Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên bề mặt của virus h5n1 phục vụ sản xuất vaccine thực vật

Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên bề mặt của virus H5N1 phục vụ sản xuất Vaccine thực vật Nguyễn Thu Hiền và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(0[.]

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT

Nguyễn Thu Hiền 1 , Chu Hoàng Mậu 1* , Lê Văn Sơn 2 , Chu Hoàng Hà 2

1 Đại học Thái Nguyên; 2

Viện công nghệ sinh học,VAST

TÓM TẮT

H5N1 là một phân nhóm của cúm A, nó ảnh hưởng đến sức khỏe con người do tiếp xúc trực tiếp với gia cầm nhiễm bệnh Để ngăn chặn sự lây nhiễm virus, các phương pháp phổ biến nhất hiện nay là tiêm phòng Hiện nay, đã có nhiều loại vắc xin phòng bệnh cúm A/H5N1 được bán sẵn trên thị trường Tuy nhiên, vaccine đường miệng là mục tiêu nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới, bởi vì vaccine này có thể ăn được, dễ quản lý và có khả năng kích thích cơ thể sản xuất kháng thể có hiệu quả hơn so với các loại vaccine tiêm Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu tạo cây đậu tương biến đổi gen ở giống đậu tương DT12 trồng phổ biến ở Việt

Nam, bằng cách lây nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens mang vector tái tổ hợp vào nách lá mầm Kiểm

tra các cây chuyển gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, kết quả đã có 8 cây dương tính với PCR Các kết quả này là cơ sở cho việc tạo các giống đậu tương biến đổi gen có thể sản xuất

kháng nguyên phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam

Từ khoá: Biểu hiện, kháng nguyên, thực vật chuyển gen, H5N1, vaccine thực vật

MỞ ĐẦU*

Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính

của gia cầm, do nhóm virus cúm A, thuộc họ

Orthomyxoviridae gây ra, có khả năng lan

truyền từ động vật sang người Theo Tổ chức

y tế thế giới (WHO) tính từ 2003 đến nay

toàn thế giới ghi nhận 562 trường hợp mắc

cúm A/H5N1 ở 15 quốc gia trong đó có 329

trường hợp tử vong còn ở Việt Nam có 119

trường hợp mắc trong đó 59 trường hợp tử

vong (WHO 2011) Đối với dịch cúm trên

người, nghiên cứu phát triển vaccine không

những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia

cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của

loại virus nguy hiểm này sang người.Vaccine

ăn được ở thực vật là vaccine tiểu phần

protein được sản xuất dựa trên hệ thống thực

vật để thu được protein làm miễn dịch thể

dịch và miễn dịch tế bào Vaccine này bền

vững trong dịch tiêu hóa, đi qua đường tiêu

hóa mà không bị phân hủy [5]

Với sự phát triển của công nghệ sinh học,

diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế

giới ngày càng tăng trong đó đậu tương biến

đổi gen chiếm diện tích lớn nhất trong tổng

diện tích cây trồng biến đổi gen.Một trong

* Tel: 0913383289;Email: mauchdhtn@gmail.com

những biện pháp chuyển gen mang lại hiệu quả cao và đang được áp dụng rộng rãi hiện nay là phương pháp chuyển gen thông qua

A.tumfaciens [6] Trong bài báo này chúng tôi

đã sử dụng giống đậu tương DT12 làm đối

tượng để chuyển gen mã hoá hemaglutinin(HA1) của virus H5N1 thông qua phương pháp nách lá mầm nhờ vi khuẩn

A.tumfaciens nhằm cơ sở cho việc sản xuất

vaccine ăn được cho gia cầm phòng chống bệnh A/H5N1

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Giống đậu tương ĐT12 do Trung tâm Nghiên cứu Phát triển cây đậu đỗ, Viện cây lương thực và cây thực phẩm cung cấp

