ĐẶT VẤN ĐỀ 1 SỞ Y TẾ TỈNH ĐIỆN BIÊN TRUNG TÂM KIỂM NGHIỆM THUỐC MỸ PHẨM THỰC PHẨM ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ TÊN ĐỀ TÀI KHẢO SÁT PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VIÊN NÉN CIMETIDIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮ.
TỔNG QUAN
Tổng quan về cimetidin
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Cimetidin
* Công thức phân tử của Cimetidin: C 10 H 16 N 6 S
2-cyano-1-methyl-3-[2-[[(5-methylimidazol-4- yl)methyl]thio]ethyl]guanidin
1.1.2 Tính chất hóa lý của Cimetidin
+ Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, dạng base ít tan trong nước, tan trong acid vô cơ loãng pKa = 6,8
Nhân thơm được xác định bằng phương pháp hấp thụ bức xạ tử ngoại, bao gồm các kỹ thuật quét phổ UV để định tính, đo độ hấp thụ riêng của hợp chất để đảm bảo chất lượng, và phương pháp quang phổ đo để định lượng chính xác Các phương pháp phân tích hiện đại như HPLC cũng được sử dụng để xác định hàm lượng nhân thơm trong mẫu, đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả phân tích.
Tính Base của hợp chất được xác định bằng phương pháp tan trong axit vô cơ và ứng dụng trong pha chế phẩm tiêm Phương pháp định tính dựa trên phản ứng với thuốc thử chung của alcaloid, cụ thể là acid silicovolframic Để định lượng, người ta sử dụng phương pháp đo lượng acid trong môi trường khan, đảm bảo độ chính xác cao trong phân tích.
+ Tác d ng với acid citric trong anhydrid acetic
1.1.3 Dƣợc lý và cơ chế tác dụng
Cimetidin là thuốc ức chế cạnh tranh với histamin tại thụ thể H2 của tế bào bìa dạ dày, giúp giảm tiết dịch acid cơ bản khi đói cũng như trong ngày và đêm Ngoài ra, Cimetidin còn làm giảm tiết dịch acid bị kích thích bởi thức ăn, histamin, pentagastrin, cafein và insulin, từ đó góp phần kiểm soát các bệnh liên quan đến dịch vị dạ dày Đồng thời, thuốc cũng làm giảm lượng pepsin do dạ dày sản xuất ra, hỗ trợ điều trị các tổn thương tiêu hóa liên quan đến tiết acid quá mức.
Cimetidin được hấp thu nhanh chóng sau khi uống, đạt hàm lượng tối đa trong máu sau 45-90 phút Thời gian bán thải khoảng 2 giờ, giúp duy trì hiệu quả điều trị Thuốc có thể được sử dụng qua đường uống hoặc tiêm tĩnh mạch và tiêm bắp, đều mang lại hiệu quả điều trị tương tự trong máu Sau khi dùng liều 300 mg, Cimetidin cung cấp tác dụng nhanh và kéo dài, phù hợp cho các điều trị liên quan đến dạ dày và tiết acid.
Sau 4-5 giờ, nồng độ thuốc trong máu vẫn duy trì vượt mức cần thiết để ức chế 80% tiết dịch axit của dạ dày, cho thấy thuốc có tác dụng kéo dài Cimetidin chủ yếu được thải qua nước tiểu, trong đó khoảng 75% thuốc được loại bỏ dưới dạng không biến đổi sau 24 giờ Khi dùng thuốc qua đường uống, phần lớn thuốc được chuyển hóa thành sulfoxid để thải loại, và 48% liều thuốc được đào thải ra nước tiểu trong vòng 24 giờ dưới dạng không biến đổi.
- Loét tá tràng tiến triển
- Ðiều trị duy trì loét tá tràng với liều thấp sau khi ổ loét đã lành
- Ðiều trị ngắn hạn loét dạ dày tiến triển lành tính
- Ðiều trị chứng trào ngược dạ dày thực quản gây loét
- Ðiều trị các trạng thái bệnh lý tăng tiết dịch vị như hội chứng Zollinger - Ellison, bệnh đa u tuyến nội tiết
- Ðiều trị chảy máu tiêu hóa do loét dạ dày tá tràng
- Phòng chảy máu đường tiêu hóa trên ở người có bệnh nặng
1.1.5 Chống chỉ định và thận trọng:
- Cimetidin tương tác với nhiều thuốc, bởi vậy khi dùng phối hợp với loại thuốc nào đó đều phải xem xét kỹ
Trước khi sử dụng Cimetidin để điều trị loét dạ dày, bạn cần loại trừ khả năng ung thư dạ dày, vì dùng thuốc có thể che phủ triệu chứng, khiến việc chẩn đoán trở nên khó khăn hơn.
Giảm liều ở người bệnh suy gan, thận
Truyền nhanh tĩnh mạch, Cimetidin có thể gây loạn nhịp tim và giảm huyết áp
1.1.6 Tác dụng không mong muốn (ADR)
- Thần kinh: Ðau đầu, chóng mặt, ngủ gà, lú lẫn hồi ph c được, trầm cảm, kích động, bồn chồn, ảo giác, mất phương hướng
- Nội tiết: Chứng to vú ở đàn ông khi điều trị 1 tháng hoặc lâu hơn
- Nội tiết: Chứng bất lực khi dùng liều cao kéo dài trên 1 năm, nhưng có thể hồi ph c
- Gan: Tăng enzym gan tạm thời, tự hết khi ngừng thuốc
* Quá mẫn: Sốt, dị ứng kể cả sốc phản vệ, viêm mạch quá mẫn
Trong lĩnh vực tim mạch, việc quản lý mạch chậm, mạch nhanh và chẹn nhĩ thất đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe tim Truyền nhanh thuốc qua tĩnh mạch có thể làm tăng mức histamin trong huyết thanh, gây ra các vấn đề như loạn nhịp tim và giảm huyết áp, đòi hỏi cần thận trọng trong quá trình sử dụng.
Các dạng rối loạn máu như giảm bạch cầu đa nhân, mất bạch cầu hạt, giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu trung tính và giảm toàn thể huyết cầu đều có thể do tác dụng phụ của thuốc Ngoài ra, thiếu máu không tái tạo cũng có thể xảy ra do các yếu tố khác Thuốc kháng histamin H2 gây ức chế tiết axit dạ dày, làm giảm hấp thu vitamin B12, từ đó dễ dẫn đến thiếu máu do thiếu máu hồng cầu túi mỡ.
- Gan: Viêm gan mãn tính, vàng da, rối loạn chức năng gan, viêm t y, nhưng sẽ khỏi khi ngừng thuốc
- Thận: Viêm thận kẽ, bí tiểu tiện
- Da: Ban đỏ nhẹ, hói đầu r ng tóc
* Hướng dẫn cách xử trí ADR
Hầu hết các tác d ng không mong muốn sẽ qua đi sau khi ngừng thuốc 3 -
Thuốc qua nhau thai, tuy chưa có bằng chứng về sự nguy hại đến thai nhi, nhưng trong thời kì mang thai, nên tránh dùng Cimetidin
Thời kỳ cho con bú
Thuốc bài tiết qua sữa mẹ và tích lũy đạt nồng độ cao hơn so với trong huyết tương của người mẹ, gây nguy cơ tiềm ẩn cho trẻ sơ sinh Mặc dù tác dụng của thuốc trên trẻ chưa được xác định rõ ràng, nhưng tốt nhất không nên sử dụng Cimetidin trong thời kỳ cho con bú để đảm bảo an toàn cho trẻ.
