Khảo sát hệ vi nấm từ đất thuộc một số công viên tại TP hồ chí minh thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và kháng candida

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYÊN TÁT THÀNH MAI HÀ THANH BÌNH KHẢO SÁT HỆ VI NÁM TỪ ĐẤT THUỘC MỘT SỐ CÒNG VIÊN TẠI TP HÓ CHÍ MINH THÊ HIỆN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUÁN VÀ KHÁNG CANDIDA Chuyên ngàn[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYÊN TÁT THÀNH

MAI HÀ THANH BÌNH

KHẢO SÁT HỆ VI NÁM TỪ ĐẤTTHUỘC MỘT SỐ CÒNG VIÊN TẠI TP.HÓ CHÍ MINH THÊ HIỆN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUÁN VÀ KHÁNG CANDIDA

Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC

Hướng dẫn khoa học: ThS Lê Quang Hạnh Thư

Tp Hồ Chí Minh-2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu cùa tôi Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Sinh viên thực hiện

Mai Hà Thanh Bình

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu này được hoàn thành tại Bộ môn Vi sinh - Ký sinh trùng, trường Đại học Nguyễn Tất Thành Trong quá trình nghiên cứu, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô và bạn bè

Với tất cả lòng biết ơn chân thành và sâu sắc, em kính gửi lời cảm ơn đen Cô

ThS Lê Quang Hạnh Thư, người đã tận tâm hướng dần khoa học, động viên và khích lệ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô và các chị kỳ thuật viên tại bộ môn Vi sinh - Ký sinh trùng đã nhiệt tình hồ trợ và tạo điều kiện thuận lợi đe em hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu

Em cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nguyền Tất Thành và Ban Chủ nhiệm khoa Dược đà tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành nghiên cứu này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn the gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn quan tầm, khích lệ, động viên em trong suốt quá trình học tập

Xin trân trọng cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, ngày 24/09/2018

Mai Hà Thanh Bình

MỤC LỤC

Trang LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC Sơ ĐỔ VÀ HÌNH V DANH MỤC BẢNG vii

ĐẶT VÁN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 TỐNG QUAN VÈ VI NÁM SỢI 2

1.1.1 Đặc điếm cơ bản của vi nấm sợi 2

1.1.2 Nguồn lợi của vi nấm sợi trong đất 3

1.2 TỎNG QUAN VÈ ĐIỀU KIỆN ĐỊA LÝ - KHÍ HẬU CỦA TP.HCM 6

1.3 TỐNG QUAN VỀ HỆ VI NÁM SỢI TRONG ĐÁT 7

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới 7

1.3.2 Nghiên cứu trong nước 8

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 11

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CÚƯ, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHÁT 11

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11

2.1.2 Dung môi - hóa chất 11

2.1.3 Vi sinh vật thử nghiệm 11

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 11

2.1.5 Trang thiết bị 12

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 12

2.2.1 Phân lập vi nấm các mầu đất thuộc Tp.HCM 12

2.2.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu 12

2.2.1.2 Phân lập vi nấm 13

2.2.2 Định danh vi nấm sợi 14

2.2.3 Thử nghiệm khảo sát tính kháng khuấn và kháng nấm Candida của chất biến dưỡng từ vi nấm 15

2.2.3.1 Hoạt hóa vi sinh vật thử nghiệm 15

2.2.3.2 Phương pháp khảo sát tính kháng khuẩn - kháng nấm Candida 16

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17

3.1 KẾT QUẢ 17

3.1.1 Phân lập vi nấm 17

3.1.2 Định danh vi nấm 17

3.1.2.1 Chi Penỉcilliutn sp 17

3.1.2.2 Chi Aspergillus sp 23

3.1.2.3 Chi Paecilomyces sp 28

3.1.2.4 Chi Trichoderma sp 28

3.1.2.5 Chi Mucor sp 30

3.1.2.6 Chi Fusarium sp 30

3.1.2.7 Chi Plĩoma sp 31

3.1.2.8 Chi Curvuỉaria sp 32

3.1.2.9 Chi Cladosporium sp 32

3.1.2.10 Các mầu không đủ cơ sở định danh 33

3.1.3 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của chất biến dưỡng từ vi nấm 43

3.1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 43

3.1.3.2 Hoạt tính kháng nấm Candida 47

3.2 BÀN LUẬN 50

3.2.1 Phân lập và định danh vi nấm 50

3.2.2 Hoạt tính sinh học của chất biến dưỡng từ vi nấm trong đất 52

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

4.1 KÉT LUẬN 54

4.2 ĐÈ NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1: Danh mục vi nấm phân lập từ đất thuộc Tp.HCM PL-1PHỤ LỤC 2: Môi trường nuôi cấy PL-2PHỤ LỤC 3: Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn PL-3PHỤ LỤC 4: Ket quả thử nghiệm hoạt tính kháng nấm Candida PL-4

