TÓM TẮTĐe tài “Xác định đặc tính di truyền học trên gen 16S của chung vi khuẩn Haemophilus paragallinarum gây bệnh phù đầu gà phân lập tại Ba Vì, Hà Nội năm 2017” được thực hiện từ thán
TÒNG QUAN TÀI LIỆU
Tổng quan về bệnh phù đầu gà
Bệnh phù đầu gà, hay còn gọi là bệnh sổ mũi truyền nhiễm, là một bệnh hô hấp cấp tính ở gà với tên khoa học Coryza Infectiosa Avium Bệnh có các triệu chứng điển hình như chảy nước mũi, hen khò khè, mặt phù thũng, sưng đầu và hốc mắt, kèm viêm kết mạc.
Bệnh gà kéo dài khoảng 1–2 tuần và lây lan rất nhanh qua đường không khí hoặc qua tiếp xúc giữa gà bệnh và gà khỏe Bệnh cũng có thể lây qua thức ăn và nước uống bị nhiễm khuẩn Tỷ lệ mắc bệnh ở gà dao động khoảng 40–70%, nhưng tỷ lệ chết lại thấp, chỉ khoảng 5–10%.
Viêm mũi ở gà bắt đầu với dịch viêm chảy ra từ mũi, ban đầu trong và sau đó chuyển sang màu trắng đục Nếu để kéo dài, dịch sẽ đặc lại thành các cục phình ở hai bên mũi, khiến gà khó thở, thở khò khè và phải mở miệng để hít thở Dấu hiệu đặc biệt và dễ nhận biết nhất là đầu gà bị phù, có hình dáng giống đôi đầu cú, đây là biểu hiện điển hình của bệnh phù đầu gà.
- Tỉ lệ đẻ trứng giảm từ 10- 40%.
- Gà chếtnghi mắc bệnh phù đầu, mổ khám thấycác bệnh tích sau:
- ỏ viêm xoang mũi đôi khi có cục viêm bã đậu.
- Tổ chức dưới da, đầu phù thũng.
- Viêm thanh quản, khí quản và đôi khi viêmphối.
- Viêm hô hấp mãn tính (viêm phổi và viêm túi khí).
Hình 1.3 Gà bị nhiễm bệnh do vi khuẩn H paragallinarum (trích dần từ VietDVM)
Ở gà mắc bệnh, thời gian ủ bệnh ngắn, chỉ từ 1–3 ngày; độ tuổi mắc bệnh thường ở khoảng 2–3 tuần tuổi Trong điều kiện thông thường, khi bệnh kéo dài sẽ xuất hiện nhiều tác nhân gây nhiễm khuẩn thứ cấp và các triệu chứng cũng trở nên rõ ràng hơn.
Bệnh lây từ gà ốm sang gà khỏe chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp với mầm bệnh tồn tại trong môi trường chăn nuôi, khiến gà khỏe cũng có nguy cơ nhiễm bệnh khi gặp nguồn lây từ gà ốm và các dụng cụ chứa mầm bệnh Nguy cơ lây nhiễm tăng lên khi gà tiếp xúc với mầm bệnh ngoài môi trường và khi quản lý chuồng trại thiếu vệ sinh Các trang trại nuôi hỗn hợp thường có tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn so với các mô hình nuôi riêng lẻ hoặc nuôi tập trung, do mật độ nuôi dày và sự giao thoa của mầm bệnh giữa các nhóm gà.
Ngay sau khi dịch xâm nhập vào cơ thể gà và ủ bệnh từ 1–3 ngày, gà nuôi sẽ xuất hiện các triệu chứng ban đầu, sau 2–3 ngày chúng lây lan nhanh ra toàn đàn qua dịch tiết mang mầm bệnh hoặc phân của gà bị bệnh Quá trình lây lan nhanh chóng này gây thiệt hại nghiêm trọng cho người chăn nuôi, ảnh hưởng đến sản lượng trứng và tỉ lệ hao hụt đầu con.
Bệnh xảy ra trên đàn gia cầm ở tất cả các nước có nền chăn nuôi gà và là bệnh thường gặp trong chăn nuôi gà công nghiệp.
Gà nuôi là vật chủ tự nhiên; ngoài ra, gà thả vườn ở châu Á cũng rất mẫn cảm với bệnh.
Tất cả các lứa tuổi của gà đều mẫn cảm với bệnh, nhưng gà lớn mắc bệnh nặng hơn so với gà nhỏ Đặc biệt dễ bị nhất là gà 2–3 tuần tuổi và gà hậu bị mới bắt đầu đẻ trứng.
Bệnh hay xảy ra vào vụ thu đông và đông xuân.
Các nghiên cứu trong và ngoài nước
Trên thế giới hiện nay đã có nhữngnghiên cứu về vi khuẩnH.paragallinarum:
Vào năm 2015, Theo T M Nabeel Muhammad và B Sreedevi công bố phát hiện H paragaïlinarum thông qua phản ứng PCR, được xác định từ vụ bùng phát bệnh sổ mũi truyền nhiễm ở gia cầm tại Andhra Pradesh, Ấn Độ Nghiên cứu cho thấy PCR là kỹ thuật chẩn đoán nhanh và có độ nhạy cao.