1.1.7 Liều lƣợng và cách dùng:
Cimetidin có thể được sử dụng bằng đường uống hoặc tiêm, với tổng liều thường không vượt quá 2,4 g/ngày Khi dùng đường uống, nên uống thuốc vào bữa ăn hoặc trước khi đi ngủ để đạt hiệu quả tốt nhất.
Để điều trị loét dạ dày và loét tá tràng, liều duy nhất 800 mg/ngày được sử dụng vào buổi tối trước khi đi ngủ ít nhất trong 4 tuần đối với loét tá tràng và ít nhất trong 6 tuần đối với loét dạ dày Liều duy trì là 400 mg vào trước lúc đi ngủ Đối với chứng trào ngược dạ dày - thực quản, liều dùng là 400 mg mỗi lần, 4 lần/ngày, vào các bữa ăn và trước khi đi ngủ, trong khoảng thời gian từ 4 đến 8 tuần để đạt hiệu quả điều trị tối ưu.
Hội chứng Zollinger - Ellison:400 mg/lần, 4 lần/ngày, có thể tăng tới 2,4 g/ngày
Stress gây loét đường tiêu hóa trên:Uống hoặc cho qua ống thông dạ dày
Để điều trị hoặc phòng ngừa các tình trạng liên quan đến dạ dày, liều lượng thuốc thường là 200 - 400 mg hoặc tiêm tĩnh mạch 200 mg/lần cách nhau từ 4 đến 6 giờ Để phòng ngừa nguy cơ hít phải dịch vị trong quá trình gây mê, bệnh nhân cần uống 400 mg thuốc 90 đến 120 phút trước khi gây mê, và nếu cần, có thể lặp lại sau 4 giờ Để giảm sự phân giải của chế phẩm bổ sung enzym, người bệnh suy tỳ có thể sử dụng Cimetidin liều 0,8 - 1,6 g/ngày, chia làm 4 lần, uống cách bữa ăn 60 đến 90 phút Trong trường hợp chảy máu tiêu hóa do loét dạ dày hoặc tá tràng, đường tiêm được chỉ định như một phương pháp điều trị quan trọng.
Tiêm tĩnh mạch với liều 200 mg, thực hiện tiêm chậm trong ít nhất 2 phút và lặp lại mỗi 4-6 giờ để duy trì hiệu quả điều trị Trong trường hợp cần liều lượng lớn hơn hoặc bệnh nhân có rối loạn tim mạch, nên truyền qua đường tĩnh mạch để đảm bảo an toàn Khi tiến hành truyền cách quãng, liều 400 mg có thể được chia trong khoảng 30 phút đến 1 giờ, còn truyền liên tục thì tốc độ là 50-100 mg mỗi giờ, đảm bảo sự phân phối thuốc ổn định và hiệu quả.
Liều tiêm bắp là 200 mg, cứ 4 - 6 giờ 1 lần
Người bệnh suy thận cần điều chỉnh liều thuốc dựa trên độ thanh thải creatinin của họ Cụ thể, nếu độ thanh thải creatinin từ 0-15 ml/phút, liều dùng là 200 mg mỗi lần, uống 2 lần/ngày Đối với độ thanh thải từ 15-30 ml/phút, liều cũng là 200 mg mỗi lần nhưng tăng lên 3 lần/ngày Cuối cùng, khi độ thanh thải từ 30-50 ml/phút, liều duy trì là 200 mg mỗi lần, uống 4 lần/ngày để đảm bảo hiệu quả điều trị an toàn và phù hợp.
> 50 ml/phút, liều bình thường
Kinh nghiệm lâm sàng khi sử dụng Cimetidin để điều trị trẻ em dưới 16 tuổi còn hạn chế, do đó cần cân nhắc kỹ giữa lợi ích và rủi ro trước khi chỉ định thuốc Đối với trẻ sơ sinh, liều dùng thường là 10 - 15 mg/kg/ngày, phù hợp với trẻ đủ tháng và có chức năng thận bình thường Đối với trẻ em trên 1 tuổi, liều dùng giảm xuống còn 20 - 25 mg/kg/ngày và chia thành nhiều lần để tối ưu hóa hiệu quả điều trị Trong khi đó, trẻ lớn hơn cần liều khoảng 30 mg/kg/ngày, chia làm 3-4 lần để đảm bảo hiệu quả và an toàn.
Trẻ bị suy thận, liều phải giảm xuống tới 10 - 15 mg/kg thể trọng/ngày và chia ra cách nhau 8 giờ
Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng là quá trình tách chất diễn ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng, còn gọi là sắc ký lỏng-rắn Quá trình phân tích mẫu được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch, giúp tách các thành phần dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc loại trừ theo kích cỡ This method is widely used in phân tích hóa học để xác định thành phần của mẫu một cách chính xác và hiệu quả.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phổ biến nhất để xác định thành phần và định lượng trong phân tích kiểm nghiệm Ra đời từ năm 1967-1968 dựa trên sự phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển, HPLC đã trở thành công cụ quan trọng trong phòng thí nghiệm Phương pháp này sử dụng pha động là chất lỏng và pha tĩnh là một chất rắn đã được phân chia thành tiểu phân, hoặc một chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hoặc chất mang đã được liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ để tách các hợp chất trong mẫu.
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), mẫu phân tích được tiêm qua buồng tiêm và chuyển vào cột nhờ pha động, giúp các thành phần trong mẫu được tách ra trên pha tĩnh trong cột Quá trình tách này giúp các thành phần khác nhau của mẫu phân tích được phân lập rõ ràng, sau đó đi qua detector để xác định và ghi lại các tín hiệu trên sắc ký đồ HPLC là phương pháp phân tích chính xác, nhanh chóng, thường được sử dụng để xác định thành phần và nồng độ của các hợp chất trong mẫu phân tích.
1.2.2 Hệ thống máy sắ ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Hình 1.2 Sơ đồ hệ thống máy HPLC
(1) Bình chứa dung môi pha động (5) Cột sắc ký (pha tĩnh)
(2) Bộ phận loại khí (6) Detector
(3) Bơm cao áp (7) Hệ thống thu nhận, xử lý dữ liệu
(4) Bộ phận tiêm mẫu (8) In dữ liệu
1.2.3 Cơ sở lý thuyết của việc lựa điều kiện sắc ký [1], [3], [4], [5]
Trong HPLC, pha tĩnh phổ biến nhất là loại có các nhóm silanol trên bề mặt hạt silicagel đã được liên kết với các nhóm hóa học khác nhau, tạo thành các hợp chất siloxan có độ phân cực đa dạng Các nhóm liên kết này ảnh hưởng lớn đến khả năng phân tách của hệ thống, giúp tối ưu hóa quá trình phân tích và nâng cao hiệu quả của phương pháp Pha tĩnh chứa các hợp chất siloxan này được sử dụng rộng rãi nhờ đặc tính phân cực phù hợp với nhiều loại mẫu thử khác nhau Do đó, lựa chọn pha tĩnh phù hợp là yếu tố then chốt để đạt được kết quả phân tích chính xác và tin cậy trong HPLC.
Khi R là các nhóm ít phân cực như Octyl (C8), Octadecyl (C18), Phenyl và pha động phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC)
R là nhóm khá phân cực như Alkylamin hoặc Alkylnitril pha động, là dung môi ít phân cực phù hợp với sắc ký pha thuận (NP-HPLC) Hiện nay, kỹ thuật RP-HPLC được sử dụng phổ biến vì khả năng tách hiệu quả nhiều hợp chất khác nhau, sử dụng cột ngược dòng như cột ODS (RP18) hoặc C8 with kích thước hạt 5 hoặc 10μm Để nâng cao khả năng tách, tiết kiệm dung môi và thời gian phân tích, các phương pháp sắc ký lỏng nhanh (UFLC) và sắc ký lỏng siêu hiệu năng (U-HPLC) đã được ứng dụng rộng rãi Trong UFLC, hạt pha mang nhỏ (thường từ 1,7 - 2,2μm) cho phép sử dụng cột ngắn hơn, từ 5-10cm, nhằm tối ưu hóa hiệu suất và giảm thời gian phân tích.
Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất phân tích khỏi cột sắc ký, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tách Hoạt động của pha động ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất tách của hỗn hợp Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định, tùy thuộc vào yêu cầu phân tích cụ thể Chọn lựa pha động phù hợp là yếu tố then chốt để đạt được kết quả phân tích chính xác và hiệu quả cao trong quá trình sắc ký.
Pha động trong HPLC đóng vai trò quan trọng trong quá trình tách các chất phân tích hiệu quả Mỗi loại sắc ký yêu cầu pha động riêng để đảm bảo hiệu quả tách tối ưu, trong đó có các loại pha động phân cực và ít phân cực phù hợp với sắc ký pha đảo và sắc ký pha thuận Khi pha động một thành phần không đủ khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp từ 2 đến 3 dung môi có độ phân cực khác nhau để tối ưu hóa quá trình phân tích Quá trình thay đổi thành phần pha động theo thời gian, gọi là rửa giải gradient dung môi, giúp nâng cao hiệu quả tách và độ chính xác của phương pháp HPLC.
Trong quá trình sắc ký tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion, việc thêm đệm vào pha động là cần thiết để duy trì pH ổn định, đặc biệt khi chất tan có tính acid hoặc base, nhằm nâng cao hiệu quả tách Giá trị pH phù hợp giúp tối ưu hóa hiệu suất sắc ký, tăng khả năng phân tách của các hợp chất Thường thì, khi chất tan là acid hữu cơ, người ta dùng đệm pH acid, tuy nhiên, trong các trường hợp đặc biệt hoặc trong sắc ký tạo cặp ion, pH cần được điều chỉnh phù hợp theo từng trường hợp cụ thể để đạt hiệu quả tối ưu.
Để tăng hiệu quả tách trong quá trình sắc ký, sau khi xác định pha tĩnh, pha động phù hợp và điều chỉnh pH thích hợp, cần chọn tốc độ dòng của pha động phù hợp để tối ưu hóa quá trình phân tích.
Các loại detector trong sắc ký đa dạng như detector tử ngoại - khả kiến (UV-VIS), tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa và phổ khối (MS) đều đóng vai trò quan trọng trong phân tích mẫu Trong đó, detector chuỗi diode (DAD) cho phép thay đổi bước sóng linh hoạt theo cấu hình đã lập trình trong quá trình sắc ký, giúp nâng cao độ chính xác và khả năng phân tích Thiết bị này sử dụng một hoặc hai mảng diode để nhận bức xạ đã tán sắc từ tia laser tạo ra phổ của mẫu, từ đó quang phổ và sắc ký đồ được hiển thị trực tiếp trên màn hình nhờ phần mềm xử lý tín hiệu của hệ thống Ngoài ra, hệ thống có khả năng trình diễn đồ thị 3D mô phỏng các yếu tố như độ hấp thụ, bước sóng và thời gian, hỗ trợ phân tích sâu và chính xác hơn.
1.2.4 Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký [1], [3], [4], [5]
Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ với các thông số
Thời gian lưu T R (phút) là thời gian từ khi tiêm mẫu đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên sắc ký đồ, phản ánh tính định lượng của hợp chất Thời gian lưu cung cấp thông tin về mặt định tính của chất tan trên sắc ký đồ Trong những điều kiện sắc ký cố định như cột, pha động, nhiệt độ và tốc độ dòng, thời gian lưu của một chất tan thường là hằng số, giúp xác định và phân tích chính xác hợp chất.
* Thời gian chết t 0 : Là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh
* W 0,5 : Độ rộng của peak ở nửa chiều cao
* Wb: Độ rộng ở đáy peak
Thể tích lưu VR là thể tích của lượng pha động bị đẩy ra khỏi cột trong quá trình phân tích, bắt đầu từ lúc bắt đầu tiêm mẫu thử cho đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên sắc ký đồ Đây là thông số quan trọng trong quá trình phân tích, giúp xác định hiệu quả của quá trình sắc ký và độ chính xác của kết quả Việc đo thể tích lưu VR chính xác giúp tối ưu hóa quá trình phân tích và nâng cao độ tin cậy của dữ liệu thu được.
VR= tR.FC (FC là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian)
Là đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất A và B (quy ước ở đây chất B là chất lưu giữ mạnh hơn chất A):
Trong quá trình tách riêng hai chất, các yếu tố chính bao gồm thời gian lưu của chất A (tRA) và chất B (tRB), cùng với hệ số dung lượng của chúng (k’A và k’B) Để tối ưu quá trình tách, thường chọn tỷ lệ α trong khoảng 1,05 đến 2,0, giúp nâng cao hiệu quả phân biệt giữa hai chất và đảm bảo quá trình diễn ra thuận lợi.
Là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc kí (ví d A và B)
Trong đó: tRB, tRA: Thời gian lưu của 2 peak liền kề nhau (A và B)
W B , W A : Độ rộng peak đo ở đáy các peak
W1/2B, W1/2A: Độ rộng peak đo ở nửa chiều cao peak
Các giá trị tRB, tRA,WB, WA,W1/2B, W1/2A phải được tính theo cùng một đơn vị
Yêu cầu: Rs> 1, giá trị tối ưu Rs = 1,5
1.2.4.3 Hệ số đối xứng của peak (F)
Thể hiện sự cân đối của peak
W: chiều rộng peak đo ở 1/20 chiều cao peak a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh peak đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao peak
Hệ số bất đối xứng càng gần 1, tức là peak có dạng phân phối chuẩn Gauss, thì kết quả tính diện tích của peak càng chính xác Khi giá trị F quá lớn, điểm cuối của peak rất khó xác định, khiến peak bị kéo dài đuôi, gây ra nhiều sai số khi tính diện tích.
Để làm cho peak sắc nét hơn và cân xứng hơn trong phân tích, có thể giảm thể tích chết tại đoạn nối từ cột đến detector Việc thay đổi thành phần pha động để tăng khả năng rửa giải giúp cải thiện chất lượng phân tích Điều chỉnh pH của dung dịch để chất tan tồn tại ở dạng phù hợp cũng góp phần nâng cao hiệu quả phân tích Bên cạnh đó, giảm lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hoặc giảm thể tích tiêm cũng là các biện pháp tối ưu để nâng cao độ chính xác và độ lặp lại của kết quả phân tích.
Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột
W B , W A : Độ rộng peak đo ở đáy các peak
W1/2B, W1/2A: Độ rộng peak đo ở nửa chiều cao peak
1.2.5 Ứng dụng Phương pháp HPLC [3], [4], [5]
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có ba ứng d ng chính
Các phương pháp định lượng cimetidin
Hòa tan 0,200 g chế phẩm trong 60 ml dung dịch acid acetic khan và chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N Phương pháp xác định điểm kết thúc của quá trình chuẩn độ là nhờ đo điện thế Quá trình này giúp kiểm tra chính xác hàm lượng của chế phẩm, đảm bảo kết quả phân tích đúng chuẩn.
1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) tương đương với 25,23 mg C10H16N6S
1.3.1.2 Phương pháp 2: Định lượng Cimetidin theo Dược điển Mỹ USP 37 (page 2341)
Pha động: Lấy 200ml methanol và 0,3ml acid phosphoric vào bình định mức 1000ml, pha loãng với nước vừa đủ Lọc
Dung dịch chuẩn gốc Cimetidin 0,4 mg/ml được pha bằng cách hòa tan trong hỗn hợp methanol và nước theo tỷ lệ 1:4, sau đó pha loãng với 20% methanol rồi bổ sung nước đến mức độ phù hợp để đảm bảo độ chính xác của phép đo.