DANH MỤC CHỮ VIÉT TẤT

MRSA Staphylococcus aureus đề kháng methicillin

DANH MỤC Sơ ĐỒ VÀ HÌNH

Trang

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ định danh nấm sợi [25] 15

Hình 3.1 Khóm nấm Penicỉllium sp trên môi trường PDA và đặc điểm hiển vi 22

Hình 3.2 Khóm nấm A.niger trên môi trường PDA 23

Hình 3.3 Đặc điếm hiến vi của A.niger 01 lóp thề bình 24

Hình 3.4 Đặc điểm hiến vi của A.niger 02 lóp the bình 24

Hình 3.5 Khóm nấm A.flavus trên môi trường PDA 25

Hình 3.6 Đặc điểm hình thái và hiển vi chủng A.flavus GD4-3 25

Hình 3.7 Khóm nấm A.fumigatus trên PDA 26

Hình 3.8 Đầu bào tử cùa A.fumigatus (lOOOx) 26

Hình 3.9 Đặc điểm hình thái và hiển vi Aspergillus sp GD5-3 27

Hình 3.10 Đặc diem hình thái và hien vi Aspergillus sp GD5-4 27

Hình 3.11 Chủng Paecỉlomyces sp GD4-6 28

Hình 3.12 Khóm nấm Trichoderma sp trên PDA 29

Hình 3.13 Đặc điểm hiển vi của Trichoderma sp 29

Hình 3.14 Đặc điểm hình thái và hiển vi Mucoĩ sp TD1-3 30

Hình 3.15 Chủng Fusarium sp HVT2-2 31

Hình 3.16 Chúng Phoma sp TD2-3 31

Hình 3.17 Chùng Curvularia sp GD2-6 32

Hình 3.18 Chủng Cladosporỉum sp HVT5-7 33

Hình 3.19 Chủng TD2-9 33

Hình 3.20 Chủng GD4-4 34

Hình 3.21 Khóm nấm GD4-10 và GD4-11 trên PDA 34

Hình 3.22 Đặc điểm hiển vi cùa chủng GD4-10 35

Hình 3.23 Đặc điểm hiển vi cùa chùng HVT1-8 35

Hình 3.24 Đặc điểm hình thái và hiến vi chủng GDI-4 36

Hình 3.25 Đặc điểm hiển vi của chủng HVT3-6 37

Hình 3.26 Chủng TD2-12 37

Hình 3.27 Đặc điểm hiển vi cùa chùng GD3-6 và HVT1-9 38

Hình 3.28 Đặc điểm hiển vi của chùng GD4-7 38

Hình 3.29 Chủng TD3-2 39

Hình 3.30 Chủng GD3-7 40

DANH MỤC BANG

Trang

Bang 2.1 Bảng ký hiệu chủng vi nấm phân lập từ các mẫu đất tại Tp.HCM 14

Bảng 3.1 Số lượng vi nấm phân lập từ 15 mẫu đất thuộc Tp.HCM 17

Bảng 3.2 Hình thái khóm nấm và đặc điểm hiển vi Penỉciỉlium sp 18

Bảng 3.3 Hình thái khóm nấm và đặc điểm hiển vi của các chủng GD3-9, GD4-5, HVT2-4, HVT3-8, HVT5-10, TD2-6, TD2-7, TD2-14, HVT1-7, HVT2- 1 và HVT3-7 41

Bảng 3.4 Vi nấm có hoạt tính kháng khuấn 44

Bảng 3.5 Vi nấm có hoạt tính kháng nấm Candida 48

Bảng 3.6 Tỷ lệ phân bố vi nấm được phân lập từ đất thuộc Tp.HCM 51

Khóa luận tôt nghiệp Dược sì đại học - Năm học 2017-2018

KHẢO SÁT HỆ VI NẤM TỪ ĐÁT THUỘC MỘT SÓ CÔNG VIÊN TẠI TP.HÒ CHÍ MINH THÉ HIỆN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG CANDIDA

MaiHà Thanh BìnhHướng dần khoa học: ThS LêQuang Hạnh Thư

Từ khóa: vi nấm từ đất, Tp.HCM, kháng khuẩn, kháng nấm, Candida

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đoi tượng nghiên cứu: vi nấm sợi được phân lập từ một so nguồn đất thuộc Tp.HCM. Địa diem lấy đất gom công viên Tao Đàn, công viên Gia Định và công viên Hoàng Văn Thụ Phương pháp nghiên cứu:

- Phân lập vi nấm sợi: pha loãng mẫu đất với nước vô trùng đến nồng độ đạt yêu cầu, trải hồn hợp lên môi trường nuôi cấy thích họp Sau thời gian nuôi cấy, ly trích khuẩn ty và cấy chuyền nhằm tinh sạch chủng.

- Định danh: dựa vào hình thái khóm nam trên các loại môi trường nuôi cấy và đặc điểmhiển vi điển hình đe định danh vi nấm đen tên chi

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng Candidacủa vi nấm bang phương pháp đục lỗ.

Kết quả

Từ các mầu đất thuộc Tp.HCM phân lập được 103 chúng gom 69 chững được định danh đến tên chi - thuộc 09 chi gồm Penicillium, Aspergillus(15 chủng được định danhđến tên loài gôm A.niger, A.flavus và A.fumigatus'), Trichoderma, Mucor, Fusarium, Phoma,

Curvularỉa, Paecilomyces, Cladosporium và 34 chùng không đù cơ sở đe định danh

Có 27 chùng gom Penicillium, Aspergillus, Trỉchoderma và một số chùng chưa đủ điều kiện định danh the hiện hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus, MRSA,

Streptococcus feacalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa.

12 chùng gồmPenicillium, Aspergillus, Trichoderma và một số chùng chưa đù điều kiệnđịnh danh the hiện hoạt tínhkháng nấm Candidagồm c albicans, c.glabrata, C.tropicalis

03 chủng gồm Penicillỉum, Aspergillus và 01 chùng chưa đù điều kiện định danh vừa thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vừa thểhiện hoạt tính kháng Candida.

Kết luận

Hệ vi nam trong đất thuộc Tp.HCM đa dạng và phù họp với các nghiên cứu ve hệ vi nấm trong đất trên the giới, chù yếu là các chùngPenicillium, Aspergillus và Trỉchoderma Quakhảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn và kháng Candida cho thấy cómột số chủng vi nấm tiềm năng có khả năng sàn xuất chất biển dưỡng the hiện hoạt tính sinh học tốt.

Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2017-2018

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF FILAMENTOUS FUNGI ISOLATED FROM

SOIL IN PARKS OF HO CHI MINH CITY (VIETNAM)

Mai Ha Thanh BinhSupervisor: Le Quang Hanh Thu

Keywords: fungi, soil, antibiotic, antifungal, Ho Chi Minh city

Introduction

The aim of our study was to isolate fungi from soil in parks of Ho Chi Minh city, identify and evaluate antimicrobial activities of metabolitesfrom these fungi

Material and methods

Soil was collected from 03 parks include Tao Dan park, Hoang Van Thu park and Gia Dinh park.

Fungi were isolated and identified by colonial and microscopic characteristic.

Antimicrobial effect were evaluated by diffuse method.

Results

There were 103 fungi strains isolated from soil: 69 strains were identified belong to 09genous such asPenicillium, Aspergillus (A.niger, A.flavus, andA.fumigatus), Trichoderma, Mucor, Fusarium, Phoma, Curvularia, Paecilomyces, cladosporium and 34 strains couldn’t identified.

27 strains include Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, and some strains of unidentified fungi showed the antibiotic activityagainst Staphylococcus aureus, MRSA, Streptococcus

feacalis, Escherichia coll, andPseudomonas aeruginosa.

12 strains include Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, and some strains of unidentified fungieffected against Candida albicans, c.glabrata and C.tropicalis.

Penicỉllium was the main fungus of soil from parks in Ho Chi Minh city. Fungi in

Penicillium, Aspergillus, Trichoderma genous and some strain of unidentified fungi showed good biological activity and became potential sources of bioactiveagents

ĐẬT VÁN ĐÈ •

Vi sinh vật sống ở khắp nơi trên Trái Đất, ngay cả trong những nơi mà điều kiện tưởng chừng hết sức khắc nghiệt vần thấy có sự phát triển của vi sinh vật Vi sinh vật trong đất và trong nước có vai trò rất quan trọng trong các lĩnh vực như nông nghiệp, công nghiệp, y tế Hiện nay, hiện tượng đe kháng kháng sinh ngày càng lan rộng và gây nhiều khó khăn cho việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn Việc tìm kiếm các hoạt chất có tính kháng sinh mới có nguồn gốc thiên nhiên, đặc biệt là từ các chủng vi sinh vật, đang được nhiều nhà khoa học quan tâm

Trên the giới, các nhà khoa học đang tập trung theo hướng tỉm kiếm các hoạt chất thiên nhiên mới có tác dụng kháng khuân, kháng nấm là các chất biến dưỡng từ vi sinh vật Trong nước có một so đề tài tương tự đà được thực hiện ở các vùng như