Chủng vi khuẩn A.tumefaciens EHA105

chứa vector pBeta-Phaso-HA do Viện công nghệ sinh học cung cấp

Phương pháp nghiên cứu

Tạo nguyên liệu chuyển gen

Hạt đậu tương chín sau khi được khử trùng, nảy mầm hạt, tách và thu phần lá mầm (tương

tự như tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro trong quy trình tái sinh cây) sẽ được gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 7-8 lần vào nách lá mầm Lá mầm đã được làm tổn thương sẽ dùng cho bước nhiễm khuẩn tiếp theo

Nguyễn Thu Hiền và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 123 - 127

124

Bảng 1 Thành phần các môi trường trong tái sinh cây đậu tương

Nảy mầm hạt

(GM)

3,052 g/l muối B5 + 20 g/l sucrose + 6 g/l agar, pH = 5,8

1 mg/l vitamin B5 Môi trường đồng

nuôi cấy (CCM)

0,3052 g/l muối B5 + 3,9 g/l MES + 30 g/l sucrose, pH = 5,4

1 mg/l vitamin B5 + 1,0 - 3,0 mg/l BAP+ 0,2 mM acetosyringon + 400 mg/l L-cystein + 158 mg/l sodium thiosulfate + 154 mg/l DTT + 0,25 mg/l GA3

Môi trường cảm

ứng tạo chồi

(SIM)

3,052 g/l muối B5 + 0,59 g/l MES + 30 g/l sucrose, pH = 5,6

1 mg/l vitamin B5 + 1,0 - 3,0 mg/l BAP + 50 mg/l Timentin + 200 mg/l Cefotaxim +

50 mg/l Vancomycin + 75 mg/l Kanamycin Môi trường kéo

dài chồi (SEM)

4,3 g/l MS + 0,59 g/l MES + 30 g/l sucrose + 6 g/l agar, pH = 5,6

1 mg/l vitamin B5 + 50 mg/l Lasparagine + 100 mg/l Lpyron glutamic acid + 0,1 -0,5 mg/l IAA + -0,5 -1,5 mg/l GA3+ 50 mg/l Timentin + 200 mg/l Cefotaxim + 50 mg/l Vancomycin + 75 mg/l Kanamycin

Môi trường tạo rễ

(RM)

1,58 g/l MS + 0,59 g/l MES + 20 g/l sucrose + 6 g/l agar, pH = 5,6 0,1 mg/l IBA + 1 mg/l vitamin B5+ 50 mg/l Timentin + 200 mg/l Cefotaxim + 50 mg/l Vancomycin + 75 mg/l Kanamycin

Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A

tumefaciens

Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: cấy trải A

tumefaciens EHA 105 mang vector chuyển

gen giữ chủng trong glycerol lên đĩa môi

trường YEP đặc, có bổ sung kháng sinh là:

50 g/l rifamycin và 100 mg/l spectinomycin

Đĩa khuẩn được đặt ở tủ 280

C trong điều kiện tối 2 ngày

Nuôi lỏng vi khuẩn: dùng que cấy chọn một

khuẩn lạc trong đĩa khuẩn cho vào 50 ml YEP

lỏngcó bổ sung 50 g/l rifamycin và 100 mg/l

spectinomycin Nuôi lắc 200 vòng/phút ở

280C trong 16h

Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: dịch khuẩn thu

từ quá trình nuôi lỏng được ly tâm ở 5000v/p

trong 10 phút ở 40C Loại bỏ phần dịch nổi và

hòa tan cặn khuẩn trong môi trường CCM

lỏng có bổ sung acetosyringone 200 mg/l và

pha loãng cho đến khi dịch khuẩn có OD660nm

đạt 0,8-1 Dịch huyền phù này được dùng cho

biến nạp

Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy

Môi trường đồng nuôi cấy là CCM đặc có bổ

sung acetosyringone 200 mg/l, thành phần

môi trường được chỉ ra trong bảng 1.CCM

được đổ trên đĩa petri, khi khô đặt giấy thấm

đã khử trùng lên trên bề mặt môi trường

Mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi

khuẩn trong thời gian 30 phút Sau thời gian

nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc Quá trình

đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250

C trong

thời gian là 5 ngày

Diệt khuẩn và tạo đa chồi

Mẫu sau thời gian đồng nuôi cấy được lắc trong môi trường SIM lỏng có bổ sung 500 mg/l cefotaxim trong thời gian là 10 phút Sau