Theo Agnesia Endang Tri Hastuti Wahyuni và các cộng sự công bố năm 2018 cho thấy sự tăng trưởng của các chủng phân lập từ chim cút không phụ thuộc vào nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) Thử nghiệm độ nhạy được thực hiện bằng cách sử dụng năm chủng vi khuẩn Haemophilus paragallinarum được nghi ngờ nhiễm.
100%; 100% đề kháng với amikacin (AK), erythromycin (E), gentamycin (CN) và tetracycline (TE); 80% đề kháng với kanamycin (K)và trimethoprim (W); Kháng 60% đối với chloramphenicol (C); và 20% đối với enrofloxacin (ENR) (Wahyuni và ctv, 2018).
Trong công trình được công bố năm 2017 bởi Patil và cộng sự, các phương pháp HPG-2 PCR, multiplex PCR và trình tự 16S rRNA được chứng minh là các công cụ chẩn đoán phân tử nhạy cảm, đáng tin cậy và có thể xác định cả đặc tính phân tử lẫn huyết thanh học của các chủng H paragallinarum Những phương pháp chẩn đoán này có thể thay thế các đặc điểm của các phương pháp thông thường và có giá trị trong việc xây dựng các biện pháp phòng ngừa, kiểm soát nhanh chóng và chính xác chống lại mầm bệnh gia cầm này.
Nghiên cứu do Hellmuth JE và các đồng nghiệp công bố năm 2016 tập trung đánh giá ERIC-PCR như một phương pháp có khả năng phân biệt các loại H paragallinarum khác nhau thông qua phân lập tham chiếu dựa trên các mối quan hệ vô tính ERIC-PCR được thực hiện trên 12 chủng tham chiếu và 41 chủng phân lập từ Nam Phi và Nam Mỹ (Hellmuth JE và ctv, 2017).
Năm 2016, Theo Trujillo-Ruiz HH và các cộng sự công bố kết quả lâm sàng và mô bệnh thực nghiệm ở gà nhiễm H paragallinarum thuộc serovar C-l Nghiên cứu đưa vào các chủng tham chiếu gồm serovar Nhật Bản H-18 và một chủng Mexico, ESV-135 Kết quả cho thấy độc lực cao của chủng tham chiếu H-18 Độc lực của các chủng H paragallinarum có thể đóng vai trò quan trọng trong việc giải thích vì sao dịch sổ mũi ở gà bùng phát nghiêm trọng ở cả nhóm được tiêm chủng và không tiêm chủng (Trujillo-Ruiz và cộng sự, 2016).
Nghiên cứu của Morales-Erasto V và cộng sự công bố năm 2015 đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc-xin Coryza truyền nhiễm đối với sự xuất hiện của H paragallinarum serovar C-l ở gà Trong thử nghiệm, bốn loại vắc-xin Coryza truyền nhiễm có sẵn trên thị trường được đánh giá ở gà sau khi tiêm chủng và thử thách với một chủng serovar C-l lấy từ một trường hợp thất bại vaccin Coryza tại một đàn gà ở Mexico Kết quả cho thấy chỉ có một loại vắc-xin Coryza truyền nhiễm mang lại mức bảo vệ tốt, đạt khoảng 83% ở gà được tiêm chủng.
9 này có thể giải thích sự bùng phát coryza truyền nhiềm ở những đàn đã được tiêm chùng đã được quan sát thấy trên thực địa (Morales-Erasto và ctv, 2015).
Fernandez RP và các cộng sự công bố năm 2005 một nghiên cứu đánh giá mức độ bảo vệ và mức độ kháng thể ức chế hemagglutination-inhibition (HI) ở gà trước H paragallinarum, tập trung vào các chùng phân lập serovar phổ biến tại Mexico (A-1, A-2, B-1 và C-2) Vi khuẩn hai thành phần (A-1 và C-1) đã bảo vệ đáng kể và làm tăng kháng thể HI chống lại các phân lập serovar A-1, A-2 và C-2, nhưng không chống lại phân lập serovar B-1 Vi khuẩn ba thành phần (A-1, B-1 và C-2) đã bảo vệ và tăng cường kháng thể HI đối với tất cả bốn phân lập serovar Kết quả cho thấy ở các khu vực chăn nuôi gia cầm có serovar B-1 phổ biến, việc đưa serovar này vào vi khuẩn là cần thiết để bảo vệ chống lại Coryza nhiễm trùng do H paragallinarum phân lập serovar B-1. -**Support Pollinations.AI:** -🌸 **Ad** 🌸Powered by Pollinations.AI free text APIs [Support our mission](https://pollinations.ai/redirect/kofi) to keep AI accessible for everyone.
Trong nghiên cứu công bố năm 2013 bởi Theo Chen và cộng sự, chức năng của gen độc tố CDT (cytolethal distending toxin) từ Haemophilus paragallinarum đã được xác định và phân tích, và đây là báo cáo đầu tiên nhận diện cũng như giải thích chức năng của các gen cdtABC ở H paragallinarum Các sản phẩm do các gen cdtABC mã hóa có thể liên quan đến sinh bệnh của các bệnh do H paragallinarum gây ra.