Tp Cần Thơ, huyện cần Giờ Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu thường được ứng dụng đe bảo vệ cây trồng [4], [13] Chỉ có một số ít các đề tài tiến hành phân lập được các chủng vi nấm sợi có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh trên người và động vật [5],

Việc nghiên cứu và sàng lọc vi nấm có hoạt tính sinh học từ đất mang ý nghĩa khoa học thiết thực nhằm khai thác nguồn lợi thiên nhiên một cách họp lý Với mục tiêu

trên, chúng tôi thực hiện đề tài “KHẢO SÁT HỆ VI NẤM TỪ ĐẤT THUỘC MỘT SÓ CÔNG VIÊN TẠI TP.HÒ CHÍ MINH THẾ HIỆN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẤN VÀ KHÁNG CANDIDA”

Mục tiêu đề tài gồm:

- Phân lập vi nấm từ đất vườn ở một so vùng thuộc Tp.HCM

- Định danh vi nấm đã phân lập và thuần chủng

- Khảo sát hoạt tính kháng khuấn và kháng Candida của chất biến dưỡng do vi nấm sản xuất

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÓNG QUAN VỀ VI NẤM SỢI

1.1.1 Đặc điểm cơ bản của vi nấm sọi

Vi nấm được xếp loại trong giới Nam (Fungi) Vi nấm là nhóm nấm có kích thước hiển vi và thuộc nhóm sinh vật nhân thật (Eukaryote)

Vi nấm là sinh vật dị dưỡng, có đời sống hoại sinh hoặc ký sinh Te bào vi nấm không có diệp lục nên không tự quang hợp nhưng có hệ thống enzym dồi dào (cellulase, protease, catalase ) tham gia chuyển hóa chất Chúng tiết các enzym này ra môi trường giúp phân giải các họp chất phức tạp thành những họp chất đơn giản để hấp thu Tùy theo cấu tạo, có thể chia vi nấm thành hai nhóm gồm dạng nấm men (yeast) có cấu trúc đơn bào và nấm sợi (hyphae) có cấu trúc đa bào

Vi nấm sinh sản bằng bào tử, gồm bào tử hữu tính và bào tử vô tính Bào tử là đặc điểm quan trọng trong sự định danh nấm sợi Hau het nấm men phân chia theo kiểu nẩy chồi, một số ít loài khác phân chia theo kiêu nhân đôi giong vi khuẩn hoặc hình thành sợi nấm giả Nấm sợi sinh sản bằng các dạng bào tử vô tính như bào tử đính, bào tử đốt hoặc sinh sản hữu tính bằng đảm, túi [9], [12] Dựa vào phương thức sinh sản bào tử hữu tính của nấm hiện nay người ta chia giới nấm thành 4 ngành và một nhóm sau đây:

- Ngành nấm roi (Chytridiomycota)

- Ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota)

- Ngành nấm túi (Ascomycota)

- Ngành nấm đảm (Basidiomycota)

- Nhóm nấm bất toàn (Fungi Imperfect!)

Dựa vào chức năng, nấm ở đất có thể được chia thành ba nhóm: [24]

- Decomposers - nấm hoại sinh: nhóm nấm này giúp biến đổi vật liệu hữu cơ chết

thành sinh khối nấm, carbon dioxide (CO2) và các phân tử nhỏ như acid hữu

cơ Những loại nấm này thường sử dụng các chất nền phức tạp như cellulose và lignin Chúng rất cần thiết trong việc phân hủy cấu trúc vòng carbon trong một số

chất gây ô nhiễm Giống như vi khuẩn, chúng đóng vai trò quan trọng giúp giữ lại các chất dinh dưỡng trong đất.

- Mutualists - nấm mycorrhizal: đây là nhóm nấm cộng sinh ở rễ các loài cây Để

đổi lấy chất dinh dưỡng từ cây, các vi nấm này giúp hòa tan và chuyển hóa các chất như phot pho, nitơ, chất vi lượng có trong đất và không khí cho cây sử dụng

- Pathogens hay Parasites - nấm ký sinh gây bệnh: nhóm nấm này thường gây giảm

năng suất cây trồng, gây bệnh hoặc gây chết sinh vật khi chúng xâm chiếm rề cây

và tấn công các sinh vật khác Các vi nấm thuộc nhóm này thường gặp

như Verticillium, Pythium và Rhizoctonia Chúng gây thiệt hại kinh tế lớn trong

nông nghiệp mồi năm Tuy nhiên, nhiều loài nấm giúp kiếm soát bệnh trên cây trong vì chúng là thiên địch đối với một số loài sâu hại hoặc vi nấm gây bệnh khác Theo Elizabeth Tootyll (1984), nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài được mô tả, tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên Trái đất [1]

1.1.2 Nguồn lọi của vi nấm sợi trong đất

Nấm mốc có ảnh hưởng xấu đến cuộc sống con người một cách trực tiếp như làm

hư hỏng, giảm chất lượng thực phàm trước và sau thu hoạch, trong chế biến hoặc bảo quản Nấm mốc còn gây hư hại vật dụng, quần áo hoặc gây bệnh cho người, động vật và cây trồng

Nhưng bên cạnh đó, vi nấm còn giừ vai trò quan trọng trong việc phân giải chất hữu

co trả lại độ màu mỡ cho đất trồng Các quy trình chế biến thực phàm có liên quan đến lên men đều cần đến sự có mặt của vi sinh vật, trong đó có nấm moc Nấm men được sử dụng để sản xuất rượu vang hay bia Chúng được thêm vào bột để làm bánh

mì có độ nở nhất định, một số được sử dụng để sản xuất pho mát ở châu Á, một số

vi nấm được thêm vào đậu nành để tạo ra một số thực phấm như nước tương được ù băng nâm môc Aspergillus (A.oryzae, A.soyae, A.niger, A.terriol )[3]

Nấm có lợi cùng với một số vi khuân cũng có the hình thành các mạng lưới bảo vệ xung quanh rễ và lá để bảo vệ cây chủ Nấm Trichoderma bảo vệ rề cây khỏi sự tấn công của các vi sinh vật có hại Nấm còn cung cấp một lớp vỏ bảo vệ đe cung cấp

cả nước và phốt pho cho rề cây trong hạn hán Bên cạnh đó, Trichoderma có khả năng sinh tong họp các enzyme ngoại bào như amylase, protease có khả năng kháng một số bệnh hại ở cây trồng [6], [30], [31], [37], [31], [34].

