Preliminary data of the biodiversity in the area

Preliminary data of the biodiversity in the area VNU Journal of Science Natural Sciences and Technology, Vol , No (20 ) 1 8 1 Original Article Development of Real time PCR Kit for Detection and Quanti[.]

1

Original Article Development of Real-time PCR Kit for Detection

and Quantitation of Six Common Mutations A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A

of Human Mitochondrial Genome

Nguyen Thi Hong Loan1, Phung Bao Khanh1, Le Ngoc Anh1,

Cao Vu Hung2, Pham Van Anh2, Phan Tuan Nghia1,*

1 VNU University of Science, Hanoi, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam

2 Vietnam National Children' Hospital, 18/879 La Thanh, Dong Da, Hanoi, Vietnam

Received 01 August 2021 Revised 11 September 2021; Accepted 13 Septerber 2021

Abstract: A procedure for the production of a real-time PCR kit for detection and quantitation of

six common mitochondrial genome mutations including A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A using fluorescent locked nucleic acid (LNA) Taqman probes was reported The procedure consists of designing specific primers and LNA probes, selection of master mixture components, and real-time PCR thermal conditions The produced kit had a specificity of 100% and sensitivity ≥ 1% and remained fully active after 7 days of storage at 25 o C or 20 days at 4 o C or

6 months at –20 o C The kit was used to analyze A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A mutations from 69 patients tentatively diagnosed with mitochondrial diseases and 3 cases of A3243G carriers (4.34%) was found In these cases, the A3243G mutation was heteroplasmic, maternally inherited, and the heteroplasmy level was shown to be related to the symptom expression

Keywords: A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A, real-time PCR.

D *

_

* Corresponding author

E-mail address: phantuannghia@vnu.edu.vn

https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.5285

Tạo bộ kit phát hiện và định lượng 6 đột biến gen ty thể A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C

và G11778A của người bằng real-time PCR

Nguyễn Thị Hồng Loan1, Phùng Bảo Khánh1, Lê Ngọc Anh1,

Cao Vũ Hùng2, Phạm Vân Anh2, Phan Tuấn Nghĩa1,*

1 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội,

334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam

2 Bệnh viện Nhi Trung ương, 18/879 La Thành, Đống Đa, Hà Nội, Việt Nam

Nhận ngày 01 tháng 8 năm 2021 Chỉnh sửa ngày 11 tháng 9 năm 2021; Chấp nhận đăng ngày 13 tháng 9 năm 2021

Tóm tắt: Trong nghiên cứu này, quy trình sản xuất bộ kit phát hiện và định lượng 6 đột biến gen

ty thể của người phổ biến là A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A bằng real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng cầu khóa axit nucleic (LNA) được thiết lập Quy trình bao gồm việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu, các mẫu dò dạng huỳnh quang cầu khóa LNA, lựa chọn dung dịch master mix và chu kỳ nhiệt Bộ kit có độ đặc hiệu là 100% và độ nhạy ≥ 1%, khi được bảo quản trong 7 ngày ở 25 o C hoặc ở 4 o C trong 20 ngày và 6 tháng ở –20 o C vẫn cho kết quả phát hiện và định lượng các đột biến tin cậy Bộ kit đã được sử dụng để điều tra sự có mặt các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A ở 69 bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể và 3 trường hợp mang đột biến A3243G (chiếm 4,34%) đã được phát hiện Các thành viên gia đình của 3 bệnh nhân mang đột biến A3243G cũng được phân tích về sự có mặt và tỷ lệ đột biến, kết quả cho thấy đột biến A3243G ở các bệnh nhân này được di truyền từ mẹ sang con và tồn tại ở dạng không đồng nhất trong tế bào, tỷ lệ đột biến có tương quan với biểu hiện lâm sàng của bệnh

Từ khóa: A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A

Ty thể là bào quan có mặt trong hầu hết các

tế bào nhân chuẩn với chức năng chính là sản

xuất năng lượng dưới dạng ATP cho các hoạt

động của tế bào Hệ gen ty thể (mtDNA) của

người có cấu trúc sợi đôi, DNA mạch vòng với

kích thước 16,569 bp, gồm 37 gen mã hóa cho

13 protein, 22 RNA vận chuyển (tRNA) và 2

RNA ribosome ty thể (rRNA) Những sai hỏng

trong DNA của ty thể có thể gây ra sự rối loạn

đa hệ thống, ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào,

mô và tổ chức khác nhau chủ yếu tập trung ở

_

* Tác giả liên hệ

Địa chỉ email: phantuannghia@vnu.edu.vn

https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.5285

cơ, thần kinh và chức năng chuyển hóa của cơ thể [1]

