BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGƯYẺN TÁT THÀNH DƯƠNG THỊ NGỌC HÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHÓNG OXY HÓA LÁ CÂY LÁ ĐẮNG VERNONIA AMYGDALINA Del ASTERACEAE TRÊN MÔ HÌNH DPPH KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược[.]
TỐNG QUAN
TÁC DỤNG DƯỢC LÝ
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của một số Sesquiterpen lactons trong v.amygdalìna [15], [19].
Vernonia amygdalina là loại cây bụi phổ biến ở vùng nhiệt đới Châu Phi, thuộc họ Asteraceae, đóng vai trò là nguồn nguyên liệu trong nhiều loại thuốc truyền thống tại Tây Phi Theo nghiên cứu của N.J Toyang và R Verpoorte đăng trên tạp chí Journal of Ethnopharmacology cùng các nghiên cứu khác, v amygdalina Del được sử dụng để điều trị các bệnh như viêm gan, đái tháo đường, kháng khuẩn, kháng nấm, sốt rét, tiêu chảy.
1.3.1 Khả năng chống oxy hóa
Nghiên cứu sử dụng phương pháp đánh bắt gốc tự do với thuốc thử DPPH và đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm cho thấy dịch chiết nước nóng và lạnh của lá V amygdalina ở nồng độ 0,2 mg/ml có hoạt tính chống oxy hóa lần lượt là 26,4% và 36,2% Kết quả này cho thấy dịch chiết lá V amygdalina có khả năng chống oxy hóa đáng kể, đặc biệt là dịch chiết lạnh Các phát hiện này góp phần làm sáng tỏ tiềm năng chống oxy hóa của lá V amygdalina trong y học tự nhiên.
Nghiên cứu khác về hoạt tính chống oxy hóa, so sánh khả năng quét dọn gốc tự do
Hai sesquiterpene lacton, vemolide và vemodalol, đã được phân lập từ dịch chiết ethanol, cho thấy vemolide có khả năng khử DPPH cao hơn vemodalol và dịch chiết ethanol Ở mức 0,25 mg/mL, vemolide đạt độ hấp thu 0,15, trong khi vemodalol và dịch chiết ethanol có độ hấp thu lần lượt là 0,042 và 0,444 Catechin, hợp chất chống oxy hóa chuẩn, thể hiện khả năng khử DPPH cao nhất trong tất cả các mẫu Tại cùng nồng độ 0,25 mg/mL, thứ tự hoạt động chống oxy hóa theo mức độ từ cao đến thấp là dịch chiết ethanol > vemodalol > vemolide.
Trong tất cả các nồng độ, dịch chiết ethanol thể hiện hoạt tính quét gốc tự do cao hơn so với sesquiterpene lacton, cho thấy tác dụng hiệp đồng tiềm năng của chúng cùng với các thành phần chống oxy hóa khác Điều này chứng tỏ rằng sự phối hợp giữa các hợp chất trong dịch chiết ethanol có khả năng tăng cường hiệu quả chống oxy hóa, góp phần vào khả năng bảo vệ chống lại các gốc tự do gây tổn thương tế bào Các nghiên cứu cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết ethanol vượt trội hơn so với sesquiterpene lacton đơn lẻ, nhấn mạnh vai trò của các thành phần hợp tác trong mécanisme chống oxy hóa tổng thể.
Nghiên cứu so sánh khả năng chống oxy hóa của dịch chiết ethanol và nước từ lá V amygdalina với các chất chuẩn như BHT và BHA trên chất thử DPPH cho thấy dịch chiết ethanol có khả năng chống oxy hóa cao hơn, với tỷ lệ chống hoạt tính đạt 90,23% và 88,23% ở nồng độ 0,8 mg/ml Trong khi đó, dịch chiết nước và BHT đạt tỷ lệ tối đa lần lượt là 73,93% và 68,66% ở nồng độ 2,0 mg/ml Kết quả này cho thấy dịch chiết ethanol và nước từ lá V amygdalina có tiềm năng thay thế các chất chống oxy hóa tổng hợp như BHT, BHA, đồng thời giảm thiểu tác dụng phụ độc hại hoặc gây ung thư trên người.
Các bệnh về gan là một trong những vấn đề phổ biến nhất trên toàn thế giới, và nhiều loại thuốc điều trị có thể gây ra tác dụng phụ nghiêm trọng, gây lo ngại về an toàn và hiệu quả Nghiên cứu của Arhoghro, E M và cộng sự vào năm 2009 đã chỉ ra rằng dịch chiết nước từ lá cây V amygdalina có khả năng phục hồi chức năng gan, làm giảm các chỉ số ALT, AST và ALP đáng kể Thử nghiệm trên 6 nhóm chuột bị viêm gan cấp cho thấy, sau 7, 14, 21 ngày điều trị với liều 5%, 10%, 15% dịch chiết, các chỉ số gan giảm rõ rệt theo liều lượng và thời gian, cho thấy tiềm năng của V amygdalina như một phương pháp điều trị thay thế an toàn và hiệu quả cho các bệnh về gan.
Nghiên cứu đã đánh giá và so sánh tác dụng điều trị đái tháo đường của chiết xuất ethanol từ lá V amygdalina già và non trên chuột bị tiểu đường do Streptozotocin (STZ) gây ra trong bốn tuần Liều cao hơn (300 mg/kg) của cả hai dạng chiết xuất đã làm giảm đáng kể nồng độ ALT, AST và ALP trong huyết thanh, cho thấy khả năng bảo vệ gan hiệu quả (p < 0,05) Kết quả còn cho thấy sự giảm rõ rệt các chỉ số lipit xấu như LDL-C và VLDL-C, đồng thời tăng HDL-C ở các chuột uống dịch chiết so với nhóm đái tháo đường không điều trị (p < 0,05) Phân tích mô bệnh học cho thấy hành động cải thiện rõ rệt trong tổn thương của tuyến tụy, gan và lá lách, đặc biệt là khả năng tái sinh tế bào beta của đảo tụy Langerhans, góp phần phục hồi chức năng nội tiết của tụy ở các chuột được điều trị [14].
Nghiên cứu của Atangwho và cộng sự năm 2007 đã thử nghiệm tác dụng của dịch chiết EtOH từ lá V amygdalina lên các chuột in vivo, chia thành ba nhóm gồm nhóm sinh lý, nhóm bệnh lý và nhóm thử nghiệm chừa trị bằng dịch chiết với nồng độ 400 mg/kg trong vòng 14 ngày Kết quả cho thấy mức đường huyết của các nhóm là 73,51 ± 18,98 mg/dL (nhóm sinh lý), 247,25 ± 4,83 mg/dL (nhóm bệnh lý) và 144,14 ± 25,83 mg/dL (nhóm thử nghiệm), chứng minh dịch chiết từ lá cây này có khả năng hạ đường huyết hiệu quả trên chuột, phù hợp với các nghiên cứu trước đó [12], [19].