Dung dịch chuẩn: Pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc về nồng độ 0,01mg/ml bằng pha động
Dung dịch thử gốc Cimetidin được pha chế bằng cách hòa tan nguyên liệu vào hỗn hợp Methanol và nước theo tỷ lệ 1:4, sau đó thêm 20% Methanol vào dung dịch, rồi bổ sung nước đến lượng phù hợp Quá trình này đảm bảo độ hòa tan tối ưu của Cimetidin trong dung dịch thử, giúp xác định chính xác nồng độ và chất lượng sản phẩm Việc pha chế chính xác theo tỷ lệ chuẩn là bước quan trọng trong quy trình kiểm nghiệm dược phẩm nhằm đảm bảo độ tin cậy và hiệu quả của phương pháp phân tích.
Dung dịch thử: Pha loãng từ dung dịch thử gốc về nồng độ 0,01mg/ml bằng pha động Điều kiện sắc ký:
Tốc độ dòng: 2ml/phút
1.3.2 Định lƣợng chế phẩm viên nén Cimetidin
1.3.2.1 Phương pháp đo quang phổ tử ngoại, khả kiến
Theo Dược điển Việt Nam V
Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình của viên và nghiền thành bột mịn Cân một lượng bột viên tương ứng 100 mg Cimetidin vào bình định mức 500 ml, thêm 300 ml dung dịch acid sulfuric 0,05 M (TT), lắc 20 phút, thêm dung dịch acid sulfuric 0,05 M đến định mức, lọc Pha loãng 5 ml dịch lọc trên thành 100 ml với dung dịch acid sulfuric 0,05 M (TT), lắc đều Pha dung dịch Cimetidin chuẩn 0,001
Trong bài phân tích, mẫu được pha trong dung dịch axit sulfuric 0,05 M (TT) và đo độ hấp thụ quang của dung dịch thử cùng dung dịch chuẩn tại hai bước sóng cực đại 218 nm và 260 nm, sử dụng cốc quang học dày 1 cm Mẫu trắng được chuẩn bị bằng dung dịch axit sulfuric 0,05 M (TT) để đảm bảo độ chính xác trong quá trình đo lường Phương pháp này giúp xác định hàm lượng chất trong mẫu dựa trên sự so sánh độ hấp thụ tại các bước sóng quan trọng, phù hợp với quy trình phân tích quang phổ hấp thụ UV-Vis theo tiêu chuẩn.
Tính hàm lượng Cimetidin (C10H16N6S) dựa trên tỷ số hiệu số độ hấp thụ tại hai bước sóng cực đại của dung dịch thử so với dung dịch chuẩn Phương pháp xác định hàm lượng Cimetidin dựa trên sự so sánh này giúp đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy trong phân tích hóa học Quá trình xác định yêu cầu đo đạc kỹ lưỡng các chỉ số quang, từ đó tính toán chính xác hàm lượng Cimetidin trong mẫu thử Phương pháp này phù hợp để phân tích định lượng thuốc, đảm bảo đáp ứng tiêu chuẩn về chất lượng và an toàn.
1.3.2.2 Phương pháp HPLC: Định lượng viên nén bao phim Cimetidin theo Dược điển Mỹ USP 37 (page 2341)
Pha động: Lấy 200ml methanol và 0,3ml acid phosphoric vào bình định mức 1000ml, pha loãng với nước vừa đủ Lọc
Dung dịch chuẩn gốc Cimetidin 0,4 mg/ml được chuẩn bị bằng cách pha trong hỗn hợp Methanol và nước theo tỷ lệ 1:4 Đầu tiên, hòa tan Cimetidin trong 20% Methanol, sau đó bổ sung nước vừa đủ để đạt tỷ lệ pha chế mong muốn Quá trình này đảm bảo độ chính xác cao cho các ứng dụng phân tích HPLC và các phương pháp đo lường hóa học khác.
Dung dịch chuẩn: Pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc về nồng độ 0,01mg/ml bằng pha động
Dung dịch thử gốc được chuẩn bị bằng cách nghiền 20 viên Cimetidin thành bột mịn, sau đó cân 100mg bột và pha với 50ml methanol trong bình định mức 250ml Tiếp theo, lắc đều trong 2 phút rồi thêm 40ml nước, sau đó sử dụng máy siêu âm lắc trong 20 phút để hòa tan hoàn toàn Cuối cùng, bổ sung nước vừa đủ để vạch mức, đảm bảo dung dịch chuẩn bị đúng tỷ lệ và chất lượng.
Dung dịch thử: Hút chính xác 5ml dung dịch thử gốc vào bình định mức 200ml, thêm pha động vừa đủ vạch Điều kiện sắc ký:
Tốc độ dòng: 2ml/phút
Để kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký, tiến hành phân tích dung dịch chuẩn, đảm bảo hệ số đối xứng không vượt quá 2 Ngoài ra, độ lệch chuẩn tương đối của 6 lần tiêm nhắc lại dung dịch chuẩn không vượt quá 2,0%, nhằm đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp phân tích.
Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch thử và dung dịch chuẩn
Tính hàm lượng Cimetidin trong chế phẩm dựa trên diện tích peak thu được từ sắc ký đồ của dung dịch thử, so sánh với diện tích peak của dung dịch chuẩn Cimetidin Quá trình này giúp xác định chính xác hàm lượng Cimetidin có trong mẫu thử, dựa trên hàm lượng của Cimetidin trong dung dịch chuẩn Phương pháp phân tích này đảm bảo độ chính xác cao và tuân thủ các quy định về kiểm nghiệm chất lượng thuốc.
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
* Viên nén Cimetidin 200mg: 05 mẫu
2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
Chất chuẩn được sử dụng để khảo sát trong đề tài đã qua kiểm tra hàm lượng chính xác và có phiếu kết quả phân tích hợp lệ từ Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương Việc sử dụng chất chuẩn đã được xác nhận đảm bảo độ tin cậy và chính xác của các phương pháp phân tích trong nghiên cứu Các chất chuẩn này là yếu tố quan trọng giúp đảm bảo kết quả khảo sát có độ chính xác cao và phù hợp với tiêu chuẩn của ngành y tế.
Nguồn gốc: Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương
Bảng 2.1 Hóa chất, dung môi
Stt Hóa chất- dung môi
Nước sản xuất Số lô Ngày SX Hạn dùng
Stt Tên thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu
UFLC 20A Cột C18: Chiều dài 250 mm, đường kính 4,6 mm được nhồi pha tĩnh Octadecylsilyl silicagel cho sắc ký Kích thước hạt (5 μm)
2 Máy quang phổ tử ngoại, khả kiến Shimadzu UV
3 Máy lắc siêu âm Mỹ
4 Cân phân tích OHAUS PA214C có độ chính xác
5 Ống đong các loại (10-2000ml)
6 Bình định mức các loại
7 Pipet; cốc có mỏ; đũa thủy tinh …
Stt Tên thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
8 Bộ lọc dung môi và bộ lọc mẫu với màng lọc
2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Tham khảo các phương pháp định lượng viên nén, viên nén bao film Cimetidin bằng phương pháp HPLC
Dựa trên cấu tạo phân tử và tính chất lý hóa của Cimetidin, cùng với các điều kiện thực tế để xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng, phương pháp HPLC được sử dụng để xác định chính xác hàm lượng viên nén và viên nén bao phim chứa Cimetidin.