Giống như tất cả DNA ngoài nhân, phần lớn mtDNA được di truyền theo dòng mẹ [2] Tuy nhiên, tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ

và con lại khác nhau, vì vậy, mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các người con có thể rất khác nhau Các tế bào thường chứa nhiều bản sao mtDNA, do đó, khi xuất hiện đột biến thì trong cùng một tế bào có thể có cả mtDNA bình thường và mtDNA đột biến Đặc điểm này được gọi là tính không đồng nhất (heteroplasmy) của mtDNA, còn nếu tất cả các bản sao của mtDNA giống nhau thì gọi là tính đồng nhất (homoplasmy) [3, 4] Hiện nay, hơn

300 đột biến trong hệ gen ty thể người (chủ yếu

là đột biến điểm) đã được phát hiện, trong đó có

hơn 200 đột biến gây bệnh, chủ yếu tập trung

vào cơ, thần kinh, chức năng chuyển hoá của cơ

thể [5] Mặt khác, bệnh do đột biến gen ty thể

có tác động lâm sàng phức tạp nên rất khó để

phát hiện thông qua việc chẩn đoán lâm sàng

Cho đến nay, phân tích DNA là phương pháp

hiện cho phép phát hiện nhanh chóng và chính

xác các đột biến gây bệnh

Các đột biến điểm chủ yếu gây ra các hội

chứng MELAS (mitochondrial encephalopathy,

lactic acidosis and stroke-like episodes), hội

chứng MERRF (myoclonic epilepsy with

ragged-red fibres), hội chứng Leigh (do nhà

khoa học Leigh tìm ra), hội chứng LHON

(Leber’s herteditary optic neuropathy) MELAS

là hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu

và giả tai biến mạch, có tần suất xuất hiện

1:15.000 và là một trong các bệnh thần kinh di

truyền phổ biến nhất, có tỷ lệ tử vong cao [6, 7]

Nguyên nhân của hội chứng MELAS là do một

trong các loại đột biến điểm trên gen MTTL1

mã hóa cho tRNALeu hoặc trên gen MTND5 mã

hóa cho ND5 ubiquinone oxidoreductase của

phức hợp I Trong đó, đột biến A thay thế G ở

vị trí 3243 (A3243G) trên gen MTTL1 làm thay

đổi cấu trúc, rối loạn chức năng của

chiếm đến 80% số ca mang hội chứng MELAS

[8-12] Bên cạnh đó, đột biến G3380A trên gen

MTND1, mã hóa cho phân tử RNA vận chuyển

leucine (tRNALeu) thường tồn tại ở dạng không

đồng nhất cũng thường được tìm thấy trên bệnh

nhân bị hội chứng MELAS [13] MERRF là hội

chứng động kinh giật cơ với các sợi cơ đỏ xé

rách có thể kèm theo mất trí, điếc, bệnh cơ, teo

dây thần kinh thị giác, tổn thương hô hấp và

tim; nguyên nhân phổ biến là do đột biến

A8344G, T8356C và G8363A nằm trên gen

MTTK mã hóa cho tRNALys gây ra Trong số

các đột biến này, đột biến A8344G là phổ biến

nhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng

MERRF [14] Leigh là hội chứng với triệu

chứng điển hình thoái hóa thần kinh tiến triển ở

trẻ, có thể dẫn đến tử vong trong vài tháng hoặc

vài năm [15] Đa số các đột biến gen ty thể gây

ra hội chứng Leigh nằm trên gen MTATP6 mã

hoá cho ATPase 6 ở phức hệ V của chuỗi hô hấp, đặc biệt các đột biến đổi T thành G hoặc C tại vị trí 8993 chiếm tỷ lệ cao nhất (khoảng 20% bệnh nhân mang hội chứng Leigh có biến đổi này) [16] Bệnh nhân Leigh có tỷ lệ đột biến rất cao; khi lượng đột biến từ 60 - 90% thì thể hiện triệu chứng rối loạn thần kinh, mất điều hòa vận động và viêm võng mạc [14, 17] LHON là hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber, tác động chủ yếu đến võng mạc, gây ra chứng teo dây thần kinh thị giác, làm mất khả năng nhìn thấy ở cả hai mắt Khoảng 95% trường hợp LHON gây ra bởi các đột biến liên quan đến các tiểu đơn vị của phức hệ I, bao

gồm đột biến G11778A trên gen ND4 (50 - 70% trường hợp), đột biến G3460A trên gen ND1

(15% trường hợp) và đột biến T14484C trên gen

ND6 (10% trường hợp) Trong đó, đột biến

G11778A là nguyên nhân phổ biến nhất của LHON Ngoài ra, còn có các đột biến hiếm khác

liên quan đến gen ND5 và ND6 [18]

Kỹ thuật real-time PCR cũng đã được sử dụng để phát hiện và định lượng các đột biến gen ty thể thuộc các hội chứng điển hình như Leigh [17], MELAS [20] hay LHON [22] Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu từng đột biến riêng lẻ; và cho đên nay, chưa có kit thương mại để phát hiện và định lượng đồng thời một số đột biến trên gen

ty thể

Nghiên cứu này báo cáo kết quả phát triển bộ kit phát hiện và định lượng đồng thời 6 đột biến điểm phổ biến trong hệ gen ty thể, bao gồm: A3243G, G3380A (đột biến phổ biến gây ra hội chứng MELAS), A8344G (đột biến phổ biến gây hội chứng MERRF), T8993G, T8993C (đột biến phổ biến gây hội chứng Leigh) và G11778A (đột biến phổ biến gây hội chứng LHON)

