Phân lập vi khuẩn pseudomonas stutzeri trong đất đồng bằng sông Cửu Long và ứng dụng xử lý amonium trong nước ở điều kiện phòng thí nghiệm pptx

PHÂN LẬP VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI TRONG ðẤT ðỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ AMONIUM TRONG NƯỚC Ở ðIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Ths.. Phan Trường Khanh∗ ∗∗ ∗ TÓM TẮT Thu thập

PHÂN LẬP VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI TRONG ðẤT

ðỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ

AMONIUM TRONG NƯỚC Ở ðIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM

Ths Phan Trường Khanh∗ ∗∗ ∗

TÓM TẮT Thu thập 36 mẫu ñất ở ðBSCL ñể phân lập vi khuẩn (VK) Pseudomonas stutzeri và nhận diện chúng bằng kỹ

thuật PCR Kết quả cho thấy dòng P8 xác ñịnh là P stutzeri bằng cặp mồi ñặc trưng 16S-rDNA và một dòng P2a

ñược xác ñịnh có mang gen cd 1 -nirD

Sử dụng riêng rẻ dòng P8, P2a, P10, dòng ñối chứng dương ATCC 14405 và hỗn hợp 2 dòng phối trộn P8-P2a,

P10-P8 ñể khử ammonia và nitrat dưới mức an toàn từ 2 ñến 4 ngày sau khi cho các dòng VK này vào trong môi

trường nước biển nhân tạo hay nước ao nuôi tôm bị nhiễm ammonia Kết quả là hầu hết các dòng VK ñều có khả

năng khử NH 4+ khoảng 80% Tuy nhiên, hiệu suất xử lý NH 4+ của dòng ATCC 14405 không cao

ABSTRACT Thirty six soil samples were taken from the Mekong Delta to identify Pseudomonas stutzeri by PCR

technology Results indicated that, P8 strain was identified Pseudomonas stutzeri with specific primers 16S-rDNA

and that one strain P2a has carried cd 1 -nirD gene

Using alone bacteria strains P8, P10, P2a, ATCC 14405 and a mixture of P8-P2a, P10-P8 reduced

ammonia and nitrate concentration to below safety level from 2 to 4 days after inoculating this bacteria into

ammonia-wastewater of artificial seawater and shrimp-pond water As a result, most of bacteria strains reduced

about 80% ammonia and nitrate However, ammonia reducible efficiency of ATCC 14405 was not high

Key words: Pseudomonas stutzeri

1 ðẶT VẤN ðỀ

Vấn ñề ô nhiễm các hợp chất nitơ vô cơ trong nước có thể gây nên một số bệnh nguy hiểm cho người

sử dụng, nitrat tạo ra chứng thiếu vitamin và có thể kết hợp với các amin ñể tạo nên nitrosamin là nguyên

+

cao gây ra hiện tượng phú dưỡng làm cho môi trường nước bị ô nhiễm nặng Nitơ amon có mặt trong nước cũng làm giảm hiệu quả của khâu khử trùng bằng clo, ngay cả

trong môi trường ñất khi lượng nitơ vô cơ quá nhiều ñất sẽ bị chay cứng… Vì vậy, việc nghiên cứu, tìm

kiếm và phân lập dòng VK Pseudomonas stutzeri ñể xử lý nitơ vô cơ trong nước là rất cần thiết

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phân lập VK này trên môi trường Pseudomonas isolation agar Sau ñó xác ñịnh các dòng VK khử

ñạm bằng môi trường SW-LB, môi trường Minimal

- Quan sát hình dạng và ño kích thước tế bào VK P Stutzeri dưới kính hiển vi với ñộ phóng ñại 400

lần

- Ly trích DNA và kiểm tra các dòng P Stutzeri ñã phân lập bằng kỹ thuật PCR

- Chạy ñiện di trên Gel Agarose

- Xác ñịnh khả năng khử nitơ vô cơ của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri

- Xác ñịnh lượng NH4

+

và NO3

-

ñược xử lý bởi VK P.stutzeri trong nước ao nuôi tôm

3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1 Hình thái, màu sắc, kích thước dòng Pseudomonas

Kết quả phân lập ñược 20 dòng VK Pseudomonas, trong ñó có 5 dòng VK ñược phân lập từ nhóm ñất

nhiễm mặn, 5 dòng từ nhóm ñất phèn, 10 dòng ñược phân lập từ nhóm ñất phù sa Trong số 20 dòng VK

Pseudomonas chỉ có 1 dòng P stutzeri là P8 Dòng P8 ñược phân lập từ mẫu ñất phù sa xã An Thạnh

Trung, huyện Chợ Mới, An Giang Hầu hết các khuẩn lạc ñều có hình que, màu trắng ñục, trắng sữa hay

màu vàng, bề mặt khuẩn lạc mô hoặc trơn, có chiều dài từ 0,4µm–2,5µm; chiều ngang từ 0,5µm–0,8µm Bảng 1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn từ ñất

Vĩnh Lợi ðất mặn 6 2

3.2 Kiểm tra các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR

Sản phẩm ADN sau khi kiểm tra ñược khuếch ñại bằng kỹ thuật PCR, tiếp tục kiểm tra bằng phương pháp ñiện di trên gel agarose 1,2% và ñược chụp hình dưới tia UV Kết quả ñiện di với cặp mồi F (5’

phát hiện ñược một loài VK cho band ADN ở vị trí 625bp là chủng P stutzeri P8 (Hình 1) phù hợp với vị trí band của VK ñối chứng dương ATCC 14405 Những dòng còn lại không cho band tương ứng chứng tỏ chúng không phải là Pseudomonas stutzeri