Phương pháp PCR
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis và cộng sự ở Mỹ phát minh vào năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới Ý tưởng của Mullis là phát triển một quy trình cho phép DNA được nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép nhờ enzyme DNA polymerase.
DNA polymerase là enzyme tự nhiên có mặt trong các sinh vật sống, chịu trách nhiệm sao chép DNA khi tế bào phân chia bằng cách liên kết với sợi DNA mạch đơn và tổng hợp mạch DNA bổ sung Theo quy trình PCR ban đầu của Mullis, enzyme tham gia nhân bản DNA được thực hiện in vitro, và sợi DNA đôi bị tách thành hai sợi đơn khi đun nóng ở 96°C để tổng hợp mạch đôi mới ở từng chu kỳ Tuy nhiên quy trình PCR gốc có hiệu quả còn hạn chế vì mất nhiều thời gian, cần lượng lớn DNA polymerase và đòi hỏi phải giám sát liên tục trong suốt quá trình Sau đó, quy trình được cải tiến khi dùng DNA polymerase từ vi khuẩn ưa nhiệt sống trong mạch nước nóng ở nhiệt độ trên 110°C; enzyme này ổn định ở nhiệt độ cao và không bị phá hủy khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA, giúp quá trình sao chép DNA trở nên đơn giản và tự động hơn Một trong những DNA polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq polymerase, enzyme này được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR.
1.4.2 Nguyên tắc phản ứng PCR Đây là phản ứng tổng hợp phân tử DNA bang enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (thường là Taq polymerase) Các DNA polymerase chỉ có thể tổng hợp được mạch DNA mới từ mạch khuôn bằng cách kéo dài một moi (primer) là một trình tự nucleotide ngắn đã bắt cặp sẵntrên mạch khuôn.
PCR là một chuồi phản ứng nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mồi chukỳ gồm ba giai đoạn:
> Giai đoạn biến tính: tách chuồi DNA từ mạch đôi thànhdạng mạch đơn
> Giai đoạn bắt cặp: gắn cặpmồi đặc trưng theonguyên tắc bố sung
> Giai đoạn kéo dài chuồi: tổng hợp chuồi DNA mới giong DNA gốc
PCR bằng DNA polymerase bền nhiệt (Taq polymerase) trộn DNA khuôn với các dNTP và primers, sau đó hợp chất này được đưa vào chu trình nhiệt phù hợp gồm ba bước: tách chuỗi (denaturation), liên kết mồi (annealing) và tổng hợp chuỗi bổ sung (extension) Trong vòng thời gian nhất định, quá trình nhân bản có thể lên tới hàng triệu lần Sản phẩm DNA được nhân lên có thể được phát hiện bằng nhiều phương pháp, phổ biến nhất là điện di trên gel agarose kèm theo nhuộm ethidium bromide.
Thành phần phản ứng
1.5.1 Trình tự DNA cần nhân bản
Axit nucleic có thể là các đoạn đặc trưng của vi khuẩn gây bệnh, của gene bệnh lý hoặc của dấu ấn di truyền Trong công nghệ PCR, các đoạn axit nucleic này được nhân bản nhằm tăng số lượng, từ đó dễ dàng xác định sự hiện diện của mầm bệnh hoặc phân tích các biến thể gen Việc nhận diện và khuếch đại các phần DNA đặc trưng này hỗ trợ chẩn đoán, nghiên cứu gene bệnh lý và theo dõi dấu ấn di truyền trong các ứng dụng y sinh và phòng thí nghiệm.
Để đảm bảo PCR có thể phát hiện bệnh một cách dễ dàng, mẫu bệnh phẩm cần chứa nucleic acid đích và không bị nhiễm các chất ức chế phản ứng Phản ứng PCR sẽ không xảy ra nếu mẫu không có nucleic acid đích hoặc chứa các chất ức chế PCR như SDS, hemoglobin, các chất hữu cơ gây ức chế (ví dụ humic substances) và heparin Trong những trường hợp này, kết quả PCR sẽ âm tính nhưng có thể là âm tính giả Vì vậy, công tác chuẩn bị và xử lý mẫu bệnh phẩm cho thử nghiệm PCR cần được coi trọng, đặc biệt ở các phòng thí nghiệm áp dụng PCR để chẩn đoán và phát hiện bệnh.
Là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base (18-
Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi (primer) có hai vai trò chính: nhận diện và ghép vào hai đầu của vùng đích khi DNA được biến tính thành dạng sợi đơn, đồng thời cung cấp vị trí khởi đầu cho quá trình sao chép DNA; chúng còn ghép cặp theo nguyên tắc bổ sung (A-T, G-C) với chuỗi đích để đảm bảo khuếch đại đúng vùng mục tiêu.
Tính đặc hiệu của phản ứng PCR là yếu tố quyết định hiệu quả khuếch đại DNA Việc chọn và thiết kế đoạn mồi (primers) có độ đặc hiệu cao đối với chuỗi đích sẽ nâng cao tính đặc hiệu của sản phẩm PCR và làm cho cả quá trình phản ứng PCR trở nên đặc hiệu hơn Do đó, tối ưu hóa thiết kế primers để chúng ghép đúng với chuỗi đích, tránh liên kết không đặc hiệu với các trình tự ngoài mục tiêu, là bước quan trọng nhằm đạt được kết quả khuếch đại tin cậy và hiệu suất PCR tối ưu.