Sốt rét là một trong những căn bệnh gây tử vong hàng đầu trên thế giới, đặc biệt là ở trẻ em Hiện nay, các loại thuốc điều trị sốt rét đang ngày càng trở nên kháng thuốc, gây khó khăn trong việc điều trị bệnh hiệu quả Để tìm kiếm phương pháp thay thế, các nhà nghiên cứu đã bắt đầu sử dụng dịch chiết từ các nguồn tự nhiên nhằm phát triển các thuốc mới có khả năng chống lại vi khuẩn sốt rét ngày càng kháng thuốc.
Nước và EtOH chiết từ lá của loài V amygdaliina cho thấy khả năng chống lại loài Plasmodium berghei theo cả hai phương pháp in vivo và in vitro Trong các thử nghiệm in vivo, dịch chiết nước giảm khả năng sinh sản giao bào cái lên đến 50% Trong khi đó, các nghiên cứu in vitro cho thấy dịch EtOH cũng có tác dụng tiêu diệt giao bào cái của P berghei hiệu quả.
Hai sesquiterpen lacton là vernolid và vemodalol được phân lập từ loài V amygdalina, có khả năng chống lại vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là Micrococcus kristinae với giá trị MIC 0,25 mg/ml Cả hai hoạt chất này không ảnh hưởng đến vi khuẩn Gram âm, ngoại trừ Salmonella pooni với MIC 0,5 mg/ml, cho thấy tiềm năng sử dụng trong điều trị nhiễm khuẩn Gram dương.
Các Sesquiterpen lacton đã được chứng minh có khả năng kháng nấm mạnh, đặc biệt là Vernolid, có khả năng ức chế các loại nấm như Penicillium notatum, Aspergillus flavus, Aspergillus niger và Mucor hiemalis, với giá trị LC50 lần lượt là 0,2, 0,3 và 0,4 mg/ml Trong khi đó, vemonalol có khả năng kháng nấm kém hơn so với vemolid, nhưng vẫn cho thấy tác dụng đáng kể chống lại Aspergillus flavus, Penicillium notatum và Aspergillus niger, với các giá trị LC50 lần lượt là 0,3; 0,4 và 0,5 mg/ml.
1.4 MỘT SỐ CÔNG DỤNG DÂN GIAN ớ Nigeria, lá của loài V amygdalina được sử dụng như một loại rau xanh trong các món ăn, đặc biệt là món soup Lá đắng Sau khi thu hoạch, có thế loại bỏ vị đắng bằng cách ngâm dầm với nước nóng hay lạnh, dịch chiết nước có the dùng làm thuốc bổ tiêu hóa và giúp ngăn ngừa một so bệnh tật. ớ Ethiopia được sử dụng để ủ bia Lá được sử dụng phố biến trong điều trị sốt; loài cây này còn được biết đến như một chất thay thế Quinin ở Nigeria và một số nước châu Phi khác Lá non được sử dụng trong y học dân gian như thuốc chống trầm cảm, chữa sốt rét, giúp nhuận tràng, long đờm, làm tăng co thắt tử cung và tăng khả năng thụ thai ở phụ nữ vô sinh.
Nhiều bác sĩ đông y đề nghị sử dụng dịch chiết nước từ loại cây này để điều trị các vấn đề về sức khỏe như mệt mỏi, buồn nôn, tiểu đường, chán ăn do ăn kiêng, kiết lỵ và các rối loạn tiêu hóa khác, mang lại hiệu quả trong hỗ trợ phục hồi sức khỏe cho bệnh nhân.
Hình 1.5 Một số chế phẩm từ Vernonia aniygdalina
1.6 GÓC TỤ DO VÀ MỘT SỐ MÔ HÌNH THỦ TÁC ĐỘNG CHÓNG OXY HÓA
Các gốc tự do như superoxid, hydroxyl tự do và hydroperoxid là nguyên nhân chính gây ra các bệnh viêm khớp, hen suyễn, mất trí nhớ, Parkinson và thậm chí ung thư Chúng là sản phẩm phụ của quá trình chuyển hóa trong chu trình hô hấp của tế bào để sinh năng lượng Mặc dù đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch, nhưng nếu tích tụ quá nhiều, các gốc tự do gây hại cho tế bào và mô Quá trình lão hóa bắt nguồn từ sự tổn thương các phân tử và tế bào do gốc tự do gây ra, làm suy yếu hệ miễn dịch và khiến cơ thể dễ bị các bệnh tự miễn Ngoài ra, các gốc tự do còn làm tăng nguy cơ đột biến vật liệu di truyền, giảm khả năng sửa chữa DNA, gây biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể và làm tăng nguy cơ phát triển ung thư.
GỐC Tự DO VÀ MỘT số MÔ HÌNH THỬ TÁC ĐỘNG CHỐNG OXY HÓA
Các gốc tự do như superoxide, hydroxyl tự do và hydroperoxide là những yếu tố chính gây ra các bệnh viêm khớp, hen suyễn, mất trí nhớ, Parkinson và thậm chí ung thư Chúng là sản phẩm phụ của quá trình chuyển hóa trong chu trình hô hấp của tế bào để sinh năng lượng Mặc dù đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch, nhưng tích tụ quá nhiều gốc tự do có thể gây hại cho cơ thể, dẫn đến quá trình lão hóa bằng cách gây hại các phân tử và tế bào Các gốc tự do còn gây tổn thương hệ miễn dịch, làm giảm khả năng nhận diện và phản ứng chống lại các tác nhân bên ngoài, cùng với việc làm tăng nguy cơ đột biến vật liệu di truyền và giảm khả năng sửa chữa DNA, từ đó thúc đẩy sự biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể và hình thành các tế bào ung thư.
Việc sử dụng các tác nhân chống oxy hóa có khả năng neutralize các gốc tự do là phương pháp tiềm năng trong phòng chống lão hóa và ngăn ngừa các bệnh lý nguy hiểm Xác định hoạt tính chống oxy hóa đóng vai trò quan trọng trong việc hướng dẫn các nghiên cứu sàng lọc sinh học sâu hơn, tạo tiền đề cho các phát hiện mới trong lĩnh vực này [7].