Hợp chất cytosporone được chiết tách từ nước dùng lên men của nấm Trichoderma

sp FKI-6626 Cấu trúc hóa học được xác định chủ yếu bằng quang phổ NMR và khối phổ Họp chất này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại một số loài vi khuẩn như s.aureus, E.coli, p.aeruginosa và vi nấm gây bệnh như Candida

albicans, Aspergillus oryzae, Mucor racemosu [26],

Trichoderma viride được phân lập từ đất trong dưa leo tại trang trại Omar Makram

(Beheara Governorate, Ai Cập) vào mùa thu hoạch và mùa đông năm 2012/2013 đã được thử nghiệm như một chất kháng khuấn, chất chống oxy hoá và chống ung thư

T.viride từ đất trồng dưa chuột gây ức chế sự phát triến của nấm Fusarium solani, Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii Ngoài ra, cao chiết sinh khối nấm bằng cồn

đã được chứng minh có tính kháng khuẩn mạnh chống lại Bacillus subtilis, E.coli

và Pseudomonas fluorescens [18],

Nấm mốc cũng giúp tông hợp những loại kháng sinh (penicillin, griseofulvin), vitamin (nhóm B, riboflavin), enzyme và một số hoạt chất khác dùng trong công nghiệp thực phàm và y dược đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới Các loài nấm song cộng sinh hoặc nội sinh trong tế bào thực vật (endophytes) có khả năng sản xuất các chất biến dưỡng hữu ích cho cây và được chiết xuất để sử dụng trong sản xuất dược phẩm và hóa chất nông nghiệp [17],

“Thòi kỳ vàng son" của kháng sinh bắt đầu từ khi Alexandre Fleming lần đầu phát hiện ra chất ức chế vi khuan penicillin từ vi nấm Penicillium notation và được Emst Boris Chain và Howard Walter Florey tinh khiết hóa thành chế phàm để dùng trong điều trị (1941) Khi đó người ta định nghĩa "Kháng sinh là chất do vi nấm hoặc vi

khuẩn tạo ra, hoặc do bản tổng hợp, tông hợp, có tác dụng điều trị đặc hiệu với liều thấp do ức chế một số quả trình song của vi sinh vật và đơn bào mà không ảnh hưởng tới vật chủ” (Turpin, Velu 1857).

Trong các chùng Penicỉlỉium được phân lập từ đất nông nghiệp ở Bắc Iran thì

p.aurantiogriseum là một trong những loài có hoạt tính mạnh nhất Bên cạnh đó,

các chủng khác bao gồm p.viridicatum, p.citrinum và p.waksmanii cũng cho thấy hoạt động kháng vi sinh vật đáng kể đối với Candida albicans, Bacillus subtilis,

s.aureus, Salmonella typhi và E.coli [23].

Một số loại nấm thuộc chi Aspergillus cũng được biết đến với khả năng sản xuất các chất chuyến hóa có hoạt tính sinh học khác nhau cho ngành công nghiệp dược phẩm, chẳng hạn như acid terrecyclic A thể hiện hoạt tính chống ung thư và kháng khuẩn [21], [38]; lovastatin có tác dụng giảm cholesterol được sản xuất bởi nấm Aspergillus terreus [20]; echinocandin B được sản xuất bởi A.nidulans có tác dụng kháng nấm [16]; fumagillin là chất chuyến hóa của A.fumigatus the hiện tính kháng ký sinh trùng [34], Một số chùng Aspergillus cũng thế hoạt tính kháng khuẩn chông lại Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), E.coli, Enterococcus

faecalis kháng vancomycin và Candida albicans [36].

Nghiên cứu phân lập và sàng lọc vi nấm từ đất của các vùng khác nhau ở Punjab,

An Độ thu được hợp chất mới 7-methoxy-2,2-dimethyl-4-octa-4',6'-dienyl-2//- napthalene-l-one từ Penỉcillỉum sp thể hiện tác dụng kháng vi sinh vật đáng kể trên các chủng Staphylococcus aureus, S.epidermidis, Klebsiella pneumoniae,

Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans [28].

Sự gia tăng đáng ke hiện tượng đề kháng kháng sinh đã dần đến việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh mới từ vi sinh vật Đất được coi là một trong những môi trường thích hợp nhất cho sự phát triến cùa vi sinh vật [22] Vì vậy, các nhà khoa học đã tận dụng đất là một nguồn để phân lập ra các vi sinh vật hữu ích

1.2 TÓNG QUAN VỀ ĐIỀU KIỆN ĐỊA LÝ - KHÍ HẬU CỦA TP.HCM

Tp.HCM có toạ độ 10° 10' - 10°38' Bắc và 106°22' - 106°54' Đông, phía Bắc giáp tỉnh Bình Dương, Tây Bẳc giáp tỉnh Tây Ninh, Đông và Đông Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, Đông Nam giáp tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, Tây và Tây Nam giáp tỉnh Long An

và Tiền Giang Nằm ở miền Nam Việt Nam, trung tâm thành phố cách bờ biển Đông 50 km theo đường chim bay [42]

Tp.HCM nằm trong vùng chuyến tiếp giữa miền Đông Nam Bộ và đồng bằng sông Cửu Long với địa hình thấp dần từ Bắc xuống Nam và từ Tây sang Đông Vùng cao nằm ở phía bắc - Đông Bắc và một phần Tây Bắc với độ cao trung bình 10-25 m, xen kè có một số gò đồi, cao nhất lên tới 32 m như đồi Long Bình ở quận 9 Ngược lại, vùng trũng nằm ở phía Nam - Tây Nam và Đông Nam thành phố, có độ cao trung bình trên dưới 01 m, nơi thấp nhất 0,5 m Các khu vực trung tâm, một phần các quận Thủ Đức, quận 2, toàn bộ huyện Hóc Môn và quận 12 có độ cao trung bình, khoảng 05 - 10 m [40]

Nằm trong vùng nhiệt đới xavan, cũng như một số tỉnh Nam bộ khác, Tp.HCM không có bốn mùa xuân, hạ, thu, đông; nhiệt độ cao đều và mưa quanh năm (mùa khô ít mưa) Trong năm, Tp.HCM có có 02 mùa mưa - khô rõ ràng, làm tác động chi phối môi trường cảnh quan sâu sắc Mùa mưa bắt đầu từ tháng 05 tới tháng 11 (khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cao mưa nhiều), mùa khô từ tháng 12 tới tháng 04 năm sau (khí hậu khô, nhiệt độ cao và mưa ít) Trung bình, Tp.HCM có 160 tới 270 giờ nắng một tháng, nhiệt độ trung bình 27°c, cao nhất lên tới 40°C, thấp nhất xuống 13,8°c Hàng năm, thành phố có 330 ngày nhiệt độ trung bình 25 - 28°c Lượng mưa trung bình của thành phố đạt 1.949 mm/năm, trong đó năm 1908 đạt cao nhất 2.718 mm, thấp nhất xuống 1.392 mm vào năm 1958 Một năm, ở thành phố có trung bình 159 ngày mưa, tập trung nhiều nhất vào các tháng từ 05 tới 11, chiếm khoảng 90%, đặc biệt hai tháng 06 và 09 Trên phạm vi không gian thành phố, lượng mưa phân bố không đều, khuynh hướng tăng theo trục Tây Nam - Đông Bắc Các quận nội thành và các huyện phía bắc có lượng mưa cao hơn khu vực còn lại

Tp.HCM chịu ảnh hưởng bởi hai hướng gió chính là gió mùa Tây - Tây Nam và Bắc - Đông Bắc Gió Tây - Tây Nam từ Ấn Độ Dương có tốc độ trung bình 3,6 m/s vào mùa mưa Gió Bắc - Đông Bắc từ biển Đông có tốc độ trung bình 2,4 m/s vào mùa khô Ngoài ra, còn có gió mậu dịch theo hướng Nam - Đông Nam vào khoảng tháng 03 tới tháng 05 với tốc độ trung bình 3,7 m/s Có the nói Tp.HCM thuộc vùng không có gió bão Cũng như lượng mưa, độ ấm không khí ở thành phố lên cao vào mùa mưa (80%) và xuống thấp vào mùa khô (74,5%) Bình quân độ ấm không khí đạt 79,5%/năm [41].