Khởi động enzyme polymerase phụ thuộc nhận diện đầu 3’ của khuôn mẫu; polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp mạch bổ sung khi nhận diện đúng đầu 3’, là đầu mà nó xúc tác cho việc gắn một dNTP vào chuỗi đang ở trạng thái sợi đôi.
Trong PCR, người ta thường dùng một cặp mồi gồm mồi xuôi và mồi ngược Cặp mồi này quyết định kích thước của sản phẩm PCR bằng cách xác định vị trí bắt cặp trên mẫu DNA đích Khoảng cách giữa hai mồi trên chuỗi đích càng xa nhau thì sản phẩm PCR sẽ có kích thước càng lớn, ngược lại khoảng cách càng gần thì kích thước sản phẩm càng nhỏ.
1.5.3 dNTP (deoxy nucleoside triphosphate) Đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích dNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là adenine (dATP), hay thymine (dTTP), hay cytosine (dCTP), hay guanine (dGTP) ở carbone số 1 (Cl) Ba phân tử phosphate (triphosphate) được gắn tại carbone số 5 (C5) cùa phân tử deoxyribose này và đâychính là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3’ của chuồi bổ sung trên chuồi đích Năng lượng đế phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu năng lượng của triphosphate trên dNTP.
1.5.4 Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt
Taq polymerase, a thermostable DNA polymerase, was the first enzyme used for PCR amplification, enabling rapid DNA amplification at high temperatures Beyond Taq, several other heat-stable polymerases have been used in PCR, including Vent and Deep Vent DNA polymerases from Thermococcus litoralis, Pfu DNA polymerase from Pyrococcus furiosus, Tth DNA polymerase from Thermus thermophilus, and Tma DNA polymerase from Thermotoga maritima, each with distinct properties that influence fidelity, processivity, and suitability for different PCR applications.
1.5.5 Dung dịch đệm cho phản ứng PCR
Phản ứng PCR thường được chuẩn bị với các muối đệm như Tris-HCl, KCl và MgCl2 MgCl2 ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất và đặc tính của quá trình khuếch đại PCR, vì Mg2+ là cofactor thiết yếu cho hoạt động của Taq polymerase Việc xác định nồng độ tối ưu của MgCl2 và các thành phần đệm thường được thực hiện bằng các thử nghiệm với từng phản ứng để đạt được hiệu quả cao nhất.
Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ):
Giai đoạn biến tính (denaturation) là quá trình tách chuỗi DNA từ sợi đôi thành hai sợi đơn Ở nhiệt độ khoảng 94–96°C, liên kết hydro giữa hai chuỗi DNA bị phá vỡ để hai sợi tách ra hoàn toàn Trước mỗi chu trình PCR, DNA được biến tính nhằm bảo đảm mạch DNA và mồi (primer) được phân tách đầy đủ và chỉ còn ở dạng sợi đơn Thời gian cho giai đoạn này thường từ 1–2 phút.
Giai đoạn bắt cặp (annealing) là quá trình gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung Sau khi hai sợi DNA được tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể ghép vào sợi DNA đơn Nhiệt độ của giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính khoảng 45–60°C Việc dùng sai nhiệt độ ở giai đoạn này có thể khiến mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu hoặc gắn một cách không đặc hiệu Thời gian bắt cặp từ 1–2 phút.
Trong giai đoạn kéo dài (extension) của quá trình khuếch đại DNA, DNA polymerase gắn vào sợi khuôn và tổng hợp chuỗi DNA mới dựa trên mẫu gốc Enzyme này bắt đầu gắn kết và di chuyển dọc theo sợi DNA để mở rộng chuỗi mới theo đúng hướng 5'→3' Nhiệt độ tối ưu cho giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào loại DNA polymerase được sử dụng Thời gian cho bước này phụ thuộc cả vào đặc tính của polymerase và độ dài của đoạn DNA cần sao chép, với quy tắc chung khoảng 100 bp mỗi phút.
Các đoạn DNA mới được hình thành lại được sừ làm khuôn de tong họp cho các chu kỳ tiếp theo.
1.6 Úngdụng của phưong pháp PCR
Nhờ kỹ thuật PCR, từ một lượng mẫu DNA rất nhỏ như một giọt máu, một sợi tóc hoặc một tế bào, người ta có thể nhân bản chính xác và theo thứ tự một lượng lớn DNA lên tới hàng triệu bản để phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản ứng PCR Trong công nghệ sinh học, PCR được ứng dụng để lập bản đồ gen, phát hiện gen, biến đổi gen và giải mã trình tự DNA, mang lại những ứng dụng thiết yếu trong chẩn đoán y khoa, nghiên cứu di truyền và phát triển liệu pháp sinh học.
Trong vi sinh học, PCR là một phương tiện hữu dụng để phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh trong các trường họp:
Các tác nhân không thể nuôi cấy bằng các phương pháp nuôi cấy thông thường gồm cả virus và vi khuẩn Ví dụ các virus như viêm gan B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV và SARS‑CoV hoặc H5N1; cùng với các vi khuẩn như Chlamydia, Legionella, Mycoplasma và Treponema pallidum Việc nhận diện những tác nhân này đòi hỏi các kỹ thuật chẩn đoán đặc thù và công cụ phân tích thay thế cho nuôi cấy tiêu chuẩn.