2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Nguyên liệu

Mẫu máu ngoại vi của 69 bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể và mẫu máu của bố mẹ và người thân của gia đình có bệnh nhân mang đột biến được lấy từ Bệnh viện Nhi Trung ương đã được

sử dụng để tách DNA cho phân tích đột biến

gen ty thể Kế hoạch nghiên cứu đã được thông

qua bởi Hội đồng đạo đức của Bệnh viện Nhi

Trung ương (ngày 15/6/2016) và được thực

hiện trên cơ sở tuân thủ chặt chẽ các tiêu quy

định mà Hội đồng đã duyệt Đối tượng cung

cấp mẫu điều tra đột biến gen ty thể (bệnh nhân

và thành viên gia đình) có bản chấp thuận tự

nguyện tham gia vào nghiên cứu

Các plasmid tái tổ hợp mang các đoạn gen

ty thể bình thường hay không có đột biến

(3243A, 3380G, 8344A, 8993T, 11778G) và có

đột biến (3243G, 3380A, 8344G, 8993C,

8993G, 11778A) là sản phẩm của đề tài

KC.04.10/11-15

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm được tách

bằng kit của Qiagen (Hoa Kỳ) Nồng độ DNA

được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ ở

bước sóng 260 nm (A260) bằng NanoDrop

ND2000 (Thermo Scientific, Đức)

2.2.2 Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu

dò huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic

Các đột biến gen ty thể được phát hiện và

định lượng bằng kỹ thuật real-time PCR

(qPCR) sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng

khóa cầu acid nucleic (LNA) theo phương pháp

được Truong và cộng sự [19] thiết lập, sử dụng

các plasmid mang đoạn gen không có đột biến

3243A, 3380G, 8344A, 8993T, 11778G và có

đột biến (3243G, 3380A, 8344G, 8993C,

8993G, 11778A) làm mẫu chuẩn Các cặp mồi

được thiết kế để nhân lên các đoạn gen đích

kích thước từ 70–114 bp ở vùng có chứa đột

biến cần nghiên cứu Mẫu dò huỳnh quang

Taqman có trình tự bổ sung với một phần trình

tự trên đoạn gen đích, dài 12–15 nucleotide, có

một số nucleotide dạng LNA, đặc biệt

nucleotide LNA ở vị trí bổ sung với điểm đột

biến là có tính bắt buộc để mẫu dò không bặt

cặp với DNA khuôn dạng không đột biến trong

khoảng nhiệt độ chọn gắn mồi Đầu 5’ của mẫu

dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter)

HEX (Ex/Em = 535/556 nm) cho mẫu dò đặc

hiệu với trình tự không đột biến và FAM (Ex/Em = 495/520 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự đột biến, còn đầu 3’ của mẫu dò có gắn chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) là IBFQ (Iowa black fluorescence quencher) Theo cách thiết kế này, khi chạy real-time PCR, nếu chỉ tín hiệu HEX gia tăng chứng tỏ mẫu DNA khuôn không mang đột biến Ngược lại, nếu chỉ tín hiệu FAM gia tăng chứng tỏ DNA khuôn mang đột biến ở dạng đồng nhất và nếu

cả hai loại tín hiệu FAM và HEX đều gia tăng thì chứng tỏ mẫu DNA khuôn mang đột biến ở dạng không đồng nhất Dựa trên số lượng bản sao đã biết của mẫu chuẩn, số lượng bản sao đột biến và không đột biến của mẫu cần phân tích được tính ra; đồng thời thiết bị real-time PCR cũng chỉ ra các thông số hiệu suất PCR (E), hệ

số tương quan tuyến tính giữa chu kì ngưỡng và

số bản sao ban đầu (R2)

Dựa trên kết quả số bản sao đột biến và không đột biến của mẫu cần phân tích hiển thị trên máy tính, tỷ lệ đột biến của mẫu bệnh phẩm được tính theo công thức: % đột biến = Số bản sao đột biến (FAM)/(Số bản sao đột biến (FAM) + Số bản sao không đột biến (HEX))