1.6.2 Một số mô hình thử tác động chống oxy hóa
Phản ứng giữa các chất chống oxy hóa và DPPH (2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate) thể hiện qua việc DPPH màu tím đậm (517 nm) bị khử thành sản phẩm có màu vàng nhạt Quá trình này cho phép xác định hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử một cách chính xác và nhanh chóng Sử dụng phương pháp đo quang học dựa trên sự thay đổi màu sắc của DPPH đã trở thành tiêu chuẩn trong các nghiên cứu về chống oxy hóa tự nhiên và tổng hợp Đây là một kỹ thuật phổ biến để đánh giá khả năng loại bỏ các gốc tự do của các hợp chất chống oxy hóa trong các sản phẩm tự nhiên hoặc tổng hợp.
Mức độ giảm cường độ hấp thu ở 517 nm nói lên mức độ chống oxy hóa của chất thử
Thử nghiệm đánh giá khả năng chống oxy hóa của các chất dựa trên sự hình thành phức hợp màu xanh (593 nm) giữa ion Fe²⁺ và TPTZ (tripyridyltriazin) Phân tích phản ứng này giúp xác định hiệu quả chống oxy hóa của các hợp chất bằng cách đo mức độ tạo thành phức màu xanh từ phản ứng giữa Fe³⁺ và TPTZ Đây là phương pháp phổ biến trong nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các chất tự nhiên hoặc tổng hợp Sử dụng kỹ thuật đo quang phổ tại bước sóng 593 nm giúp định lượng chính xác khả năng chống oxy hóa của mẫu thử.
Mức độ tăng cường độ hấp thu ở 593 nm nói lên khả năng chống oxy hóa của chất thừ nghiệm [26], [29].
Thử nghiệm đánh giá khả năng ngăn chặn sự tạo thảnh sản phẩm oxy hóa có màu
(734 nm) của muối ABTS [2,2’-azisbonis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) diammonium] cua các chất thử nghiệm.
Mức độ làm giảm cường độ hấp thu ơ 734 nm nói lên khả năng chống oxy hóa của chất thư nghiệm [26], [29].
Acid thiobarbituric (TBA) được sử dụng để xác định hoạt tính chống oxy hóa trong lipid trong các hệ thống sinh học Phương pháp này dựa trên việc tạo ra sản phẩm màu đỏ với bước sóng 532 nm khi TBA phản ứng với Malondialdehyd, một hợp chất sinh ra từ quá trình phân hủy lipid peroxid Đo lượng sản phẩm màu đỏ này giúp đánh giá mức độ chống oxy hóa của các mẫu lipid trong môi trường sinh học.
Mức độ làm giảm cường độ hấp thu ở 532 nm nói lên khả năng chống oxy hóa của chất thử nghiệm [26], [29].
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúư
NGUYÊN LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ
Lá cây Lá Đắng được thu hái tại thành pho Hồ Chí Minh từ tháng 07/2018.
Mầu lá tươi được thu hái tự nhiên, đảm bảo nguồn gốc rõ ràng để giữ nguyên hoạt tính tự nhiên Sau đó, các lá hư hại được loại bỏ nhằm đảm bảo chất lượng sản phẩm Lá mầu tươi được rửa sạch kỹ để loại bỏ bụi bẩn và tạp chất, sau đó sấy ở nhiệt độ 60°C để giữ mùi vị và hoạt tính của lá mầu Cuối cùng, mầu sau khi sấy được xay nhỏ thành bột với kích cỡ phù hợp cho từng loại thí nghiệm, đảm bảo độ mịn và đồng nhất của sản phẩm để nâng cao hiệu quả nghiên cứu và ứng dụng.
- Các dụng cụ thường quy trong phòng thí nghiệm
- Bep cách thủy Memmert (Đức)
- Đèn uv Spectroline Model CM-10A (Mỳ)
- Cân phân tích Sartorius (Đức)
- Cân kỹ thuật Electronic Scale G&G
- Máy quang phổ tử ngoại UV- Vis 1800 Shimadzu (Nhật)
- Máy siêu âm Hwashin Technology Power sonic 410 (Hàn Quốc)
- Máy xác định hàm ẩm Ohaus Model MB45 (Mỳ)
- Máy cô quay chân không Heidolph Hei-VAP Advantage (Đức)
- Máy đông khô (Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh)
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters 2695-2996, Detecter PDA Waters 2996
- Dung môi: Ethanol, Chroloform, Ethyl acetat, Methanol (Merck),
- Thuốc thử: DPPH (2,2-diphenyl-l-picrylhdrazyl)
- DMSO PROLABO (Pháp), Acid Ascorbic (Guangdong Guanghua Sci-Tech- Trung Quốc, DTK > 99,7%)
- Sắc ký lớp mỏng pha thuận dùng bản silica gel F254 tráng sằn trên đế nhôm (Merck).
- Dung môi dung cho HPLC: MeOH (Merck), nước cất 2 lần.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúư
Cách tiến hành gồm có cách bước sau:
- Sử dụng phương pháp chiết nóng ở 90°C
- Dung môi: cồn 96%, cồn 70%, con 50%, cồn 25% và nước
- Cô đuối bớt dung môi dưới áp suất giảm hoặc đông khô Thu được các cao có độ cồn khác nhau.
Các cao có độ cồn khác nhau sẽ được thử hoạt tính chống oxy hóa nhằm chọn ra cao có tiềm năng cao nhất.
Cách tiến hành gồm các bước sau:
- Mầu: cao cồn có khả năng chống oxy hóa mạnh nhất
- Dung môi: CHCỈ3, EtOAc, MeOH.
- Tiến hành: Chiết lỏng- lỏng được thực hiện trong bình lắng gạn 1000ml, ở nhiệt độ phòng.
- Hòa mẫu với một lượng nước tối thiểu, phân tán mẫu đều trong nước.
- Lắc phân đoạn phần dịch này lần lượt với từng dung môi có độ phân cực tăng dần: CHCI3, EtOAc, MeOH.
Tiến hành lắc mẫu cho đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi, sau đó chuyển sang lắc với dung môi có độ phân cực cao hơn để đảm bảo hoàn toàn trích ly Kiểm tra hiệu quả của quá trình bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) để xác định không còn vết nào của chất hòa tan, hoặc sử dụng phương pháp lượng cắn để đo phần còn lại tối thiểu của chất trong mẫu Các bước này giúp tối ưu hóa quá trình phân tách và đảm bảo chất lượng mẫu phân tích.
- Thu các phân đoạn, cô đuổi bớt dung môi dưới áp suất giảm Thu được 3 phân đoạn cao: cao phân đoạn CHCI3, EtOAc và MeOH.