Như vậy, nhìn chung Tp.HCM có điều kiện thiên nhiên thuận lợi cho vi nấm tồn tại

và phát triển

1.3 TÓNG QUAN VỀ HỆ VI NẤM SỢI TRONG ĐẤT

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới

Khoa học về các vi sinh vật có trong đất đã nghiên cứu và phân loại vi sinh vật dựa trên khả năng cố định đạm và các phản ứng sinh hóa Trong quá trình nghiên cứu, các loại vi khuẩn, nấm men và nấm mốc đã được phân lập và mô tả

Admetz (1886) là người tiên phong trong việc nghiên cứu vi nấm có trong đất ông

đã phân lập và đặt tên cho 04 loài nấm men và 11 loài nấm mốc bao gom cả

Aspergillus glaucus, Penicillium glaucus và Mucor stolonifer [ 15],

Có 19 loài được tìm thấy trong đất nông nghiệp và 28 loài trong đất vườn ở Bắc 24 Parganas, Tây Bengal Trong đất nông nghiệp, vi nấm chủ yếu là Aspergillus niger,

Rhizopus oryzae và Penicỉllium expansum Vi nấm chủ yếu trong đất vườn là Aspergillus niger và Fusarium moniliforme Nghiên cứu của Simpson chỉ ra rằng

đất vườn có nhiều vi nấm hơn so với đất nông nghiệp [32] Tại Hà Lan, Oudermans

và Koning phân lập được 45 loài vi nấm bao gom cả Trichoderma koningi và

đặc biệt là tất cả các địa phương trong nghiên cứu thuộc hai loại điều kiện khí hậu là đoi núi thấp (với nhiệt độ tối thiểu là -06°C) và vùng đồng bằng ấm (với nhiệt độ tối

đa là 46°C) [29],

Waksman định danh được hơn 200 loài nấm từ 25 nơi của nước Mỹ Trong số đó,

có 4 chi phổ biến là Aspergillus, Mucor, Penicillium and Trichoderma sống rải rác nhiều nơi Đặc biệt, Mucor và Penicillium thường xuất hiện trong đất ở vùng ôn đới hay vùng có khí hậu mát mẻ, Aspergillus có trong đất ở vùng nhiệt đới,

Trỉchoderma xuất hiện trong đất có tính chất ẩm ướt hay có tính acid [39].

Penicillium, Aspergillus, Trichoderma và Fusarium là các chủng nâm được tìm thây

nhiều nhất từ các độ cao khác nhau của vùng lyidere-Ikizdere ở Rize, Thổ Nhĩ Kỳ Các chùng vi nấm này được phân lập từ 40 mầu đất ở độ sâu 25 cm bằng kỳ thuật pha loãng mầu đất [27]

Có 61 chủng nâm sợi bao gôm Alternaria, Aspergillus clavatus, A.fumigates, A.flavus, A.glaucus, A.niger, A.terras, Fusarium, Mucor, Paecỉlomyces crustaceus, Penicillum, Phoma glomerata, Phoma, Rhizopus, Trichoderma được phân lập tại

vùng đất trầm tích của một dòng sông tại Ấn Độ [36],

1.3.2 Nghiên cứu trong nước

Vi nấm phân bố rộng rãi trên nhiều loại cơ chất tự nhiên, pho biến ở khắp nơi trên trái đất Các nghiên cứu về hệ vi nấm trong đất tại Việt Nam nói chung và tại Tp.HCM nói riêng còn tương đối ít, chủ yếu tập trung ở các vùng đất thuộc rừng ngập mặn Bên cạnh đó, lợi ích từ vi nấm phân lập từ đất của các nghiên cứu trong nước chủ yếu về khả năng thế hiện hoạt tính sinh học chống lại bệnh hại ở cây trồng

Theo nghiên cứu của Trần Thị Minh Định và Trần Thị Thanh Thủy phân lập được

58 chủng nấm sợi từ đất rừng ngập mặn cần Giờ Trong đó, tuyển chọn được 01 chủng Aspergillus terreus the hiện hoạt tính kháng mạnh trên vi khuấn thử nghiệm gom Bacillus subtilis và Escherichia colỉ Đồng thời, nhóm tác giả cũng tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu đe thu được họp chất có tính kháng sinh từ

A.terreus [4] Cũng tại rừng ngập mặn cần Giờ, theo nghiên cứu của Võ Thị Bích

Viên, 476 chủng vi nấm sợi được phân lập từ các mầu lá vàng trên cành, lá mục, cành khô, cành mục, đất mặt, đất sâu 05-10 cm; trong đó, có 98 chủng Aspergillus

và 168 chủng Penicillium Ket quả nghiên cứu cho thấy vi nấm sợi có mặt ở hầu hết các cơ chất của rừng ngập mặn nhưng đất mặt là cơ chất có nhiều chủng nấm nhất Các chủng vi nấm thể hiện hoạt tính kháng Bacillus subtilis tốt chủ yếu thuộc chi

Penicillium [14] Một nghiên cứu khác từ đất rừng ngập mặn cần Giờ của tác giả

Nguyền Thiện Phú và Vũ Thị Phương phân lập được 120 chủng vi nấm sợi Nhóm tác giả tuyển chọn được 6 chùng vi nấm sợi có khả năng sản xuất lovastatin Chùng

có hoạt tính tốt nhất được định danh bằng cách giải trình tự 28S rRNA cho kết quả thuộc loài Aspergillus terreus [11]

Báo cáo của Phạm Thị Ngọc Lan và Hoàng Dương Thu Hương có đề cập đến nhóm

vi nấm sợi hòa tan phosphate vô cơ được phân lập từ đất rừng ngập mặn Thừa Thiên - Huế nhằm cải thiện công tác ươm trồng phục hồi và phát triển hệ sinh thái rừng ngập mặn Từ 18 mầu đất đã phân lập được 164 chủng vi nấm sợi có khả năng hòa tan phosphate vô cơ, trong đó 02 chủng có khả năng hòa tan phosphate vô cơ

mạnh nhất được định danh đến tên loài đó là Aspergillus oryzae và Aspergillus japonicus [7].