đó, đặt mẫu lên giấy thấm khử trùng, thấm

khô mẫu Dùng panh và dao cắt bỏ chồi chính xuất hiện trên các mảnh lá mầm, cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi SIM đặc, có bổ sung

500 mg/l cefotaxim Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc

có bổ dung 500 mg/l cefotaxim, trong 2 tuần

Tái sinh cây hoàn chỉnh

Các cụm chồi sống được trên môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM có bổ sung kháng sinh 500 mg/l cefotaxim và 50mg/l kanamycine Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3-5 cm thì

được chuyển sang môi trường ra rễ RM có bổ

sung 250 mg/l cefotaxim và 25mg/l kanamycine Cây To tái sinh hoàn chỉnh được chuyển ra trồng trên đất chăm sóc trong nhà lưới

Kiểm tra cây chuyển gen bằng phản ứng PCR

DNA của cây được tách chiết theo phưong pháp của Edwards(1991) [7].Tiến hành phản

ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen HA1

theo chu kì nhiệt: 940C/5 phút 30 chu kì

(94 C/30 giây, 54C/30 giây, 72C/1 phút 30

giây 720C/7 phút và 40C/30 phút Sản phẩm

PCR được điện di trên gel agarose 0,8%

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Đánh giá khả năng tạo chồi

Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào rất nhiều

yếu tố như nguồn vật liệu ban đầu, môi

trường nuôi cấy, thời gian nhiễm khuẩn,

vector chuyển gen, Trong nghiên cứu này,

cây mầm 4 – 5 ngày tuổi được sử dụng làm

vật liệu chuyển gen bởi ở giai đoạn này, việc

tách đôi hai lá mầm được thực hiện dễ dàng,

đồng thời chồi ngọn và chồi bên có thể được

phát hiện và loại bỏ nhằm tránh hiện tượng ưu

thế ngọn ảnh hưởng đến sự phát triển của các

mô phân sinh phụ nằm ở vùng nách lá

mầm.Việc sử dụng dao gây tổn thương nách

lá mầm giúp cho mẫu vật sản sinh ra các hợp chất phenolic có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn, làm tăng cường khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn Ngoài ra, tổ hợp các hợp chất có chứa thiol (L-cysteine, dithiothreitol và sodium thiosulfate) được bổ sung vào môi trường

đồng nuôi cấy CCM giúp làm tăng khả năng

gắn T-DNA vào bộ gen thực vật và do đó

tăng hiệu quả chuyển gen (Olhoft et al.,

2001) Tiến hành thí nghiệm với tổng số 650 mẫu cho chuyển gen HA, có 65 chồi kéo dài trên môi trường chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, trong đó 45 chồi có khả năng ra

rễ và thu nhận được 32 cây T0 phát triển trên giá thể (bảng2)

Bảng 2 Khả năng tái sinh thông qua nách lá mầm của giống đậu tương ĐT12

Lô thí nghiệm Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo chồi Số chồi kéo dài Số chồi ra rễ Số cây sống

trên giá thể

Hình 1 Quy trình chuyển gen ở đậu tương

Hạt sau khử trùng 3

Cảm ứng tạo chồi trên SIM-Km50/5d

Chọn lọc trên SIM-Km75/4 tuần

Kéo dài chồi trên SEM-Km50/ 4 -8 tuần

Ra rễ trên RM/4 tuần

Hạt đậu tương

Ra cây trên

cát/trấu

Nguyễn Thu Hiền và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 123 - 127

126

Kết quả kiểm tra cây chuyển gen HA bằng

phản ứng PCR

Sử dụng 3µl sản phẩm DNA đã được tách

chiết, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với

các cặp mồi đặc hiệu Kết quả điện di sản

phẩm PCR cho thấy đã thu nhận được 8 cây

dương tính với phản ứng PCR nhân gen HA,

chiếm tỷ lệ 1,2 % tổng mẫu biến nạp (Hình2)