* Khảo sát lựa chọn cột, bước sóng phát hiện, pha động, tốc độ dòng và thể tích tiêm thích hợp để định lượng
* Xây dựng phương pháp định lượng viên nén bao film Cimetidin
* Đánh giá phương pháp mới xây dựng theo các chỉ tiêu sau:
- Khảo sát độ đặc hiệu
- Khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ Cimetidin và diện tích peak trên sắc ký đồ
- Đánh giá độ lặp lại của phương pháp
- Đánh giá độ đúng (độ thu hồi, độ chính xác trung gian, so sánh với phương pháp chuẩn thông qua test t, test F) của phương pháp
* Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê [7], [8], [9], [11]
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD):
* Phần mềm xử lý số liệu: Microsoft excel 2010 (Data analysis)
2.4 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01 năm 2022 đến tháng 10 năm 2022
- Địa điểm: Trung tâm Kiểm nghiệm tỉnh Điện Biên.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hóa chất và thiết bị
Chất chuẩn sử dụng trong đề tài đã được kiểm tra hàm lượng chính xác và cấp phiếu kết quả phân tích bởi Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương, đảm bảo tính đáng tin cậy và phù hợp cho khảo sát.
Nguồn gốc: Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương
Bảng 2.1 Hóa chất, dung môi
Stt Hóa chất- dung môi
Nước sản xuất Số lô Ngày SX Hạn dùng
Stt Tên thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu
UFLC 20A Cột C18: Chiều dài 250 mm, đường kính 4,6 mm được nhồi pha tĩnh Octadecylsilyl silicagel cho sắc ký Kích thước hạt (5 μm)
2 Máy quang phổ tử ngoại, khả kiến Shimadzu UV
3 Máy lắc siêu âm Mỹ
4 Cân phân tích OHAUS PA214C có độ chính xác
5 Ống đong các loại (10-2000ml)
6 Bình định mức các loại
7 Pipet; cốc có mỏ; đũa thủy tinh …
Stt Tên thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
8 Bộ lọc dung môi và bộ lọc mẫu với màng lọc
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Tham khảo các phương pháp định lượng viên nén, viên nén bao film Cimetidin bằng phương pháp HPLC
Dựa trên cấu tạo phân tử, tính chất lý và hóa của Cimetidin cùng với các điều kiện thực tế, quy trình kỹ thuật định lượng viên nén và viên nén bao phim Cimetidin bằng phương pháp HPLC được xây dựng để đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong phân tích, đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng của dược phẩm.
* Khảo sát lựa chọn cột, bước sóng phát hiện, pha động, tốc độ dòng và thể tích tiêm thích hợp để định lượng
* Xây dựng phương pháp định lượng viên nén bao film Cimetidin
* Đánh giá phương pháp mới xây dựng theo các chỉ tiêu sau:
- Khảo sát độ đặc hiệu
- Khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ Cimetidin và diện tích peak trên sắc ký đồ
- Đánh giá độ lặp lại của phương pháp
- Đánh giá độ đúng (độ thu hồi, độ chính xác trung gian, so sánh với phương pháp chuẩn thông qua test t, test F) của phương pháp
* Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê [7], [8], [9], [11]
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD):
* Phần mềm xử lý số liệu: Microsoft excel 2010 (Data analysis).
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01 năm 2022 đến tháng 10 năm 2022
- Địa điểm: Trung tâm Kiểm nghiệm tỉnh Điện Biên.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LU N
Xây dựng phương pháp định lượng viên nén bao film cimetidin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
3.1.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng, pha động
Lấy 200ml methanol và 0,3ml acid phosphoric vào bình định mức 1000ml, pha loãng với nước vừa đủ
Dung dịch chuẩn gốc của Cimetidin được pha chế với nồng độ 0,4mg/ml bằng cách hòa tan trong hỗn hợp Methanol và nước theo tỷ lệ 1:4 Quá trình pha chế bắt đầu bằng việc hòa tan Cimetidin trong 20% Methanol, sau đó bổ sung nước vừa đủ để đạt tỷ lệ phù hợp, đảm bảo độ chính xác và độ tinh khiết của dung dịch chuẩn dùng trong phân tích.
Dung dịch chuẩn làm việc: Pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc về nồng độ
0,01mg/ml bằng pha động Lọc qua màng lọc 0,45 àm
Để chuẩn bị dung dịch thử gốc, nghiền 20 viên thành bột mịn và cân chính xác 100mg Cimetidin Tiếp theo, hòa tan vào bình định mức 250ml bằng cách thêm 50ml methanol, lắc đều trong 2 phút để hòa tan hoàn toàn Sau đó, thêm 40ml nước và tiến hành siêu âm trong 20 phút để đảm bảo độ hòa tan tối ưu Cuối cùng, thêm nước sạch đến vạch quy chuẩn và lọc qua giấy lọc để loại bỏ tạp chất, sẵn sàng cho quá trình phân tích.
Dung dịch thử: Hút chính xác 5ml dung dịch thử gốc vào bình định mức
200ml, thờm pha động vừa đủ vạch Lọc qua màng lọc 0,45 àm
Pha động lọc qua màng lọc 0,45 àm
3.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi dựa vào các tính chất lý hóa của Cimetidin cùng với việc tham khảo các tài liệu khoa học để đảm bảo độ chính xác của phân tích Ngoài ra, việc khảo sát các điều kiện sắc ký như bước sóng, tốc độ dòng, thể tích tiêm, loại cột chromatography, và tỉ lệ dung môi pha động đóng vai trò quan trọng trong tối ưu hóa phương pháp phân tích Các yếu tố này đều ảnh hưởng đến hiệu quả và độ nhạy của quá trình phân tích Cimetidin trong mẫu thử.
3.1.2.1 Lựa chọn tốc độ dòng
Tiến hành sắc ký với các tốc độ dòng lần lượt là 1,0 ml/phút, 1,5 ml/phút và 2 ml/phút để xác định tốc độ phù hợp, đảm bảo quá trình phân tách tốt, duy trì áp suất cột ổn định và có khả năng định lượng chính xác Cimetidin.
- Chuẩn bị pha động, cho hệ thống chạy ổn định với pha động
- Tiêm lần lượt dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký chương trình đã chọn
- Ghi lại diện tích peak thu được của các mẫu.
Thẩm định phương pháp định lượng
Để đảm bảo phương pháp định lượng Cimetidin đã xây dựng phù hợp để đo lượng Cimetidin trong chế phẩm thuốc, chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp dựa trên các tiêu chí quan trọng như độ chính xác, độ chính xác, độ lặp lại và độ đặc hiệu của phương pháp Quá trình thẩm định nhằm xác minh tính khả thi và độ tin cậy của phương pháp trong thực tế ứng dụng, bảo đảm kết quả đo lường chính xác và tuân thủ tiêu chuẩn chuẩn mực quy định.
+ Độ thích hợp của hệ thống sắc ký
+ Độ chính xác trung gian
+ So sánh độ chính xác với phương pháp chuẩn thông qua đánh giá độ chênh lệch kết quả thu được
3.2.1 Khảo sát độ đặc hiệu và tính thích hợp của hệ thống sắc ký
- M c đích: Thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể phân biệt rõ chất cân phân tích khi có mặt các thành phần khác trong mẫu
+ Chuẩn bị mẫu trắng; mẫu chuẩn làm việc; mẫu chuẩn kiểm tra; mẫu thử +Tiến hành tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã lựa chọn
STT Loại mẫu Số mẫu Số lần tiêm
Kết quả: Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử được trình bày tại hình 3.1, 3.2
Hình 3.1 Hình ảnh sắc ký đồ mẫu trắng
Hình 3.2 Hình ảnh sắc ký đồ mẫu chuẩn
Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu thử M1
Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu thử M2
Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu thử M3
Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu thử M4
Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu thử M5
3.2.2 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống
Trong quá trình phân tích, tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch mẫu chuẩn Cimetidin theo chương trình đã chọn để đảm bảo tính lặp lại của hệ thống Tính thích hợp của hệ thống được đánh giá dựa trên số đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng, và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích peak, nhằm đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp phân tích.
