ĐỀ TÀI ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC

Hình 1: Coliform 1.1 Phương pháp màng lọc - Phương pháp màng lọc thường được dùng để định lượng vi sinh vật đặc biệt là vi sinh vật chỉ thị trong mẫu nước.. - Bản chất của phương pháp n

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM _

NHÓM 07

TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM

BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 11 NĂM 2022

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯƠNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC

Bộ môn Phân Tích Vi Sinh là môn học thú vị, vô cùng bổ ích và có tính thực tế cao.Đảm bảo cung cấp đủ kiến thức, gắn liền với nhu cầu thực tiễn của sinh viên Tuynhiên, do vốn kiến thức còn nhiều hạn chế và khả năng tiếp thu thực tế còn nhiều bỡngỡ Mặc dù em đã cố gắng hết sức nhưng chắc chắn bài tiểu luận khó có thể tránhkhỏi những thiếu sót và nhiều chỗ còn chưa chính xác, kính mong cô xem xét và góp ý

để bài tiểu luận của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 11 năm 2022

LỜI NÓI ĐẦU

Phân tích vi sinh vật học thực phẩm là một môn học quan trọng trong hệ đạihọc ngành công nghệ thực phẩm Môn học này giúp chúng ta có được những kiến thứchữu ích trong việc phân tích các chỉ tiêu vi sinh trong thực phẩm Hiên nay, việc phântích vi sinh thực phẩm của một số các sản phẩm thiết yếu như thịt-các sản phẩm từthịt, thủy sản, sữa,… đều đã được tiêu chuẩn hóa, nên những vấn đề được đề cập trongtiểu luận này chỉ là các vấn đề cơ bản nhất Những ai đang làm, hoặc sẽ làm trong lĩnhvực này phải thường xuyên cập nhật thông tin, tiêu chuẩn hóa kiến thức của mình, phùhợp với sự thay đổi của các tiêu chí chất lượng thực phẩm ngày càng cao của xã hội

Mục Lục

Chương 1: Tổng quan 6

1 Định nghĩa Coliform 6

1.1 Phương pháp màng lọc 6

Chương 2: Định lượng Coliform bằng phương pháp màng lọc 8

2 Môi trường 8

2.1.1 Quy định/TCVN/ISO 8

2.1.2 Quy trình phân tích 9

2.1.3 Mục đích của từng bước 9

2.1.4 Mục đích của môi trường trong từng bước 10

2.1.5 Màu của khuẩn lạc 11

2.1.6 Màu của phản ứng trên môi trường khẳng định 12

2.2 Hóa chất 13

2.2.1 Môi Trường Trytose lauryl 13

2.2.2 Môi trường M-endo ( Môi trường phát hiện Coliform) 14

2.2.3 Môi Trường CCA (Chromogenic Coliform Agar) 16

2.2.4 Môi Trường TSA ( Trypton Đậu nành) 18

2.3 Định lượng coliform bằng phương pháp màng lọc 18

Kết Luận 20

Củng cố kiến thức 21

TÀI LIỆU THAM KHẢO 26

- Phân bố: nước hoặc thực phẩm có nhiễm phân.

- Nhóm Coliforms gồm 4 giống đó là Escherichia với một loài duy nhất là

E coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacte (gồm 2 loài E aerobacter và E.cloacae)

Hình 1: Coliform

1.1 Phương pháp màng lọc

- Phương pháp màng lọc thường được dùng để định lượng vi sinh vật ( đặc biệt

là vi sinh vật chỉ thị) trong mẫu nước

- Bản chất của phương pháp này là tập trung số vi sinh vật ít ỏi trong một mẫu

có khối lượng khá lớn trên màng lọc khuẩn và định lượng chúng theo số khuẩn lạcđếm được sau khi đặt màng lọc lên một môi trường thạch có thành phần dinh dưỡngthích hợp

- Về thực chất đây là sự kết hợp của hai phương pháp đó là phương pháp mànglọc và phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa

Hình 2: Phiễu lọc

 Kích thước lỗ lọc 0,47μm hay 0,22μm

 Đường kính và hình dạng của màng lọc phụ thuộc vào đường kính của phễu lọc

 Đường kính thường là 45mm

Chương 2: Định lượng Coliform bằng phương pháp màng lọc

2 Môi trường

2.1.1 Quy định/TCVN/ISO

- TCVN 6187-1:2019,ISO 9308-1:2014: CHẤT LƯỢNG NƯỚC, PHÁT HIỆN

VÀ ĐẾM ESCHERICHIA COLI VÀ VI KHUẨN COLIFORM (Phần 1),PHƯƠNG PHÁP LỌC MÀNG ÁP DỤNG CHO NƯỚC CÓ SỐ LƯỢNG VIKHUẨN THẤP

- TCVN 6187-1:2019 thay thế cho TCVN 6187-1:2009

- TCVN 6187-1:2019 hoàn toàn tương đương với ISO 9308-1:2014

- TCVN 6187-1:2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc giabiên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩmđịnh, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố

2.1.2 Quy trình phân tích

Hình 2.1.1: Quy trình xác định coliform tổng số theo kỹ thuật màng lọc

2.1.3 Mục đích của từng bước

BƯỚC 1: Lựa chọn lượng mẫu

- Lượng mẫu lấy phân tích phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn dự kiến và mật độ vikhuẩn này trong mẫu chỉ bị ảnh hưởng bởi độ đục

- Lượng mẫu lý tưởng là lượng mẫu cho khoảng 50 khuẩn lạc coliform và khôngquá 200 khuẩn lạc của tất cả các vi khuẩn

- Lựa chọn 1 bước trực tiếp hoặc làm giàu 2 bước để phù hợp quá trình lọc

BƯỚC 4: Đếm khuẩn lạc có ánh kim

BƯỚC 5: Tính mật độ Coliform

- Báo cáo mật độ coliform tính theo số coliform (tổng số)/100 mL Tính số vikhuẩn coliform trên màng lọc có 20 khuẩn lạc coliform đến 80 khuẩn lạccoliform và không quá 200 khuẩn lạc của tất cả các vi khuẩn

- Mặc dù mức độ tin cậy của kỹ thuật màng lọc theo thống kê là lớn hơn mức độtin cậy của kỹ thuật MPN, nhưng số đếm trên màng lọc không phải là con sốđúng tuyệt đối Bảng 1 minh họa một số mức tin cậy 95 %

2.1.4 Mục đích của môi trường trong từng bước

Để chuẩn bị mẫu lọc và chủng cấy trên môi trường biệt lập, theo hướng dẫntrong ISO 8199 và TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) Tốt nhất là bắt đầu phép thử ngay saukhi lấy mẫu Nếu mẫu được giữ ở nhiệt độ môi trường (trong tối và không quá 25 °C)việc kiểm tra nên tiến hành ngay trong vòng 6 h kể từ khi lấy mẫu Trường hợp đặcbiệt mẫu có thể lưu giữ ở (5 ± 3) °C đến 24 h trước khi kiểm tra

Lọc 100 ml mẫu (hoặc thể tích lớn hơn, ví dụ 250 ml cho nước đóng chai mànglọc Đặt cái lọc lên trên môi trường thạch tương ứng, đảm bảo không có không khí ởphía dưới.

Sau khi lọc đặt màng trên đĩa aga Lactoza TTC và ủ ở (36 ± 2) °C trong (21 ± 3) h

Kéo dài thời gian ủ đến (44 ± 4) h có thể cho độ nhạy của phép thử cao hơn vànhất là với những đĩa không hiện rõ các khuẩn lạc điển hình sau (21 ± 3) h

Dùng thêm một màng lọc để ủ ở 44 °C có thể khắc phục được vấn đề pháttriển nền mẫu

Kiểm tra và đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng dương tính với lactoza, nhưngkhông quan tâm đến kích thước, hiện màu vàng trong môi trường ở dưới màng lọc.Đối với thử oxydaza và indol cần cấy tiếp tất cả các khuẩn lạc đặc trưng thu được,hoặc một số đại diện (ít nhất 10) trên thạch không chọn lọc và trên tryptophan tươngứng

