TIEU LUAN MON CAC HOAT CHAT SINH HOC -TACH CHIET FLAVONOID TU DIEP CA

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Môn: CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌCĐỀ TÀITÁCH CHIẾT FLAVONOID TỪ DIẾP CÁGVHD: Lại Đình BiênLỚP: 12CDSH2NHÓM: FLAVONOIDtổng quan về tài liệu1.1 Tổng quan về thực vật:Cây Diếp cá còn có  tên là cây Giấp cá, Lá giấp, Ngư tinh thảo. Tên khoa học là Houttuynia cordata ThunbTên tiếng Anh của nó là heartleaf (lá hình tim) hay lizardtail (đuôi thằn lằn).Phân loại:Giới Thực vật (Plantae) - Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) - Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) - Bộ Hồ tiêu (Pip rals) - Họ Lá giấp (Saururac a ) - Chi Diếp cá (Houttuynia Thunb.) - Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) - Phân lớp Ngọc lan (Magnoliida ) 1.1.1 Mô tả thực vật : Cây thuộc thảo, thân ngầm, rễ mọc ở các đốt. thân trên mặt đất mọc đứng cao 40cm, có long. Lá hình tim, mền nhẵn, mặt dưới tím nhạt, khi vò có mùi tanh như cá do đó có tên là diếp cá hay ngư tinh thảo. Cụm hoa là bông, màu vàng không có hoa, có 4 lá bắc trắng; tất cả nhìn như một cái hoa đơn độc. Quả nang mở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn 1.1.2 Phân bố, sinh thái Phân bố từ Nhật Bản, Trung Quốc tới Nêpan, Ấn Độ, các nước Đông Dương và Indonsia. Ở nước ta, cây mọc rất phổ biến. Cây mọc hoang ở những nơi ẩm thấp. Ở miền Nam được trồng nhiều làm rau sống.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

Môn: CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC

TÁCH CHIẾT FLAVONOID

TỪ DIẾP CÁ

GVHD: Lại Đình Biên LỚP: 12CDSH2

NHÓM: FLAVONOID

 1.1 Tổng quan về thực vật:

 Cây Diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, Lá giấp, Ngư tinh thảo

 Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb

 Tên tiếng Anh của nó là heartleaf (lá hình tim) hay liza

rdtail (đuôi thằn lằn)

 - Chi Diếp cá (Houttuynia Thunb.)

 - Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.)

 - Phân lớp Ngọc lan (Magnoliida )

 Cây thuộc thảo, thân ngầm, rễ mọc ở các đốt thân trên mặt đất mọc đứng cao 40cm, có long Lá hình tim, mền nhẵn, mặt dưới tím nhạt, khi vò có mùi tanh như cá do đó có tên là diếp cá hay ngư tinh

thảo Cụm hoa là bông, màu vàng không có hoa,

có 4 lá bắc trắng; tất cả nhìn như một cái hoa đơn độc Quả nang mở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn

 Phân bố từ Nhật Bản, Trung Quốc tới Nêpan, Ấn

Độ, các nước Đông Dương và Indonsia

 Ở nước ta, cây mọc rất phổ biến Cây mọc hoang ở những nơi ẩm thấp Ở miền Nam được trồng nhiều làm rau sống

 - Các flavonoid: quercitrin (=quercetin 3-

rhamnosid), isoquercitrin (quercetin 3-glucosid)

 - Tinh dầu: Đây là thành phần làm cho dược liệu

có mùi đặc biệt Thành phần chủ yếu của tinh dầu

là methylnonylceton, laurylaldehyd, caprylaldehyd

và decanonyl acetaldehyd Chất sau cùng này là thành phần chính nhưng không bền và dễ bị phân huỷ khi chưng cất

 - Ngoài ra trong diếp cá còn có nhiều chất khác: (4-hydroxystyryl)-benzamid, aristolactam, các