2.2.3 Xác định độ nhạy và đặc hiệu

Độ nhạy của phương pháp hay bộ kit được định nghĩa là giới hạn nồng độ thấp nhất mà phương pháp hay bộ kit vẫn cho phép phát hiện

và định lượng chính xác

Độ đặc hiệu của phương pháp hay bộ kit được đánh giá trên cơ sở tỷ lệ mẫu dương tính phát hiện được /Số mẫu dương thực và tỷ lệ mẫu âm tính phát hiện được /Số mẫu âm tính thực Trong đó, các loại DNA khác nhau đã được sử dụng DNA được tách từ một mẫu bệnh phẩm không mang bất kì đột biến nào trong số 6 đột biến nghiên cứu (đã được xác định trước đó bằng PCR-RFLP và giải trình tự) được sử dụng là mẫu dương tính giả Mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân mang đột biến A3243G (đã được phân tích trước đó) được sử dụng làm mẫu dương tính thật Ngoài ra, để kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của master mix trên các vùng gen khác nhau của ty thể, chúng tôi đã sử dụng hỗn hợp

10 plasmid chứa các đoạn gen ty thể khác nhau

nhưng không chứa trình tự trùng với trình tự

của mẫu dò và mồi được thiết kế để làm mẫu

âm tính

Các thí nghiệm định lượng tỷ lệ đột biến được

lặp lại 3 lần, số liệu được xử lý bằng phương pháp

thống kê để tính giá trị trung bình của mẫu và độ

lệch chuẩn theo phần mềm Excel.

3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận

3.1 Xác định điều kiện real-time PCR để phát

hiện và định lượng 6 đột biến gen ty thể

A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G,

G11778A

Sau các lần thử nghiệm, chúng tôi đã xác

định được thành phần thích hợp của master mix

bao gồm: hỗn hợp 2X (sẵn có Taq DNA

polymerase, đệm, dNTP, dUTP, MgCl2,

Uracyl-N-glucosylase), bổ sung 10 pmol mồi

xuôi, 10 pmol mồi ngược, 2 pmol mẫu dò đột biến,

2 pmol mẫu dò không đột biến, bổ sung đệm

TE 1X đến thể tích cuối cùng là 15 µL Master mix

sử dụng cho real-time PCR trong nghiên cứu này

đã được thay đổi về nồng độ mẫu dò và bổ sung

thêm dUTP, Uracyl-N-glucosylase (UNG) để loại khả năng có kết quả dương tính

Trên cơ sở nhiệt độ Tm của mồi, mẫu dò và thăm dò điều kiện nhiệt độ cho các bước phản ứng, chúng tôi đã chọn ra chế độ nhiệt là: 50 oC trong 4 phút để UNG loại bỏ gốc uracyl ra khỏi các sản phẩm PCR (của lần thí nghiệm trước đó) có thể lẫn vào hỗn hợp phản ứng, 95 oC trong 10 phút cho biến tính DNA ban đầu, đồng thời bất hoạt UNG, tiếp theo là 40 chu kì bao gồm 95 oC trong 15 giây để biến tính DNA, 60

oC trong 30 giây cho gắn mồi và kéo dài chuỗi Tiếp theo, master mix được thử nghiệm để xác định điều kiện thích hợp cho việc định lượng đột biến thông qua xây dựng các đường chuẩn Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa giá trị chu kỳ ngưỡng và logarit

số bản sao với cả kênh HEX (không đột biến)

và kênh FAM (có đột biến) (Hình 1)

Giá trị hiệu suất PCR (E) của các phản ứng nằm trong khoảng 90 - 110%, hệ số tương quan tuyến tính R2 cả hai kênh đều lớn hơn 0,99 (Bảng 1) khẳng định master mix cho phép định lượng các đột biến nêu trên với độ tin cậy cao

Hình 1 Biểu đồ tương quan tuyến tính giữa chu kì ngưỡng và số bản sao ban đầu của các đột biến A: Đột biến A3243G, B: đột biến G3380A, C: Đột biến A8344G, D: Đột biến T8993G, E: Đột biến T8993C,

F: Đột biến G11778A Đường màu đỏ là đường chuẩn của kênh đột biến (FAM),

đường màu xanh là đường chuẩn của kênh không mang đột biến (HEX)

Bảng 1 Hiệu suất real-time PCR và hệ số tương quan tuyến tính của đường chuẩn các đột biến A3243G,

G3380A, A8344G, T8993G/C và G11778A Đột biến

Tín hiệu FAM (Đột biến) Tín hiệu HEX (Không đột biến) Hiệu suất real-time PCR (E) % R 2 Hiệu suất real-time

2

Trên cơ sở dung dịch master mix tạo được,

chúng tôi đã tạo bộ kit (100 phản ứng/bộ) phát

hiện và định lượng từng đột biến A3243G,

G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A

gồm có các thành phần sau: i) Master mix (Mix):