Ủ aga không chọn lọc ở (36 ± 2) °C trong (21 ± 2) h và tiến hành thử oxydazanhư sau

– Nhỏ hai đến ba giọt thuốc thử oxydaza mới chuẩn bị lên giấy lọc

– Dùng que cấy thủy tinh, gỗ, vòng dây plastic hoặc platin (không dùng dâycromniken) bởi một phần khuẩn lạc vi khuẩn lên giấy lọc đã được chuẩn bị

– Màu xanh đậm xuất hiện trong 30 s là phản ứng dương tính Ủ ống nghiệmchứa L-tryptophan ở (44,0 ± 0,5) °C trong (21 ± 3) h và kiểm tra sự sinh ra indol bằngcách thêm 0,2 ml đến 0,3 ml thước thử Kovac Mẫu đỏ thẫm trên bề mặt môi trườngxác định sự sinh ra indol

Một số chủng Klebsiella oxytoca cho phản ứng indol dương tính Để khắc phụckết quả dương tính này, cần thử thêm β- glucuronidaza (E coli cho phản ứng dươngtính còn K oxytoca cho phản ứng âm tính)

Đếm các khuẩn lạc có phản ứng oxydaza âm tính là vi khuẩn coliform

Đếm các khuẩn lạc có phản ứng oxydaza âm tính và phản ứng indol dương tính

là E.coli

2.1.5 Màu của khuẩn lạc

 Khuẩn lạc coliform đặc trưng có màu hồng đến đỏ thẫm với bề mặt ánh kim Vùng ánh kim có kích thước thay đổi từ chấm nhỏ đến phủ toàn bộ bề mặt khuẩn lạc

2.1.6 Màu của phản ứng trên môi trường khẳng định

2.2 Hóa chất

2.2.1 Môi Trường Trytose lauryl

2.2.2 Môi trường M-endo ( Môi trường phát hiện Coliform) 2.2.3.

Môi Trường CCA (Chromogenic Coliform Agar)

2.2.4 Môi Trường TSA ( Trypton Đậu nành)

2.3 Định lượng coliform bằng phương pháp màng lọc

Bước 5 Tính toán kết quả

Z là tổng số các khuẩn lạc đếm trên đĩa hoặc trên màng từ các độ pha loãng

d1 ,d2 ,… ,di, hoặc từ các thể tích riêng biệt của các phần mẫu thử (mẫu hoặc dungdịch pha loãng)

V s là thể tích chuẩn được chọn để biểu thị nồng độ của vi sinh vật có trongmẫu

V totlà thể tích tổng tính được của các mẫu ban đầu bao gồm các đĩa đượcđếm Vtot hoặc là tổng các thể tích riêng biệt của các phần mẫu thử (mẫu hoặc dungdịch pha loãng) hoặc được tính theo Công thức (2):

V tot= (n1V1d1)+ (n2V2d2)+….+ (niVidi) (2)

Trong đó

Vtot là thể tích tổng được tính của các mẫu ban đầu bao gồm các đĩa được đếm;

n1,n2,…,ni là số lượng các đĩa được đếm đối với độ pha loãng d1,d2,….,di

V1, V2, …, Vi là thể tích mẫu thử được sử dụng với độ pha loãng d1,d2,….,di

d1,d2,….,di là độ pha loãng sử dụng đối với các thể tích thử V1, V2, …, Vi (d = 1đối với mẫu không pha loãng, d = 0,1 đối với dung dịch pha loãng mười lần v.v )

 Ví dụ biểu thị kết quả

Trong nước khoáng đóng chai nếu hai phần mẫu, mỗi phần 10 mL và 100mlđược lọc trên hai màng lọc và tương ứng có 11 và 82 khuẩn lạc coliform, báo cáo kếtquả là 84 khuẩn lạc coliform trên 100 mL nghĩa là:

Kết Luận

Phương pháp màng lọc dùng để định lượng vi sinh vật trong mẫu nước khi tiến hành các xét nghiệm môi trường, phương pháp này hiện nay rất phổ biến và được sử dụng rộng rãi Môi trường dùng để định lượng Coliform bằng phương pháp màng lọc

là môi trường M-endo và Trytose lauryl và cách nhận biết có khuẩn lạc coliform là khuẩn lạc đặc trưng có màu hồng đến đỏ thẫm với bề mặt ánh kim Vùng ánh kim có kích thước thay đổi từ chấm nhỏ đến phủ toàn bộ bề mặt khuẩn lạc

Câu 6: Lượng mẫu lý tưởng của phương pháp này là bao nhiêu?