Các dòng cây này đang được tiếp tục trồng để

thu hạt và đánh giá sự biểu hiện của gen

chuyển ở các thế hệ sau( hình 3)

Hình 2 Phân tích cây đậu tương T0 chuyển gen

HA M: Thang DNA chuẩn 1kb; -: Đối chứng âm;

WT: Cây không chuyển gen; 1 – 8: Các dòng T0

được phân tích; +: Đối chứng dương (plasmid)

KẾT LUẬN

Hình 3 Các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0

được trồng trong nhà lưới

Sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua

nách lá mầm nhờ vi khuẩn A.tumefacien,

bước đầu đã thu được 8 dòng cây T0 mang gen HA Đây là tiền đề quan trong cho việc tạo được các dòng đậu tương mang gen mã hoá cho các kháng nguyên của virus H5N1 làm vacine ăn đựơc cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1 ở Việt Nam

TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bardiya N and Bae JH (2005) Influenza vaccines: recent advances in production

technologies Appl Microbiol Biotechno 67:

299 – 305

[2] Biemelt S, Sonnewald U, Galmbacher P, Willmitzer L, Mueller M (2003) Production of Human Papillomavirus Type 16 Virus-Like

Particles in Transgenic Plants J Virol 77:

9211-9220

[3] Binh LT and Trang CH (2005) Research and

development of plant edible vaccines J Biotech 3:

133-143

[4] Bolivar FM, Wright R, Funk V, Sentz D, Barrroso L, Wilkins TD, Petri W, Cramer CL (2003) A non – toxic lectin for antigen delivery of plant – based mucosal vaccine

Vaccine 21: 997-1005

[5] Dinh DK, Le TH, Nong VH, Phan VC, Nguyen BN, Nguyen DT and Le TB (2004) Molecular analysis of the avian influenza virus

H5N1 isolated inpoultry in Vietnam GenBank Acc Number AY574192

[6] Donaldson PA, Simmonds DH (2000) Susceptibility of A.tumefaciens andcotyledonary node transformation in shor-season soybean Plant Cell Rep 19: 478-484

[7] Edwards K, Johnstone C and Thompson C (1991) A simple and rapid method for thepreparation of genomic plant DNA for PCR

analysis Nucleic Acids Res 19: 1349

[8] Fischer R, Stoger E, Schillberg S, ChristouP and Twyman RM (2004) Plant-based production

of biopharmaceuticals CurrOpinion in Plant Biol

7: 152-158

SUMMARY

THE STUDY CREATED TRANSGENIC SOYBEAN CULTIVARS BEARING STRUCTURE EXPRESSED GENES ENCODING SURFACE ANTIGEN OF THE

Nguyễn Thu Hien 1 , Chu Hoang Mau 1* , Le Van Son 2 , Chu Hoang Ha 2

1 Thai Nguyen University, 2 Institute of Biotechnology

H5N1 is a subtype of influenza A, it affects human health by direct contact with infected poultry

To prevent the virus infection, the most common method today is vaccination Currently, many types of influenza A/H5N1 vaccine is commercially available in the market To prevent the viral infection, the most common method is vaccination Currently, many types of influenza A/H5N1 vaccine is commercially available in the market However, the oral vaccine is the research targeted

of scientists in the world, because this vaccine can eat, easy to manage and able to stimulate the body to produce antibodies and have more effectively than the other injected vaccine In this paper, we present the results of research to create genetically modified soybean cultivars from DT12 soybean in Vietnam, by infecting in cotyledonary-node by bacteria A.tumefaciens carrying recombinant vector Testing these genetically modified soybean plant by PCR with specific primers, results show there were 8 positive cultivars with PCR These results are base for creating transgenic soybean cultivars with can produce antigen poultry flu A/H5N1 disease for in Vietnam These results are the basis for creating the genetically modified soybean, can produce antigen A/H5N1 bird flu in Vietnam

Keywords: Antigen, gene expression, H5N1, transgenic plant, plant vaccine

*

Tel: 0913383289;Email: mauchdhtn@gmail.com