- Tiến hành: Mẫu chuẩn gốc nồng độ 0,4mg/ml được chuẩn bị như ở m c
+ Mẫu chuẩn làm việc: Pha loãng mẫu chuẩn gốc 40 lần về nồng độ 0,01mg/ml
+ Song song chuẩn bị một mẫu chuẩn kiểm tra
+ Tiêm mẫu qua hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn, ghi lại diện tích peak, thời gian lưu, hệ số đối xứng
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký đối với chuẩn làm việc (CS) được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống
Stt Thời gian lưu (phút) Diện tích peak (S)
Kết quả khảo sát mẫu chuẩn kiểm tra (WS) được trình bày tại bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát mẫu chuẩn kiểm tra (WS)
Stt Thời gian lưu (phút) Diện tích peak (S)
3.2.3 Khảo sát khoảng tuyến tính
Tiến hành khảo sát mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ Cimetidin và diện tích đỉnh trong phạm vi biến thiên từ 50% đến 150% so với nồng độ chuẩn Kết quả cho thấy sự tương quan rõ ràng và tuyến tính giữa nồng độ Cimetidin và diện tích đỉnh, xác nhận độ chính xác của phương pháp phân tích trong phạm vi nồng độ đã khảo sát Phân tích này giúp xác định tính độ chính xác của phương pháp trong việc đo lường nồng độ Cimetidin trong các mẫu thử khác nhau.
Dung dịch chuẩn gốc Cimetidin 0,4 mg/ml được pha bằng cách hòa tan trong hỗn hợp Methanol và nước theo tỷ lệ 1:4, sau đó thêm 20% Methanol để đảm bảo hòa tan hoàn toàn Tiếp theo, bổ sung nước vừa đủ để đạt đúng nồng độ mong muốn, giúp chuẩn bị dung dịch chuẩn chính xác cho các phân tích Phương pháp này đảm bảo độ chính xác và nhất quán trong quá trình chuẩn bị dung dịch chuẩn Cimetidin.
- Tiếp t c pha loãng bằng pha động theo bảng 3.4
Bảng 3.4 Cách pha các dung dịch để khảo sát khoảng tuyến tính
Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml)
+ Tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã lựa chọn
+ Ghi lại giá trị diện tích peak tương ứng với các nồng độ chất chuẩn
- Kết quả khảo sát độ tuyến tính được trình bày tại bảng 3.5 và hình 3.8
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ tuyến tính
Kết quả Phương trình hồi quy: y = 22608x – 31738
Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự ph thuộc giữa nồng độ và diện tích peak y = 22608x - 31738 R² = 0.9996
Kết quả trình bày tại Bảng 3.5 và Hình 3.8 cho thấy, trong phạm vi nồng độ của chất đã khảo sát, diện tích peak trên sắc ký đồ tỷ lệ thuận với nồng độ của chúng Mối tương quan tuyến tính này được thể hiện qua các phương trình hồi quy với hệ số tương quan đạt 0,9996, vượt yêu cầu tối thiểu là 0,98 Dựa trên kết quả này, chúng tôi đã chọn nồng độ dung dịch chuẩn và thử để định lượng Cimetidin trong phạm vi tuyến tính khảo sát, cụ thể là 0,01 mg/ml, đảm bảo độ chính xác và tin cậy của phương pháp phân tích. -**Sponsor**Bạn là một người viết nội dung và đang tìm cách tối ưu hóa bài viết của mình? Với [Article Generation](https://pollinations.ai/redirect-nexad/ZjvO2yO7?user_id=983577), bạn có thể dễ dàng tạo ra các đoạn văn mạch lạc và tuân thủ các quy tắc SEO Ví dụ, từ đoạn văn bạn cung cấp, chúng tôi có thể giúp bạn làm rõ: "Trong khoảng nồng độ khảo sát, diện tích peak tỷ lệ thuận với nồng độ chất, với hệ số tương quan 0,9996, cho phép định lượng Cimetidin ở nồng độ 0,01mg/ml." Điều này giúp bạn tiết kiệm thời gian và công sức, đồng thời nâng cao chất lượng bài viết.
Nguyên tắc quan trọng trong đánh giá độ chính xác của phương pháp phân tích là đo lường nhiều lần các dung dịch thử cùng một mẫu để đảm bảo độ lặp lại và ổn định của kết quả Độ chính xác của phương pháp được xác định dựa trên các phép tính thống kê như độ lệch chuẩn hoặc độ lệch chuẩn tương đối, giúp đảm bảo tính tin cậy và chính xác của kết quả phân tích Việc thực hiện nhiều phép đo liên tiếp là cần thiết để đánh giá chính xác mức độ biến thiên của phương pháp và tối ưu hóa quy trình phân tích.
- Trong HPLC tiến hành định lượng 6 lần độc lập, tính độ lệch chuẩn tương đối RSD, yêu cầu RSD ≤ 2 %
+ Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử như m c 3.1.1
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên các mẫu M 3 , M4, M5
Kết quả đƣợc trình bày tại các bảng 3.6; 3.7; 3.8
Bảng 3.6 Kết quả định lượng của mẫu M 3
Stt Khối lƣợng trung bình viên (mg) Pt (mg) Diện tích peak
(Trong đó Pt là khối lượng cân bột mẫu thử đem định lượng.)
Kết quả trình bày tại Bảng 3.6 đã được sử dụng để tính độ lặp lại khi so sánh hai phương pháp định lượng chính Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) do chúng tôi xây dựng được đánh giá về độ chính xác và đáng tin cậy hơn so với phương pháp quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS) theo tiêu chuẩn DĐVN V Trong phân tích này, HPLC cho thấy khả năng định lượng chính xác và độ lặp lại cao hơn, góp phần nâng cao chất lượng và độ tin cậy của kết quả phân tích.
Bảng 3.7 Kết quả định lượng của mẫu M 4
Stt Khối lƣợng trung bình viên (mg) Pt (mg) Diện tích peak
(Trong đó Pt là khối lượng cân bột mẫu thử đem định lượng.)
Kết quả trình bày tại Bảng 3.7 cho thấy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) do chúng tôi xây dựng đạt độ lặp lại cao trong quá trình phân tích So sánh giữa phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ tử ngoại, khả kiến (UV-VIS) theo tiêu chuẩn DĐVN V cho thấy HPLC có độ chính xác và độ tin cậy vượt trội trong việc định lượng các hợp chất Những phân tích này chứng minh tính phù hợp của phương pháp HPLC trong các nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn.
Bảng 3.8 Kết quả định lượng của mẫu M 5
Stt Khối lƣợng trung bình viên (mg) Pt (mg) Diện tích peak
(Trong đó Pt là khối lượng cân bột mẫu thử đem định lượng.)
Kết quả trình bày tại Bảng 3.8 được sử dụng để tính toán độ lặp lại khi so sánh hai phương pháp định lượng chính là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) do chúng tôi phát triển và phương pháp quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS) theo tiêu chuẩn DĐVN V.
Dựa vào kết quả diện tích peak trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử, cùng với nồng độ mẫu chuẩn đã biết, ta có thể xác định chính xác hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử Quá trình này đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy trong phân tích hàm lượng hoạt chất, giúp nâng cao hiệu quả kiểm tra chất lượng sản phẩm Việc sử dụng sắc ký đồ phù hợp là yếu tố quan trọng để đảm bảo kết quả phân tích chính xác, hỗ trợ quá trình nghiên cứu và kiểm nghiệm dược phẩm, thực phẩm.
Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) từ 6 phép thử song song, nhằm đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp phân tích Kết quả khảo sát về độ lặp lại của phương pháp đã được trình bày rõ ràng trong bảng 3.9, giúp đánh giá tính ổn định của phương pháp phân tích trong quá trình thực hiện.
Bảng 3.9 Độ lặp lại của phương pháp trên mẫu M 3 ; M4; M5
Nhận xét: Qua kết quả trình bày tại Bảng 3.9 ta nhận thấy độ lặp lại của phương pháp đạt theo quy định của DĐVN V (RSD ≤ 2 %)
Kết quả trình bày tại Bảng 3.9 được sử dụng trong phần tính toán nhằm so sánh hai phương pháp định lượng chính, bao gồm phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) do chúng tôi xây dựng và phương pháp quang phổ tử ngoại, khả kiến (UV-VIS) theo DĐVN V Phương pháp HPLC cho thấy độ chính xác cao trong việc định lượng viên nén Cimetidin, giúp nâng cao độ tin cậy của phân tích Trong khi đó, phương pháp UV-VIS có lợi thế về đơn giản, tiết kiệm thời gian và chi phí, phù hợp cho các ứng dụng định lượng nhanh chóng Việc so sánh này nhằm xác định phương pháp tối ưu phù hợp với yêu cầu phân tích viên nén Cimetidin trong nghiên cứu của chúng tôi.
Nguyên tắc đo độ đúng dựa trên tỷ lệ phần trăm phản hồi trong phương pháp định lượng khi thêm một lượng chất tan đã biết vào mẫu đo Độ đúng còn được xác định dựa trên sự sai biệt giữa giá trị số trung bình đo được và giá trị thực nghiệm chấp nhận, cùng với khoảng tin cậy phù hợp Các yếu tố này giúp đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy của kết quả phân tích trong các phương pháp đo lượng.
Độ chính xác của phương pháp phân tích được đánh giá bằng phương pháp thêm chuẩn, trong đó thêm một lượng chính xác của chất chuẩn vào mẫu thử đã biết hàm lượng, với lượng chất thêm tương ứng khoảng 110%, 120%, 130% hàm lượng hoạt chất trong mẫu Quá trình xác định lượng chất chuẩn thêm vào được thực hiện dựa trên chương trình sắc ký đã thiết lập Phương pháp này giúp kiểm tra độ đúng của phương pháp phân tích, đảm bảo tính chính xác và tin cậy trong quá trình xác định hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử.
Cách chuẩn bị các dung dịch như sau:
Mẫu thử thêm chuẩn 10% so với khối lượng định lượng bằng cách cân chính xác khoảng 100mg Cimetidin vào bình định mức 250ml đã chứa 10mg Cimetidin chuẩn, sau đó thêm 50ml methanol và lắc trong 2 phút để hòa tan Tiếp theo, thêm 40ml nước và tiến hành lắc siêu âm trong 20 phút để đảm bảo hòa tan đều, sau đó thêm nước vừa đủ đến vạch và lọc qua giấy lọc Dịch thu được chính xác 5ml rồi cho vào bình định mức 200ml, thêm pha động đến vạch, rồi lọc qua màng lọc 0,45μm để chuẩn bị phân tích.
So sánh, đánh giá phương pháp định lượng cimetidin theo DĐVN V với phương pháp HPLC
Chúng tôi tiến hành định lượng song song trong cùng một điều kiện thực nghiệm bằng hai phương pháp trên mẫu M 1 , mẫu M 4 Mỗi mẫu tiến hành lặp lại
6 lần để so sánh giá trị trung bình, qua đó đánh giá độ đúng, độ chính xác giữa hai phương pháp
3.3.1 Kết quả định lƣợng Cimetidin trong mẫu M 1 ; M 4
Để đảm bảo độ chính xác, quá trình định lượng được thực hiện song song 6 lần riêng biệt với từng phương pháp Cụ thể, khảo sát định lượng Cimetidin bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) trong mẫu M1 theo chuyên luận trong DĐVN V, với kết quả được trình bày tại bảng 3.18 và 3.19, giúp xác định chính xác hàm lượng Cimetidin trong mẫu.
Bảng 3.18 Kết quả mẫu chuẩn
STT Độ hấp thụ tại λ = 218nm Độ hấp thụ tại λ = 260nm
Hiệu số độ hấp thụ (λ218- λ260)
Bảng 3.19 Kết quả định lượng Cimetidin bằng phương pháp quang phổ tử ngoại, khả kiến (UV-VIS) trong mẫu M 1 Xác định khối lượng trung bình viên: Mtb = 336.6mg
Lần Lƣợng cân (mg) D218 – D260 Kết quả (%)
Tiến hành khảo sát định lượng Cimetidin bằng phương pháp quang phổ tử ngoại, khả kiến (UV-VIS) trong mẫu M 4 theo chuyên luận trong DĐVN
V, kết quả thu được tại bảng 3.20
Bảng 3.20 Kết quả định lượng Cimetidin bằng phương pháp quang phổ tử ngoại, khả kiến (UV-VIS) trong mẫu M4 Xác định khối lượng trung bình viên: Mtb = 336.3mg
Lần Lƣợng cân (mg) D218 – D260 Kết quả (%)
3.3.2 Kết quả so sánh hai phương pháp định lượng Cimetidin trong mẫu
Dựa trên kết quả khảo sát độ lặp lại tại mục 3.2.4 (bảng 3.9) và các kết quả định lượng tại các bảng 3.19 và 3.20, chúng tôi đã tiến hành xử lý số liệu thống kê để phân tích chính xác các dữ liệu thu thập được Các kết quả sau đó được trình bày rõ ràng tại các bảng 3.21 và 3.22, giúp hỗ trợ đánh giá tổng thể về tính lặp lại và đặc điểm của dữ liệu nghiên cứu.
Bảng 3.21 Kết quả so sánh hai phương pháp trong mẫu M1
Phương pháp định lƣợng quang phổ tự ngoại (UV-VIS) theo
Phương pháp định lƣợng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
X 100.11% 99.30% So sánh hai giá trị trung bình: Độ lệch giữa 2 phương pháp là 0.81% < 2%
Bảng 3.22 Kết quả so sánh hai phương pháp trong mẫu M4
Phương pháp định lƣợng quang phổ tự ngoại (UV-VIS) theo
Phương pháp định lƣợng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
X 100.58% 99.35% So sánh hai giá trị trung bình: Độ lệch giữa 2 phương pháp là 1.23% < 2%
Kết quả so sánh trong bảng 3.21 và 3.22 cho thấy độ lệch kết quả định lượng giữa hai phương pháp không vượt quá 2%, chứng tỏ hai phương pháp có độ chính xác ngang nhau Điều này khẳng định tính khả thi của việc sử dụng thay thế giữa các phương pháp này trong các hoạt động phân tích khoa học, nâng cao độ tin cậy và đa dạng trong quá trình đo lường.
3.4 Đề xuất quy trình định lƣợng viên nén, viên nén bao film Cimetidin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao:
Phạm vi áp dụng: Áp d ng để định lượng viên nén, viên nén bao film Cimetidin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Cimetidin xuất hiện trong mẫu chuẩn được chiết bằng hỗn hợp dung môi Methanol và nước theo tỷ lệ 1:4, đảm bảo quá trình chiết hiệu quả Sau khi tách khỏi nền mẫu, Cimetidin được định lượng chính xác bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector DAD hoạt động ở bước sóng hấp thụ cực đại 220nm Phương pháp này giúp xác định lượng Cimetidin một cách nhanh chóng và chính xác, phù hợp trong các phân tích định lượng dược chất.