N-alcaloid nhân pyridin, 1,3,5 - tridecanonylbenzen

 - Tác dụng kháng nhiều loại virus đã được nghiên cứu Thành phần có tác dụng là quercitrin và tinh Tinh dầu ức chế trực

tiếp các virus sau: Virus gây bệnh herpes (mụn rộp) chủng 1 (HSV-1), virus gây bệnh cúm và HIV chủng 1 của người (HIV- 1) nhưng không thấy có tác dụng chống virus gây bệnh bại liệt

 - Diếp cá còn có tác dụng kháng viêm, thông tiểu Tác dụng

làm bền mao mạch của quercitric đã được chứng minh

 - Dược điển Trung quốc chỉ định dùng lá diếp cá trong các

trường hợp apxe phổi, ho khó thở, lỵ, nhiễm trùng đường tiểu tiện, mụn nhọt

 - Có thể dùng diếp cá tươi để chữa đau mắt đỏ có tụ máu (giã nhỏ lá, ép vào hai miếng giấy bản, đắp vào mắt), bệnh trĩ (hãm lấy nước uống và rửa) Diếp cá là thứ rau ăn thông thường ở miền Nam Đây cũng là nguồn cung cấp vitamin P rất tốt cho

cơ thể

2.1 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO DIẾP

CÁ

 Bột Diếp Cá được làm ẩm với cồn 96% trong 2h, nạp vào bình ngấm kiệt, thêm cồn vào bình chiết, ngâm trong 12h

Rút dịch chiết ở tốc độ 10-12 giọt/phút cho đến khi dịch chiết nhạt màu Gộp toàn bộ dịch chiết cồn, cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch

chiết đậm đặc

 Dịch A (mục 3.1.1.) được pha loãng với 1 lít nước, lắc phân bố với CHCl3 đến khi dịch

CHCl3 không còn cho màu xanh nhạt với TT

FeCl3 5%, dịch CHCl3 được rửa nước nhiều lần, gộp các dịch CHCl3, cô thu hồi dung môi được cao A1 (12 )

 Dịch A còn lại được lắc phân bố với ethyl acetat đến khi dịch ethyl acetat không còn cho màu xanh rêu

đậm với TT FeCl3 3,5%, rửa dịch ethyl acetat với 100 ml nước cất, gộp các dịch ethylacetat, cô thu hồi dung môi được cao lỏng A2 (54 g) A2 được dùng làm mẫu để phân lập các flavonoid bằng sắc ký cột nhanh (VLC)

 Dịch A còn lại tiếp tục được lắc phân bố với nbutanol đến khi dịch nbutanol không còn cho màu xanh đen với TT FeCl3 3 ,5% Dịch n-butanol thu được, rửa nước nhiều lần, gộp các dịch n-butanol, cô thu hồi dung

môi được cao A3 (7 g)

 Định tính flavonoid trong các cao A1, A2,

A3 bằng phản ứng cyannidin và sắc ký lớp mỏng

 Kết quả: phân đoạn 2 – cao A2 giàu

flavonoid so với phân đoạn 1 và phân đoạn 3,

do đó A2 được dùng để phân lập các flavonoid bằng sắc ký cột

Phân lập flavonoid từ cao A2 bằng SKC chân

không

 Thăm dò hệ dung môi trên sắc ký lớp mỏng

 Khảo sát một số hệ dung môi, tiến

hành thăm dò trên sắc ký lớp mỏng tráng sẵn

(silica gel F254), phát hiện bằng TT FeCl3 5%,

soi UV 254nm, UV 365nm và thu được kết quả

như sau:

STT Hệ dung môi trên sắc kí Khả năng tách

1 Butyl acetat-acid formic ++

Kết quả: Hệ Butyl acetat- nước (15:5) có khả năng tách tốt, R1 thích hợp nên được dùng để tiến

hành triển khai trên sắc ký cột chân không Tuy nhiên

do không có mặt của acid formic nên các vết tách kéo đuôi, do đó silica gel sẽ được tầm 5% acid formic để tách gọn hơn

 Phân lập flavonoid bằng sắc ký cột chân không

- Pha động: Butyl acetat- nước (15:5)