Có 18 dòng nấm Trichoderma được phân lập từ 26 mẫu đất trong cây lương thực, cây công nghiệp và cây ăn quả thuộc các tỉnh Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh, Bà Rịa - Vũng Tàu và Tp.HCM Đây là các chủng nấm có khả năng sản xuất các enzyme ngoại bào như amylase, protease và có the khai thác tiềm năng như một tác nhân sinh học phòng trừ bệnh hại cây trồng tại địa phương [6]

Bên cạnh đó, theo nghiên cứu cùa tác giả Nguyễn Thị Hà cho kết quả phân lập được

11 chủng nấm sợi từ đất thuộc quận Ninh Kiều, thành phố cần Thơ cho hoạt tính kháng E.coli và B.subtilis Các chủng vi nấm này gồm Pemcillium, Aspergillus,

Fusarium, Trichoderma và Alternaria', trong đó, chủng nấm cho hoạt tính kháng

khuân tôt nhât là Penicillỉum pinophilum và Fusarium solani [5]

Một nghiên cứu tại Bình Dương của tác giả Đồ Lương Ngọc Châu và Nguyền Anh Dũng thu thập được các chủng Trichoderma từ các mẫu thân, lá cành mục và đất

mặt tại các vùng nông nghiệp Thử nghiệm khả năng đối kháng của 08 chúng

Trỉchoderma spp với 02 chủng nấm Sclerotium spp gây bệnh thối thân, thối lá trên

lan Mokara và Dendrobium đều cho kết quả tốt [2]

Trong số 120 chủng vi nấm sợi phân lập từ đất ở 15 địa điểm khác nhau thuộc các huyện Phú Vang, Hương Trà và thành phố Huế, tác giả Phạm Thị Ngọc Lan và Võ Thị Thanh Nhàn đã tuyển chọn được 02 chùng vi nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp chitinase gôm Aspergillus fumigatus và Aspergillus oryzae [8]

Như vậy, đa phần các nghiên cứu trong nước về vi nấm từ đất đều phân lập được các chùng vi nấm sợi chủ yếu thuộc các chi gồm Aspergillus, Penỉcillium và

Trichoderma Các chủng nấm này đều thế hiện hoạt tính sinh học như khả năng

kháng vi khuẩn và vi nấm gây bệnh hại ở cây trồng hoặc có khả năng sản xuất các chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học tốt

CHƯƠNG 2 ĐÓI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vi nấm sợi phân lập từ đất thuộc Tp.HCM Loại đất được chọn là đất trong cây co thụ ở công viên, nơi có bóng râm mát

- Thời gian lấy mẫu: Tháng 07/2018

- Địa điểm lấy mẫu:

+ Công viên Tao Đàn, 55C Nguyễn Thị Minh Khai, P.Ben Thành, Quận 1;

+ Công viên Gia Định, đường Hoàng Minh Giám, P.9, Quận Phú Nhuận;

+ Công viên Hoàng Văn Thụ, đường Hoàng Văn Thụ, P.2, Quận Tân Bình

2.1.2 Dung môi - hóa chất

Dung môi, hóa chất, thuốc thử đạt độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng:

- Hóa chất: acid lactic, phenol (tinh thể), glycerol do Trung Quốc sản xuất

2.1.3 Vi sinh vật thử nghiêm

Vi sinh vật thử nghiệm bao gom:

- Vi khuân: Escherichia coỉỉ ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Streptococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC 43300.

- Vi nâm: Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata PK12B, Candida

tropic alls PK12C.

Nơi cung cap chùng vi sinh vật: Khoa Dược, trường Đại học Y Dược Tp.HCM (41 Đinh Tiên Hoàng, P.Bến Nghé, Quận 1, Tp.HCM)

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường Sabouraud (SDA)

- Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)

- Môi trường Tryptic Soy Agar (TSA)

- Môi trường Czapeck Dox

- Môi trường Mueller Hinton Agar (MHA)

- Môi trường Potato Carrot Agar (PCA)

- Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) và Chloramphenicol 0,1%

- Môi trường cao nấm men

- Môi trường hồn hợp nước chiết ngô và cao nấm men

- Nước chiết ngô [33]

2.1.5 Trang thiết bị

- Lò hấp vô trùng Hiyayma HV-110

- Tủ cấy vô trùng ESCO AVC - 4D1

- Máy lắc ổn nhiệt IKA KS 4000Ĩ control

- Máy siêu âm Elmasonic SI20

- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss microsopy Gmbtt

- Tủ ấm Memmert INB - 5000

- Tủ sấy Memmert unB - 5000

- Tủ âm SANYO SR-U19JN

- Tủ lạnh SANYO SR - U19JN

- Cân kỳ thuật Sartorius TE412

- Máy vortex Labnet SO200 - 23V - EU

Các thí nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh - Ký sinh trùng, Khoa Dược, Đại học Nguyền Tất Thành, 300A Nguyễn Tất Thành, p 13 Q.4, Tp.HCM

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.2.1 Phân lập vi nấm các mẫu đất thuộc Tp.HCM

2.2.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu

Đất được lấy ở độ sâu 05 - 10 cm bằng dụng cụ sạch và đặt trong petri vô trùng.Đất được rây qua lưới kích thước lồ 01 mm đe loại bỏ đá sỏi Mầu được xử lý ngay hoặc được bảo quản ở 4°c không quá 48h

Pha loãng mẫu đất với dung dịch NaCl 0,9% đến nong độ đạt yêu cầu[10]:

- Cần 05 ống nghiệm, mồi ống 09 ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, đánh số từ 01 đến 05

- Cho 1,0 g đất vào ống nghiệm 01, lắc kỳ (độ pha loãng 01/10), đe lắng các phân tử lớn và nặng

- Hút 1,0 ml dung dịch 01 cho vào ống nghiệm số 02.

- Lặp lại bước trên cho đến ống 05 đe có độ pha loãng từ 1 O'2 den 1 O’" (lắc kỳ mồi ống trước khi chuyển dịch pha loãng vào ống mới và thay pipet ở mồi độ pha loãng)

- Hút 0,1 ml dung dịch ở mồi độ pha loàng, cho lên mặt thạch PDA chứa chloramphenicol 0,1% đế ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Dùng que tam giác

vô trùng trải dịch đều khắp mặt thạch

- Ư ở nhiệt độ phòng

2.2.1.2 Phân lập vi nấm

Các đĩa thạch đã trải mầu đất được ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của

vi nấm trong 03 - 07 ngày Thời gian theo dõi có thể lâu hơn nếu tốc độ sinh trưởng của vi nấm chậm