> Tác nhân nuôi cấy thường quycho kết quả chậm: M tuberculosis.
> Tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã được điều trị kháng sinh trước đó (laothấtbại nuôi cấy, viêm màng não mủ ).
PCR cũng được dùng để xác định độc tố của vi sinh vật: Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT - cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây bệnh của chúng PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó, có thế phân biệt một cách chắc chan Vibriocholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG) Vi khuan Clostridium difficile cũng được định loại thông qua xác định các loại độc tố riêngbiệt củachúng bằng PCR.
Những hiểu biết về gene 1 6S rRNA
Sử dụng trình tự gen 16S rRNA để nghiên cứu phát sinh vi khuẩn và phân loại đã trở nên phố biến vì chúng có những chức năng:
> Giống như RNA ribosome lớn (23S), nó có vai trò cấu trúc, đóng vai trò như một giàngiáo xác định vị trí của các protein ribosome.
> Đầu 3 có chứa trình tự chống -Shine-Dalgamo , liên kết ngược dòng vớimã khởi động AUGtrên mRNA 3'-end cùa 16S RNA liên kết với các protein
SI và S21 được biết là tham gia vào quá trình tong hợp protein; Liên kết chéo RNA-protein của AP Czemilofsky et al (FEBS Lett Vol 58, trang 281-284, 1975).
> Tương tác với 23s, trợ giúp trong việc gắn kết hai tiếu đơn vị ribosome (50S + 30S).
> Ôn định sự ghép cặp codon-anticodon chính xác ở vị trí A, thông qua sự hình thành liên kết hydro giữa nguyêntửNI cùa Adenine dư lượng 1492 và
1493 và nhóm2'OH cùa xươngsống mRNA.
Carl Woese và George E Fox là hai trong số những người tiên phong sử dụng 16S rRNA trong phylogenetics.
Hình 1.4 Cấu trúc của 16SrRNA từ vi khuẩn Woese năm 1987.
Trình tự gen 16S rDNA đã đóng vai trò then chốt trong việc xác định chính xác các chùng vi khuấn và khámphá vi khuân mới trong các phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng Nó không chỉ cung cấp thông tin chi tiết về nguyên nhân cùa bệnh truyền nhiễm, mà còn giúp các bác sĩ lâm sàng trong việc lựa chọn thuốc kháng sinh và xác định thời gian điềutrị và thú tục kiếm soát nhiềm trùng Với việc sử dụngtrình tự 16S rDNA đã phát hiện 215 loài vi khuẩn mới, trong số đó 29 loài thuộc về chi mới từ các mầu vật cùa con người Trong số 100 loài mới, Streptococcus sinensis, Laribacter hongkongensis, Clostridium hathewayi và Borrelia spielmanii do s sinensis, L.hongkongensis và c hathewayi đã được tìm thấy trên toàn cầu.
Điện di
1.8.1 Nguyên lý chung Điện di là quá trình chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch dưới tác dụng của dòng điện Trong quá trình điện di, phân tử tích điện sè di chuyển về điện cực có điện tích trái dấu với nó, việc phân tách nhau của các chất là theo khối lượng.Một hỗn họp các phân tử có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau
Mục đích: dùng để tách, phân tích các phân tử như ADN, ARN hay protein dựa trênđặc điếm vật lý của chúng như: kích thước, hình dạng.
Các phân tử protein và axit nucleic có thể điện di trên các khuôn đỡ như giấy, cellulose acetate và tinh bột, hoặc trên các loại gel như agarose và polyacrylamide Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên giá rắn—ví dụ gel agarose hoặc gel polyacrylamide—được sử dụng phổ biến nhất trong phòng thí nghiệm.
> Gel polyacrylamide: phân tách phân tử protein và các phân tử DNA có chiều dài Gel agarose: phân tách hiệu quả các phân tử DNA hoặc RNA có kích thước từ
Kỹ thuật giải trình tự gen
Có hai phương pháp giải trình gen đó là phương pháp hóa học cùa Maxam- Gilbert và phương pháp enzymecủa Sanger và cộng sự.
> Phương pháp hóa học của Maxam-Gilbert:
Vào năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu công bố phương pháp giải trình tự DNA bằng phương pháp hóa học Nguyên lý của phương pháp Maxam–Gilbert dựa trên phản ứng thủy giải đặc hiệu, cắt DNA ở các vị trí cụ thể và làm cho các chuỗi DNA không tự xoắn lại với nhau, từ đó hình thành tập hợp các đoạn có kích thước khác nhau để xác định trình tự nucleotide.
