Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và tính chất phổ của một số hợp chất tách từ keo ong không ngòi đốt (homotrigona apicalis) ở bình định

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN NGUYỄN ĐÀO HỮU TOÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT PHỔ CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TÁCH TỪ KEO ONG KHÔNG NGÒI ĐỐT (Homotrigona Apicalis) Ở B[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN

NGUYỄN ĐÀO HỮU TOÀN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ

Người hướng dẫn: TS DIỆP THỊ LAN PHƯƠNG

TS NGUYỄN LÊ TUẤN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Diệp Thị Lan Phương và TS Nguyễn Lê Tuấn

Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này trung thực và chưa từng công bố dưới bất kỳ hình thức nào

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Học viên

Nguyễn Đào Hữu Toàn

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành tại Khoa Khoa học Tự nhiên - Trường Đại học Quy Nhơn Trong thời gian thực hiện luận văn, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo tâm huyết, nhiệt tình của thầy

cô, gia đình và bạn bè

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Diệp Thị Lan Phương, TS Nguyễn Lê Tuấn và NCS Hồ Văn Ban đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn tốt nghiêp

Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Khoa học và Công nghệ cấp

Bộ năm 2022, mã số B2022-DQN-08.

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Quy Nhơn đã quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện luận văn

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn, các anh chị em tập thể lớp Cao học Hóa K23 trường ĐH Quy Nhơn đã luôn hỗ trợ, động viên trong suốt thời gian qua Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên giúp đỡ em hoàn thành luận văn này

Mặc dù đã rất cố gắng trong thời gian thực hiện luận văn, nhưng vì còn hạn chế về kiến thức cũng như thời gian, kinh nghiệm nghiên cứu nên không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự thông cảm và những ý kiến đóng góp quý báu từ quý thầy cô để luận văn của em được hoàn thiện hơn

Em xin trân trọng cảm ơn!

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC HÌNH ii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu ong không ngòi đốt (Homotrigona Apicalis) 4

1.2 Giới thiệu keo ong không ngòi đốt 6

1.3 Công dụng của keo ong đối với con người 8

1.4 Giới thiệu các lớp chất có trong mẫu tự nhiên 8

1.4.1 Terpene và Terpenoid 8

1.4.2 Steroid 10

1.4.3 Alkaloid 11

1.4.4 Flavonoid 12

1.4.5 Hợp chất phenol 13

1.5 Một số công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài 14

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 17

2.1 Phương pháp nghiên cứu 17

2.1.1 Phương pháp chiết 17

2.1.2 Phương pháp hóa lý nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết EtOH của keo ong không ngòi đốt (Homotrigona Apicalis) 19

2.1.3 Phương pháp định tính các lớp chất có trong keo ong 20

2.1.4 Phương pháp sắc ký 21

2.1.5 Phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất phân lập 25

2.1.6 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định 27 2.2 Hóa chất và thiết bị 28

2.2.1 Hóa chất 28

2.2.2 Thiết bị 28

2.3 Thực nghiệm 29

2.3.1 Nguyên liệu 29

2.3.2 Tạo tro keo ong 29

2.3.3 Nghiên cứu phân lập hợp chất từ cao chiết EA 30

2.3.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết EtOH 31 2.3.5 Định tính các lớp chất 33

2.3.6 Đánh giá thành phần cao chiết EtOH và EA từ keo ong 34

2.3.7 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 37

3.2 Hàm lượng tro của keo ong Homotrigona Apicalis 37

3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết EtOH 38

3.3.1 Phương pháp ngâm chiết 38

3.3.2 Phương pháp chiết siêu âm 42

3.4 Định tính các lớp chất chính có trong keo ong 47

3.4.1 Phát hiện triterpenoid 47

3.4.2 Phát hiện alkaloid 48

3.4.3 Phát hiện hợp chất phenol 48

3.4.4 Phát hiện steroid 49

3.4.5 Phát hiện flavonoid 50

3.5 Đánh giá sơ bộ thành phần hóa học từ cao chiết EtOH và EA 50

3.6 Nghiên cứu phân lập hợp chất từ cao chiết EA 54

3.7 Xác định cấu trúc và tính chất phổ của chất rắn phân lập 55

3.7.1 Phổ 1H NMR của hợp chất thu được 56

3.7.2 Phổ 13 C NMR và HSQC của hợp chất thu được 62

3.7.3 Phổ HMBC của hợp chất thu được 64

3.7.4 Phổ MS của chất rắn thu đƣợc 673.8 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định của cao chiết EtOH 68KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

COSY Homonuclear Correlated

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể HMBC Heteronuclear Multiple Bond

HSQC Heteronuclear Single

Quantum Coherence

Phổ tương tác trực tiếp H-C

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Ong không ngòi đốt Homotrigona Apicalis 5

Hình 1.2 Hình dạng bên ngoài của ong không ngòi đốt Homotrigona Apicalis 5

Hình 1.3 Quá trình hình thành keo ong 7

Hình 1.4 Keo ong (Stingless bee propolis) (a keo trong tổ; b keo sau thu hoạch) 7

Hình 1.5 Một số chế phẩm trên thị trường từ keo ong 8

Hình 1.6 Một số terpene 9

Hình 1.7 Một số terpenoid 9

Hình 1.8 Bộ khung của steroid 10

Hình 1.9 Một số alkaloid 11

Hình 1.10 Bộ khung của flavonoid 12

Hình 2.1 Mẫu sắc ký bản mỏng 22

Hình 2.2 Mẫu keo ong Homotrigona Apicalis 29

Hình 2.3 Đốt tạo tro keo ong Homotrigona Apicalis 29

Hình 2.4 Sắc ký cột cao EA của keo ong 30

Hình 2.5 Các chất ở phân đoạn 2 được tẩm silica gel 30

Hình 2.6 Quy trình tách chiết hợp chất từ keo ong Homotrigona Apicalis 31

Hình 2.7 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột keo ong với thể tích EtOH 32

Hình 2.8 Thiết bị chiết siêu âm dùng trong thí nghiệm 33

Hình 3.1 Bột keo ong Homotrigona Apicalis 37

Hình 3.2 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ bột keo ong (g) : thể tích EtOH (mL) đến hàm lượng cao chiết EtOH trong ngâm chiết 40

Hình 3.3 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hàm lượng cao chiết EtOH 41

Hình 3.4 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ bột keo ong (g) : thể tích

EtOH (mL) đến hàm lượng cao chiết EtOH trong chiết siêu âm 43

Hình 3.5 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng cao chiết EtOH trong chiết siêu âm 45