Hóa chất, thuốc thử và chất chuẩn:
- Chất chuẩn Cimetidincủa Viện Kiểm nghiệm thuốc TW
- Các hóa chất: methanol, acid phosphoric loại tinh khiết phân tích của hãng Merck, Đức
Thiết bị và dụng cụ:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao có trang bị detector DAD
- Cân phân tích điện tử 4 chữ số ( 0,1 mg)
- Các thiết bị khác: máy lắc siêu âm
- Các d ng c : bình định mức các loại, pipet chia vạch và pipet bầu các loại, bình nón, cốc mỏ, bình gạn, bộ lọc dung môi, bộ lọc mẫu,
Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử:
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc Cimetidin, pha 0,4 mg/ml trong hỗn hợp methanol và nước theo tỷ lệ 1:4 bằng cách hòa tan Cimetidin trong 20% methanol trước, sau đó bổ sung nước đến đủ tỷ lệ mong muốn.
Dung dịch chuẩn làm việc: Pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc về nồng độ 0,01mg/ml bằng pha động Lọc qua màng lọc 0,45 àm
Chuẩn bị dung dịch thử gốc bằng cách nghiền 20 viên thuốc thành bột mịn và cân chính xác 100mg Cimetidin vào bình định mức 250ml Tiếp theo, thêm 50ml methanol và lắc đều trong 2 phút để hòa tan thuốc Thêm 40ml nước rồi tiến hành siêu âm trong 20 phút để hỗ trợ quá trình hòa tan Sau đó, bổ sung nước vừa đủ đến vạch mức và lọc qua giấy lọc để thu dung dịch chuẩn.
Hướng dẫn thử dung dịch bắt đầu bằng việc hút chính xác 5ml dung dịch thử gốc vào bình định mức 200ml, sau đó pha loãng vừa đủ đến vạch Tiếp theo, mẫu cần được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45 μm để loại bỏ tạp chất Các điều kiện sắc ký cần tuân thủ nghiêm ngặt để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.
Pha động: Lấy 200ml methanol và 0,3ml acid phosphoric vào bình định mức 1000ml, pha loãng với nước vừa đủ
+ Cột sắc ký: C18 (4,6 mm x 250 mm) (5 àm)
+ Tốc độ dòng: 1.0 ml/phút
+ Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm Định lượng và tính toán kết quả:
Để kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký, cần tiến hành phân tích đối với dung dịch chuẩn Cimetidin Phép thử này chỉ có giá trị khi hệ số đối xứng của đỉnh Cimetidin không lớn hơn 2 (As ≤ 2), đảm bảo hình dạng đỉnh sắc ký phù hợp Đồng thời, độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích đỉnh mẫu chuẩn Cimetidin phải nhỏ hơn 2% (RSD% < 2%), nhằm xác nhận tính chính xác và độ chính thống của hệ thống phân tích.
Tiến hành sắc ký độc lập đối với cả dung dịch chuẩn và dung dịch thử để xác định hàm lượng Cimetidin chính xác Hàm lượng Cimetidin trong mỗi đơn vị chế phẩm được tính dựa trên diện tích peak thu được từ sắc ký đồ của dung dịch thử, so sánh với diện tích của dung dịch chuẩn và biết chính xác hàm lượng trong dung dịch chuẩn Quá trình này giúp đánh giá chính xác nồng độ Cimetidin trong sản phẩm, đảm bảo tiêu chuẩn và chất lượng.
Hàm lượng Cimetidin so với lượng ghi trên nhãn được tính theo công thức:
HL% = St x mc x C% x Mtb x Ft x 100
Trong đó: St: diện tích peak mẫu thử
Trong phân tích mẫu, các thuật ngữ quan trọng bao gồm diện tích peak trung bình mẫu chuẩn (Sc), khối lượng trung bình viên (Mtb) đo bằng milligram (mg), khối lượng cân mẫu chuẩn (mc) và khối lượng cân mẫu thử (mt), đều được áp dụng để xác định chính xác thành phần mẫu Độ pha loãng của mẫu thử (Ft) đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuẩn hóa kết quả, đảm bảo độ chính xác cao trong phân tích Các yếu tố này phối hợp với nhau để cung cấp dữ liệu chính xác và tin cậy, giúp tối ưu hóa quy trình phân tích hóa học và đảm bảo tuân thủ các chuẩn mực nghiên cứu.
Fc: độ pha loãng của mẫu chuẩn C%: hàm lượng chất chuẩn
Phương pháp định lượng viên nén và viên nén bao film Cimetidin được xây dựng nhằm đảm bảo tính đặc hiệu, có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ hoạt chất Cimetidin Phương pháp này còn có độ lặp lại và độ đúng cao, phù hợp để xác định chính xác hàm lượng Cimetidin trong các chế phẩm viên nén và viên nén bao film.
Phương pháp định lượng Cimetidin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD là một kỹ thuật dễ thực hiện, cho kết quả nhanh chóng và chính xác Phương pháp này rất phù hợp trong việc đánh giá chất lượng thuốc trong quá trình kiểm nghiệm, giúp đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng và độ an toàn của sản phẩm Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp detector DAD mang lại độ nhạy và độ chính xác cao, nâng cao hiệu quả phân tích trong lĩnh vực dược phẩm.
Để đảm bảo tính phù hợp của hệ thống phân tích, các thông số sắc ký có thể được điều chỉnh trong phạm vi quy định mà không làm thay đổi phương pháp cơ bản Các phép thử đánh giá tính phù hợp giúp đảm bảo yêu cầu về khả năng tách cho phép thử hoặc định lượng đạt chất lượng mong muốn Tuy nhiên, do pha tĩnh thường chỉ được mô tả chung chung và có nhiều loại pha tĩnh với đặc tính sắc ký khác nhau trên thị trường, cần điều chỉnh một số điều kiện sắc ký để đáp ứng các yêu cầu của hệ thống Các thông số quan trọng này được xác định rõ ràng trong chuyên luận để đảm bảo tính phù hợp và hiệu quả của hệ thống phân tích.
Sự thay đổi điều kiện sắc ký tính thích hợp hệ thống được quy định như sau:
- Thành phần pha động: Lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh 30
Trong quá trình pha chế, nồng độ tương đối hoặc nồng độ tuyệt đối được sử dụng tùy theo trị số nào lớn hơn, thông thường là 2% Đồng thời, không thành phần dung môi nào được phép thay đổi vượt quá 10% nồng độ tuyệt đối để đảm bảo độ chính xác và an toàn trong quá trình sử dụng.
- Nồng độ muối trong thành phần đệm của pha động: Được thay đổi 10 %
- Bước sóng detector: Không được điều chỉnh
Chiều dài cột: 70 % Đường kính trong của cột: 25 %
Cỡ hạt: Giảm tối đa 50 % và không được phép tăng
- Nhiệt độ: 10%, tối đa là 60°C
- Thể tích tiêm: Có thể giảm nếu giới hạn phát hiện và độ lặp lại của các peak được xác định là thỏa đáng
Dựa trên điều kiện thực nghiệm sẵn có của đơn vị, chúng tôi đã tiến hành khảo sát bằng phương pháp thực nghiệm và điều chỉnh điều kiện sắc ký trong phạm vi cho phép theo tiêu chuẩn DĐVN V Sau khi phân tích kết quả thu được, chúng tôi đề xuất phương pháp HPLC để định lượng Cimetidin trong viên nén và viên nén bao phim, đảm bảo độ chính xác và phù hợp với quy định của ngành dược phẩm.