> Phương pháp enzyme sửdụng các dideoxynucleotide:
Phương pháp Sanger, được F Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977, dựa trên nguyên tắc tổng hợp mạch bổ sung nhờ DNA polymerase và sự có mặt của dideoxynucleotide (ddNTP) để ngắt tổng hợp ở các vị trí khác nhau Khi ddNTP được bổ sung cùng với dNTP thông thường, quá trình tổng hợp tạo ra một tập hợp các đoạn DNA có độ dài khác nhau, mỗi đoạn kết thúc tại một ddNTP đã chặn bước tổng hợp Mồi DNA ngắn được dùng làm khuôn cho phản ứng và các đoạn DNA được tách riêng bằng điện di để đọc trình tự nucleotide trên mạch đơn Kết quả là trình tự các nucleotide của mạch đơn được xác định và từ đó suy ra trình tự sắp xếp các nucleotide trong gen.
Hiện nay có phương pháp xác định trình tự nucleotide bằng máy tự động Trong kĩ thuật này, người ta không dùng đồng vị phóng xạ để đánh dấu mà sử dụng hóa chất Mồi loại ddNTP được gắn fluorochrome với các màu khác nhau; do đó mọi oligonucleotide kết thúc tại cùng một loại ddNTP sẽ có cùng một màu Sau khi điện di trên gel polyacrylamide, kết quả được xử lý qua một hệ thống vi tính để giải mã trình tự.
Xây dựng cây phát sinh loài
Phát sinh loài miêu tả lịch sử tiến hóa của một nhóm loài có đặc tính khác nhau nhưng vẫn có mối quan hệ họ hàng và cùng được hình thành từ một tổ tiên chung trong quá khứ Có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau để chứng minh đặc điểm phát sinh chủng loại này Trước hết, người ta so sánh trình tự DNA thuộc sinh học phân tử và hệ gen học để xây dựng cây phát sinh loài dựa trên dữ liệu di truyền Song song, người ta cũng so sánh các hóa thạch và di chỉ cổ sinh vật học để xác lập trình tự lịch sử và mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Những phương pháp này kết hợp với nhau giúp làm sáng tỏ quan hệ họ hàng và dòng thời gian tiến hóa của nhóm loài.
Các nhà sinh học tổ chức và phân tích mối quan hệ tiến hóa bằng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm phát sinh loài, hình thái học và mô tả theo nhánh học Các sự kiện chính trong quá trình tiến hóa của sự sống được xây dựng thành biểu đồ thời gian dựa trên hiểu biết hiện nay của khoa học, giúp làm rõ lịch sử phát triển và các mối quan hệ giữa các nhóm sinh vật.
CHƯƠNG 2 NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1 Noi thực hiện Đe tài được thực hiện từ tháng 2-2018 đến tháng 8 - 2018 tại phòng thí nghiệm
Vi sinh, Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM tọa lạc tại 2347 quốc lộ 1A, phường Trung Mỳ Tây, quận 12, TpHo Chí Minh.
- Nuôi cấy và tăng sinh chủng vi khuan H paragallinarum từ gà nhiễm bệnh theo phương pháp thường quy.
- Giám định loài vi khuan H paragallinarum theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỳ thuật PCR
- Xây dựng cây phát sinh loài và phân tích đặc điểm di truyền vi khuẩn H paragaỉlinarum.
Vi khuan H paragallinarumđã được phân lập từ gà mắc bệnh.
Bảng 2.1 Danhmục thiếtbị sử dụng trongnghiên cứu
STT Thiết bị STT Thiếtbị•
1 Máy ly tâm 10 Tù hấp
3 Máy vortex 12 Lò vi sóng
4 Máy Spindown 13 Bê ôn nhiệt
6 Tủ cấy 15 Máy nước cất
7 Tủ lạnh 16 Thiết bị điện di
8 Tủ mát 17 Kính hiển vi
Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng trongnghiên cứu
STT Dụng cụ STT Dụng cụ
2 Găng tay y tế 12 Bình tam giác
3 Khay đựng eppendorf 13 Bình xịt con
4 Hộp đựng đầu tuýp 14 Ống phacol
9 Que cấy trang 19 Đĩa petri
2.4.2 Hóa chất và thuốc thử
Bảng 2.3 Danh mục hóa chất và thuốc thử sử dụng trongnghiên cứu
STT Hóa chất STT Hoa,,, chat.hi.
1 Bộ nhuộm Gram 7 Dau soi kính
4 Sheep Bood Agar Base 10 TAE 50X
5 Brain Heart Infusion Broth 11 Prime
2.5 Các môi trường được sử dụng
2.5.1 Môi trường thạch BHI (Brain Heart Infusion Broth)
Quá trình pha chế môi trường nuôi cấy theo công thức BHI kết hợp với agar bắt đầu bằng việc cân và hòa tan các thành phần vào nước cất cho đến khi hòa tan hoàn toàn, sau đó hỗn hợp được đóng kín và tiến hành tiệt trùng bằng phương pháp phù hợp trước khi sử dụng.
Quy trình tiệt trùng bằng nhiệt được thực hiện và mẫu được làm nguội ở mức an toàn trước khi phân phối vào các đĩa Petri đã được chuẩn bị sẵn trong tủ cấy vô trùng Khi các đĩa đã đông đặc, chúng được bảo quản ở ngăn mát của tủ lạnh để duy trì điều kiện lưu trữ.
Cách pha và tiệt trùng môi trường nuôi cấy BHI: cân đúng thành phần và hòa tan trong nước cất cho đến khi dung dịch đồng nhất; đậy kín bình và thực hiện tiệt trùng ở điều kiện phù hợp; sau khi dung dịch nguội, bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh cho đến khi sử dụng.