Hình 3.6 Kết quả định tính triterpenoid bằng thuốc thử Liebermann - Burchard 47

Hình 3.7 Kết quả định tính alkaloid bằng thuốc thử Wagner 48

Hình 3.8 Kết quả định tính các hợp chất phenol bằng thuốc thử FeCl3 49

Hình 3.9 Kết quả định tính Steroid bằng phản ứng Salkowski 49

Hình 3.10 Kết quả định tính các hợp chất Flavonoid 50

Hình 3.11 Dịch chiết EtOH của keo ong 51

Hình 3.12 Cao chiết EtOH của keo ong 51

Hình 3.13 Chiết keo ong với dung môi EA 51

Hình 3.14 Cao chiết EA của keo ong 52

Hình 3.15 TLC của cao chiết EtOH hiện màu với Ce(SO4)2 53

Hình 3.16 TLC của cao chiết EA hiện màu với Ce(SO4)2 53

Hình 3.17 TLC của phân đoạn 2 cao chiết EA 55

Hình 3.18 TLC của chất rắn sạch 55

Hình 3.19 Quy ước đánh số trong công thức của Spathulenol và công thức 3D 56

Hình 3.20 Phổ 1H NMR của chất phân lập trong CDCl3 57

Hình 3.21 Phổ 1H NMR của chất phân lập kéo giãn đoạn 2,45 – 1,75 ppm 58 Hình 3.22 Phổ 1H NMR của chất phân lập kéo giãn đoạn 1,8 – 0,5 ppm 59

Hình 3.23 Phổ COSY của chất phân lập 60

Hình 3.24 Phổ 13C NMR của chất rắn phân lập trong CDCl3 62

Hình 3.25 Phổ HSQC của chất phân lập 63

Hình 3.26 Phổ HMBC của chất phân lập trong CDCl3 65

Hình 3.27 Phổ HMBC của chất phân lập kéo giãn 2,4-0,6 ppm 66

Hình 3.28 Phổ MS của chất phân lập 67

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học và tên thông thường một số hợp chất phenol loại

C6C1, C6C3 14

Bảng 3.1 Hàm lượng tro của keo ong dú Lisotrigona furva 37

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa khối lượng bột keo ong và thể tích EtOH đến hàm lượng cao chiết trong ngâm chiết 39

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hàm lượng cao chiết 41

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ khối lượng bột keo ong và thể tích dung môi EtOH đến hàm lượng cao chiết trong chiết siêu âm 43

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng cao chiết 44

Bảng 3.6 So sánh các yếu tố ảnh hưởng của cả 2 phương pháp 46

Bảng 3.7 Kết quả định tính các lớp chất có mặt trong keo ong 50

Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H NMR của chất thu được và số liệu tham khảo 61

Bảng 3.9 Số liệu phổ 13C NMR của chất phân lập và số liệu tham khảo 64

Bảng 3.10 Kết quả phổ MS của chất phân lập và công thức của mảnh ion 67

Bảng 3.11 Kết quả kháng vi sinh vật và nấm của cao chiết EtOH 69

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong những năm gần đây, keo ong ngày càng thu hút nhiều nghiên cứu bởi những tác dụng có lợi đến sức khỏe con người như được sử dụng trong thực phẩm, đồ uống, chất bổ sung dinh dưỡng, mỹ phẩm…1,2 Keo ong là hỗn hợp nhựa tự nhiên được tạo ra do những con ong thu thập nhựa từ các kẽ hở của vỏ, chồi của thực vật và dịch chiết ra từ tuyến nước bọt của ong, được sử dụng để hàn kín tổ giúp bảo vệ sự phát triển của ấu trùng và bản thân khỏi sự tấn công của tác nhân gây bệnh 1 Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng keo ong có nhiều chức năng sinh học khác nhau, chẳng hạn như chống vi khuẩn

3,4

, chống ung thư 5,6, các hoạt động chống oxy hóa và chống viêm 7,8

Thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt là đa dạng, khác nhau

do phụ thuộc vào loài ong, khu vực địa lý và hệ thực vật quanh đàn ong Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loại keo ong không ngòi đốt ở Việt Nam

Ở Bình Định, các cơ sở nuôi ong không ngòi đốt còn tự phát theo kinh nghiệm dân gian, thậm chí keo ong còn bỏ phí không sử dụng, đã không phát huy hết công dụng và lãng phí nguồn tài nguyên thiên nhiên giá trị này Vì vậy, rất cần thiết để nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của keo ong không ngòi đốt ở Bình Định nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác, sử dụng một cách hiệu quả, tạo các chế phẩm có giá trị cao từ nguồn keo ong không ngòi đốt còn bỏ ngỏ này

Vì vậy, nhằm góp phần vào việc nghiên cứu xác định thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt ở tỉnh Bình Định nói riêng và ở Việt Nam nói

chung, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và tính chất phổ của một số hợp chất tách từ keo ong không ngòi đốt

(Homotrigona Apicalis) ở Bình Định”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập hợp chất, xác định cấu trúc và tính chất phổ của một số hợp

chất tách từ keo ong không ngòi đốt (Homotrigona Apicalis)

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Một số hợp chất được phân lập từ keo ong

không ngòi đốt (Homotrigona Apicalis) ở Hoài Nhơn, Bình Định

- Phạm vi nghiên cứu: Cấu trúc và tính chất phổ của một số hợp chất

được phân lập từ keo ong không ngòi đốt (Homotrigona Apicalis)

4 Nội dung nghiên cứu

- Tạo tro keo ong không ngòi đốt (Homotrigona Apicalis) ở Hoài Nhơn,

Bình Định

- Tạo cặn chiết tổng EtOH của keo ong không ngòi đốt

- Định tính các lớp chất có trong keo ong không ngòi đốt

- Tạo cặn chiết phân đoạn hexane, EtOAc của keo ong không ngòi đốt

- Phân lập một số hợp chất từ cặn chiết EtOAc của keo ong không ngòi đốt

- Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được từ mẫu keo ong

- Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định của cao chiết

tổng EtOH thu được

5 Phương pháp nghiên cứu

- Tổng hợp và thu thập tài liệu liên quan đến đề tài

- Phương pháp phân lập: Chiết gián đoạn và chiết liên tục, chiết phân

đoạn và phân lập một số hợp chất từ keo ong không ngòi đốt (Homotrigona

Apicalis) ở Hoài Nhơn, Bình Định

- Phương pháp hóa lý nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu

cao chiết EtOH từ keo ong không ngòi đốt (Homotrigona Apicalis)

- Các phương pháp sắc ký kết hợp như sắc ký cột, sắc ký bản mỏng để tinh chế hợp chất

- Các phương pháp vật lý hiện đại như: Phương pháp phổ MS, NMR 1 chiều (1H NMR, 13C NMR) và 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC) để xác định cấu trúc chất phân lập

- Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định của cao chiết EtOH

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Việc định tính các lớp chất nhằm tìm hiểu sơ bộ các lớp chất có trong

keo ong không ngòi đốt Homotrigona Apicalis, từ đó định hướng việc chiết

tách phân lập hợp chất sau này

Việc phân lập và xác định được cấu trúc hợp chất là một đóng góp mới

về thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt, tạo cơ sở cho các nghiên cứu sau này

