Tuy nhiên các nghiên cứu trên đều chưa đưa ra một quy trình hoàn chỉnh để có thể ứng dụng cho việc nhân giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô trong sản xuất.. - Để có nguồn mẫu c
Trang 1Xây dựng quy trình nhân giống cây đồng tiền bằng kỹ
thuật nuôi cấy mô
Establishment of the protocol for Gerbera propagation via in vitro culture technique
Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Phương Hoa, Nguyễn Thị Giang,
Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh
Summary Using in vitro culture technique on Gerbera propagation is a critical/urgent requirement of the practical flower production in Vietnam Several researches have been carried out on this flower However there is still not an optimal protocol that can be applied for the large-scale production The present study aimed
to establish a protocol that can implement successfully in practical production The study was conducted on 14 varieties The followings are the main results obtained:
- The best initial explants for in vitro culture was young blower bud
- The best medium for the highest multiplication rate was MS + 1ppm BA+ 0,3ppmKi + 0,2ppmIAA/liter
- The best medium for propagation was MS + 1,0 ppm Kinetin + 2,5% sacaro
- The best medium for rooting was MS + 0,1ppm αNAA + 2,5% sacaro
- The best subtrate for plantlet hardening in the nursery was rice husk + humus (at ratio 1:1)
- It was possible to transfer the in vitro plants to the nursery in spring, autum and winter season and the best time was sping
Keywords: gerbera, in vitro propagation
1 Đặt vấn đề
Đã có một vài công bố về nghiên cứu nhân giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô ở ngoài nước (Pierik và cộng sự, 1975; Erwin, J.j T.Heins, and W.Carlson, 1991; Tjia và Joiner, 1984) ở nước ta một số tác giả đã công bố về nghiên cứu nhân giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô (Mai Thị Tân, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Trường Sơn, 1991; Dương Minh Nga, Hà Thị Thuý, Lê Quỳnh Mai, Đỗ Năng Vịnh, 2003) Tuy nhiên các nghiên cứu trên đều chưa đưa ra một quy trình hoàn chỉnh để có thể ứng dụng cho việc nhân giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô trong sản xuất
2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là tập đoàn 14 mẫu giống hoa đồng tiền nhập nội từ Côn Minh (TQ) dưới dạng cây cấy mô xuất vườn Đây là những giống đang trồng phổ biến trong sản xuất và được người tiêu dùng rất ưa chuộng Trong đó, giống nghiên cứu chủ đạo là giống hoa kép, màu đỏ nhung, nhị nâu
2.2 Phương pháp nghiên cứu
- Các phương pháp nghiên cứu nuôi cấy mô hiện hành đã được sử dụng cho nghiên cứu
- Phương pháp bố trí thí nghiệm và các chỉ tiêu theo dõi, điều tra đều được tiến hành theo phương pháp nghiên cứu nông sinh học thông dụng Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm, vườn thực nghiệm phòng CNSH - Viện Sinh học Nông nghiệp- Trường ĐHNN I- Hà Nội