2.5.3 Môi trường BHI - agar -máu cừu
Sheep Blood Agar (SBA) là một môi trường nuôi cấy phổ biến trong vi sinh học, cho phép phân biệt và đánh giá đặc tính sinh trưởng của vi khuẩn dựa trên khả năng biến đổi huyết trong môi trường SBA kết hợp nền agar với huyết cừu, giúp nhận diện các mẫu vi khuẩn thông qua các mô hình hemolysis (alpha, beta, gamma), từ đó hỗ trợ chẩn đoán và phân loại tác nhân gây bệnh Việc tối ưu thành phần và điều kiện nuôi cấy SBA đóng vai trò thiết yếu cho độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm, đồng thời yêu cầu tuân thủ nghiêm ngặt nguyên tắc vô trùng và an toàn sinh học Trong ngữ cảnh tối ưu SEO, nội dung về SBA có thể tập trung vào lợi ích của SBA trong nuôi cấy vi sinh, vai trò của huyết cừu, và cách nhận diện hemolysis để phân loại vi khuẩn.
2.6.1 Phương pháp nuôi cấy chủng H paragallìnarum
2.6.1.1 Khử trùng, vệ sinh tủ cấy
Bước 1: Bật đèn uv trong 20 phút để khử trùng khu vựcchuẩn bị cấy.
Bước 2: Dùng cồn 70 % lau sạch tủcấy, các dụng cụ cấy và khử trùng tay cho thật sạch.
Bước 3: Chuấn bị các dụng cụ như : môi trường cấy, que cấy, que trải, giá đỡ, đèncon, pipet,
2.6.1.2 Cấy ria bằng que cấy
Quy trình cấy và nuôi cấy vi sinh trong phòng thí nghiệm nhằm phân tích mẫu bệnh phẩm đòi hỏi sự khắt khe về vô trùng, thao tác chuẩn và tuân thủ an toàn sinh học Người làm việc xử lý mẫu bằng dụng cụ vô trùng và thực hiện các bước trên môi trường nuôi cấy để giảm thiểu nhiễm chéo và đảm bảo độ tin cậy của kết quả Sau khi chuẩn bị, vi khuẩn hoặc vi sinh vật được nuôi trong điều kiện kiểm soát và được quan sát sự phát triển theo thời gian để nhận diện và đánh giá đặc tính của tác nhân gây bệnh Kết quả được kiểm tra sau một khoảng thời gian phù hợp bằng phương pháp quan sát và phân tích phù hợp với mục đích chẩn đoán hoặc nghiên cứu.
Hình 2.1 Nuôi cấyvi khuẩn bằng que cấy tại phòng thí nghiệm
2.6.2 Nuôi tăng sinh trong môi trường lỏng
Chọn lọc khuẩn lạc khỏe từ đĩa thạch và xử lý mẫu trong môi trường nuôi cấy dinh dưỡng nhằm đảm bảo chất lượng và tính đại diện cho các phân tích vi sinh tiếp theo Quá trình chuẩn bị và trộn mẫu được tối ưu hóa để tạo sự đồng nhất của mẫu, phục vụ cho nghiên cứu, kiểm tra chất lượng và chẩn đoán vi sinh trong phòng lab.
2.6.3 Phương pháp nhuộm Gram tế bào vi khuẩn
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành hai nhóm: Gram dương và Gram âm, dựa trên đặc tính hoá lý của thành tế bào Phương pháp này được đặt theo tên của nhà khoa học Đan Mạch Hans Christian Gram (1853–1938), người đã phát triển kỹ thuật này vào năm 1884 với mục đích phân biệt Pneumococcus với Klebsiella pneumoniae.
Các thuốc thử được trình bàytrong Bảng 2.4.
Bảng 2.4 Các thuốc thử trong phươngpháp nhuộm Gram
Thuốc thử Thành phần Số lượng ĐK bảo quản
Crystal violet lOOml/chai X 1 Nhiệtđộ phòng Nhuộm Gram Lugol lOOml/chai X 1 Nhiệtđộ phòng
Alcohol 95% lOOml/chaiX 1 Nhiệtđộ phòng Safanine lOOml/chai X 1 Nhiệtđộ phòng
Chi tiết các bước thực hiện:
Bước 1: Làm 1 phết bệnh phấm hoặc vi khuấn trên một lame sạch Đe khô tự nhiên và cố định bằng cách hơ nóng qua ngọn lửa đèn cồn.
Bước 2: Nhỏ vài giọt Crystal Violet cho ohur đều lên trên bề mặt phết nhuộm và đếyên trongvòng 1 phút.
Bước3: Rửa nhanh bằng nước.
Bước 4: Nhỏ vài giọt Lugolcho phủ đều trên bề mặt phết nhuộm và đe yên trongvòng 1 phút.
Bước 5: Rửa nhanh bằng nước.
Bước 6: Tẩy màu bằng cách nghiêng lame và nhỏ từ từ alcohol lên phết nhuộm, khi giọt alcohol rời khỏi lame không có màu tím thì ngưngngay.