Thu sợi khuẩn ty và cấy chuyển sang các môi trường chứa chất dinh dưỡng thích hợp như môi trường thạch khoai tây đường (PDA), thạch Sabouraud (SDA) Thực hiện cấy chuyền vi nấm nhiều lần để tinh sạch chủng Tùy theo tốc độ phát triển của

vi nấm, tiến hành ủ mẫu ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của vi nấm trong khoảng 01-02 tuần hoặc lâu hơn Kiếm tra độ tinh sạch của chủng bằng cách quan sát sự phát triển đồng nhất của khóm nấm và đặc điểm hiển vi Đánh giá tốc độ phát triển của vi nấm trên các loại môi trường khác nhau để sơ bộ xác định môi trường nuôi cấy thích hợp

Các chủng nấm thu được từ các mầu đất, được kí hiệu dựa trên nơi lấy mẫu (TD: công viên Tao Đàn, GD: công viên Gia Định, HVT: công viên Hoàng Văn Thụ), vị trí lấy mẫu (1, 2, 3, 4, 5) và so thứ tự của mầu (1, 2, 3 )

Bảng 2.1 Bảng ký hiệu chùng vi nấm phân lập từ các mầu đất tại Tp.HCM

2.2.2 Định danh vi nâm sợi

Tên khoa học của vi nấm đuợc xác định đến chi Vi nấm sợi được tiến hành định danh dựa trên hình thái khóm nấm và đặc điếm hiển vi Quá trình định danh được thực hiện với các bước cơ bản sau:

Bước 1: Nuôi cấy vi nấm

- Cấy trên đĩa peptri để đo đường kính và các đặc diem hình thái của khóm nấm, theo dõi sự phát triển, sự thay đối màu sắc, hình dạng của khóm nấm theo thời gian

- Cấy lên lame để quan sát hình thể hiển vi như đặc điểm sợi nấm, bào tử

Bước 2: Quan sát khóm nấm Thời gian tiến hành trung bình từ 03 - 15 ngày Đối với số chùng nấm phát triển chậm hoặc có cơ quan sinh sản hữu tính, thời gian quan sát có the kéo dài hơn Quan sát các đặc điểm sau:

- Đường kính khóm nấm để đánh giá tốc độ phát triển

- Màu sắc và sự thay đối màu sắc của khóm nấm

- Đặc diem sắc tố được tiết vào môi trường nuôi cấy

- Đặc điếm giọt tiết trên bề mặt khóm nấm

- Các đặc điểm khác: mùi, cấu tử đặc biệt

Bước 3: Quan sát đặc điểm vi nấm dưới kính hiển vi quang học.

Khi nấm trưởng thành, tiến hành nhuộm với thuốc nhuộm Lactophenol cotton blue (LPCB) để quan sát đặc điểm sợi nấm, bào từ, cơ quan sinh sản Hoặc tiến hành cấy trực tiếp trên lame để quan sát

Bước 4: Dựa vào các khóa phân loại vi nấm để định danh chủng nấm phân lập

được

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ định danh nấm sợi [25]

2.2.3 Thử nghiệm khảo sát tính kháng khuẩn và kháng nấm Candida của chất biến dưỡng từ vi nấm

2.2.3.I Hoạt hóa vi sinh vật thử nghiệm

Vi khuẩn thử nghiệm được cấy hoạt hóa trên môi trường TSA 24h trước khi tiến hành thử nghiệm Sau đó, vi khuẩn được chuyển sang môi trường TSB đe tăng sinh trong vòng 4h Pha loãng môi trường TSB bằng nước muối sinh lý đến mật độ tương đương 10K tế bào/ml (so độ đục với ống Me Farland 0,5)

V i nấm Candida thử nghiệm được cấy hoạt hóa trên môi trường SDA 48h trước khi

tiến hành thử nghiệm Pha loãng vi nấm vào nước muối sinh lý và điều chỉnh đến mật độ tương đương 106 tế bào/ml (so độ đục với ống Me Farland 0,5)

V i nấm đã phân lập được hoạt hóa trên môi trường dinh dường phù hợp Sau 03 -

07 ngày, sử dụng dụng cụ để lấy một diện tích khóm nấm nhất định và chuyển sang

02 môi trường dinh dưỡng gồm:

- Môi trường 1: cao chiết nấm men

- Môi trường 2: hồn hợp nước chiết ngô và cao chiết nấm men

Sau thòi gian nuôi cấy 10 ngày, tiến hành siêu âm dịch nuôi có chứa vi nấm 30 phút

và thu dịch để thực hiện khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật

2.2.3.2 Phương pháp khảo sát tính kháng khuẩn - kháng nấm Candida

Nguyên tắc

Những chất biến dường được vi nấm sản xuất và tiết vào môi trường nuôi cấy Các hợp chất có tính kháng khuấn/kháng nấm sè lấn át sự phát triển cùa vi sinh vật thử nghiệm

Phương pháp đục lỗ

Môi trường thử nghiệm là thạch đĩa MHA dày 04 mm Sử dụng tăm bông vô trùng

để thấm huyền trọc vi sinh vật đã pha loãng và trải đều lên bề mặt thạch Sử dụng dụng cụ đục lồ đe tạo giếng có đường kính 06 mm Nhỏ 70 |11 dịch nuôi vi nấm vào giếng Đặt đĩa thử nghiệm vào ngăn mát tủ lạnh 2h để chất biến dưỡng của vi nấm khuếch tán vào môi trường thạch Sau đó, đặt đĩa thử nghiệm vào tủ ấm 37°c Tiến

hành đọc kết quả sau 24h đối với vi khuẩn và sau 48h đối với vi nấm Candida.

Thực hiện tương tự với mầu chứng âm là môi trường nuôi cấy vi nấm gom:

- Môi trường 1: cao chiết nấm men

- Môi trường 2: hồn hợp nước chiết ngô và cao chiết nấm men

Ket quả

Hoạt tính kháng khuẩn/kháng nấm được xác định theo đường kính vòng ức chế (mm)

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 KẾT QUẢ

3.1.1 Phân lập vi nấm

Từ các mẫu đất thuộc Tp.HCM phân lập được 103 chủng vi nấm gom 34 chủng từ công viên Tao Đàn, 38 chùng từ công viên Gia Định và 31 chủng từ công viên Hoàng Văn Thụ Ký hiệu chùng được liệt kê cụ thể ở phụ lục 1

Bảng 3.1 Số lượng vi nấm phân lập từ 15 mầu đất thuộc Tp.HCM

Công viên Tao Đàn

Fusarium (02 chủng), Phoma (01 chủng), Curvularia (01 chủng), Paecilomyces (01 chủng) và Cladosporỉum (01 chủng) 34/103 chủng không đủ cơ sở đe định danh.