Hình 1 Vi khuẩn P8 Hình 2 Vi khuẩn P2a

CCC GAG CCG CGC GT-3’); R4 (5’-AC CCG ACC GGT AAG TTC AAC GTG -3’), chúng tôi cũng phát hiện ñược một loài VK cho band ADN ở vị trí 785bp là chủng VK P2a (Hình 2) nhưng không phải là Pseudomonas stutzeri

Hình 3 ðoạn gen của P stutzeri mang gen nos, nir, nor Hình 4 P2a tổng hợp cd 1 -nirD từ hem D1 3.3 Xác ñịnh khả năng khử nitơ vô cơ của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri

Thí nghiệm ñược bố trí với 7 nghiệm thức bao gồm: 4 dòng VK ñơn lẻ P10, P8, P2a, ñối chứng dương ATCC 14405; 2 dòng phối trộn P10-P8, P8-P2a và một nghiệm thức ñối chứng âm Mỗi dòng VK tiến hành lặp lại 3 lần trong 3 bình tam giác khác nhau Mẫu ñối chứng âm ñược chuẩn bị giống như mẫu thật nhưng không có chủng VK

Chủng vi khuẩn ñối chứng dương ATCC 14405

1 chủng vi khuẩn P8

P stutzeri

100 bp

300 bp

600 bp

900 bp

1200 bp

Thang chuẩn

100bp

300 bp

900 bp

600 bp

100 bp

1 chủng vi khuẩn P2a khử ñạm mang gen cd1-nirD

Thí nghiệm ñược tiến hành trên môi trường nước biển nhân tạo với hai nồng ñộ NH4 khác nhau

+

+

ban ñầu 5ppm)

+

, NO3

còn lại

nghiệm 1), 30ppm (thí nghiệm 2), ao nuôi tôm 5ppm (thí nghiệm 3).

STT Nghiệm Thức Hiệu Suất (%) (thí nghiệm 1) Hiệu Suất (%) (thí nghiệm 2) Hiệu Suất (%) (thí nghiệm 3)

+

, nghĩa là tất cả các dòng VK trên ñều có

mang các gen ñặc hiệu nào khác không? Dòng P8 là dòng P stutzeri có mang tổ hợp các gen nir, nor, nos

+

qua các giai ñoạn NH4

+

->NO3 > NO2 -> NO > N2O > N2 và cũng có khả năng

+

->NO3 > NO2 ->NH3 Vì vậy, hiệu suất khử NH4

+

của dòng P8 cao nhất trong tất cả

mạnh nhất ở giai ñoạn NO2 >NO > N2O > N2 Còn giai ñoạn khử NH4

+

sang NO3 sang NO2 xảy ra nhưng rất chậm Vì vậy, hiệu suất khử NH4

+

ở dòng P2a thấp hơn so với dòng VK P8

Khi ứng dụng VK vào xử lý các mẫu nước ao nuôi tôm bị nhiễm amonium thì hầu hết chúng làm

+

khoảng 80% sau bốn ngày thí nghiệm Tuy nhiên, hiệu suất xử lý thấp hơn so với thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2

Biểu ñồ 2 cũng cho thấy nồng ñộ NO3

còn lại sau bốn ngày thí nghiệm rất thấp dao ñộng trong

+

chuyển hoá thành NO3

-, sau công ñoạn nitrat hoá amoni là khâu khử nitrat sinh hoá nhờ các dòng vi sinh vật trong ñiều kiện thiếu khí Nitrit và nitrat sẽ chuyển thành dạng khí N2 Vì vậy nồng ñộ NO3

giảm một cách ñáng kể ở hầu hết các nghiệm thức và mật số VK có xu hướng giảm theo thời gian thí nghiệm ðiều này cho thấy, trong mẫu nước ao nuôi tôm các hợp chất hữu cơ chứa cacbon ñã cạn kiệt do ñó mật số VK có

xu hướng giảm xuống ở những ngày thí nghiệm cuối cùng ðiều này có thể giải thích VK thu năng lượng

ñể tăng trưởng từ quá trình chuyển hoá NO3

thành khí N2 và cần có nguồn cacbon ñể tổng hợp tế bào

0

1

2

3

4

5

6

ðC

P8

P2a

ATCC

P10

P10-P8

P8-P2a

4.185

nghiệm thức

4 KẾT LUẬN

- Bằng kỹ thuật PCR kết quả nhận diện ñược một dòng VK P.stutzeri ñó là dòng P8 ñược phân lập từ mẫu ñất phù sa, huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang Dòng P2a không phải là VK P stutzeri nhưng có gen

cd1-nirD khử ñược oxyt nitơ từ NO sang N2O ñến N2 và ñược phân lập từ mẫu ñất phù sa huyện Ô Môn, Cần Thơ

- Tất cả các dòng VK P8, ATCC14405, P2a, P10 hệ phối trộn P8-P2a, P8-P10 ñều có khả năng khử

+

ñạt

+

ñạt 79,96% Dòng P2a khả năng xử lý ñạm amon không ổn ñịnh và hiệu suất xử lý thấp chỉ ñạt 59,92% Dòng ñối chứng dương ATCC 14405 là dòng VK P.stutzeri lấy từ nước ngoài nên khả năng thích nghi kém trong ñiều kiện của nước ta vì vậy hiệu suất xử lý cũng không cao

5 KIẾN NGHỊ

- Cần phải ứng dụng các dòng VK này ở ngoài ñồng ñể có kết luận chính xác hơn

- Cần nghiên cứu sâu hơn nửa các dòng VK này ñể sản xuất chế phẩm sinh học trong xử lý môi trường nước ao tôm bị nhiễm ñạm amon và nitrat

- Chúng ta nên phân lập, tìm kiếm và ứng dụng những dòng VK có tại ñịa phương ñể xử lý nước bị nhiễm amonium và nitrat sẽ cho kết quả tốt hơn.