1 TRƯỜNG THPT LÊ HỒNG PHONG HỌC CHỦ ĐỀ Môn Công Nghệ CHỦ ĐỀ Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống Cây trồng nông , lâm nghiệp Tổ 3 Lớp 10 A1 NĂM HỌC 2016 – 2017 A Đặt vấn đề B Nội dun[.]
Trang 1TRƯỜNG THPT LÊ HỒNG PHONG
…… ……
HỌC CHỦ ĐỀ: Môn Công Nghệ
CHỦ ĐỀ Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống
Cây trồng nông , lâm nghiệp
Tổ : 3 Lớp : 10 A1
NĂM HỌC 2016 – 2017
Trang 2A Đặt vấn đề
B Nội dung
1 Lịch sử hình thành và phát triển công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
+) Thế Giới :
Chia làm 3 giai đoạn
- Khởi đầu 1902 -1933:
Haberlandt , Đức (1902) : “ Tính toàn năng của tế bào thực vật ” Tuy nhiên ông đã không thành công với các tế bào mô mềm , biểu bì dom chúng không thể phân chia được
- Giai đoạn 1934-1965:
+ Phát hiện các hooc môn sinh trưởng đầu tiên
+ Xây dựng được môi trường cơ bản
- Giai đoạn 1965 – Nay:
Phát hiện ra các kĩ thuật nuôi cấy mô có ý nghĩa : Tạo cây đơn bội, nuôi cây tế bào trần
+) Việt Nam :
-Du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm 1980
Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng
Nhiều phòng tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô này
- Ở nước ta cây trồng chuyển gen mới chỉ được nghiên cứu ở các viện, các phòng thí nghiệm, mà chưa được sản xuất ở quy mô lớn, đại trà như viện Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ sinh học, viên Lúa đông bằng sông Cửu Long…và một số chương trình từ dự án quốc gia và quốc tế và thành công trong việc chuyển một số gene diệt sâu, bệnh, kháng thuốc vào một số cây như lúa, ngô, cải bắp…
- Nhìn sang các nước khác chúng ta thấy công nghệ sinh học của Việt Nam còn đi một khoảng cách khá xa: Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ…
2 Khái niệm
-Nuôi cấy mô tế bào là phương pháp tách rời tế bào, mô đem nuôi cấy trong môi trường thích hợp để chúng tiếp tục phân bào rồi biệt hóa thành mô, cơ quan và phát triển thành cây mới
Trang 33 Cơ sở khoa học
a) Tính toàn năng của tế bào
Tế bào chứa hệ gen quy định kiểu gen loài đó, mang toàn bộ lượng thông tin của loài
Có thể sinh sản vô tính khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp
b) Khả năng phân hoá và phản phân hoá của TB
- Phân hoá TB : Là quá trình tế bào phôi sinh biến đổi thành tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô cơ quan khác nhau, để đảm nhận các chức năng khác nhau
- Phản phân hoá TB : Là quá trình chuyển tế bào chuyên hoá về một chức năng nào đó về trạng thái phôi sinh ban đầu và phân chia mạnh mẽ
c) Môi trường dinh dưỡng : Là nhân tố quan trọng quyết định sự thành công của quá trình nuôi cấy Hầu hết các môi trường dinh dưỡng nhân tạo được sử dụng
để nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm các thành phần sau:
Các nguyên tố muối khoáng
+Nguyên tố đa lượng
+Nguyên tố vi lượng
Nguồn cac bon Vitamin
4 Quá trình công nghệ nuôi cấy mô tế bào
Bước 1: Chọn vật liệu nuôi cấy
Bước 2 : Khử trùng
Buồng khử trùng
- Mẫu và dụng cụ được tẩy rửa khử trùng
- Cắt đỉnh sinh trưởng thành phần tử nhỏ, tẩy rửa, khử trùng ở buồng vô trùng VD:
- Vật liệu nuôi cấy tiến khử trùng với HgCl 0,1% và nước cất
- Que cấy, ống nghiệm và giá thể.được khử trùng trong nồi hấp
Bước 3 : Tạo chồi
Khối callus chuẩn bị tạo cây con
Cây con mới đang hình thành
- Để cây có thể phát triển thân cành
- Cắm vật liệu nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung thêm xytokinin hoạt hoá tạo chồi
Trang 4Bước 4 : Tạo rễ
- Khi cây đạt tiêu chuẩn về chiều cao, số lá thì chuyển sang MT tạo rễ Đó là MT dinh dưỡng thích hợp bổ sung chất KT auxin, IBA