- Để có nguồn mẫu cho quá trình nuôi cấy in vitro chúng tôi đã chọn lựa các cây mẹ sạch bệnh, sinh trưởng phát triển tốt nhất để làm nguồn mẫu ban đầu
3 Kết quả và thảo luận
Trang 23.1 Giai đoạn tạo nguồn mẫu ban đầu
Bảng 1 ảnh hưởng của thời gian khử trùng và vị trí lấy mẫu đến khả năng sống của mẫu cấy
Thời gian khử trùng Cơ quan nuôi
Thân
Cuống lá non
Lá non
Cuống hoa
Hoa non
Bảng 2 ảnh hưởng của tổ hợp Benzyl adenin (BA)+ Kinetin (K) + Indol acetic axit (IAA) đến sự phát sinh
hình thái của mẫu cấy (sau 16 tuần nuôi cấy)
Sự phát sinh hình thái Công thức
Lá non Cuống lá non Hoa non Cuống hoa (đối chứng)
Mẫu có màu xanh, chết sau 2 tuần
Chết Sau 2 tuần
Chết Sau 2 tuần
Chết Sau 2 tuần (0,3ppm BA + 0,2ppmK
+0,2ppmIAA)
Mẫu có màu xanh, phồng to và chết sau
5 tuần
(0,5ppm BA + 0,2 ppmK
+ 0,2ppmIAA)
Sùi callus 15%
sau 10 tuần nuôi cấy
Sùi callus 5%, sau
10 tuần nuôi cấy
Sùi callus 17% sau
9 tuần, có 6,7% tạo thành chồi sau 16 tuần nuôi cấy
Chết
(1,0ppm BA + 0,2 ppmK
+ 0,2ppmIAA)
Sùi callus 23%, sau 9 - 10 tuần nuôi cấy
Sùi callus 13%, sau
10 tuần nuôi cấy
Sùi callus 25%, có
20% tạo chồi sau
16 tuần nuôi cấy
Chết (1,5ppm BA + 0,2
ppmK +
0,2ppmIAA)
Sùi callus 10%, sau 8 - 10 tuần nuôi cấy
Sùi callus 7%, sau
10 tuần nuôi cấy
Sùi callus 9%, sau
8 - 10 tuần nuôi cấy
Chết
(2 ppm BA + 0,2 ppmK
+ 0,2ppmIAA)
Sùi callus 5%, sau 8 - 10 tuần nuôi cấy
Sùi callus 3%, sau
10 tuần nuôi cấy
Sùi callus 3%, sau 8-10 tuần nuôi cấy Chết
Kết quả bảng 1, 2 cho thấy:
Tỷ lệ mẫu nhiễm tỷ lệ nghịch với thời gian khử trùng mẫu Vị trí lấy mẫu khác nhau cho kết quả khử trùng khác nhau Mẫu nuôi cấy từ hoa non cho tỷ lệ mẫu "sạch" cao nhất đạt 33,3%, tiếp theo là phần lá non, cuống hoa Thời gian khử trùng 5 phút cho tỉ lệ mẫu sống cao nhất trên các vị trí lấy mẫu
Trên hầu hết các môi trường bổ sung chất điều tiết sinh trưởng mẫu cấy phát sinh hình thái theo hướng hình thành callus Duy nhất chỉ có công thức bổ sung 1ppm BA + 0,2 ppmK +
Trang 30,2ppmIAA là cho 20% mẫu cấy tạo chồi ở mẫu cấy là hoa non, đây là hướng mà người nghiên cứu
mong muốn
Thời gian để mẫu cấy tái sinh chồi là 16 tuần, đây là đặc điểm khá đặc trưng của cây hoa đồng
tiền
Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng được tiến hành để rút ngắn thời gian tái sinh chồi, lớp mỏng tế
bào được cắt theo chiều ngang phần thân của thể tiền chồi với các kích thước: 0,1mm, 0,3mm,
0,5mm, 0,7mm Môi trường nuôi cấy lớp mỏng là môi trường MS có bổ sung 1ppmBA + 0,2ppmK +
0,2ppmIAA Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3
Bảng 3 ảnh hưởng của kích thước lát mỏng đến khả năng phát sinh hình thái
Tỷ lệ lát tái sinh theo thời gian (%) Đường hướng phát sinh
hình thái
Kích
thước
(mm) 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần Callus Chồi
Số chồi/lát (4 tuần)
∑chồi tạo thành (chồi)