Bên cạnh, việc phân tích cấu trúc phổ của hợp chất và việc định tính các lớp chất có thể giúp cho việc giảng dạy, học tập và thực hành môn Hóa học các hợp chất thiên nhiên, môn Phương pháp phổ cho Sinh viên và Học viên Cao học ngành Hóa học Ngoài ra, thông qua khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định của cao EtOH có thể định hướng tạo các chế phẩm có

giá trị cao từ nguồn keo ong không ngòi đốt: nước súc miệng, xịt họng, kem

bôi vết thương Vì vậy, đề tài có ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu ong không ngòi đốt (Homotrigona Apicalis)

Ong không ngòi đốt hay còn gọi Ong Dú có tên tiếng Anh là Stingless

bee, ong không ngoài đốt thuộc ngành Insecta, bộ Hymenoptera, họ Apidae,

tông Meliponini, chi Homotrigona, loài Homotrigona Apicalis 9

Ong Dú là những con côn trùng có tổ chức xã hội lớn nhất trên trái đất,

với hơn 600 loài trên thế giới 10, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, tập trung ở Trung và Nam Mỹ, Châu Phi, Úc và Đông Nam Á, trong đó hơn 300 loài ở Brazil 9 Đặc biệt, ở Việt Nam có khoảng 14-15 loài

đã tìm thấy được phân chia thuộc hai giống Lisotrigona và Trigona 11,12

Riêng ở Bình Định đã phát hiện có 7-8 loài ong không ngòi đốt khác nhau và được nuôi tại các huyện Hoài Ân, Hoài Nhơn, An Lão với số lượng khá lớn

Chi Trigona bao gồm khoảng 120 loài trên toàn thế giới, được xếp vào 10 phân chi, trong đó Homotrigona, Lepidotrigona và Heterotrigona là các loài

phổ biến của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Á 13,14

Hình thái học bên ngoài của ong không ngòi đốt có ba bộ phận chính của

cơ thể: đầu, ngực và bụng Các bộ phận quan trọng có trên đầu gồm râu, mắt đơn, mắt kép và răng hàm dưới Hai cặp cánh và ba cặp chân được gắn vào ngực Chân sau của hầu hết các ong thợ có một túi phấn để thu thập và vận chuyển phấn hoa Phần bụng không có khả năng chích đốt Đặc biệt, hầu hết các bộ phận của cơ thể bên ngoài của ong không đốt là phủ đầy lông 9

Hình dạng bên ngoài của ong thợ Homotrigona Apicalis được mô tả như sau: màu cơ thể chủ yếu là màu đen Phần ngực có màu đen, được bao phủ

hoàn toàn bởi lớp lông đen ở mép trước Có sáu đốt bụng màu nâu đen Màu lông của cánh trước không đồng đều, 1/2 màu nâu đen trên nền và 1/2 nửa trong suốt trên đỉnh Bờ sau của xương chày sau đơn giản (không phân nhánh), đáy sau có hình elip 15

(Hình 1.1, Hình 1.2)

Hình 1.1 Ong không ngòi đốt Homotrigona Apicalis

Hình 1.2 Hình dạng bên ngoài của ong không ngòi đốt Homotrigona Apicalis

(A Chiều dài cơ thể B Chiều rộng hai râu C Chiều rộng phần đầu

D Chiều rộng khoang mắt E Chiều rộng xương chày sau, F Chiều rộng của đáy sau)

Tất cả các ong không ngòi đốt cũng như ong mật có tổ chức xã hội và sống theo bầy đàn, bao gồm một ong chúa, vài trăm ong đực và vài nghìn ong thợ Ong chúa là mẹ của tất cả các thành viên của một bầy ong và điều khiển

sự tổ chức và các hoạt động của tổ ong Ong thợ cũng là thành phần ong cái của một đàn ong ngoài ong chúa và phát triển từ ấu trùng Ong trưởng thành lớn lên là những ong thợ và thực hiện hầu hết các hoạt động của tổ như tìm kiếm thức ăn, dọn dẹp tổ, bảo vệ và cho ấu trùng ăn Ong đực có vai trò rất quan trọng trong việc sinh sản của đàn ong bằng cách giao phối với ong chúa

từ đàn ong khác.

Ong không ngòi đốt làm tổ sinh sống trong các lỗ của cành cây, các khúc

gỗ chết, các vết nứt ở tường nhà Chúng sử dụng các nguyên liệu khác nhau

để làm tổ Ong thợ sẽ sử dụng gôm, sáp, nhựa, cát và bùn để xây dựng tổ Có một số loài ong không ngòi đốt, dùng cát và bùn thêm vào keo ong và sáp để xây dựng tổ, tổ lớn nhất có kích cỡ khoảng 30-40 cm 9

So với các giống ong khác như ong ruồi, ong khoái, ong mật,… ong không ngòi đốt có kích cỡ nhỏ hơn, chỉ bằng 1/2 đến 2/3, chúng có tính hiền, không chích đốt như nhiều loài ong khác, mà chỉ cắn khi bị phá tổ

Đối với ong không ngòi đốt, nguồn thực phẩm dồi dào đã được thiên nhiên ban tặng, chúng có thể hoạt động trong vòng bán kính 5-7 km, Vì vậy người nuôi không cần can thiệp vào, bởi bản thân loài ong này không ăn đường mà lấy phấn các loài hoa, kể cả hoa cỏ dại nhỏ nhất Tuy nhiên, ong không ngòi đốt chỉ thích hợp với thời tiết có nhiệt độ từ 28 – 34 o

C Nếu thời tiết quá nóng, nắng hoặc lạnh, mưa bất thường dễ làm cho đàn ong nhiễm bệnh và chết hàng loạt Ong cũng rất mẫn cảm với mùi hôi của phân gia súc, gia cầm, nước thải, thuốc bảo vệ thực vật và thậm chí cả tiếng ồn

1.2 Giới thiệu keo ong không ngòi đốt

Để bảo vệ sự phát triển của ấu trùng, trứng và sự tấn công của virus, các

kẻ xâm hại như rắn, thằn lằn… các mối đe dọa về thời tiết như gió và mưa, các con ong thợ tạo ra một chất kết dính hàn kín tổ gọi là keo ong, keo ong là

sự kết hợp từ nhựa cây với chất tiết ra ở tuyến nước bọt của ong

Keo ong có đặc tính ưa béo, chất liệu cứng và giòn trong điều kiện lạnh

Nó trở nên mềm mại, linh hoạt, nhão và rất dính khi tiếp xúc với nhiệt độ 45˚C 16