A Khoảng 40 khuẩn lạc coliform và không quá 200 khuẩn lạc

B Khoảng 50 khuẩn lạc coliform và không quá 190 khuẩn lạc

C Khoảng 50 khuẩn lạc coliform và lớn hơn 200 khuẩn lạc

D khoảng 50 khuẩn lạc coliform và không quá 200 khuẩn lạc

Câu 7: Đâu là độ ẩm tối thiểu khi ủ màng lọc?

a.0,47 micromet hay 0,22 micomet

b 0,52 micromet hay 0,32 micomet

c 0,15 micromet hay 0,38 micomet

d 0,22 micromet hay 0,40 micomet

Câu 10: Ở kỹ thuật làm giàu hai bước, thời gian và nhiệt độ ủ là bao nhiêu?

a 3h đến 4h ở 35 độ C

b 1,5 đến 2h ở 35 độ C

c 1,5 đến 2h ở 50 độ C

d 3h đến 4h ở 50 độ C

Câu 11: Coliform phân bố nhiều ở đâu?

a.Thực phẩm được bảo quản không kỉ

b Nước nhiễm phân và nguyên liệu thực phẩm có nhiễm phân

c Các loại thực phẩm đóng hộp

d Thịt gia súc, gia cầm

Câu 12: Môi trường được sử dụng để định lượng Coliform bằng pp màng lọc là:

a Môi trường M-endo và Trytose lauryl

b Môi trường Dichloran-Rose Bengal Chloramphenicol

c Môi trường Saline peptone water

d Môi trường Plate Count Agar

Câu 13: Thành phần Natri Laury Sulfate trong môi trường M-endo có vai trò gì?

a Sử dụng như chất lợi mật và chất tẩy rửa

b Ức chế các vi khuẩn tạp nhiễm trong môi trường canh, tăng sinh chọn lọc và chuẩn đoán sơ bộ

c Kháng sinh, có tác dụng kìm khuẩn hoặc kháng khuẩn

d Khử chất thải oxi

Câu 14: Mục đích của môi trường M-endo là gì?

A Để định lượng Coliform trong nước bằng kỹ thuật lọc màng hai bước

B Sử dụng để phát hiện Coliform trong nước, nước thải, các sản phẩm sữa và các mẫu thực phẩm

C A,B đều sai

A Môi trường TBX và môi trường Trytose

B Môi trường TSI và môi trường M-endo

C Môi trường M-endo và môi trường Trytose lauryl

D Môi trường EMB và môi trường TBX

Câu 17: Phương pháp màng lọc có thể kết hợp được với các phương pháp phân tích nhanh vi sinh nào ?

A: Petriflim 3m và oxi không khí

B: Môi trường vi sinh pha sẵn Compact Dry và Petriflim 3m

C: Bộ lọc vi sinh và Petriflim 3m

D: Môi trường vi sinh pha sẵn Compact Dry

Câu 18: Coliform xâm nhiễm vào thực phẩm từ đâu?

A.Thực phẩm được bảo quản không kỉ

B Nước nhiễm phân và nguyên liệu thực phẩm có nhiễm phân

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 coliform-tong-so-ky-thuat-mang-loc

https://vanbanphapluat.co/tcvn-8775-2011-chat-luong-nuoc-xac-dinh-2 12019-chat-luong-nuoc-phat-hien-va-dem-escherichia-coli-va-vi-khuan-coliform-phan-1-phuong-phap-loc-mang-ap-dung-cho-nuoc-co-so-luong-vi-khuan-thap/