3 ống x 0,5 mL; ii) Mẫu chuẩn (PC) nồng độ

DNA 5.103 - 5.106: 4 ống x 50 µL/ống; iii) Đối

chứng âm (NC): 1 ống x 0,2 ml (4 pg/µL);

iv) H2O cất loại ion: 1,2 mL

Mẫu chuẩn hay đối chứng dương bao gồm

plasmid mang đoạn gen ty thể tương ứng có đột

biến và không đột biến đã trộn sẵn theo tỷ lệ 1:1

với 4 nồng độ từ 5x103, 5x104, 5x105 và 5x106

của từng đột biến A3243G, T8993G, G11778A,

G3380A, A8344G, T8993C Đối chứng âm là

plasmid mang đoạn gen ty thể tương ứng không có

đột biến

3.2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và các điều

kiện bảo quản của bộ kit

3.2.1 Xác định độ nhạy của bộ kit

Việc đánh giá độ nhạy của bộ kit tạo ra

bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn là hỗn hợp

plasmid mang đoạn gen ty thể có đột biến và

không có đột biến với các tỷ lệ plasmid mang đoạn gen đột biến khác nhau

Biểu đồ đường cong khuếch đại sau khi kết thúc real-time PCR (Hình 2) cho thấy với cả 6 mẫu phân tích đều có sự gia tăng tín hiệu của cả hai kênh đột biến (FAM) và không đột biến (HEX), tức là có sự nhân lên của đoạn gen đích đột biến và không đột biến, chứng tỏ bộ kit cho phép phát hiện đột biến ở tỷ lệ 1% (và không cho kết quả ở tỷ lệ đột biến thấp hơn) Trong khi đó, ở tỷ lệ đột biến ≤ 0,1% đã không phát hiện được gia tăng tín hiệu của kênh đột biến

Độ nhạy của một số phương pháp real-time PCR có thể tới 0,1% đột biến [19, 20], thậm chí tới 0,01% [21] và có thể chỉ ở mức 5% [22] tùy thuộc vào việc thiết kế mẫu dò So với các phương pháp khác như kỹ thuật pyrosequencing [23] và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính có độ nhạy 1% [24], bộ kit tạo ra trong nghiên cứu này có đủ độ nhạy trong việc phát hiện và định lượng các đột biến gen ty thể phổ biến

Hình 2 Biểu đồ đường cong khuếch đại phản ứng realtime PCR khi sử dụng khuôn là 1% tỷ lệ đột biến A: Đột biến A3243G, B: Đột biến G3380A, C: Đột biến A8344G, D: Đột biến T8993G, E: Đột biến G11778A,

F: Đột biến T8993C Mẫu dò huỳnh quang mang HEX, đặc hiệu cho mẫu không đột biến,

mẫu dò huỳnh quang mang FAM, đặc hiệu cho mẫu đột biến

3.2.2 Xác định độ đặc hiệu của bộ kit

Kết quả thu được với mẫu dương tính giả,

tín hiệu nhân bản chỉ xuất hiện ở kênh HEX đặc

hiệu cho mẫu không đột biến mà không xuất

hiện tín hiệu nhân bản ở kênh FAM đặc hiệu

cho mẫu có đột biến (Hình 3A) Ngược lại, với

mẫu DNA được tách từ mẫu bệnh phẩm của

bệnh nhân có đột biến A3243G, bộ kit A3243G

cho thấy sự gia tăng tín hiệu ở cả kênh đột biến

(3243FAM) và không đột biến (3243HEX), phù

hợp với tính toán lý thuyết ban đầu là bệnh

nhân mang đột biến ở dạng không đồng nhất

(Hình 3B) Trong khi đó, khi sử dụng các

khuôn là hỗn hợp plasmid chứa đoạn gen ty thể

không thuộc vùng mang đột biến quan tâm thì

không có mẫu nào cho thấy có sự gia tăng tín

hiệu của cả hai kênh đột biến và không đột biến

(Hình 3B) Các kết quả thu được chứng tỏ bộ

kit có độ đặc hiệu cao (100%) Trong tế bào ty

thể tồn tại với rất nhiều bản sao, các đoạn gen

đích trên các bản sao này đôi khi chỉ khác nhau

một nucleotide, do đó các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể đòi hỏi phải có độ đặc hiệu rất cao gần như tuyệt đối Hầu hết các nghiên cứu sử dụng real-time PCR phát hiện các đột biến A3243G, T8993G/C, G11778A đều cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu lên tới 100% [20-22] Bộ kit tạo ra trong nghiên cứu này cho phép phát hiện chính xác các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C

và không có xảy ra khả năng bắt cặp nhầm giữa các vùng DNA khác nhau trên hệ gen ty thể

Bộ kit do chúng tôi tạo ra được ký hiệu: Mito-6-mutations q.PCR

Ngoài ra, bộ kit cũng cho kết quả phát hiện đột biến tương tự, khi chúng tôi sử dụng các mẫu dương tính nhân tạo với 6 đột biến bằng cách trộn một tỷ lệ nhất định (5x108 bảnsao) của mỗi loại plasmid mang đột biến (3243G, 3380A, 8344G, 8993G, 8993C và 11778A) với huyết thanh của người không mang đột biến thay cho mẫu bệnh nhân nghi bị đột biến gen ty thể

F

Hình 3 Đường cong khuếch đại đoạn gen mang đột biến A3243G bằng real-time PCR A: các mẫu bệnh phẩm không mang các đột biến; B: một trường hợp dương tính với A3243G và các đoạn gen khác trên hệ gen ty thể.