Phương pháp tinh chế phù hợp bằng quá trình kết tinh phân đoạn sử dụng dung môi hoặc hợp chất dung môi thích hợp với lượng tối thiểu giúp đảm bảo hiệu quả cao Khi kết tinh xảy ra, tiến hành lọc lấy tinh thể trên phểu thủy tinh xốp và rửa sạch bằng dung môi phù hợp để loại bỏ tạp chất Sau đó, sấy chân không để loại bỏ hơi ẩm và xác định khối lượng tinh thể thu được để đánh giá quá trình tinh chế.
2.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết
2.2.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Chất phân lập được phân tích trên 3 bản mỏng sử dụng các hệ dung môi khác nhau, sau đó hiện sắc ký đồ bằng UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm, đồng thời hiện màu bằng thuốc thử vanillin-sulfuric Chất đạt tiêu chuẩn độ tinh khiết khi chỉ cho một vết gọn có giá trị Rf trong khoảng từ 0,25 đến 0,75, đảm bảo tính đồng nhất và độ tinh khiết cao của mẫu.
Chất phân lập được hòa tan trong methanol (Merck) với nồng độ khoảng 0,25-0,5 mg/ml, sau đó được lọc qua màng Millipore 0,45 μm để loại bỏ tạp chất Hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) sử dụng bơm đôi Alliane 2695 kết hợp đầu dò dãy diod quang PDA 2996 và phần mềm EMPOWER để phân tích mẫu Cột sắc ký sử dụng loại Symmetry 150 x 4,5 mm, với bán kính hạt 5 μm, giúp đảm bảo độ phân giải cao trong quá trình phân tích Chương trình PURETEST được cài đặt sẵn và thực hiện theo các thông số quy trình chuẩn để đảm bảo độ chính xác và lặp lại của kết quả.
• Nhiệt độ buồng cột sắc kí: 30°C.
• Dãy bước sóng phát hiện: 190-400 nm.
• Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
• Pha động: MeOH: H2O, chạy gradient được thê hiện ở Bảng 2.1:
Bảng 2.1 Chương trình chạy kiểm tinh khiết
• Chế độ ghi sắc ký đồ: maxplot
Dựa vào tỷ lệ diện tích các pic trên sắc ký đồ, có the đánh giá độ tinh khiết
2.2.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình DPPH Được tiến hành trên bản mỏng và sử dụng phương pháp đo quang đe xây dựng đường tuyến tính, từ đó xác định IC50 (là nồng độ mà tại đó đánh bắt được 50% gốc tự do DPPH).
DPPH là một gốc tự do có màu tím và có cực đại hấp thu tại 517 nm Khi gặp tác nhân chống oxy hóa, DPPH bị khử, chuyển từ màu tím sang vàng và dẫn đến giảm đáng kể độ hấp thu tại bước sóng 517 nm, thể hiện khả năng chống oxy hóa của hợp chất.
2.2.3.1 Khảo sát hoạt tỉnh chong oxy hóa bằng sắc ký lớp mỏng
Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các cao có độ cồn khác nhau, các cao phân đoạn và chất bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng giúp xác định hiệu quả chống oxy hóa của từng mẫu Việc dựa vào số vết và độ chuyển màu trên sắc ký đồ cho phép sơ bộ đánh giá số lượng hợp chất chống oxy hóa cũng như mức độ chống oxy hóa của các cao này Phương pháp sắc ký lớp mỏng là một công cụ nhanh chóng, chính xác, hỗ trợ nghiên cứu đánh giá khả năng chống oxy hóa trong các mẫu tự nhiên Kết quả phân tích giúp xác định các hợp chất chính góp phần vào tác dụng chống oxy hóa, từ đó thúc đẩy phát triển các sản phẩm y dược hoặc thực phẩm có lợi cho sức khỏe.
Các mẫu thử được hòa trong Methanol và được chấm bằng ống mao quản có khắc vạch, lấy đong lượng lOOpg các mầu thử.
Sau khi khai triển, bản mỏng được quan sát dưới đèn uv 254nm và 365nm.
Nhúng bản mỏng vào thuốc thử DPPH 1%, ủ trong tối 5 phút.
Quan sát bản mỏng, chất có khả năng chống oxy hóa sẽ cho vết vàng trên nền tím của bản mỏng.
2.2.3.2 Khảo sát tác dụng chổng oxy hóa trên mô hình DPPH bằng phương pháp quang phổ
Khảo sát dung môi là bước quan trọng để xác định dung môi phù hợp cho quá trình hòa tan mẫu Khi thực hiện, chúng tôi tiến hành thử màu bằng dung môi methanol (MeOH), và nếu mẫu không hoàn toàn tan, chúng tôi sẽ thêm DMSO với các nồng độ khác nhau để tăng khả năng hòa tan Việc xác định nồng độ dung môi tối ưu giúp đảm bảo hòa tan tối đa các màu thử, nâng cao hiệu quả phân tích.
Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa
- Mầu trắng: dung dịch MeOH + DMSO
- Chứng âm: MeOH + DMSO + DPPH
- Chứng dương: MeOH + DPPH + Vitamin c
- Mầu khảo sát: MeOH + DMSO + DPPH + mẫu thử
Để tiến hành phép thử DPPH, trộn 2,5 ml dung dịch DPPH (4 mg/dL) với các mẫu thử ở các nồng độ khảo sát khác nhau, sau đó thêm dung môi để đủ 5 ml Để mẫu phản ứng trong bóng tối trong vòng 30 phút, đảm bảo phản ứng diễn ra hoàn toàn Cuối cùng, đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 517 nm để xác định hiệu quả quenching của các hợp chất chống oxy hóa.
Tỷ lệ phần trăm hoạt tính chong oxy hóa (HTCO) được tính theo công thức: x Ar A t _
A c Ac: Giá trị mật độ quang của chứng âm
A t : Giá trị mật độ quang của mẫu thử
Dựa trên tỷ lệ phần trăm hoạt tính chống oxy hóa và nồng độ của các mẫu thử, chúng tôi xây dựng đường chuẩn bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 để phân tích dữ liệu một cách chính xác Qua đường chuẩn này, chúng tôi xác định được giá trị IC50 – một chỉ tiêu quan trọng thể hiện khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử, góp phần đánh giá hiệu quả của các hợp chất trong nghiên cứu.
KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
CHIẾT XUÁT VÀ KHẢO SÁT TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN
3.2.1 Ket quả chiết xuất phân đoạn
Hàm lượng chất chiết được cồn 96% là 22,10%
Cao cồn 96% được tiến hành với cỡ mầu lớn: 100 g bột dược liệu chiết theo phương pháp chiết nóng, dung môi chiết là cồn 96%.
Kết quả thu được 22 g cao cồn tổng.