25- Hầu hết keo ong bao gồm 50% nhựa (được tạo thành từ flavonoid và các phenolic acid liên quan), 30% sáp, 10% tinh dầu, 5% phấn hoa và 5% các hợp chất hữu cơ khác 17 Keo ong có thành phần hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng, nó phụ thuộc vào vùng địa lý, nguồn thực vật và tùy vào loài ong18 Các thành phần hóa học của keo ong phụ thuộc vào nhựa từ thảm thực

vật trong khu vực kiếm ăn của ong và các loại cây mà ong chọn để thu thập

Do đó, các loại keo ong đã đƣợc tìm thấy có tính đặc trƣng theo mùa, địa lý

19

Ví dụ, Keo ong Apis mellifera (A mellifera) đƣợc thu ở vùng ôn đới chứa

nhiều loại flavonoid và ester, phenolic acid, đặc biệt là pinocembrin, pinobanksin, galangin, chrysin và caffeic acid, phenyl ester, đóng vai trò nhƣ các hợp chất hoạt tính sinh học chính 20,21 Tuy nhiên, thành phần hóa học của

Keo ong A mellifera đƣợc phát hiện là khá phức tạp với hơn 300 các hợp chất

đã đƣợc xác định, chẳng hạn nhƣ polyphenol, phenolic aldehyde, sesquiterpene quinone, coumarin, acid amin, steroid và các hợp chất vô cơ, và thay đổi tùy thuộc vào địa điểm thu thập, thời gian và nguồn thực vật 22

Hình 1.3 Quá trình hình thành keo ong

Hình 1.4 Keo ong (Stingless bee propolis) (a keo trong tổ; b keo sau thu hoạch)

1.3 Công dụng của keo ong đối với con người

Keo ong của loài ong không ngòi đốt được sử dụng như một loại thuốc

cổ truyền để chữa một số bệnh liên quan đến hệ tiêu hóa và hô hấp, khả năng sinh sản của phụ nữ, rối loạn da, thị giác, bệnh tim, chống thiếu máu cục bộ 23

và nhiều bệnh khác 24,25 Về mặt khoa học, keo ong từ ong không đốt có một

số chức năng sinh học như ức chế men α-glucosidase 26, hoạt động chống tăng sinh trong tế bào ung thư ở người 27, độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư đầu và cổ 28

, kháng khuẩn, chống viêm, độc tế bào 38, và các hoạt động chống oxy hóa 29,30 Trên thị trường Việt nam đã có nhiều sản phẩm với thành phần keo ong như siro, viên nang, thuốc xịt họng, nước súc miệng từ Brazil,

Úc, Nhật Bản (Hình 1.5)

Hình 1.5 Một số chế phẩm trên thị trường từ keo ong

1.4 Giới thiệu các lớp chất có trong mẫu tự nhiên

Các nhóm chất thường gặp trong thiên nhiên có trong thực vật, động vật,

vi sinh vật như: lipid, acid amin, protein, carbohydrate, terpene, terpenoid, steroid, alkaloid, flavonoid, hợp chất phenol, tanin, 31,32

1.4.1 Terpene và Terpenoid

Terpen là tên gọi của một nhóm hydrocarbon, đa số không no thường có công thức chung (C5H8)n (n  2), hay gặp trong giới thực vật, nhất là trong các tinh dầu thảo mộc như tinh dầu thông, cam, sả, hoa hồng,

Terpene có cấu trúc hóa học dựa trên cơ sở các phân tử isoprene liên kết lại với nhau

* Các thuốc thử đặc trưng để định tính terpenoid là các phản ứng như:

Liebermann - Burchard, Rosenhelm, Rosenthaler, Nolier

* Cách chiết tách terpenoid ra khỏi thực vật: Hầu hết các terpenoid là

những hợp chất ít phân cực, có tính thân dầu nên tan tốt trong ether dầu hỏa, hexane, diethyl ether, chloroform

Không có phương pháp đặc trưng nào chỉ để tách riêng terpenoid ra khỏi bột cây Sử dụng các dung môi hữu cơ nêu trên để tách chúng ra khỏi cây và tiếp theo sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột để tách riêng các hợp chất

Hình 1.8 Bộ khung của steroid

Steroid đƣợc tách chiết từ tủy sống và mật của động vật có sừng, từ dịch

thuỷ phân kiềm của sự lên men, từ dầu thực vật, mỡ động vật, từ chất thải của

công nghiệp giấy, từ loài thực vật khác nhau hoặc tổng hợp từ các nguyên liệu

không phải nguồn gốc thiên nhiên

* Các thuốc thử đặc trưng để định tính steroid là các phản ứng nhƣ:

Liebermann - Burchard, Rosenthaler, Salkowski, Komarowsky, Nolier

* Cách chiết tách ra steroid khỏi thực vật: Hầu hết các steroid là

hydrocarbon có mang một số nhóm chức hydroxy (-OH), acetyl (-OAc), ether

(-O-), carbonyl (C=O, ester hoặc carboxylic acid), nối đôi (-C=C-) nên nói

chung chúng là những hợp chất có tính ít phân cực nên tan tốt trong ether dầu

hỏa, hexane, diethyl ether, chloroform ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với các phân tử đường để tạo thành các glycoside

Không có phương pháp đặc trưng nào chỉ để tách riêng steroid ra khỏi bột cây Sử dụng các dung môi hữu cơ nêu trên để tách chúng ra khỏi cây và tiếp theo sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột để tách riêng các hợp chất

1.4.3 Alkaloid

Alkaloid nhóm hợp chất hữu cơ thiên nhiên chứa nitrogen, thường có nguồn gốc thực vật Có nhiều trong các cây họ Cà, họ Thuốc phiện, vv Alkaloid là những kiềm yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạng muối của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin; đa số alkaloid là chất rắn, không màu, một số ít ở thể lỏng, tan trong ethanol, không tan hoặc ít tan trong nước Việc chiết xuất alkaloid cần phải tán nhỏ dược liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những dung dịch kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh

Alkaloid gồm có alkaloid không chứa dị vòng nitrogen và alkaloid có chứa dị vòng nitrogen (pyrrolidine, pyridine, pyperidine, quinoline, isoquinoline )

Hình 1.9 Một số alkaloid

* Các thuốc thử thông dụng để định tính alkaloid là: Thuốc thử Mayer,

Dragendorff, Wagner Ngoài ra, có thể dùng thuốc thử khác để phát hiện các alkaloid đặc thù như thuốc thử Iodoplatinate dùng để phát hiện alkaloid có nitrogen trong vòng dị hoàn)