3.2.3 Xác định thời gian bảo quản của bộ kit

Chúng tôi tiến hành bảo quản bộ kit

Mito-6-mutations q.PCR trong 6 tháng ở

–20 oC, sau đó, xây dựng đường chuẩn của 6

đột biến quan tâm để kiểm tra chất lượng các

thành phần của master mix Kết quả thu được

(Bảng 2) cho thấy, sau 6 tháng bảo quản bộ kit

vẫn cho tín hiệu đường cong khuếch đại ổn

định, hệ số tương quan tuyến tính giữa chu kì

ngưỡng và số bản sao ban đầu của 2 kênh HEX

và FAM của 6 đột biến nằm trong khoảng

0,970–0,999 Kết quả này chỉ ra rằng trong

vòng 6 tháng kể từ ngày sản xuất, được bảo quản ở –20 oC, bộ kit Mito-6-mutations q.PCR vẫn cho phép phát hiện và định lượng đột biến tin cậy, phù hợp với tiêu chuẩn cơ sở đã đặt ra Tương tự, bộ kit được bảo quản ở nhiệt độ phòng (25 oC) trong 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày và

ở 4 oC trong 10 ngày, 20 ngày và 30 ngày; sau

đó đánh giá khả năng phân tích các đột biến

T8993G, T8993C

Kết quả thu được cho thấy, sau 7 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc tương tự sau 20

ngày ở 4 oC, các thành phần của bộ kit vẫn hoạt

động tốt, biểu đồ đường cong khuếch đại của 6

đột biến vẫn cho tín hiệu ổn định, hệ số tương

quan tuyến tính R2 giữa Ct và số bản sao ban

đầu của 2 kênh đột biến và không đột biến của

các mẫu chuẩn đều lớn hơn 0,99 chứng tỏ rằng

đường chuẩn có giá trị tin cậy

Bảng 2 Hiệu suất PCR (E) và hệ số tương quan tuyến

tính (R 2 ) của đường chuẩn các đột biến A3243G,

G3380A, A8344G, T8993G/C và G11778A sử dụng

bộ kit bảo quản sau 6 tháng ở –20 o C

Đột biến Tín hiệu FAM Tín hiệu HEX

E (%) R 2 E (%) R 2

A3243G 114,3 0,972 151,7 0,999

G3380A 83,2 0,995 96,4 0,995

A8344G 96,9 0,998 117,8 0,971

T8993G 91,4 0,994 83,6 0,996

T8993C 104,7 0,984 104,6 0,996

G11778A 83,6 0,997 95,7 0,999

Tuy nhiên, sau 10 ngày bảo quản ở nhiệt độ

phòng (25 oC) hoặc sau 30 ngày ở 4 oC, độ

tương quan tuyến tính giữa chu kì ngưỡng và số

bản sao ban đầu của 6 đột biến không còn đủ độ tin cậy cho việc định lượng (R2 < 0,99) Như vậy

bộ kit Mito-6-mutations q.PCR có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng (25 oC) trong 7 ngày, ở 4

oC trong 20 ngày hay ở –20 oC trong 6 tháng

3.3 Kiểm tra khả năng phát hiện đột biến ty thể của bộ kit

3.3.1 Kiểm tra khả năng phát hiện và định lượng đột biến G1177A

Trong một nghiên cứu trước đây [25], chúng tôi đã phát hiện được một bệnh nhân (nữ, 7,5 tháng tuổi) mang đột biến G11778A thuộc hội chứng LHON với tỷ lệ đột biến là 2,710,12% Bố và mẹ bệnh nhân không phát hiện thấy có mang đột biến này Với bộ kit Mito-6-mutations q.PCR tạo ra, chúng tôi cũng đã tiến hành lặp lại việc phân tích sự có mặt cũng như tỷ lệ đột biến

Kết quả thu được (Hình 4) cho thấy mẫu bệnh nhân có mang đột biến với tỷ lệ là 2,7%, trong khi mẫu bố và mẹ bệnh nhân không thấy mang đột biến này Kết quả này phù hợp với phát hiện trước đây, và sự có mặt của đột biến G11778A của bệnh nhân có thể do phát sinh trong quá trình phát triển cá thể

I

Hình 4 Kết quả real-time PCR với mẫu gia đình bệnh nhân (A) và đường chuẩn thể hiện tương quan giữa logarit số bản sao gen ty thể và chu kỳ ngưỡng của đột biến G11778A (đường dưới là dạng có đột biến,

đường trên là dạng không mang đột biến) (B)