Bước 5 :Cấy cây vào môi trường thích ứng
- Chuyển cây sang MT thích ứng gần giống với mặt trời tự nhiên về: nhiệt độ, độ
ẩm, ánh sáng
- Không thể bỏ qua bước này được vì cây mới tạo ra rất yếu Nếu trồng trực tiếp vào MT tự nhiên cây sẽ dễ nhiễm bệnh và chết
Bước 6: Trồng cây trong vườn ươm
- Cho cây thích ứng với MTSX
- Khi cây đủ chiều cao, thân lá thì chuyển cây ra vườn ươm nhân nhanh sản xuất
Áp dụng nuôi cấy mô tế bào của Hoa phong lan:
Vật liệu nuôi cấy: mô phân sinh ngọn, mô phân sinh bên, cuống hoa, đỉnh lá, hạt lan…
Thông thường người ta nuôi cấy hạt lan tạo ra các chồi mới hoặc nuôi cấy trực tiếp các cơ quan của cây
1 Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy
1.1 Khử trùng trái lan
Rửa trái lan bằng xà phòng, rửa lại bằng nước sạch
Cho trái lan vào bình hấp khử trùng và cho vào tủ cấy vô trùng
Dùng cồn 70° lắc qua trong 30s, rửa lại bằng nước cất vô trùng
Khử trùng trái lan lại bằng cồn 96º
Dùng dao xẻ dọc trái lan để lấy hạt, cho hạt vào môi trường nuôi cấy, quấn xung quanh miệng hộp nuôi cấy bằng parafin
Để hộp vào chỗ tối 2 tuần, sau đó đem ra để ngoài sáng
1.2 Khử trùng mẫu cấy là các cơ quan
Tách các vảy hành ra từ cây, bóc các lá già cho đến khi xuất hiện các màm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng
Khử trùng bằng cồn 70° trong 30s, rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng
Ngâm mẫu trong dung dịch Ca(0cl)2 2% trong 5 phút
Rửa lại bằng nước cất 4-5 lần
Mỗi mầm được đặt trong một đĩa peptri vô trùng, cẩn thận tách các lá non, sau mỗi lần tách phải nhúng mầm vào cồn 70º trong 1s và rửa với nước cất vô trùng, chuyển sang một đĩa peptri vô trùng khác
Trang 5Tách các lá mầm bằng dao nhọn vô trùng , dùng kim nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinhtrưởng ra khỏi mô và cấy vào môi trường nhân giống
Cắt và khử trùng mẫu cấy
2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
2.1 Môi trường nuôi cấy hạt
Mỗi loại môi trường thích hợp cho từng nhóm lan khác nhau: Knudson’s đối với lan Dendrobium, Cattleya; MS1/2 hoặc Hyponex(20-20-20) đối với lan đơn thân như Vanda, Phalaenopsis Đường được bổ sung vào moi trường nuôi cấy 30g/l
và môi trường được làm đặc bằng agar Trước khi cấy môi trường được hấp khử trùng ướt ở 121ºC, 1atm trong thời gian 15 phút(tuỳ vào thể tích của môi trường nuôi cấy)
2.2 Môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Một số môi trường thường được dùng là:Knudson’s, Heller, Knop, MS…
Được sử dụng phổ biến nhất là môi trường MS có bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng: NAA với nồng độ phần triệu(ppm),hoặc 2,4D với nồng độ 1-2 ppm nồng độ các chất nên giảm dần trong các lần cấy chuyển sau đó
Một số dich chiết trái cây cũng được bổ sungvào môi trường nuôi cấy
Saccarose gây ra sự kích thích mô đối với một số loài lan và ngược lạ cũng gây
ức chế với một số loài lan khác, cytokynin có hiệu quả gây sự mọc chồi với đa số loài và với nhiều bộ phận của cây lan, đối với những loài hoặc những bộ phận không chịu ảnh hưởng của cytokynin thì được thay thế bằng axit tranh-cinamic Nhiệt độ lý tưởng cho nuôi cấy mô phong lan là 22ºC±1 đối với đa số các loài lan
đa thân và 26ºC±3 đối với các loài lan đơn thân.Ánh sáng nhân tạo được
cungcấp bởi 2 loại đèn huỳnh quang và đèn nóng sáng, ánh sáng phải được sử dụng liên tục với quang kỳ 16 giờ,18 giờ hoặc 24 giờ, cường độ ánh sáng thay đổi từ 1000 lux- 2000 lux tuỳ loài và tuỳ thuộc vào thời kỳ sinh trưởng, các đèn phải đặt cách môi trường 0,4-0,5m
Trước khi nuôi cấy,môi trường cấy và nước cất phải được tiệt trùng trong nồi ở