- Nhồi bột: Nhồi bột khô, sau đó cho 15ml pha động chảy qua cột , hút chân không đến khi không còn dung môi

- Khối lượng mẫu: 25g cao A2

- Nạp mẫu dạng dung dịch Mẫu được nạp đều lên bề mặt silica gel, hút chân không đến khi mẫu thấm hết xuống silica gel, sau đó tiến hành hứng phân đoạn

- Thể tích hứng mỗi phân đoạn là 150ml

- Kiểm tra các phân đoạn trên bảng sắc ký lớp mỏng tráng sẵn với dung môi Butyl acetat- nước-acid formic (15:5:5), phát hiện dưới ánh sáng thường, UV 254nm, UV 365nm, thuốc thử FeCl3

 Kết quả : Thu được 5 phân đoạn được ghi ở bảng sau:

Phân đoạn V(ml) P(g) Thành phần

Bảng 3.1 Kết quả phân lập flavonoid bằng dung môi butyl acetat- nước (15:5)

A

B _

C _

D _

E _

F _

G _

H _ _ _

I _ _

J _ _

TP 1 2 3 4 5

Nhận xét:

 Phân đoạn 1 (1,1g) được kết tinh trong methanol thu

được tinh thể tinh thiết màu vàng chanh , đặt tên là DC1

(34mg) Tinh thể được kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng qua 4

hệ dung môi khác nhau ethyl acetat-nước-acid

 Phân đoạn 2 (3,7g) có ít nhất 3 vết phát quang màu dưới đèn UV

365 nm và cho màu xanh đen TT.FeCl3, trong đó có 1 vết chiếm lượng lớn , tiến hành kết tinh phân đoạn này nhiều lần trong methanol bằng cách hòa tan hoàn toàn phân đoạn này trong lượng vừa đủ methanol, lọc qua phễu thủy tinh xốp Dung dịch được để trong tủ lạnh, cho bay hơi dung môi từ từ, lọc và rửa tinh thể methanol lạnh Tinh thể được

kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng qua 4 hệ dung môi khác nhau ethyl

acetat-nước-acid formic-acetic, Etoac-aceton-(H20) , CHCl3

-HCOOH-CH3COOH , butyl - nước- acid formic, phát hiện bằng TT Vanillin-

asulfuric,TT.FeCl3, soi UV 365 nm, UV 254 nm Tinh thể được thu màu vàng tươi đặt tên là DC2 (450 mg)

 Phân đoạn 4 (2,3g) và phân đoạn 5 (11,6g) khá giống nhau nên

gộp chung, tiến hành kết tinh, cô thu hồi 2 phân đoạn, kiểm tra trên sắc

ký lớp mỏng nhận thấy vết G bị phân hủy thành 2 vết là G và G’ ( có thể là sự góp mặt ủa acid formicm), Do đó để phân lập chat G thì cần phải khảo sát lại hệ dung môi khai triển mà không có mặt của acid

 Các phân đoạn còn lại do khối lượng ít và có nhiều vết nên không tiếp tục nghiên cứu

Phân đoạn Chất tinh

 Mục đích : Để tiếp tục phân lập chất G hay các flavonoid còn lại trong cao A2, tiens hành khảo sát lại một số hệ dung môi khai triển

 Pha động: Ethyl acetat – aceton – H2O (8:1,9:0,1)

 Khối lượng mẫu: 25g cao A2

 Nạp mẫu: nạp mẫu khô

 Thể tích hứng mỗi phân đoạn là :150 ml

 Kiểm tra các phân đoạn trên bảng sắc ký lớp mỏng tráng sẵn với hệ dung môi butyl acetat – nước – acid formic (15:5:5), phát hiện dưới ánh thường,UV 254 nm, UV 365nm, thuốc thử FeCl35%

 Kết quả: thu được 6 phân đoạn được ghi nhận ở bảng sau:

Phân đoạn Dung môi V (ml) P(g) Thành phần

1 (1-5) Ethyl acetat 100% 750 1.3 Tạp kém phân cực

2 (6-7) Ethyl acetat- aceton- nước

 Lực chọn pha tĩnh

Thông thường, kỹ thuật sắc ký pha đảo với cột C8 hay C18 là sự lựa chon đầu tiên cho sự phân tách các chất có nguồn gốc tự nhiên và cũng dùng để cô đặc

hoạt chất Việc lựa chọn loại cột phù hợp với hợp chất hợp chất quan tâm phụ thuộc nhiều vào điều kiện thí nghiệm Do đó, sẽ thật khó khăn nếu thiếu sự hiểu biết

về nhóm hợp chất cần quan tâm Tuy nhiên, việc chạy thử với 2 hay 3 điều kiện cột pha đảo khác nhau sẽ

mang lại nhiều lợi ích, cho ta những dữ kiện cơ bản về nhóm hợp chất quan tâm có thể thăm dò được một điều kiện phân tách thành công

Lượng mẫu tiêm vào cột và lượng chất tinh khiết phụ thược nhiều vào từng yêu cầu nhất định Khi không áp dụng

kỹ thuật cột quá tải và tiến hành thăm dò điều kiện sắc ký cho cột điều chế bằng cột phân tích thì lượng mẫu tiêm vào cột được giới hạn bởi độ hoà tan của mẫu trong dung môi và khả năng chịu tải của cột

Với yêu cầu cần một lượng khá lớn chất tinh khiết, cần thực hiện tiêm mẫu nhiều lần với một lượng mẫu ban đầu phù hợp để thu đủ lượng chất tinh khiết cần

Với điều kiện lí tưởng là cột điều chế và cột phân tích

có cùng chiều dài được sản xuất với cùng một kĩ thuật nhồi cột của cùng một hãng sản xuất,ta có thể phát triển sang

phương pháp điều chế dễ dàng hơn và có thể dự đoán trước được

Lựa chọn phương pháp

 Sự lựa chọn dung môi

 Đối với sắc ký pha đảo, nước được sử dụng như một dung môi yếu trong khi các dung môi hữu cơ như MEOH,

MeCN hay THF là các dung môi mạnh Các dung môi này có

độ truyền qua rất tốt cho đầu dò UV và làm thay đổi độ chọn lọc của các chất trong phân tách

 Nếu một dung môi không thích hớp để đạt được sự tách chiết theo mong muốn, ta có thể thay thế bằng một dung môi khác Trong hầu hết các trường hợp, hỗn hợp 2 dung môi

là thích hợp cho sự phân tách các hỗn hợp, khi đó hỗn hợp 3 hay 4 dung môi là không cần thiết

4.1 Kết luận:

 Chiết suất: từ 6 kg dượcliệu đã chiết ngấm kiệt với cồn 96% thu được 54g cao A2, cao A2

chứa hàm lượng lớn flavonoid

 Phânlập: Từ 50g cao A2 tiến hành phân lập các flavonoid bằng sắc ký cột chân không (cột 1 vàcột 2) đã thu được 3 hợp chất tinh khiết là DC1, DC2, DC3 với khối lượng tương ứng

34mg, 670mg, 800mg

 Cấu trúc của các chất được xác định lần lượtlà: quercetin (DC1), quercitrin(DC2), quercetin - 3-0- -D-galactoppyranosid (DC3)

4.2 Nhận định

bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 96% và phương háp siêu âm

quercetin -3-0- -D-galactoppyranosid (DC3) bằng sắc

ký cột chân không hoặc HPLC điều chế

chiếu cho các mục đích nghiên cứu về Diếp cá

phương pháp sắc ký cột chân không, tuy nhiên cần phải

có máy móc hiện đại, điều này không phải cơ sở sản xuất Dược phẩm nào cũng được, nên khó được áp

dụng rộng rãi hơn so với phương pháp sắc ký chân

không

 Trong bài tiểu luận của nhóm có tham khảo và sử dụng một số hình ảnh từ Google, một số tài liệu từ sách Hóa Sinh Học và từ INTERNET