3.3.2 Ứng dụng bộ kit trong sàng lọc sự có

mặt của các đột biến gen ty thể ở bệnh nhân

Bộ kit Mito-6-mutations q.PCR đã được sử

dụng thử nghiệm điều tra sự có mặt và định

lượng 6 đột biến gen ty thể A3243G, G3380A,

A8344G, G11778A, T8993G, T8993C trên 69

bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi bệnh ty

thể tại Khoa Thần kinh, Bệnh viện Nhi Trung

ương Kết quả thu được cho thấy: 57 trong số

69 mẫu bệnh phẩm cho kết quả âm tính Ở đây chúng tôi chỉ nêu một trường hợp làm minh họa Cụ thể bệnh nhân số 1 (ký hiệu BN1), kết quả thu được ở Hình 5 cho thấy, ở cả 6 đột biến, đồ thị tín hiệu real-time PCR nhân bản với mẫu dò không đột biến HEX xuất hiện với số chu kỳ ngưỡng Ct dao động từ 14 - 17 nhưng không thu được tín hiệu khuếch đại nào của kênh FAM với mẫu dò đột biến Trong khi đó,

đối chứng dương của 6 đột biến đều cho đường

khuếch đại với mẫu dò không đột biến HEX

xuất hiện với chu kỳ ngưỡng Ct dao động từ

19 - 23 và mẫu dò đột biến FAM xuất hiện với

chu kỳ ngưỡng Ct dao động từ 18 - 26 Các kết

quả này chứng tỏ, bệnh nhân BN1 không mang

6 đột biến nghiên cứu là A3243G, G3380A,

A8344G, T8993G, T8993C và G11778A trên

gen ty thể Các bệnh nhân ký hiệu BN4, BN11

và BN30, đồ thị nhân bản với mẫu dò FAM và

HEX xuất hiện với cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu

cho đột biến A3243G, trong khi các bệnh nhân

còn lại chỉ thu được tín hiệu HEX mà không thu được tín hiệu FAM (Hình 5) Kết quả chứng tỏ các bệnh nhân BN4, BN11, BN30 có mang đột biến A3243G ở dạng không đồng nhất Bên cạnh đó, đồ thị tín hiệu nhân bản với mẫu dò FAM không xuất hiện với cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu cho các đột biến G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C, trong khi đó đồ thị tín hiệu nhân bản vẫn xuất hiện với HEX, chứng tỏ trong số 69 bệnh nhân điều tra, không

có bệnh nhân nào mang đột biến G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C

I

F

Hình 5 Kết quả thử nghiệm bộ kit Mito- 6-mutations q.PCR phát hiện đột biến gen ty thể

của các bệnh nhân BN1, BN4, BN11 và BN30

Xét về tỷ lệ đột biến, với số lượng mẫu là

69 bệnh nhân nghiên cứu, có 3 bệnh nhân mang

đột biến A3243G ở dạng không đồng nhất được

phát hiện, chiếm tỷ lệ 4,34% Tỷ lệ đột biến này

khá gần với tỷ lệ 5,7% mà Truong và các cộng

sự [26] trước đây đã phát hiện khi điều tra trên

106 bệnh nhân người Việt Nam nghi bị bệnh ty

thể Trong một nghiên cứu trước đây ở 631

bệnh nhân người Hungary có triệu chứng bệnh

ty thể, Gal và các cộng sự [27] đã cho thấy có

2,2% bệnh nhân mang đột biến A3243G Tỷ lệ

này là 1,74% trong một nghiên cứu khác, ở 230

bệnh nhân người Nhật bị giảm khả năng nghe

[28] Trên thực tế, bên cạnh các đặc điểm di truyền, tỷ lệ đột biến gen ty thể còn phụ thuộc tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân, đối tượng, độ tuổi,

4 Kết luận

Bộ kit Mito-6-mutations q.PCR tạo ra cho phép phát hiện và định lượng chính xác các đột biến gen ty thể A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C và G11778A bằng real-time PCR sử dụng mẫu dò dạng LNA Bộ kit đã được thử nghiệm để phân tích sự có mặt của các đột biến gen ty thể cho các bệnh nhân ở Bệnh viện Nhi Trung ương