áp suất 1kg/cm² trong 10-30 phút
3 Cấy chuyển sang môi trường mới
3.1 Đối với hạt nảy mầm
- Đối với hạt nảy mầm, sau một thời gian nuôi cấy sẽ thấy các điểm xanh xuất hiện trên bề mặt môi trường, nếu cấy thưa thì vãn để cây phát triển trong môi trường cũ, nếu cấy mau thì phải cấy chuyển sang môi trường mới,môi trường mới như môi trường gieo hạt nhưng có bổ sung thêm 10% nước dừa
Khi chồi lớn lên có thể tiến hành nhân chồi hoặc chuyển sang môi trường cơ bản nhưng có bổ sung thêm 50g dịch chiết khoai tây hoặc 50g chuối nghiền
Hạt lan Mini Dendrobium nảy mầm sau 30 ngày bằng phương pháp nuôi cấy mô Cây con phát triển mạnh trong điều kiện in-vitro
Trang 63.2 Đối với đỉnh sinh trưởng
-Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn gọi là thể chồi, thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt thanh 4-6 miếng tuỳ theo kích thước của thể chồi, lát cắt sẽ được chuyển vào trong môi trường phát triển chồi, mỗi đỉnh sinh trưởng sẽ tạo ra được một chồi nới sau khoảng 4 tuần, có thể cắt tiếp và chuyển sang môi trường mới, tất cả việc cấy chuyển phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng
Thể chôì lan Hồ điệp phát triển sau 4 tuần nuôi cấy mô
Thể chồi lan Hồ Điệp phát triển sau 8 tuần
4 Tái sinh cây hoàn chỉnh
Khi đạt đén số cây giống cân thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ(môi trường có nồng độ auxin tăng lên để kích thích ra rễ) Sau 4-5 tháng, các thể chồi
sẽ phát triển thành cây con
Tạo rễ chuẩn bị đưa ra trồng ngoài tự nhiên
5 Chuyển cây ra vườn ươm
Khi cây con cao 5-7cm, có từ 3-4 lá, có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung các chất dinh dưỡng
Khi đem ra khỏi chai, dùng vòi rửa sạch hết môi trường nuôi cấy còn bám trên cây con, ngâm vào nước có pha thuốc trừ nắm trong khoảng 5 phút rồi xả sạch nới nước
Giá thể thường được sử dụng để ươm cây con sau nuôi cấy là vỏ dừa
C Ý nghĩa – Thành Tựu
1 Ý nghĩa
Có thể sản xuất giống cây trồng theo quy mô công nghiệp và có hệ số nhân giống cao
- Sản phẩm được tạo ra đồng nhất về mặt di truyền
- Sản phẩm hoàn toàn sạch bệnh nếu nguyên liệu nuôi cấy sạch bệnh
2 Thành tựu
Bắt đầu với công trình của White(1934) nuôi cấy thành công rễ cà chua trên môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose, dịch chiết nấm men
(1935 )Thimann đã phát hiện ra auxin(IAA) trong mô thực vật Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng IAA cùng các vitamin bổ sung vào môi trương nuôi cấy đã thu được kết quả tốt
Trang 7Những năm 1940 nhiều chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm IAA được tổng hợp thành công và được sử dụng nhiều trong nuôi cấy kết quả cho thấy chất này có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, phân chia tế bào
1954-1955 Skoog phát hiện kinentin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào
1956 Skoog và Miller tìm hiểu ảnh hưởng của tỉ lệ Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy đến sự hình thành cơ quan và tạo được chồi từ lá cây thuốc lá
1960 Bergman đã tái sinh tế bào đơn thuốc lá trong môi trường lỏng
Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô tế bào vào công nghệ sinh học thực vật(1960 đến nay)
1960 Cooking đã dùng enzym cellulase phân huỷ vỏ cellulose của tế bào thực vật thu được tế bào không vỏ gọi là tế bào trần
1968 Nakata và Tanaka tạo được cây thuốc lá đơn bội bằng cách nuôi cấy bao phấn
Từ 1977 Melchers dung hợp tế bào trần giữa khoai tây và cà chua thành công tạo ra cây lai khoai tây-cà chua
Từ năm 1980 hàng loạt nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học đã được công bố