* Cách chiết tách alkaloid ra khỏi thực vật: Có 2 phương pháp để chiết

tách cũng như sơ chế các alkaloid ra khỏi bột cây khô

- Chiết tách alkaloid bằng dung môi hữu cơ: Bột cây được tẩm với dung dịch kiềm để chuyển đổi alkaoid ở dạng muối trở thành dạng base tự do, kế tiếp, bột cây tẩm này được chiết với một trong các dung môi hữu cơ như: Benzene, diethyl ether, chloroform, ethyl acetate Và tiếp theo sử dụng các

kỹ thuật sắc ký cột, kết tinh để tách riêng các hợp chất

- Chiết tách alkaoid bằng dung dịch nước acid: Bột cây được chiết với methanol, đây là dung môi rất tốt có thể chiết hết tất cả các alkaloid ở dạng base tự do, alkaloid ở dạng muối, dạng glycoside - là những alkaloid phân cực mạnh, sau đó hòa với dung dịch acid loãng để tạo alkaloid dạng muối acetate, tan trong nước, chiết với một trong các dung môi hữu cơ chloroform, diethyl ether nhằm loại bỏ những hợp chất hữu cơ khác và tiếp theo sử dụng các phương pháp tinh chế (kết tinh trong dung môi) để tách được hợp chất

1.4.4 Flavonoid

Flavonoid là nhóm hợp chất phenolic đa vòng, được tìm thấy rộng rãi trong thực vật Phần lớn các flavonoid có màu vàng, một số có màu xanh, tím,

đỏ và cũng có một số flavonoid lại không có màu

Flavonoid có cấu tạo cơ bản là diphenylpropane, nghĩa là 2 vòng benzene nối với nhau qua một dây có 3 nguyên tử carbon, nên thường được gọi là C6-C3-C6 Một số trường hợp flavonoid có mạch 3 nguyên tử carbon hở,

đa số mạch 3 nguyên tử carbon đóng vòng tạo nên dị vòng chứa oxy

Hình 1.10 Bộ khung của flavonoid

* Các thuốc thử để định tính sự hiện diện của flavonoid: Có thể dùng

thuốc thử khác nhau để phát hiện các flavonoid như dùng H2SO4 đậm đặc, dùng NaOH/ethanol 1%, dùng AlCl3/ethanol 1%, dùng acetate chì pha bão hòa với nước, dùng phản ứng Cyanidin của Wilstatter

* Cách chiết tách flavonoid ra khỏi thực vật: Không có một phương

pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan Các flavonoid glycoside thường dễ tan trong các dung môi phân cực Các flavonoid aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực Các dẫn xuất của flavon, flavonol có nhóm -OH tự do ở vị trí C-7 tan được trong dung dịch kiềm loãng Dựa trên cơ sở này có thể chọn dung môi chiết thích hợp

Phenylpropanoid cũng là thành phần của tinh dầu Số lượng tinh dầu loại này trong tự nhiên không nhiều và phổ biến bằng tinh dầu terpenoid nhưng chúng có giá trị kinh tế cao và có nhiều ứng dụng cho cuộc sống

* Các thuốc thử đặc trưng để định tính sự hiện diện của hợp chất

phenol: Để phát hiện các loại hợp chất phenol có thể sử dụng những thuốc thử

chung và có những thuốc thử riêng cho từng loại như: Dung dịch nitroaniline, thuốc thử FeCl3, thuốc thử Millon… hoặc dùng vaniline, HCl để phát hiện catechol, dùng magnesium acetate để phát hiện ra quinone, dùng gelatine để phát hiện ra tannin…

4-Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học và tên thông thường một số hợp chất phenol loại C 6 C 1 ,

C 6 C 3

R 1 R 2 R 3

Hợp chất phenol C 6 C 3 Hợp chất phenol C 6 C 1

H OH H p-coumaric acid p-hydroxybenzoic acid

OCH3 OH H ferulic acid vanillic acid

OCH3 OH OCH3 sinapic acid syrigic acid

OH OH OH trihydrocinamic acid galic acid

* Các phương pháp chiết tách hợp chất phenol ra khỏi cây: Hợp chất phenol có tính phân cực từ trung bình đến mạnh, tùy theo hợp chất có mang ít hoặc nhiều nhóm chức hydroxy, carboxyl… Vì vậy, muốn chiết tách các hợp chất này ra khỏi bột cây, cần sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần như benzene, diethyl ether, chloroform, ethyl acetate, ethanol…

1.5 Một số công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu và công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loại keo ong không ngòi đốt Các công trình nghiên cứu về các loại keo ong không ngòi đốt có thể kể đến như sau:

* Ngoài nước

Năm 2011, Zhu và cộng sự báo cáo rằng keo ong của Trung Quốc và Brazil đã ngăn ngừa đáng kể sự tiến triển của bệnh tiểu đường do Streptozotocin gây ra ở chuột và giảm stress oxy hóa ở chuột mắc bệnh tiểu đường 33

Trong một nghiên cứu, các nhà khoa học Nhật Bản đã phân lập và xác định năm triterpene loại cycloartane là các hợp chất chính từ ong không đốt

Tetragonula sapiens keo ong được thu thập từ Đông Nam Sulawesi,

Indonesia, nơi có nguồn gốc thực vật của nó Mangifera indica 34

Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng các triterpene có một số hoạt tính sinh học, có thể chất ức chế α-glucosidase: corosolic acid, maslinic acid 35, betulinic acid, ursolic acid và oleanolic acid 36,37 Sự kết hợp của chất ức chế α-glucosidase

và chất chống oxy hóa gần đây đã được chứng minh là có hiệu quả trong điều trị bệnh đái tháo đường và ngăn ngừa sự phát triển của nó 38,39

Gần đây, một số nhóm hợp chất như xanthone, alkaloid lần đầu tiên được phát hiện từ keo ong không ngòi đốt và chưa từng được tìm thấy ở keo

ong mật Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào keo ong của các loài thuộc

khu vực Nam Mỹ như Brazil và một số loài ong thuộc các nước Đông Nam

Á, như Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philipine và Australia Đặc biệt, năm

2022, nhóm nghiên cứu keo ong ở Úc đã nghiên cứu keo ong ở bang Queensland, kết quả cho thấy: đã tách được 9 hợp chất từ loài keo ong ở Queensland, trong đó có 6 flavonoid có khả năng ức chế α-Glucosidase, α-Amylase và Lipase giúp ngăn ngừa bệnh tiểu đường type 2 và béo phì Ngoài

ra, nhóm nghiên cứu cũng đã đánh giá đa dạng hóa học của 158 mẫu keo ong

mật Apis mellifera ở Úc, cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của các loại keo

ong này mạnh hơn so với keo ong xanh và keo ong đỏ của Brazil và có thể xác định 16 loại keo ong Úc có thể được coi là keo ong cao cấp do hàm lượng phenolic tổng số cao của chúng 40,41

* Trong nước

Năm 2004, Tống Xuân Chinh và cộng sự có công bố nghiên cứu về một

số loài thuộc giống Lisotrigona ở các tỉnh phía Bắc, chủ yếu là 3 loài ong không ngòi đốt như Lisotrigona carpenteri Engel, Trigona (Tetragonula)

laeviceps Smith và Trigona (Lepidotrigona) ventralis Smith Các tác giả lần

đầu tiên mô tả tả về tổ của các loài ong này 42

Năm 2017, các nhà khoa học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được 16 hợp chất triterpene trong đó có 5 hợp chất mới khung cycloartane, cùng với 10 hợp chất đã biết khung cycloartane

từ dịch chiết của keo ong Trigona minor Trong số các hợp chất được phân

lập thì 23-hydroxyisomangiferolic acid và 27-hydroxyisomangiferolic acid có hoạt tính tốt chống lại dòng tế bào ung thư tuyến tụy ở người PANC-1 với nồng độ PC50 là 4,3 và 3,7 μM 43