Quá trình phân lập bắt đầu từ cao con tổng, tiến hành lắc phân bố với dung môi có độ phân cực tăng dần như CHCl₃, EtOAc, giúp tách các hợp chất theo độ phân cực Phần dịch còn lại sau đó được cô cạn rồi trộn đều với silica gel, tiếp tục đun hồi lưu bằng methanol (MeOH) để chiết xuất các hợp chất khác Các dịch chiết phân bố được cô quay dưới áp suất giảm nhằm thu được các phân đoạn chính gồm CHCl₃, EtOAc và MeOH, tối ưu hóa quá trình phân lập các hợp chất quan trọng trong mẫu.
Tiến hành thử hoạt tính chống oxy hóa trên 3 phân đoạn vừa chiết được.
Bảng 3.9 Kết quả các phân đoạn Phân đoạn Khối lượng (g)
Phân đoạn CHCI3 8,7594 Phân đoạn EtOAc 0,9160 Phân đoạn MeOH 5,1900
3.2.2 Kết quả khảo sát tác dụng chống oxy hóa trên mô hình DPPH của các phân đoạn
Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các phân đoạn được thực hiện dựa trên mô hình dập tắt gốc tự do DPPH, phương pháp này được ưa chuộng vì thao tác đơn giản, nhanh chóng và cho kết quả đánh giá chính xác hoạt tính chống oxy hóa Ngoài ra, hoạt tính chống oxy hóa còn được xác định thông qua các phương pháp sắc ký lớp mỏng và quang phổ, giúp cung cấp dữ liệu toàn diện về khả năng chống oxy hóa của các phân đoạn.
3.2.2.1 Khảo sát tác dụng chổng oxy hóa bằng sắc ký lớp mòng
Sau khi khảo sát với nhiều hệ dung môi khác nhau trên bảng mỏng, pha động được chọn là CHCỈ3- MeOH- HCOOH (8: 2: 0,05) (Hình 3.8)
UV254nm UV365nm TT vs DPPH
Hình 3.8 Sắcký đồ các phân đoạn EtOAc-MeOH-HCOOH(8:2:0,05)
1 CHCh 2 EtOAc 3 MeOH Kết quả thử nghiệm Hình 3.8 cho thấy, phân đoạn EtOAc có khả năng chống oxy hóa mạnh hon so với các phân đoạn còn lại Ket quả sau khi nhúng thuốc thử DPPH 1% hiện 6 vết màu vàng trên nền tím đối với phân đoạn EtOAc.
3.2.2.2 Kháo sát tác dụng chong oxy hóa bằng phương pháp quang pho
Khảo sát dung môi hòa tan tốt là MeOH với DMSO ở các nồng độ khác nhau Ket quả được trình bày ở Bảng 3.10:
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát DMSO
Ghi chú: (++): cắn nhiều, (+): cắn ít, (-): Không còn cắnChọn nồng độ DMSO 10%, dung môi gồm: MeOH + 10% DMSO
> Kết quả khảo sát hoạt tác dụng chống oxy hóa dựa trên mô hình DPPH
Bảng 3.11 Thông số hoạt tính chống oxy hóa cúa phân đoạn CHCh
Mẩu phân đoạn CHCh Ống Nồng độ (pg/ml) Abs HTCO(%)
Phân đoạn CHCh có hoạt tính dập tắt gốc tự do thể hiện rõ qua kết quả khảo sát với nồng độ từ 125 đến 1000 pg/ml, đạt % HTCO từ 17,53% đến 77,61%, cho thấy khả năng chống oxy hóa tăng cùng với nồng độ Nghiên cứu cũng xác định được mức IC50 của phân đoạn là 561,39 pg/ml, phản ánh mức độ hiệu quả trong việc trung hòa gốc tự do.
Bảng 3.12 Thông số hoạt tính chống oxy hóa cùa phân đoạn EtOAc
Mẩu phân đoạn EtOAc Óng Nồng độ (pg/ml) Abs HTCO(%)
Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của phân đoạn EtOAc
Hình 3.10 trình bày hoạt tính dập tắt gốc tự do của phân đoạn EtOAc Kết quả khảo sát cho thấy, phân đoạn EtOAc có dãy nồng độ từ 20 pg/ml đến 60 pg/ml với phần trăm ức chế gốc tự do (HTCO) dao động từ 28,8% đến 56,47% Ngoài ra, nồng độ IC50 của phân đoạn EtOAc đạt mức 49,9 pg/ml, thể hiện khả năng chống oxy hóa đáng kể của hợp chất này.
Bảng 3.13 Thông số hoạt tính chống oxy hóa cùa phân đoạn MeOH
Mẩu phân đoạn MeOH Óng Nồng độ (pg/ml) Abs HTCO(%)
Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của phân đoạn MeOH
Phân đoạn MeOH thể hiện hoạt tính dập tắt gốc tự do với nồng độ từ 100 pg/ml đến 200 pg/ml, đạt tỷ lệ tiêu quỵ từ 40,91% đến 71,66%, cho thấy khả năng chống oxy hóa rõ ràng Nồng độ IC50 của phân đoạn MeOH là 130,49 pg/ml, phản ánh mức độ hiệu quả trong việc giảm hoạt tính gốc tự do.
Dựa trên phương trình hồi quy, ta có thể xác định nồng độ tối thiểu cần thiết để thu gọn 50% gốc tự do DPPH, gọi là IC50 của các cao chiết Thường xuyên, cao chiết có nồng độ IC50 càng thấp thì hoạt tính chống oxy hóa càng cao, cho thấy hiệu quả chống oxy hóa của cao chiết tương ứng càng tốt Do đó, việc xác định IC50 giúp đánh giá chính xác khả năng chống oxy hóa của các cao chiết tự nhiên.
Bảng 3.14 Giá trị IC50 của các phân đoạn Mẩu Giá trị IC50 (pg/ml)
Dựa trên kết quả thử nghiệm trong Bảng 3.14 và Hình 3.12, phân đoạn EtOAc cho khả năng chống oxi hóa mạnh nhất với giá trị IC50 là 49,9 pg/ml, chứng tỏ hiệu quả chống oxi hóa vượt trội so với các phân đoạn còn lại Phân đoạn MeOH có khả năng chống oxi hóa trung bình với IC50 là 130,49 pg/ml, còn phân đoạn CHCl₃ thể hiện khả năng chống oxi hóa kém nhất với IC50 là 561,39 pg/ml.
