẳng định trong bảo quản tinh trùng
Năm 1999, theo J.K Sherman [5] có rất nhiều
trung tâm bảo quản tinh trùng trên thế giới sử
dụng môi trường có chứa egg yolk như: Ngân
hàng gen và tinh trùng, trường Đại học Tổng
hợp Nebraska và Ngân hàng gen lạnh quốc tế
sử dụng TESNaK-EYG có glucose không có
citrate Ngân hàng lạnh Califonia và Phòng thí
nghiệm gen lạnh Quốc tế sử dụng TEST-EYG
không có glucose, có citrate Hiện nay còn
nhiều quan điểm khác nhau về môi trường egg
yolk và các thành phần khác
Silva A.L [6] đã kết luận môi trường
TEST-Yolk, TEST-Yolk thêm 20% sodium citrate, 2%
fructose và TEST-Yolk thêm 20% sodium
citrate khi sử dụng bảo quản tinh trùng đều tốt
như nhau Còn theo Stanic P [7] và Hammadeh
M.E [4], môi trường TEST-Yolk tốt hơn HSPM
(môi trường Tyrode có glycerol) Các tác giả
khuyến cáo TEST-Yolk là môi trường được lựa
chọn đầu tiên bảo quản tinh trùng
Chỉ số CSF di động (nhanh & chậm) ở
khoảng thời gian sau bảo quản 1 ngày, 2 ngày,
30 ngày và 90 ngày đều đạt khá cao (69,0%;
62,3%; 62,3% và 64%) (Bảng 3.4) Kết quả
này chứng tỏ hiệu quả của môi trường GEYC
cho bảo quản tinh trùng trong lạnh sâu đạt yêu
cầu do AATB quy định
Với những môi trường nhiều thành phần có
egg yolk, có hoặc không có TEST thì chất lượng
cho bảo quản có khác nhau không? Trong 10
năm gần đây không thấy nghiên cứu nào công
bố Theo Foote R.H [2], sử dụng môi trường egg
yolk-citrate-glucose-glycerol và egg
yolk-tris-glucose-glycerol cho kết quả tỷ lệ di động sau tan
đông tương ứng là 35% và 37% Tác giả khuyến
cáo một môi trường có egg yolk và tris nên được
sử dụng trong bảo quản tinh trùng
Với môi trường GEYC chúng tôi áp dụng
pha theo công thức do Ackerman giới thiệu
Chúng tôi tự pha lấy, trong đó không có thành phần TEST, các nguyên liệu khác đều nhập từ nước ngoài, quy trình tương đối phức tạp, đòi hỏi tiêu chuẩn cao về vô trùng và an toàn sinh học, cho nên phải bổ sung thêm kháng sinh Tuy nhiên giá thành so với môi trường khác trên thị trường thì tương đối rẻ Mỗi lần chúng tôi pha 200ml, chia thành các ống nhỏ 2ml bảo quản ở -200C, sử dụng trong 3 tháng Không sử dụng lại sau tan đông Môi trường Sperm freeze nhập ngoại được đóng gói vô trùng Chai 20ml, bảo quản ở 20C-80C, giá thành khá cao
Sau tan đông, quan sát những mẫu tinh trùng được bảo quản trong môi trường GEYC dưới kính hiển vi quang học, chúng tôi nhận thấy có nhiều hạt egg yolk xen lẫn với tinh trùng Những hạt này có thể gây khó khăn khi lọc rửa tinh trùng sau bảo quản Để khắc phục vấn đề này cần được phối hợp nghiên cứu chi tiết hơn
Qua những kết quả thu được, chúng tôi cho rằng với ưu thế về chất lượng, giá cả, chủ
động, tiện lợi và tính khoa học, môi trường GEYC thích hợp cho bảo quản tinh trùng bằng lạnh sâu Tuy nhiên, để đáp ứng được cho thực tiễn các nhà lâm sàng cũng như ứng dụng rộng rãi trong bảo quản tinh trùng cần có những nghiên cứu tiếp theo với quy mô và thời gian lớn hơn để có kết luận thoả đáng hơn
V kết luận Nghiên cứu hiệu quả của môi trường GEYC trong bảo quản lạnh sâu tinh trùng người, chúng tôi có những kết luận sau:
1 Chất lượng tinh trùng sau bảo quản bằng môi trường GEYC đảm bảo theo tiêu chuẩn của AATB
2 Môi trường GEYC có thể tự chủ động pha tại phòng thí nghiệm với giá thành phù hợp với
điều kiện Việt Nam
- Báo cáo là một phần trong luận văn cao học Bạn đọc có thể tìm đọc toàn văn tại thư viện trường ĐHYHN, trung tâm thông tin Y học và thư viện Quốc gia.
tài liệu tham khảo
Trang 65 J.K.Sherman (1990), “ Cryopreservation
of human semen”, CRC Handbook of the Laboratory Diagnosis and Treatment of Infertility, pp: 229-258
1 Tr−¬ng C«ng Hæ, Hå M¹nh T−êng
(2001), “Ph−¬ng ph¸p tr÷ tinh trïng”, Ph−¬ng
ph¸p xÐt nghiÖm tinh dÞch, BÖnh viÖn Phô s¶n
Tõ Dò, Thµnh phè Hå ChÝ Minh
6 Silva A.L., Yamasaki R., de-Sala M.M., Cabrera M-da-G., de-Sa M.F (1996), “The addition of fructose or sodium citrate does not improve recovery rates of cryopreserved human spermatozoa”, Int-J-Fertil-Menopausal-Stud, 41(3), pp: 304-9
2 Foote R.H., Mc Gonagle., Goldstein M.,
Feldschuh J (2002), “The influence of
cryoprotective media and processing
procedures on motility and migration of
frozen-thawed human sperm”, Asian J Androl, 4(2),
pp: 137-41
7 Stanic P., Tandara M., Sonicki Z., Simunic V., Radakovic B., Sukhanek E (2000),
“Comparison of protective media and freezing techniques for cryopreservation of Human semen”, Eur-J-Obstet-Gynecol-Reprod-Biol, 91(1), pp: 65-70
3 Hallak J., Sharma R.K., Wellstead C.,
Agarwal A (2000), “Cryopreservation of human
spermatozoa: comparison of TEST-Yolk buffer
and glycerol”, Int-J-Fertil-Womens-med, 45(1),
pp: 38-42
4 Hammadeh M.E., Greiner S.,
Rosenbaum P., Schmidt W (2001),
“Comparison between human sperm
preservation medium and TEST – Yolk buffer
on protecting chromatin and morphology
integradity of human spermatozoa in fertile and
subfertile men after freeze – thawing
procedure”, J Androl, 22(6), pp: 1012 – 8
8 World health organisation (1999) WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm – Cervical mucus interation, fourth edition, Cambridge University press.34
Summary
The effect of GEYC on deep-cryopreserved
human spermatozoa
Deep-cryopreserved 30 samples of human spermatozoa in GEYC medium, it is
prepared at Lab, shows that quality of cryopreserved spermatozoa conforms to criteria
of AATB GEYC medium would be performed at Laboratory with low cost andBBPP
suitability of Vietnamese condition
