Nghiên cứu sự nhân lên tối ưu của dòng virut Rota VNHR 203-030 trên tế bào thận khỉ tiên phát Macaca Mulatta Lê Thị Luân Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin VNHR 203-30 là chủng
Trang 1Nghiên cứu sự nhân lên tối ưu của dòng virut Rota VNHR 203-030 trên tế bào thận khỉ tiên phát Macaca
Mulatta
Lê Thị Luân
Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin
VNHR 203-30 là chủng virut rota người G4P6,8; được phân lập từ bệnh phẩm phân có nguồn gốc
từ bệnh nhi nam 9 tháng tuổi vào viện Xanh Pôn vì tiêu chảy cấp năm 2000 Chủng này là ứng cử viên để sản xuất văcxin phòng bệnh tiêu chảy cho trẻ em Việt Nam Liều gây nhiễm trên tế bào thận khỉ tiên phát Macaca Mulatta là 0,1 FFU/1 tế bào
i Đặt vấn đề
Việt Nam là nước đang phát triển có dân
số gần 80 triệu người, với tỷ lệ sinh hàng năm
lớn (1,52 triệu trẻ em sơ sinh trong 1 năm) và
tỷ lệ tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi cao (42,5 trẻ/
1000 trẻ /năm hay 9880 trẻ bị chết /năm)
trong số đó có 15,4% là do bị tiêu chảy [5]
Theo kết quả giám sát bệnh tiêu chảy trong 5
năm 1998 đến 2003 tại các bệnh viện lớn của
nước ta thì tiêu chảy do căn nguyên virut rota
chiếm 45% đến 60% trẻ vào viện do tiêu
chảy Nếu tỷ lệ chết do virut rota cũng theo tỷ
lệ đó hoặc một nửa tỷ lệ đó thì tỷ lệ tử vong do
nguyên nhân này là 4% đến 8% trong tổng số
trẻ em dưới 5 tuổi/năm Như vậy trong suốt 5
năm đầu tiên cứ 280-560 trẻ có 1 trẻ chết do
virut rota/năm [5] Đối với trẻ vào viện, tối
thiểu trẻ phải mất một tuần nằm viện, cha mẹ
của trẻ phải nghỉ việc ít nhất một tuần để
chăm sóc chúng do vậy chi phí cho đi lại,
thuốc men là rất tốn kém Theo thống kê của
Mỹ, hàng năm chi phí cho thuốc men điều trị
tiêu chảy do virut rota lên tới 246 triệu đô la
Dân số Mỹ gấp 3 lần dân số nước ta và coi
dịch vụ y tế cao hơn gấp 10 lần thì số chi phí
cho trẻ em Việt Nam bị tiêu chảy cũng phải
mất 9 triệu đô la Mỹ tương đương với 135 tỷ
đồng/năm Do vậy việc nghiên cứu sản xuất
văcxin không những dự phòng được căn bệnh
phổ biến đối với trẻ hiện nay mà còn góp
phần quan trọng trong công tác chăm sóc sức
khoẻ; đồng thời tiết kiệm chi phí cho các gia
đình có trẻ mắc bệnh và cho toàn xã hội
Hiện nay, trên thế giới các nhà khoa học
đã nghiên cứu rất nhiều về virut rota, đặc biệt
là nghiên cứu sản xuất văcxin phòng bệnh này ứng cử viên sáng giá nhất trong sản xuất văcxin là chủng virut rota dựa trên các týp gây bệnh cho trẻ em hoặc động vật Các týp này
được phân lập từ bệnh phẩm phân của trẻ hay
động vật, sau đó được dùng để tạo chủng văcxin trên các dòng tế bào theo những qui trình khác nhau Cho đến đầu năm 2004 một
số ứng cử viên văcxin sống giảm độc lực phòng bệnh tiêu chảy do virut rota đang tiến hành nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng giai
đoạn cuối trước khi được cấp giấy phép sử dụng như văcxin từ chủng G1P8 (Rotarix) của hãng Glaxo Smith Lines; G10P12 của Lan Châu Trung Quốc; G3P6 của Australia;.G1,G2,G3,G4P8 (RotateqT) của Merk,
Cùng với các nước trên thế giới, nước ta thực hiện giám sát bệnh tiêu chảy do virut rota từ năm 1998 và đã xác định được 4 chủng chính gây bệnh đó là: G1; G2; G4; và G9 [5] Chủng G1 và G2 đã được cấy chuyển