Tiếp đó năm 2018, nhóm nghiên cứu báo cáo 3 hợp chất phân lập từ cặn chiết CHCl3 gồm hợp chất mới alkylphenol và hai hợp chất đã biết Hợp chất mới alkylphenol thể hiện hoạt tính khá tốt trên dòng tế bào ung thư tuyến tụy

ở người PANC-1 với nồng độ PC50 là 2,4 μM 44

Gần đây, từ dịch chiết

Ethanol (EtOH) của keo ong Trigona minor, nhóm nghiên cứu đã phân lập

được 4 hợp chất lignan 45

Đặc biệt, gần đây nhóm nghiên cứu của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Đại học Quy Nhơn kết hợp với Giáo sư Bankova và Giáo sư Popova, Viện Hàn lâm Khoa học Bulgaria đã tiến hành nghiên cứu

keo ong không ngòi đốt Lisotrigona cacciae, Lisotrigona furva 46,47

ở Việt

Nam, cho thấy thành phần hóa học của 2 loài này khác với loài Trigona minor

của nhóm nghiên cứu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh và cho nhiều kết quả hoạt tính sinh học quý giá

Các kết quả nghiên cứu bước đầu về các loại keo ong ở Việt Nam cho thấy đây là hướng nghiên cứu mới có triển vọng, có thể phát triển để ứng dụng keo ong không ngòi đốt vào các sản phẩm chăm sóc sức khỏe người dân

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Phương pháp chiết

Chiết là phương pháp tách chất từ hỗn hợp bằng dung môi thích hợp Chiết trong hệ chất lỏng - lỏng: Nguyên tắc căn bản của sự chiết lỏng - lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng không hòa tan vào nhau Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, được biểu diễn bằng hằng số phân bố K

a b b

C

K =C

Ca là nồng độ chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng

Cb là nồng độ chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng

Mục đích của sự chiết bằng dung môi là để sơ bộ tinh chế hóa một hợp chất nào đó Nếu một chất tan X hoặc những chất tương đồng với chất X này

có hằng số phân bố lớn còn các tạp chất bản cũng như các chất khác có cấu trúc không tương đồng với X lại có hằng số phân bố nhỏ thì có thể áp dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng để cô lập chất X và các chất tương đồng với nó

2.1.1.1 Phương pháp chiết gián đoạn (ngâm chiết)

Ngâm chiết là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật Sản phẩm thu được của quá trình ngâm chiết là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi Dung dịch này được gọi là dịch chiết Có ba quá trình quan trọng đồng thời cùng xảy ra trong ngâm chiết là:

- Sự hòa tan của chất tan vào dung môi;

- Sự khuếch tán của chất tan trong dung môi;

- Sự dịch chuyển các phân tử chất tan qua vách tế bào keo ong

Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, thời gian, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột keo ong ) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình ngâm chiết Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại hoạt chất mà chọn cho thích hợp

Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycoside, các muối của alkaloid, các hợp chất polyphenol ) thì phải sử dụng các dung môi phân cực

Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, triterpene và steroid tự do ) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác nhau là dung môi hay được dùng Cồn có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ tiền và dễ kiếm, ngoài ra còn có thể dùng các dung môi khác như methanol, acetone, dichloromethane, hexane

2.1.1.2 Phương pháp chiết siêu âm

Siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phần tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (16 - 20 kHz) Ngoài ra, sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc hay sóng nén, nghĩa là trong trường siêu âm các phần tử dao động theo phương cùng với phương truyền của sóng

Các thông số của quá trình siêu âm:

Tần số là số dao động phần tử thực hiện được trong 1 giây, (Hz)

Biên độ biểu thị mức độ thay đổi áp suất (so với áp suất cân bằng của môi trường) trong quá trình dao động

Cường độ là năng lượng mà sóng siêu âm truyền trong một đơn vị thời gian qua một đơn vị diện tích đặt vuông góc với phương truyền âm Công thức tính:

P I S



Trong đó: P là công suất của nguồn âm (W);

S là diện tích miền truyền âm (m2)

Mức cường độ âm là đại lượng được tính bởi công thức:

0lg( I )

L

I



Trong đó: I là cường độ âm tại điểm cần tính

I0 là cường độ âm chuẩn (âm ứng với tần số f = 1000 Hz) có giá trị là: 10 - 12 W/m2

+ Thiết bị sóng siêu âm

Thiết bị phát sóng siêu âm cũng phải gồm có 3 phần tối cần thiết sau:

Bộ phận chuyển phần lớn điện năng thành dòng điện xoay chiều tần số cao để vận hành bộ phận biến đổi

Bộ phận biến đổi chuyển dòng điện xoay chiều tần số cao thành những dao động Phần lớn thiết bị phát sóng siêu âm ngày nay sử dụng kỹ thuật áp điện Hình dạng và kích thước của bộ phận này phụ thuộc vào tần số làm việc,

bộ phận 20 kHz có chiều dài gấp đôi bộ phận 40 kHz Năng lượng qua bộ biến đổi sẽ chuyển ngược lại thành bình phương tần số dao động, vì vậy thiết

bị năng lượng cao tần số thấp được chú trọng Bộ phận biến đổi nối với hệ thống truyền sóng thông qua một thiết bị phụ

Hệ thống truyền sóng sẽ truyền những dao động vào trong lòng chất lỏng Trong thiết bị phát sóng siêu âm dạng bể, bộ phận biến đổi được gắn ở đáy bể và truyền trực tiếp dao động vào chất lỏng trong bồn Tuy nhiên, đối với thiết bị năng lượng cao (thiết bị dạng thanh/que) dao động được khuyếch đại và truyền vào môi trường lỏng nhờ thiết bị trung gian gắn với bộ phận biến đổi Theo thời gian, đầu của bộ phận trung gian này có thể bị mòn và bị giảm chiều dài cần thiết vì vậy người ta phải lắp đầu có thể tháo gỡ được

2.1.2 Phương pháp hóa lý nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết EtOH của keo ong không ngòi đốt (Homotrigona Apicalis)

Mặc dù các phương pháp xử lý có ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu suất thu cao chiết của keo ong Tuy nhiên, trong quá trình trích ly có nhiều yếu tố

khác ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết của keo ong như: Nguyên liệu, dung môi, thời gian trích ly