Dựa trên kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, phân đoạn EtOAc thể hiện khả năng chống oxy hóa mạnh nhất Nghiên cứu được mở rộng với quy mô lớn hơn sử dụng 3kg dược liệu, sau đó ngấm kiệt với cồn 96%, thu về 21,50g phân đoạn EtOAc sau quá trình lắc phân bố Phân đoạn EtOAc sau khi để bay hơi tự nhiên cho ra 1,4983g chất thu được, chứng tỏ tiềm năng lớn trong các nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của dược liệu.
Phân đoạn EtOAc được phân tách thành các phân đọan đon giản hon bằng kỳ thuật sắc ký cột quá tải với các thông số sau:
Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước cột 8x50 cm, rửa sạch, sấy khô. Pha tĩnh: 200 g Silicagel, cỡ hạt trung bình (40-63 pm).
Nhồi cột khô, có bơm hút chân không cho on định, chiều cao pha tĩnh 10 cm Mầu: 20 g cao phân đoạn EtOAc, nạp mẫu khô.
Trong quá trình phân tích, phương pháp pha động được thực hiện bằng cách chạy gradient với dung môi nền là n-Hex Ban đầu, tỷ lệ n-Hex-ChCh được tăng dần từ 1:9 đến 100% CHCh, giúp phân tách các hợp chất một cách hiệu quả Tiếp theo, hệ dung môi được chuyển sang hệ CHCh-MeOH, và tỷ lệ MeOH được tăng dần đến 100% để nâng cao độ phân giải Phương pháp này đảm bảo quá trình phân tích diễn ra mượt mà, chính xác và tối ưu hóa khả năng phân tách mẫu.
The tích hứng phân đoạn: 200 ml.
Kiểm tra phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH-HCOOH (8:2:0,05) để phân tích hợp chất Quá trình phát hiện được thực hiện bằng cách soi UV ở 254 nm và 365 nm, kết hợp với thủy phân thử nghiệm và theo dõi sắc ký Các phân đoạn có cùng sắc ký đồ được gộp lại, sau đó cô quay để thu được các phân đoạn khác nhau, đảm bảo phân tích chính xác và đáng tin cậy (Phụ lục 1)
Bảng 3.15 Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột quá tải
Phân đoạn Tỷ lệ dung môi
Phân đoạn hứng Khối lượng
2 n- Hexan-CHCh (2:8) n- Hexan-CHCh (1:9) CHCh-MeOH(98:2)
5 CHCh-MeOH (95:5) 77-84 740 Túa màu vàng nâu
6 CHCh-MeOH (95:5) 85-94 470 Dạng dầu béo
10 CHCb-MeOH (8:2) 221-243 320,6 Tùa màu vàng
PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ
Tủa thu được sau quá trình bay hơi tự nhiên phân đoạn EtOAc được tinh chế bằng cách rửa nhiều lần với n-Hexan, EtOAc và MeOH lạnh để loại bỏ tạp chất Quá trình kết tinh trong MeOH giúp nâng cao độ tinh khiết của tinh thể Sau khi có kết tinh, tinh thể được lọc trên phễu thủy tinh xốp và rửa bằng MeOH lạnh để loại bỏ các chất còn bám dính Cuối cùng, tinh thể được sấy chân không để loại bỏ hơi ẩm, thu được 624, Img V1 tinh thể tinh khiết.
3.3.1.2 Kiêm tra độ tinh khiết Vi a Phương pháp sắc ký lớp mỏng
V1 (63,8 mg) thu được dưới dạng bột vi tinh the màu vàng hơi xanh, ít tan trong MeOH, khó tan trong EtOAC, không tan trong n-Hexan, CHCỈ3.
Kiểm tra độ tinh khiết cùa V1 trên 3 hệ dung môi bằng sắc ký lóp mỏng.
Ket quả: Trên cả 3 hệ dung môi V1 điều cho 1 vết gọn trên sắc ký đo, sơ bộ kết luận V1 tinh khiết trên bản mỏng.
Hình 3.13 Sắc ký đồ cùa V1
254nm 365ntn IS b Phương pháp HPLC
Sắc ký đồ thư tinh khiết bằng HPLC chất V|
Thòi gian lưu Diện tích pic % diện tích pic
Kết quả: Sắc ký cho 1 pic chính, chiếm 90,80% (Phụ lục 2)
Tủa thu được từ phân đoạn 5 của sắc ký cột nhanh bằng phân đoạn EtOAc đã được tinh chế qua quá trình rửa nhiều lần với n-Hexan, EtOAc và MeOH lạnh để loại bỏ tạp chất Sau đó, tinh thể đã được kết tinh trong MeOH, và khi hình thành tinh thể, quá trình lọc diễn ra trên phễu thủy tinh xốp nhằm thu lấy tinh thể đồng thời rửa sạch bằng MeOH lạnh Cuối cùng, tinh thể được sấy chân không để loại bỏ hoàn toàn dư lượng dung môi, thu được 30 mg V2 tinh khiết.
3.3.2.2 Kiêm tra độ tinh khiết v2 a Phương pháp sắc kỷ lớp mỏng
V2 (30 mg) thu được dưới dạng bột vi tinh the màu vàng tươi, tan tốt trong MeOH, tan trong EtOAc, không tan trong n-Hexan.
Kiểm tra độ tinh khiết cùa V2 trên 3 hệ dung môi bằng sắc ký lóp mỏng.