và nhân lên trên tế bào [1,3] nhưng chỉ có chủng virus rota G4P6,8 là thích nghi trên tế bào thận khỉ tiên phát Chủng G4P6,8 (VNHR203) phân lập từ trẻ nam 9 tháng tuổi vào viện Xanh Pôn vì tiêu chảy cấp năm
2000 Chủng này được cấy chuyển thích nghi
30 lần trên các dòng tế bào thích hợp, đặc biệt là tế bào thận khỉ tiên phát Macaca Mulatta để tạo chủng cho nghiên cứu sản
Trang 2xuất văcxin phòng bệnh tiêu chảy cho trẻ em
nước ta Để virut này nhân lên trên tế bào
thận khỉ có hiệu giá tối ưu trong nghiên cứu
sản xuất văcxin, điều nhất thiết phải tìm liều
gây nhiễm thích hợp Do vậy mục tiêu duy
nhất của nghiên cứu này là xác định liều gây
nhiễm để tạo hiệu giá cao nhất khi nhân
chúng trên tế bào thận khỉ tiên phát
ii Đối tượng và phương pháp
nghiên cứu
Sử dụng chủng virus rota phân lập và cấy
truyền trên tế bào thận khỉ tiên phát từ một
mẫu phân của 1 trẻ bị tiêu chảy cấp do virus
rota được gọi là VNHR-203-030 Chủng virus
này được chuẩn độ hiệu giá bằng phương
pháp miễn dịch huỳnh quang trên tế bào thận
khỉ bào thai rhesus (MA104) [2,3] và hiệu giá
tính bằng đơn vị huỳnh quang trong 1ml
(FFU/ml)
Nuôi tế bào thận khỉ tiên phát Macaca
Mulatta bằng môi trường LHE (Trung tâm
Khoa học Sản xuất văcxin Sabin sản xuất)
10% huyết thanh bê (Gibco- Mỹ) Tách tế bào
thận khỉ tiên phát một lớp theo tỷ lệ 1:5 và
nuôi chúng bằng môi trường 199 (Trung tâm
Khoa học Sản xuất văcxin Sabin sản xuất)
10% huyết thanh bê (Gibco-Mỹ) Khi tế bào
kín một lớp, đếm số lượng tế bào và sau đó
gây nhiễm tế bào bằng các liều gây nhiễm
khác nhau: (A)3,5 tế bào/ 1FFU; (B)4,5 tế
bào/ 1FFU; (C) 6,3 tế bào/1FFU; (D) 10 tế
bào /1FFU; (E) 30 tế bào/1FFU; (G) 32 tế
bào/1FFU; (H) 50 tế bào/1FFU; (I) 70 tế
bào/1FFU; (K) 90 tế bào/1FFU và (M) 100 tế
bào/1FFU
Hỗn dịch virus thu được từ các liều gây
nhiễm trên được bảo quản ở nhiệt độ -200C
hoặc -800C Chúng được đông tan 3 lần, sau
đó ly tâm 3000 vòng/1phút/10phút Lấy nước
nổi và chuẩn độ hiệu giá virus rota từ các mẫu
thu được bằng phương pháp miễn dịch huỳnh
quang như sau:
Bước 1: Nuôi tế bào MA104 một lớp trên
phiến nhựa 96 giếng, đáy phẳng (sản xuất tại
Đan Mạch-loạt số 047016) Rửa tế bào bằng
2 lần môi trường muối cơ bản Hank và 1 lần bằng môi trường 199 có chất ổn định pH (heppes), giữ phiến tế bào với môi trường 199 tại 370C đến khi gây nhiễm virut
Bước 2: Hoạt hóa virut VNHR-203-030
bằng dung dịch trysin IX (Gibco-Mỹ) tại 37oC
từ 30 đến 60 phút
Pha loãng virus bậc 10 bằng môi trường
199 hoặc DMEM có heppes và không có huyết thanh bê
Bước 3: Hút hết môi trường 199 tại các
giếng tế bào, cho 100àl hỗn dịch virus nồng
độ từ 10-1 đến 10-8 vào phiến, mỗi nồng độ 3 giếng, ủ phiến tại 370C trong 18 giờ
Bước 4: Cố định tế bào bằng dung dịch
formaldehyt 15àl/ giếng ở 40C trong 30 phút, sau đó bỏ hết môi trường và để khô tự nhiên Cho 100àl huyết thanh kháng thỏ đa giá (RRV) với tỷ lệ 1/5000 (pha với PBS 1% skimmilk) như kháng thể thứ nhất, để nhiệt độ phòng thí nghiệm 1 giờ, rửa 3 lần bằng PBS-Tween và cho 100àl kháng thể tinh khiết dê gắn huỳnh quang kháng IgG thỏ (ICN-Mỹ) có xanh Evanblu như một kháng thể thứ 2, để phòng thí nghiệm 2 giờ, sau đó rửa và để khô