- Nguyên liệu

Kích thước của nguyên liệu: Mức độ nghiền nhỏ của nguyên liệu ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết Kích thước nguyên liệu càng nhỏ thì bề mặt tiếp xúc của nguyên liệu với dung môi càng lớn, do đó hiệu suất thu cao chiết sẽ tăng lên Khi nguyên liệu càng nhỏ thì quá trình thẩm thấu của dung môi vào nguyên liệu sẽ nhanh hơn Ngoài ra, với kích cỡ và hình dạng thích hợp thì quá trình chuyển động của các phân tử trong dung môi sẽ dễ dàng hơn

- Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi

Với khối lượng nguyên liệu ban đầu cố định, trong khi lượng dung môi ngày càng tăng lên, quá trình trích ly sẽ diễn ra nhanh chóng và lượng chất còn lại trong bã sẽ giảm Tuy nhiên, nếu lượng dung môi quá lớn cũng không làm tăng sự thẩm thấu của dung môi vào nguyên liệu, khi lượng dung môi đạt tới một thể tích nhất định thì hiệu suất cao chiết thu được sẽ không thay đổi, nếu tiếp tục tăng thể tích dung môi lên nữa thì chúng ta sẽ làm cho dung môi

bị hao phí

- Thời gian trích ly

Thời gian trích ly càng dài thì hiệu suất thu cao chiết sẽ càng cao vì thời gian tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi càng dài Tuy nhiên, thời gian càng về sau thì chất trong bã càng giảm Do vậy, nếu kéo dài thời gian trích ly thì hiệu suất thu cao chiết cũng không tăng đáng kể mà làm cho chúng ta tốn kém về mặt thời gian

2.1.3 Phương pháp định tính các lớp chất có trong keo ong

Xác định được các lớp chất có thể có trong keo ong bằng phương pháp định tính, sử dụng các thuốc thử tương ứng các lớp chất

2.1.4 Phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn hợp dựa trên sự phân bố không đồng đều của chúng giữa hai pha, một pha không chuyển động (gọi là pha tĩnh) và một pha chuyển động (gọi là pha động) [6]

2.1.4.1 Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)

Sắc ký bản mỏng gồm pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, pha tĩnh là chất hấp phụ (thường là siliaca gel hoặc aluminum oxide) được tráng thành lớp mỏng trên tấm nhôm hoặc kính Khi pha động chuyển động trên pha tĩnh kéo các chất di chuyển với những tốc độ khác nhau làm chúng dịch chuyển những đoạn đường khác nhau, sự khác nhau này đặc trưng bằng giá trị Rf

* Các bước thực hiện sắc ký bản mỏng

- Sắc ký lớp mỏng được thực hiện với bản mỏng tráng s n DC-Alufolien

60 F254 (Merck 1,05715), dày 0,25 mm, được cắt với chiều rộng thích hợp, dùng bút chì kẻ nhẹ một đường ngang cách mép dưới (tuyến xuất phát) khoảng 1cm, mép trên (tuyến dung môi) khoảng 0,2 - 0,3 cm Bản mỏng phải được sấy khô trước khi dùng

- Cho dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp vào bình triển khai sắc ký, đặt vào đó một mẫu giấy lọc rồi đậy kín bình, để yên ít phút đến khi dung môi trong bình ổn định

- Mẫu chất được pha loãng trong dung môi thích hợp, dùng mao quản nhỏ đưa chất lên bản mỏng sao cho vết chấm nhỏ và tròn ở tuyến xuất phát

- Dùng máy sấy sấy nhẹ để đuổi hết dung môi khỏi vệt chấm rồi đặt bản mỏng thẳng đứng hoặc lệch 75o so với phương nằm ngang vào bình triển khai sắc ký, chú ý sao cho dung môi trong bình triển khai nằm dưới vạch xuất phát

và đi lên đều Tiến hành triển khai sắc ký đến khi dung môi chạm đến vạch mép trên thì lấy bản mỏng ra

- Phát hiện vệt chất bằng đ n tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365

nm hoặc dùng thuốc hiện là dung dịch cerium(IV)sulfate trong acid H2SO4, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu

L : là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vệt

L0 : là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tuyến dung môi

2.1.4.2 Sắc ký cột (Column chromatography - CC)

Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh thường là các hạt có kích thước lớn (50 - 150 µm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt ở phía trên Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần phía dưới cột, được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn

ra cột Sắc ký cột có ưu điểm là các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với lượng lớn mẫu chất

- Lựa chọn chất hấp thu và dung môi khởi đầu giải ly

Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau Với hai phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng lượng phân tử lớn

sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên

di chuyển chậm hơn so với phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu trong cột hơn so với vài phân tử có tính phân cực nhưng có trọng lượng phân tử nhỏ

Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng

để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp Sau khi chọn hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giống nhau Dung môi để giải ly cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thực nghiệm, nhưng phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn Bởi vì silica gel tráng trên bản mỏng có kích cỡ nhuyễn mịn, lại được phun xịt tráng lên bằng áp lực lớn nên có độ chặt khít cao Trong khi đó, silica gel được dùng trong sắc ký cột với cỡ hạt lớn hơn lại được nạp vào ở áp suất thường nên có tính lỏng lẻo hơn

Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì:

Chất hấp thu phải lớn hơn 25 - 50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc ký Chiều cao của chất hấp thu nạp trong cột cần đạt tỉ lệ: Chiều cao chất hấp thu: đường kính trong của cột vào khoảng (10 : 1)

- Nạp chất hấp thu vào cột

Muốn tách riêng các hợp chất trong hỗn hợp một cách có hiệu quả nhất, chất hấp thu phải được nạp trong cột một cách đồng nhất để hạn chế những dãy xéo, bất thường

Kích cỡ hạt giữ vai trò quan trọng: Trong sắc ký cột hở, dung môi chảy

ra khỏi cột nhờ trọng lực, cho nên nếu sử dụng hạt hấp thu có kích cỡ hạt quá mịn, cột sẽ quá chặt, dung môi không thể chảy ra khỏi cột Để có thể có một vận tốc chảy có thể chấp nhận được, kích cỡ hạt chất hấp thu phải > 150 µm

* Nạp mẫu chất ở dạng bột khô

Nếu mẫu chất không tan trong dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt

đầu quá trình sắc ký cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trong dung môi phân cực có thể ảnh hưởng vào quá trình giải ly,

Đặt mẫu bột khô này lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký cột), thấm ướt phần bột silica gel Cho một lớp cát dày khoảng 3 - 6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột Cuối cùng cho dung môi vào đầy vào cột để bắt đầu giải ly

Giải ly cột: Việc sử dụng một loại dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một

số cấu tử nhất định nào đó và một số cấu tử khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột Nếu muốn đuổi chúng ra khỏi cột, phải dùng một dung môi có lực mạnh hơn Trong suốt quá trình sắc ký, cần thay nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăng dần (độ phân cực tăng dần) để có thể đuổi hết các cấu tử khác ra khỏi cột

Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm: Thêm từ từ mỗi lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực hơn vào dung môi cũ đang sử dụng

Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột Điều này được giải thích do aluminium hoặc silica gel khi được xáo trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng tạo ra nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi bốc hơi, hơi sinh

ra tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột Cột gãy làm mất đi sự liên tục của chất hấp thu, vì thế không tách tốt chất được

Vận tốc chảy của dung môi giải ly không được quá nhanh (sẽ không kịp cân bằng với chất hấp thu) cũng không được quá chậm hoặc bị cho ngừng lại

một thời gian vì lúc đó các dãy chất tan sẽ khuyếch tán hoặc trải dài theo mọi hướng làm xấu quá trình tách Thường thường trong đa số sắc ký cột, vận tốc giải ly là khoảng 5 - 50 giọt/phút hoặc 1 - 2 cm/phút

Theo dõi quá trình giải ly cột: Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu,

quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể theo dõi bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc khác nhau, đang tách xa nhau ra Theo dõi các dãy màu và hứng chúng khi được giải ly ra khỏi cột Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không màu, nên dung dịch giải ly cũng trong suốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau

Phương pháp thông dụng nhất lấy dung dịch giải ly trong những lọ có đánh số thứ tự Dung dịch trong những lọ hứng này sẽ được sắc ký trên cùng một bản mỏng Những lọ nào có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn Đuổi dung môi ở áp suất thấp các phân đoạn này sẽ cho cao của phân đoạn đó

2.1.5 Phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất phân lập

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại Chất tinh khiết sau khi phân lập được xác định các hằng số vật lý như: Màu sắc, nhiệt độ nóng chảy, sau đó tiến hành ghi các phổ như:

2.1.5.1 Phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc: Cơ sở của phương pháp MS đối với các hợp chất hữu cơ là

sự bắn phá các phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích dương, hoặc phá vỡ các mảnh ion, các gốc theo sơ đồ sau bằng các phần tử mang năng lượng cao:

Năng lượng bắn phá phân tử thành ion phân tử khoảng 10 eV, sự phá vỡ này phụ thuộc cấu tạo chất, phương pháp và năng lượng bắn phá  quá trình ion hóa Ion phân tử có số khối (m/z) kí hiệu là M+ Có nhiều phương pháp ion hóa khác nhau như va chạm electron, ion hóa proton, ion hóa trường, bắn phá ion, bắn phá nguyên tử nhanh Phương pháp phổ khối chính là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lượng chất đó

2.1.5.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Nguyên tắc: Cơ sở vật lí của cộng hưởng từ hạt nhân dựa trên từ tính của hạt nhân: Tất cả các hạt nhân đều mang điện tích, một số hạt nhân có điện tích chuyển động quay xung quanh trục hạt nhân, chuyển động quay của điện tích này sinh momen từ (lưỡng cực) µ dọc theo trục hạt nhân Biểu thức của momen từ hạt nhân:

µ = γ.p

Trong đó: µ momen từ hạt nhân

γ tỉ số hồi chuyển, phụ thuộc vào bản chất hạt nhân

 µ = 0 (không tồn tại momen từ) khi I = 0

Do đó chỉ các hạt nhân có số khối (A) lẻ hay số hiệu nguyên tử (Z) lẻ có spin hạt nhân I ≠ 0, có thể cho hiện tượng NMR

Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin I ≠ 0 (thường là số spin I lẻ ( 1

H,

13

C, ) ở trạng thái cơ bản trong 1 từ trường ngoài (Bo), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo 2 hướng: Thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa 2 trạng thái này với 1 tỉ lệ xác định của 2 trạng thái (ở đây tạo ra 2I + 1 mức năng lượng của hạt nhân, cân bằng số hạt nhân ở mức năng lượng cao và ở trạng thái cơ bản), nếu dùng một bức xạ điện từ có

tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường) Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó

2.1.6 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định

a Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp dãy nồng độ trên môi trường lỏng Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng vi khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (minimum inhibitor concentration - nồng độ tối thiểu ức chế), IC50 (50% inhibitor concentration - nồng độ ức chế 50%), MBC (minimum bactericidal concentration - nồng độ tối thiểu diệt khuẩn)

b Các chủng vi sinh vật kiểm định

Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người:

- Bacillus subtilis (ATCC 6633): Là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử,

thường không gây bệnh

- Staphylococcus aureus (ATCC 13709): Cầu khuẩn gram (+) gây mủ

các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các

cơ quan nội tạng

- Lactobacillus fermentum (N-4): Vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn

đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hóa của người và động vật

- Escherichia coli (ATCC 25922): Vi khuẩn gram (-) gây một số bệnh về

đường tiêu hóa: Viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm l trực khuẩn

- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): Vi khuẩn gram (-), trực

khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột

- Salmonella enterica: Vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn,

nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật

- Candida albicans (ATCC 10231): Là nấm men, thường gây bệnh tưa

lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa

c Môi trường nuôi cấy

MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabourand

- 2% dextrose broth) và SA (Sabourand - 4% dextrose agar) cho nấm

- Thuốc hiện màu cho sắc ký bản mỏng Ce(SO4)2 / H2SO4.

2.2.2 Thiết bị

- Đ n soi tử ngoại CM - 24 gồm đ n hai bước sóng 254 nm và 365 nm

- Máy cô quay chân không EYELA N - 1200AV - WD Nhật Bản

- Bể siêu âm Elmasonic S 30H

- Phổ khối lượng được đo trên máy LC-MS-Trap-SL tại Viện Hóa học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều được đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR Spectromter, BRUCKER 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Cột sắc ký, cốc, phễu, pipette, bình giải ly, cân phân tích, …

2.3 Thực nghiệm

2.3.1 Nguyên liệu

Thu thập mẫu: Mẫu keo ong được thu tại Hoài Xuân, Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định vào tháng 3-4/2022 và được PGS.TS Nguyễn Thị Phương Liên, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam xác định tên khoa học là Homotrigona Apicalis

Xử lý mẫu: Keo ong trong tổ khi thu mẫu còn dẻo nên phải bảo quản ở ngăn đông tủ lạnh trong ít nhất 24 giờ đến khi cứng lại Khi keo ong khô cứng lại sẽ được nghiền, xay nhỏ, rồi rây (kích thước lỗ rây khoảng (0,5 - 1 mm) Phần không lọt rây tiếp tục đem xay và rây lại đến khi đạt kích thước cần thiết Quá trình này lặp đi lặp lại đến khi không còn bột keo ong trên rây

Hình 2.2 Mẫu keo ong Homotrigona Apicalis

2.3.2.Tạo tro keo ong

Cân 1,0 g keo ong Homotrigona Apicalis cho vào chén sứ, đốt cháy hoàn

toàn lượng keo trên cho đến khi còn tro Cân khối lượng tro thu được

Hình 2.3 Đốt tạo tro keo ong Homotrigona Apicalis