0,7 100 100 100 100
100% lát mỏng vừa tạo callus vừa tái sinh chồi ngay trên cùng một lát
Nuôi cấy lớp mỏng đã rút ngắn thời gian và tăng số lượng chồi tạo thành rất đáng kể Chỉ sau
4 tuần, từ một thể tiền chồi có thể cắt được 4 lát mỏng, mỗi lát mỏng ở kích thước tối ưu cho 7,43
chồi/lát, vậy tổng số chồi thu được là 29,7 chồi trong khi đối chứng nếu được nhân thông thường chỉ
tạo 4-5 chồi (bảng 3) Như vậy, việc nuôi cấy lớp mỏng đã làm tăng hệ số nhân từ 6 – 7 lần so với
nhân nhanh thông thường
3.2 Giai đoạn nhân nhanh (bảng 4)
Sau khi có được chồi non hình thành từ quá trình trên, tiến hành tách chồi non thành các cụm
nhỏ có từ 2-3 chồi/cụm và đưa vào môi trường nuôi cấy có bổ sung riêng rẽ BA, kinetin, đường
sacaroza với các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân
nhanh K có hiệu quả tót hơn cho giai đoạn nhân nhanh (kết quả thu được trình bày ở bảng 4) Nồng
độ đường trong môi trường nuôi cấy 2,5% là tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh
Nhìn chung, bổ sung chất điều tiết sinh trưởng đều cho tác dụng kích thích sự đẻ chồi cao hơn
so với đối chứng Môi trường cho hệ số nhân chồi cao nhất là môi trường có bổ sung Kinetin ở nồng
độ 1,0mg/l (hệ số nhân đạt 5,78 lần) đồng thời cho chất lượng chồi khá cao (chiều cao cây đạt 2,58
cm, số lá đạt 2,67lá/cây)
Kết luận: môi trường cho hệ số nhân chồi cao và chất lượng chồi tốt là: MS + 1ppm kinetin+ 2,5%
đường sacaro
Bảng 4 ảnh hưởng của Kinetin đến quá trình nhân nhanh (sau 4 tuần nuôi cấy)
MS+0,3ppmK 2,45 1,60 2,78 MS+0,5ppmK 3,09 2,27 3,36 MS+1,0ppmK 5,78 2,85 3,67 MS+2ppmK 2,67 2,02 3,33 MS+3ppmK 2,22 2,26 2,56
Trang 43.3 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh (bảng 5)
Bảng 5 ảnh hưởng của αNAA đến quá trình ra rễ
Tỷ lệ ra rễ của chồi (%) Chiều cao trung bình
cây (cm)
Chỉ tiêu theo dõi
Công thức
Sau 1 tuần Sau 2 tuần
Số rễ /cây
Chiều dài
TB rễ (cm) Ban đầu Sau 2 tuần
MS+0,1ppmαNAA 20,00 100,00 8,30 0,60 4,00 6,00 MS+0,3ppmαNAA 40,00 100,00 4,00 1,00 4,00 5,80 MS+1,0ppmαNAA 20,00 100,00 3,70 0,80 4,00 5,50 Chồi đồng tiền hoàn toàn có khả năng ra rễ sau 2 tuần nuôi cấy (tỷ lệ ra rễ đều đạt 100%) trên tất cả các môi trường Bổ sung 0,1ppm αNAA đã cho tỷ lệ tạo rễ đạt 100% cũng như chất lượng cây
là cao nhất Môi trường thích hợp tạo cây hoàn chỉnh là MS + 0,1ppm αNAA
3.4 Giai đoạn v ườn ươm (bảng 6 và 7)
Bảng 6 ảnh hưởng của nền trồng đến tỷ lệ sống, sinh trưởng, phát triển của cây cấy mô giai đoạn vươn ươm (sau 4
tuần theo dõi)
Chỉ tiêu theo dõi Nền trồng
Tỷ lệ sống (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá/cây)
Bảng 7 ảnh hưởng của thời vụ trồng đến sự sinh trưởng của cây đồng tiền cấy mô ở vườn uơm (sau 4 tuần)
(cây)
Tỷ lệ sống (%)
Chiều cao cây (cm/cây)
Số lá (lá/cây)
Với các nền trồng khác nhau thì nền trồng bằng trấu hun hoàn toàn không thích hợp cho việc ra cây