tự nhiên
Bước 5: Đọc kết quả trên kính hiển vi
huỳnh quang vật kính 10
Tế bào bình thường là tế bào MA104 bắt màu da cam đậm
Tế bào nhiễm virus là tế bào bắt màu xanh phát quang
Hiệu giá virus là nồng độ pha loãng nhất
mà tại đó đếm được các điểm huỳnh quang màu xanh của tế bào nhiễm virut trên một giếng
Hiệu giá virut (FFU/ml)= n x1/ log 10-x x
10
Trong đó: n là số lượng điểm huỳnh quang
10-x là nồng độ pha loãng nhất có thể đếm
được điểm huỳnh quang
10 là hệ số tính hiệu giá trong 1ml
Trang 3iii Kết quả
Kết quả nghiên cứu được trình bầy trong
các bảng sau:
Bảng 1 Hiệu giá chủng VNHR-203-030
Hiệu giá
Chủng
Log10n FFU/ml
VNHR-203-030 7,0
Bảng 1 cho kết quả hiệu giá chủng
VNHR203-030 là 107,0FFU/ml
Bảng 2 Hiệu giá của virus rota trên các
liều gây nhiễm khác nhau
Hiệu giá
Liều
gây
nhiễm
Số lượng tế
bào gây
nhiễm/1FFU Log10n
FFU/ml
FFU/ml
A 3,5 tế bào 6.84 6918309
B 4,5 tế bào 6.65 4466835
C 6,3 tế bào 6.95 8912509
D 10 tế bào 7.08 12022644
E 30 tế bào 6.76 5754399
G 32 tế bào 6.70 5011872
H 50 tế bào 6.72 5248074
I 70 tế bào 6.05 1122018
K 90 tế bào 6.48 3019951
M 100 tế bào 5.50 316227
Bảng 2 cho thấy hiệu giá cao tại 2 liều gây
nhiễm 6,3 tế bào/1FFU và 10 tế bào/1FFU tuy
nhiên hiệu giá cao hơn ở liều gây nhiễm là 10
tế bào/FFU (cao hơn 1,35 lần so với liều gây
nhiễm 6,3 tế bào/1FFU) Hiệu giá thấp dần
khi số lượng tế bào tăng và hiệu giá thấp nhất
là 100 tế bào/FFU
iv Bàn luận
Tế bào thận khỉ tiên phát Macaca Mulatta
là tế bào được tách từ tổ chức thận khỉ
Macaca Mulatta (khỉ nuôi tại đảo Rều Quảng
Ninh) và có thể cấy chuyển 3 lần liên tiếp Mỗi
đôi thận khỉ có thể tách được khoảng 100-120
chai roux tế bào Tế bào này được nuôi và
phát triển kín 1 lớp bằng môi trường LHE 10% huyết thanh bê trong 7 ngày Khỉ lấy thận
được kiểm tra nghiêm ngặt về các tác nhân ngoại lai theo phương pháp và tiêu chuẩn của
Tổ chức Y tế thế giới Khỉ và tế bào thận khỉ
được chấp nhận để nghiên cứu và sản xuất văcxin khi đã qua tất cả thử nghiệm theo yêu cầu của Tổ chức Y tế thế giới
Tế bào (MA104) có nguồn gốc từ tế bào thận bào thai khỉ rherus, được chọn lọc tạo thành dòng tế bào thường trực, dòng tế bào
có thể cấy chuyển nhiều lần mà không ảnh hưởng đến đặc tính của tế bào, được bảo quản ở -1960C và được cung cấp bởi Trung tâm Phòng chống và Kiểm soát bệnh tật CDC-Atlantta-Mỹ, là nguồn tế bào nhạy cảm cho sự nhân lên của virus rota và dùng để sử dụng cho phân lập và kiểm tra hiệu giá virut rota
Virut rota nhóm A là virut chính gây bệnh cho trẻ em dưới 5 tuổi [4,5] Virut này rất khó nhân lên và thích nghi trên tế bào một lớp cho
đến khi sử dụng enzym trypsin hoạt hóa virut [6] Liều gây nhiễm virut cực kỳ quan trọng trong sự nhân lên của virut, không phải nồng
độ gây nhiễm cao là tạo ra sản phẩm có hiệu giá cao, cụ thể như nồng độ gây nhiễm từ 3,5
tế bào/ FFU đến 4,5 tế bào/FFU cho sản phẩm có hiệu giá thấp hơn tại nồng độ 6,3 tế bào/FFU và 10 tế bào/FFU Do vậy việc chọn