CHCh-MeOH-HCOOH EtOAc-MeOH-HjO CHCh-MeOH-HjO
254nm 365ntn ỈS 254nm 365nm ỈS 254nm 365nm IS
Hình 3.15 Sắc kỷ đồ cùa V2
1 Cao EtOAc 2 Phân đoạn 5 3 Tủa v2
Kết quả: Trên cả 3 hệ dung môi V2 điều cho 1 vết gọn trên sắc ký đồ, sơ bộ kết luận V2 tinh khiết trên bản mỏng. b Phương pháp HPLC
Hình 3.16 Sắc ký đồ thừ tinh khiết bằng HPLC chất V2
Thòi gian lưu Diện tích pic % diện tích pic
Kết quả: Sắc ký cho 1 pic chính, chiếm 92,36% (Phụ lục 3)
3.4 THỦ TÁC DỤNG CHÓNG OXY HÓA CÁC CHẤT •
3.4.1 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình DPPH ciia V| V1 được xác định cấu trúc là Cynarosid (luteolin-7-ơ-/?-glucosid) với M= 448 đvC. (Phụ lục 4)
Kết quả khảo sát tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp quang phổ
Bảng 3.16 Thông số hoạt tính chống oxy hóa của V1
Mẩu V| Óng Nồng độ (pg/ml) OD HTCO(%)
Hình 3.17 Hoạt tính dập tắt gốc tự do của V1
Ket quả khảo sát cho thấy, V1 có dãy nồng độ từ 1 pg/ml- 5 pg/ml với % HTCO từ
3.4.2 Ket quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình DPPH của V2 V2 được xác định cấu trúc là Luteolin với M= 286 đvC (Phụ lục 5)
Kết quả khảo sát tác dụng chong oxy hóa bằng phương pháp quang phổ
Bảng 3.17 Thông số hoạt tính chống oxy hóa của v2
Mẩu v2 Ống Nông độ (pg/ml) OD HTCO (%)
Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của v2
Hình 3.18 Hoạt tính dập tắt gốc tự do cùa v2
Ket quả khảo sát cho thấy, V2 có dãy nồng độ từ 1 pg/ml- 2 pg/ml với % HTCO từ 35,78% - 71,57%; IC50 có nồng độ 1,38 pg/ml
Kết quả khảo sát tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp quang phổ Vitamin c
Bảng 3.18 Thông số hoạt tính chống oxy hóa của chất tinh khiết
Chứng dưong Vitamin c Óng Nồng độ (pg/ml) Abs HTCO(%)
Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của chất tinh khiết Vitamin c
Hình 3.19 Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPHcùa chất tinh khiết Vitamin c
Kết quả khảo sát cho thấy, chất tinh khiết Vitamin c có dãy nồng độ từ 2 pg/ml- 4 pg/ml với % HTCO từ 35,78% - 71,57%; IC50 có nồng độ 3,01 pg/ml
Bảng 3.19 Giá trị IC50 cùa V], V ị và Vitamin c
Mẩu Giá trị IC50 (pM)
Hình 3.20 Giá trị IC50 về hoạt tính dập tẳt gốctự do DPPH V|, V2 và Vitamin c
Dựa vào kết quả thử nghiệm ở Bảng 3.19 và Hình 3.20 cho thấy, cả V1 và V2 đều có tác dụng chống oxy hóa.
V1 có giá trị ICso= 5,8 |1M, V2 có giá trị IC.50= 4,8 pM và Vitamin c có giá trị ICso 17,1 pM.
Giá trị IC50 của V1 thấp hơn giá trị IC50 của Vitamin c gấp 2,95 lần.
Giá trị IC50 của V2 thấp hơn giá trị IC50 của Vitamin c gấp 3,56 lần.
Do đó, V1 và V2 có tác dụng chống oxy hóa trên mô hình DPPH cao hơn Vitamin c
V2 (Luteolin) có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn V1 (Cyranosid) và vượt trội hơn cả Vitamin C trong việc dập tắt gốc tự do DPPH Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Wing-Cheung Leung, kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH cho thấy Luteolin có giá trị IC50 chỉ 30 pM, cho thấy khả năng chống oxy hóa cực kỳ mạnh mẽ Kết quả này cho thấy Luteolin tiềm năng phát triển thành thuốc chống oxy hóa hiệu quả, mở ra triển vọng ứng dụng trong lĩnh vực y học và chăm sóc sức khỏe.
CHƯƠNG 4 KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ
Sau một thời gian thực hiện, đề tài đạt đã được những kết quả sau:
- Xác định được độ ẩm bột dược liệu là 6,11 %
Khảo sát cho thấy cao cồn 96% có khả năng chống oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50 là 72,82 pg/ml Quá trình phân đoạn cao cồn 96% (22 g) cho ra ba phần: cao phân đoạn CHCl₃ (8,7594 g), EtOAc (0,9160 g) và MeOH (5,1900 g) Trong đó, cao phân đoạn EtOAc thể hiện khả năng chống oxy hóa vượt trội với IC50 chỉ 49,9 pg/ml.
Trong quá trình phân đoạn EtOAc, tôi đã thu được 624,1 mg tủa, trong khi phân đoạn ket trong MeOH cho ra 63,8 mg V1 V1 sau đó được xác định có độ tinh khiết cao qua phân tích trên bản mỏng với ba hệ dung môi khác nhau, trong đó xuất hiện một pic chính chiếm 90,80% trên sắc ký đồ HPLC Nghiên cứu còn khảo sát tác dụng chống oxy hóa của hợp chất V1 nhằm đánh giá tiềm năng ứng dụng trong y học và dược phẩm.
(Cyranosid) trên mô hình DPPH, V1 có giá trị ICso= 5,8 pM thấp hon
Từ phân đoạn 5 sử dụng phương pháp sắc ký cột nhanh (cao EtOAc), thu được 256,8 mg tủa Sau quá trình loại bỏ tạp và tinh chế bằng cột Sephadex, đã thu được 30 mg Vi Quá trình này chứng minh hiệu quả của phương pháp sắc ký và tinh chế trong việc cô lập hợp chất vi trong mẫu ban đầu.
Vi cho kết quả tinh khiết trên bản mỏng với ba hệ dung môi khác nhau, trong đó hình ảnh chính chiếm 92,36% trên sắc ký đồ HPLC Khảo sát tác dụng chống oxy hóa của Vi (Luteolin) trên mô hình DPPH cho thấy V2 có giá trị IC50 = 4,8 pM, thấp hơn so với Vitamin C (IC50 = 17,1 pM), chứng tỏ khả năng chống oxy hóa vượt trội của Chiết xuất Vi.
- Như vậy, tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập được trên mô hình DPPH được sắp xếp theo thứ tự sau: V2> V1 > Vitamin c
- Tiếp tục thử tác dụng chống oxy hóa từ các phân đoạn thu được từ cột quá tải cao EtOAc.
- Xác định cấu trúc và thử tác dụng các chất phân lập được.
1 Bộ Y Tế, (2009), “Dược điển Việt Nam IV”, NXB Y Học, Phụ lục 12 pp.
2 Lê Thị Mi Chi, Kiều Loan, Lê Thị Đại Phương, (2016), "Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học, đặc điểm vi phẫu và hình thái của cây Lá Đắng", Tạp chỉ Khoa học và Công nghệ Đại học Đà Nằng, quyến 1 (so 11), pp tr 78-81.
3 VÕ Văn Chi, (2012), "Từ điển cây thuốc Việt Nam", NXB YHọc, TP Hồ Chỉ
4 Trương Thị Đẹp, (2014), "Thực vật Dược", NXB Giảo dục Việt Nam, TP Hồ
5 Phạm Hoàng Hộ, (2003), "Cây cỏ Việt Nam", NXB Trẻ, TP Hồ Chỉ Minh, tập
6 Trần Hùng, (2016), Phương pháp nghiên cứu Dược liệu, Đại học Y Dược, TP
Hồ Chí Minh, pp tr 26-41.
7 Trân Hùng (2012), Chất chong oxy hóa tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe Bộ môn Dược liêu, Đại học Y Dược tp HCM, tr 20-26.