đồng tiền cấy mô (tỷ lệ sống chỉ đạt 6%) Giá thể cát cho tỷ lệ sống tương đối cao nhưng cây sinh trưởng chậm Giá thể thích hợp nhất là mùn + trấu hun (1:1) (tỷ lệ sống cao 93,5%, cây sinh trưởng mạnh nhất) Thời vụ có thể ra cây đồng tiền cấy mô là vụ xuân, thu và vụ đông, tránh ra cây vào vụ hè do thời tiết quá nóng nắng, tỷ lệ chết khá cao Thời vụ ra cây tốt nhất là vụ xuân
Quy trình hình thành trên đã được vận dụng cho 13 giống thí nghiệm và đều cho kết quả tương tự Kết luận
3.1 Đã xây dựng được quy trình nhân giống hoa đồng tiền bằng phương pháp nuôi cấy mô hoàn chỉnh như sau:
Trang 5Chế độ khử trùng thích hợp cho giai đoạn tạo nguồn mẫu ban đầu là: sử dụng HgCl2 nồng độ 0,1% thời gian 5 phút
Vị trí lấy mẫu thích hợp nhất cho tỷ lệ mẫu tạo chồi cao nhất là hoa non
Môi trường thích hợp cho sự phát sinh chồi là môi trường MS +1ppmBA + 0,3ppmKi + 0,2ppmIAA +2,5 %sacaroza + 6,5g agar/lít
Môi trường thích hợp cho quá trình nhân nhanh là: MS+ 1,0ppmKinetin +2,5% sacaroza+6,5g agar Môi trường ra rễ tốt nhất: MS + 0,1ppm αNAA + 2,5% sacaroza +6,5g agar/lít
Thời vụ ra cây tốt nhất là vụ xuân, cũng có thể ra cây đồng tiền cấy mô vào vụ thu và vụ đông Giá thể ra cây tốt nhất cho cây đồng tiền cấy mô là mùn+trấu hun (1:1)
4.2 Đây là một quy trình có khả năng áp dụng rộng rãi ngoài sản xuất
Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống hoa đồng tiền
Cây mẫu
Hoa non
Khử trùng bằng HgCl2 0,1%trong 5 phút
Tạo thể tiền chồi, cắt lớp mỏng tiền chồi (0,3mm) (16 tuần)
MS +1ppm BA + 0,2 ppmKi + 0,2ppmIAA + 2,5% đường sacarose +6,5g agar/lít
Nhân nhanh (6 tuần)
MS + 1ppm kinetin+ 2,5% đường sacarose +6,5g agar/lít
Ra rễ cho chồi in vitro (2 tuần)
MS+0,1mgαNAA+2,5% sacarose+6,5g agar/lít
Vườn ươm (5 – 6 tuần)
Mùn + trấu hun (1:1)
Vườn sản xuất (sau 3 tháng có hoa)
Trang 6Tài liệu tham khảo
Erwin, J.j T.Heins, and W.Carlson (1991) Pot Gerbera production Minnesota Flower Growers Association Bulletin 40(5):1 - 6
Dương Minh Nga, Hà Thị Thuý, Lê Quỳnh Mai, Đỗ Năng Vịnh (2003) “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh các giống hoa đồng tiền Gerbera jasmesonii nhập nội bằng công nghệ in vitro” Báo cáo khoa học Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2003 Nhà xuất bản KHKT, trang 987 - 991
Pierik, R.L.M., J.L.M Jansen, A.Maasdam và C.M Binnendijk (1975) Optimalization of Gerberra plantlet production from excised capitulum explants Scientia Horticulturae 3:35357
Mai Thị Tân, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Trường Sơn (1991) ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nhân nhanh cây hoa đồng tiền Kết quả nghiên cứu khoa học 1986 – 1991, khoa Nông học, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, trang 6-8
Tjia, B., F.J Marousky, and R.H Stamps (1987) Response of cut gerbera flowers to fluoridated water and a floral preservative HortScience 22:896-897