ra liều gây nhiễm thích hợp là vô cùng quan trọng Liều gây nhiễm thích hợp lượng virus rota tính theo đơn vị FFU sử dụng cho 01 tế bào mà tại đó tạo ra sản phẩm có hiệu giá cao nhất Như vậy liều gây nhiễm thích hợp cho chủng VNHR203-030 là 0,1FFU virus rota/ 1 tế bào Liều gây nhiễm này cao hơn so với liều gây nhiễm của chủng virut bại liệt trong sản xuất văcxin bại liệt sống uống (0,0033PFU virus bại liệt/1 tế bào thận khỉ tiên phát) và cũng cao hơn liều gây nhiễm chủng virut viêm gan A trong sản xuất văcxin viêm gan A (0,05PFU virus viêm gan A/1 tế bào thận khỉ tiên phát)
Trang 4V Kết luận
Chủng virut rota VNHR203-030 nhân lên
tốt nhất trên tế bào thận khỉ tiên phát khi liều
gây nhiễm là 0,1 đơn vị miễn dịch huỳnh
quang trên một tế bào (0,1FFU/ 1 tế bào)
Lời cảm ơn
Nghiên cứu này là công trình nghiên cứu
lần đầu tiên tại nước ta về virut rota, nghiên
cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm
chuẩn tại Trung tâm Khoa học Sản xuất
Văcxin Sabin, số 135 phố Lò Đúc-Hà Nội
Nghiên cứu này là một trong những nội dung
giám sát bệnh tiêu chảy do virut rota tại Việt
Nam năm 2003 đề tài hợp tác với Trung tâm
Phòng chống và Kiểm soát Bệnh tật (CDC)
Atlantta-Mỹ và dưới sự tài trợ của Tổ chức Y
tế thế giới và của Trung tâm Khoa học Sản
xuất Văcxin Sabin Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc tới Gs Nguyễn Văn Mẫn chủ nhiệm
đề tài hợp tác, đã tạo mọi điều kiện cho tôi
chủ động thực hiện nghiên cứu Tôi cũng xin
chân thành cảm ơn tới: Ts Nguyễn Thị Quỳ;
Ts Nguyễn Đăng Hiền; Cn Lê Trung Dũng;
Cn Trần Bích Hạnh và Cn Nguyễn ánh Tuyết
Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin
đã giúp tôi thực hiện nghiên cứu này
Tài liệu tham khảo
1 Lê Thị Luân Quá trình chọn lọc chủng
virut rota týp G2 trên nuôi cấy tế bào Tạp chí Y
học thực hành; Số 9 (460); Trang 13-15; 2003
2 Lê Thị Luân Nuôi cấy virut rota gây bệnh tiêu chảy cấp ở trẻ em dưới 5 tuổi trên tế bào thận khỉ Rherus châu Phi; Tạp chí Y học thực hành, Số 10 (463), trang 52-53; 2003
3 Lê Thị Luân Chọn lọc chủng virut rota G1 trên tế bào thận khỉ Macaca Mulatta Tạp chí Y học Thực hành số 9 (460); trang 54-56;2003
4 Nigel A.C., Jailosi S.G., Robin L.B., et
al Rotavirus G and P types in children with acute diarrhea in Blantyre, Malawi, from 1997
to 1998: Predominance of Novel P6G8 strains Journal of Medical Virology 57: 308-312; 1999
5 Nguyen Van Man and et al The Epidermiology and Disease Burden of rotavirus in Vietnam: Sentinel Surveillance at
6 hospitals The journal of infectious Disease
in America; volume 183: 1707-1712; 2001
6 Esparza J., Gorziglia M., Gil F., and Romer H Multiplication of Human Rotavirus
in cultured cells: an Electron Microscopic Study J.Gen.Virol.,47, 461-472; 1980
Sumary
The study of priority multiplication rotavirus VNHR 203-030
on Macaca Multta primary monkey kidney cells
VNHR 203-030 is human rotavirus strain G4P6,8 It was isolated from stool sample of male patient- 9 month of age He addmited Saint Pont hospital cause by acute diarrhea This strain was passaged 30 times in the cell culture It is candidate for producing rotavaccine It's M.O.I is 0.1 FFU virus rota/ 1 Primary monkey kidney cells