Lời cảm ơn

Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ

kính phí của Đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà

Nội, mã số KLEPT16.03

Tài liệu tham khảo

[1] P Mishra, D C Chan, Mitochondrial Dynamics and

Inheritance During Cell Division, Development and

Disease, Nat, Rev, Mol, Cell, Biol, Vol 15, 2014,

pp 634-646

[2] P F Chinnery, Inheritance of Mitochondrial

Disorders, Mitochondrion, Vol 2, 2002, pp 149-155

[3] S Shanske, J Pancrudo, P Kaufmann, K Engelstad,

S Jhung, J Lu, A Naini, S DiMauro, D C De Vivo,

Varying Loads of the Mitochondrial DNA A3243G

Mutation in Different Tissues: Implications for

Diagnosis, Am, J Med, Genet, Part A, Vol 130A,

2004, pp 134-137

[4] M K Koenig, Presentation and Diagnosis of

Mitochondrial Disorders in Children, Pediat, Neurol,

Vol 38, 2008, pp 305-313

[5] X Zhou, H Zhang, F Zhao, Y Ji, Y Tong,

J Zhan, Y Zhang, L Yang, Y Qian, F Lu, J Qu,

M X Guan, Very High Penetrance and Occurrence of

Leber’s Hereditary Optic Neuropathy in a Large Han

Chinese Pedigree Carrying the ND4 G11778A

Mutation, Mol, Genet, Metab, Vol 100, 2010,

pp 379-384

[6] Y Ma, F Fang, Y Cao, Y Yang, L Zou, Y Zhang,

S Wang, S Zhu, Y Xu, P Pei, Y Qi, Clinical

Features of Mitochondrial DNA m.3243A>G

Mutation in 47 Chinese Families, J Neurol, Sci,

Vol 291, 2010, pp 17-21

[7] S Rahman, J Poulton, D Marchington,

A Suomalainen, Decrease of A3243G mtDNA

Mutation from Blood in MELAS Syndrome: A

Longitudinal Study, Am, J Hum, Genet, Vol 68,

2001, pp 238-240

[8] E Ciafaloni, E Ricci, S Shanske, C T Moraes,

G Silvestri, M Hirano, S Simonetti, C Angelini,

M A Donati, C Garcia, A Martinuzzi,

R Mosewich, S Servidei, E Zammarchi, E Bonilla,

D C DeVivo, L P Rowland, E A Schon,

S DiMauro, MELAS: Clinical Features, Biochemistry,

and Molecular Genetics, Annal, Neurol, Vol 31, 1992,

pp 391-398

[9] K Majamaa, J S Moilanen, S Uimonen, A M Remes,

P I Salmela, M Kärppä, K A Voltti,

H Rusanen, M Sorri, K J Peuhkurinen, I E

Hassinen, Epidemiology of A3243G, the Mutation

for Mitochondrial Encephalomyopathy, Lactic

Acidosis, and Strokelike Episodes: Prevalence of the

Mutation in an Adult Population, Am, J Hum, Genet, Vol 63, 1998, pp 447-454

[10] P J Lorenzoni, R H Scola, C S K Kay, R C Arndt,

A A Freund, I Bruck, M L S F Santos,

L C Werneck, MELAS: Clinical Features, Muscle Biopsy and Molecular Genetics, Arquivos de Neuro-Psiquiatria, Vol 67, 2009, pp 668-676 [11] M Mimaki, H Hatakeyama, T Ichiyama, H Isumi,

S Furukawa, M Akasaka, A Kamei, H Komaki,

I Nishino, I Nonaka, Y I Goto, Different Effects of Novel mtDNA G3242A and G3244A Base Changes Adjacent to a Common A3243G Mutation in Patients with Mitochondrial Disorders, Mitochondrion, Vol 9,

2009, pp 15-122

[12] C Glatz, K D’Aco, S Smith, N Sondheimer, Mutation in the Mitochondrial tRNA(Val) Causes Mitochondrial Encephalopathy, Lactic Acidosis and Stroke-like Episodes, Mitochondrion, Vol 11, 2011,

pp 615-619

[13] R Horvath, R Reilmann, E Holinski-Feder,

E B Ringelstein, T Klopstock, The Role of Complex

I Genes in MELAS: A Novel Heteroplasmic Mutation 3380G>A in ND1 of mtDNA, Neuromusc, Disord, Vol 18, 2008, pp 553-556

[14] A L Gropman, The Neurological Presentations of Childhood and Adult Mitochondrial Disease: Established Syndromes and Phenotypic Variations, Mitochondrion, Vol 4, 2004, pp 503-520

[15] Y Suzuki, T Wada, T Sakai, Y Ishikawa,

R Minami, N Tachi, S Saitoh, Phenotypic Variability

in a Family with a Mitochondrial DNA T8993C Mutation, Pediat, Neurol, Vol 19, 1998, pp 283-286 [16] E M Rebai, W Chaari, S Younes,

R Bousoffara, M T Sfar, F Fakhfakh, Maternally Inherited Leigh Syndrome: T8993G Mutation in a Tunisian Family, Pediat Neurol, Vol 40, 2009,

pp 437-442

[17] H Tajima, K Sueoka, S Y Moon, A Nakabayashi,

T Sakurai, Y Murakoshi, H Watanabe, S Iwata,

T Hashiba, S Kato, Y I Goto, Y Yoshimura, The Development of Novel Quantification Assay for Mitochondrial DNA Heteroplasmy Aimed at Preimplantation Genetic Diagnosis of Leigh Encephalopathy, J Assist, Reprod, Genet, Vol 24,

2007, pp 227-232

[18] G C Black, K Morten, A Laborde, J Poulton, Leber's Hereditary Optic Neuropathy: Heteroplasmy

is Likely to be Significant in the Expression of LHON in Families with the 3460 ND1 Mutation, Brit, J Ophthalmol, Vol 80, 1996, pp 915-917 [19] T H Truong, T V A Nguyen, T H L Nguyen,

V A Pham, T N Phan, Sensitive Quantitation of