3.1.2.1 Chi Penicilliunt sp.

Trên môi trường PDA, khóm nấm thường có màu xanh lục đến lục xám, ria khóm màu trắng Sợi nấm có vách ngăn, không màu, cuống bào tử thường phân nhánh ít

hay nhiều, mang các thể bình, từ thể bình sinh các bào tử hình cầu hoặc bầu dục xếp thành chuồi [10], [25], [35],

Penicillium là hệ vi nấm chính của mẫu đất thuộc Tp.HCM Từ 15 mầu đất, phân

lập đuợc 37 chủng Penicillium gồm 19 chủng từ công viên Tao Đàn, 06 chủng từ công viên Gia Định và 12 chủng từ công viên Hoàng Văn Thụ Penicỉlỉium xuất hiện tập trung ở mẫu đất TD1 và TD3

Hình thái khóm nấm và đặc điếm hiển vi của các chủng Pemcillium đuợc mô tả cụ thê trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Hình thái khóm nấm và đặc diem hiến vi Penỉcillium sp

1 TD1-1 Dạng bông sau chuyên sang

bột, màu xanh lục đậm, rìa màu trắng, ít nhăn, có giọt tiết không màu Mặt trái màu vàng nhạt

Thuôn dài, mập Hình cầu

Dạng bột, màu xanh lục đậm, khóm nhăn ít Mặt trái màu vàng

8 TD2-2 Dạng bột, màu trăng, nhăn,

trung tâm có nhiều giọt tiết màu vàng chuyên dân sang màu nâu đên màu đen Mặt trái màu vàng nâu, nhăn

17 TD3-3 Dạng bông, màu xám, rìa màu

trăng, khóm nhăn Mặt trái màu vàng

Thuôn dài Hình cầu

21 GD4-1 Dạng bông, màu xanh lục ở

trung tâm, rìa trắng Mặt trái màu nâu đỏ, nhăn

22 GD4-8

23 GD5-5 Dạng bông, màu xanh lá, rìa

vàng Mặt trái màu vàng cam, rìa màu trắng

Thuôn dài Hình cầu

25 GD5-8

26 HVT1-2 Dạng bột, màu xanh lục hơi

xám, rìa trắng Mặt trái hơi vàng

Thuôn dài Hình cầu

30 HVT3-5 Dạng bông, màu lục xám hơi

31 HVT4-2

Dạng bông, trung tâm màu lục xám, rìa màu trắng Mặt trái màu trắng

Thuôn dài Hình cầu

32 HVT4-3 Dạng bông, màu xám, rìa màu

trăng Mặt trái màu trăng Thuôn dài Hình cầu

33 HVT4-4

34 HVT5-4

Dạng bông, trung tâm màu lục xám, rìa màu trăng Mặt trái màu trắng

Thuôn dài Hình cầu

35 HVT5-5 Dạng bông, màu xám, rìa màu

trăng Mặt trái màu trăng Ngắn Hình cầu

Thuôn dài Hình bầu dục

TDl-1 TD1-6 TD1-8

TD3-7

TD3-9

TD3-4

HVT3-1 HVT3-5 HVT4-2 HVT4-3

Hình 3.1 Khóm nấm Pemcillium sp trên môi trường PDA và đặc điếm hiến vi

3.1.2.2 Chi Aspergillus sp.

Aspergillus sp là một nhóm nấm lớn Đặc điềm của khóm nấm rất đa dạng phong

phú và là đặc điểm có ý nghía trong định danh nấm Màu sắc, kết cấu bề mặt khóm nấm và tốc độ phát triển thay đổi tùy theo từng loài và điều kiện nuôi cấy [10], [19], [25], [35]

Có 17 chủng Aspergillus sp được phân lập từ cả 03 địa diem lấy đất

Nhóm Aspergillus niger

A.niger là một nhóm phố biến nhất và dễ nhận biết nhất của chi Aspergillus Đây

cũng là chùng nấm thường xuất hiện nhiều và gây ô nhiễm môi trường

Có 10 chủng A.niger được phân lập từ cả 03 địa điểm lấy mẫu đất gồm chủng

TD1-4, TD1-11, GDI-3, GD2-1, GD2-TD1-4, GD3-1, GD3-3, GD5-1, GD5-2 và HVT1-3 Các chùng này có đặc điếm khóm tự nhau Trên môi trường PDA, khóm nấm màu trắng lúc mới mọc, sau chuyển sang màu vàng rồi nâu đậm hay đen Khóm dạng sợi chuyển sang dạng bột Mặt trái không màu hay màu vàng nhạt Khóm nấm phát triển nhanh, thời gian theo dõi từ 03 - 05 ngày

Hình 3.2 Khóm nấm A.nỉger trên môi trường PDA

A.niger có dạng sợi nấm không màu, có vách ngăn Cuống bào tử nhằn, tận cùng có

đầu phình hình tròn to mang cấu trúc the bình 01-02 lóp Bào tử xếp thành chuồi dạng tỏa tia, bào từ hình cầu và có gai [10], [19], [25], [35],

Chủng TD1-4, TD1-11, GD2-1, GD2-4, GD3-1, GD3-3 và GD5-2 có cấu trúc thểbình 01 lớp.

Hình 3.4 Đặc điếm hiến vi của A.niger 02 lóp thể bình

(1) cấu trúc mang bào từ (400x) (2) Bào tứ (lOOOx)

Nhóm Aspergillus flavus

Có 02 chùng A.flavus GD4-2 và GD4-3 được phân lập với đặc điểm khóm và hiển

vi tự nhau Trên môi trường PDA, khóm nấm dạng bột, màu vàng lục, rìa khóm màu trắng Mặt trái màu vàng nhạt Khóm nấm phát triển nhanh, thời gian theo dõi

từ 03 - 05 ngày

Hình 3.5 Khóm nấm A.flavus trên môi trường PDA

Sợi nấm không màu, có vách ngăn Cuống bào tử nhẵn, tận cùng có đầu phình hình tròn to mang cấu trúc the bình 01-02 lớp Bào tử xếp thành chuồi dạng tỏa tia, bào

tử hình cầu hay bầu dục, hơi sần sùi, màu vàng nâu hơi lục [10], [19], [25], [35]

(1)

Hình 3.6 Đặc điếm hình thái và hiển vi chủng A.flavus GD4-3

(ỉ) Bào từ tủi (400x) (2) Bào tứ (lOOOx)

Nhóm Aspergillus funiigatus

Có 03 chủng A.fumigatus TD2-4, TD2-17 và TD2-18 được phân lập với đặc điểm

khóm nấm và hiến vi như nhau Việc định danh A.fumigatus chủ yếu dựa vào hình thái của cách đính bào tử và màu đặc trưng của khóm nấm [10], [19], [25], [35]

Trên môi trường PDA, khóm nấm dạng mịn như nhung, màu xanh xám rồi đậm dần Mặt trái màu vàng nhạt Khóm nấm phát triển nhanh, thời gian theo dõi từ 03 -

05 ngày

TD2-18

Hình 3.7 Khóm nấm A.fumigatus trên PDA

Cuống bào tử nhằn, tận cùng có đầu phình hình phều mang cấu trúc thể bình 01 lớp Bào tử hình cầu hay bầu dục xếp thành chuồi dạng cột [10], [19], [25], [35]

Hình 3.8 Đầu bào tử cùa A.fumigatus (lOOOx)