8 Abay s M., Lucantoni L., Dahiya N., Dori G., et al, (2015), "Plasmodium transmission blocking activities of Vernonia amygdalina extracts and isolated compounds", Malaria journal, 14 (1), pp 288.
9 Adesanoye o A., Farombi E O.,(2010), "Hepatoprotective effects of
Vernonia amygdalina (Astereaceae) in rats treated with carbon tetrachloride", Exp Toxicol Pathol, 62 (2), pp 197-206.
10 Ahmed Bamidele, Adeola p Bamidele, Danie A Nnate, (2017), “Evaluation of antioxdant potentials of the methanolic leaf extracts of vegetables, fruits and medicinal plants commonly consumed in Kaduna state, Nigera”, Journal of Medicinal Plants Studies, 5(1), pp 388-393.
Tetrachloride (CC14) onduced liver damage in Albino Wistar rats", European
Journal of Scientific Research, 26 (1), pp 122-130.
12 Atangwho I J., Ebong p E., Eteng M u., Eyong E u., et al, (2007), "Effect of Vernonia amygdalina Del Leaf on Kidney Function of Diabetic Rats",
International Journal of Pharmacology, 3 (2), pp 143-148.
13 Bhattacharjee B., Lakshminarasimhan p., Bhattacharjee A., Agrawala D., et al, (2013), "Vernonia amygdalina Delile (Asteraceae)-An African medicinal plant introduced in India", Zoo’s Print, pp.
14 Du-Bois Asante, Emmanuel Effah-Yeboah, Precious Barnes, et al, (2016),
“Antidiabetic Effect of Young and Old Ethanolic Leaf Extracts of Vernonia amygdalina: A Comparative Study”, Journal of Diabetes Research, 2016, pp.
15 Erasto p., Grierson D s, Afolayan A J., (2006), "Bioactive sesquiterpene lactones from the leaves of Vernonia amygdalina", J Ethnopharmacol, 106
16 Erasto p., Grierson D s, Afolayan A J., (2006), "Antioxidant Consitituents in
Vernonia amygdalina Leaves", Pharmaceutical Biology, 45 (3), pp 195-199.
17 Farombi E o., Owoeye o., (2011), "Antioxidative and Chemopreventive Properties of Vernonia amygdalina and Garcinia biflavonoid", International
Journal of Environmental Research and Pubic Health, 8 (6), pp 2533-2555.
18 Godwin o Igile, Wieslaw Oleszek, Marian Jurzysta, Stanislaw Burda, et al,
(1994), "Flavonoids from Vernonia amygdalina and their antioxidant activities", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42 (11), pp 2445- 2448.
19 Ijeh I L, Ejike c E., (2010), "Current perspectives on the medicinal potentials of Vernonia amygdalina Del.", Journal of Medicinal Plants Research, 5 (7), pp 1051-1061.
20 Iwalewa E.O., Adewunmi C.O., Omisore N.O.A., Adebanji O.A., et al, (2005),
"Pro- and Antioxidant Effects and Cytoprotective Potentials of Nine Edible
Vegetables in Southwest Nigeria", Journal of Medicinal Food, 8 (4), pp 539- 544.
21 1walokun B.A., Efedede B.U., Alabi-Sofunde J.A., et al, (2006),
“Hepatoprotective and antioxidant activities of Vernonia amygdalina on acetaminophen- induced hepatic damage in mice”, J Med Food, 9 (4), pp 524- 530.
22 Jisaka M., Ohigashi H., Takegawa K., Hirota M., et al, (1993), "Steroid glucosides from Vernonia amygdalina, a possible chimpanzee medicinal plant", Phytochemistry, 34 (2), pp 409 - 413.
23 Mbang A Owolabi, Smith I Jaja, Oyenike o Oyekanmi, Opeyemi J Olatunji,
(2008), "Evaluation of the Antioxidant Activity and Lipid Peroxidation of the Leaves of Vernonia amygdalina", Journal of Complementary and Integrative
24 Offor c E., (2014), "Comparative Chemical Analyses of Vernonia amygdalina and Azadirachta indica Leaves", IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences, 9 (5), pp 73-77.
25 Okamura N., Haraguchi H., Hashimoto K., Yagi A., (1994), “Flavonoids in
Rosmarinus officinalis leaves”, Phytochemistry, 37 (5), pp 1463-1466.
26 Sakthidevi G., V.R Mohan, et al "In vitro antioxidant activity of Alangium salviifolium (Lf) Wang (Alangiaceae) stem" IJAPCB 3(3): p 589-596.
27 Takhtajan A., (2009), "Flowering plant", Springer, 2 nd ed pp 498-503.
28 Toyang N J., Verpoorte R., (2013), "A review of the medicinal potentials of plants of the genus Vernonia (Asteraceae)", J Ethnopharmacol, 146 (3), pp 681-723.
29 Vats, s (2011), "Evaluation of antioxidant potential of Alangium salviifolium (Lf) Wangerin" Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine', p 147-150.
30 Wang M., Simon J.E., Aviles I.F., et al, (2003), “Analysis of antioxidative phenolic compounds in artichoke (Cynara scolymus L.)”, J Agric Food Chern,
31 Wing-Cheung Leung, H., Kuo, C.-L.,Yang, W.-H., et al, (2006), “Antioxidant enzymes activity invovement in luteolin-induced human lung squamous carcinoma CH27 cell apoptosis”, European Journal of Pharmacology, 534 (1-
32 Wu z Y., Raven p H., Hong D Y., (2011), Flora of China, 20-21 pp 354- 371.
33 Yeap s K., Ho w Y., Beh B K., San Liang w., et al, (2010), "Vernonia amygdalina, an ethnoveterinary and ethnomedical used green vegetable with multiple bioactivities", Journal of Medicinal Plants Research, 4 (25), pp 2787-2812.
Phụ lục 1 Ket quả sắc ký đo của các phân đoạn từ sắc ký cột nhanh- cao EtOAc uv 254nm uv365 nm
Phụ lục 2 sắc ký đồ HPLC V1
PA: 0.214 TH: 0.898 - Peak: Peak2 348.0nm - Purity
Phụ lục 3 sắc ký đồ HPLC V2
Phụ lục 4 Bảng so sánh số liệu phố NMR của V1 và Cynarosid
VI (500 MHz, DMSO-dó) Cyranosid (400 MHz, DMSO-do) [30] I3C
5’ 115,9 6,91 í/(lH; 8,5Hz) 115,9 6,90 ư (1H; 8,1Hz) 6’ 119,1 7,44 dd (1H; 7,5Hz;2Hz) 119,1 7,44