Bước 8: Nhỏ vài giọt Safranine cho phủ đều trên bề mặtphếtnhuộm và để yên trongvòng 1 phút.
Bước 10: Thấm khô phết nhuộm và quan sát dưới kính hiếnvi.
2.6.4 Phương pháp tách chiết DNA
Sử dụng phương pháp shock nhiệt đe tách chiết DNA
Chi tiết các bước thực hiện tách chiết DNAnhư sau:
Bước 1: Lấy 0,5 ml dung dịchtăng sinh vào ong tube 1,5ml
Bước 2: Ly tâm tâm 13000 vòng/5phút, bỏ dịch noi, giữ phần lắng
Bước 3: Tiếp tục cho 500 pl nước, vortex đều
Bước 4: Ly tâm 13000vòng/ 5phút, bỏ dịch nối, giữ phần lắng Lặp lại 3 lần
Bước 5: Bổ sung 300 pl nước, vortex cho tan đều Giừ ống vi khuấn trong khay đá trong 5-10 phút.
Bước 6: Cho vào bể ổnnhiệt ở 95 °C trong 15 phút.
Bước 7: Ly tâm trong 13000 vòng/5 phút, lấy phần nổi bên trên chứa DNA của vi khuấn.
Bước 8 DNA thu được bảo quản ở nhiệt độ -20 °C.
2.6.5 Giám định loài vi khuẩn H paragalỉinarum đã được nuôi cấy theo phưong pháp phát hiện gene 16s RNA bằng kĩ thuật PCR
2.Ó.5.2 Các thành phần của phản ứng PCR
Bảng 2.5 Các thành phần của phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (pl)
Chuẩn bị 1 ống eppendorf cần chạy PCR, ghi tên vi khuẩn cần đánh dấu.
Dùng pipet lấy các thành phần đã chuẩn bị vàoống eppendorf:
> Lấy 1pl DNA khuôn mầu
> Đậy nắp và tan đềubằng máy vortex
> Lắng hồn hợp phản ứng bằngmáy spindow
Bảng 2.6 Chukì nhiệtcủa phản ứng PCR
SỐ chu kỳ Chu kỳ Nhiệt độ(°C) Thời gian
1 Biến tính ban đầu 95 5 phút
Sản phẩm của phản ứng PCR được phát hiện bằng kỳ thuật điện di trên gel agarose nong độ 1%.
2 6.6.1 Chuẩn bị gel agarosenồng độ 1%
Bước 1: Cho 0,5g bộtagarosevà 50ml dung dịch TBE vào bìnhtam giác, lắc cho tan đều.
Bước 2: Cho vào vi sóng 1 - 2 phút.
Bước 3: Đe nguội đến nhiệt độ phòng khoảng 50 °C thì đổ vào khuôn đã cài sẵn lược Chờ khoảng 15 phút cho gel đông lại.
Bước 4: Rút răng lược ra sẽ được một dãy các giếng.
2 Ó.6.2 Bơm mẫu vào giếng và chạy điện di
Bước 1: Lấy miếng gel đã chuẩnbị vào bể điện di đã chứa dung dịch TBE, phần giếng miếng gel hướng về cực âm.
Bước 2: Hút Ipl mầu loadingbye và 1(11 mầu đã PCR mix lại với nhau và bơm vào từng giếng.
Bước 3: Bơm thang DNAvào giếng tiếp theo.
Bước 4: Tiến hành điện di từ cực âm sang cực dương Thời gian điện di 15 phút ở 60mA.
Bước 5: Đậynắp và cắm nguồn điện
Saukhi điện di, đặt miếng gel vào máy soi Quan sát và chụp hình kết quả.
2.6.7 Phương pháp xâydựng cây phả hệ
Phân tích trình tự gen của chủng H paragallinarum được thực hiện bằng phần mềm DNASTAR Lasergene (DNASTAR) Trình tự nucleotide của chủng H paragallinarum và các chủng tham chiếu được phân tích và so sánh bằng phần mềm BioEdit 6.0 (Hall, 2009).
Bài viết xây dựng và phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự di truyền của cấu trúc chủng H paragallinarum, so sánh với các chủng tham chiếu được lưu trữ tại ngân hàng gen NCBI GenBank Trình tự gene được sắp xếp và căn chỉnh bằng công cụ CLUSTAL X alignment (Thompson et al., 1997) Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên phần mềm MEGA 4.0, sử dụng mô hình Kimura-2 parameter để mô phỏng sự biến đổi nucleotide và đánh giá độ tin cậy của nhánh bằng bootstrap re-sampling 1,000 lần (Kumar et al., 2016).
CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn H paragallinarum
3.1.1 Ket quả nuôi cấyvi khuẩn H paragallinarum trên môi trường thạch
Trên thế giới, việc nuôi cấy vi khuẩn H paragallinarum cho thấy sự đa dạng và phức tạp của các phương pháp khoa học nhằm phân lập tác nhân gây bệnh Vào thế kỷ 19, các kỹ thuật trong phòng thí nghiệm về vi khuẩn và ký sinh trùng được phát triển mạnh, tạo nền tảng cho những tiến bộ sau này trong vi sinh Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã có những bước tiến đáng kể trong nửa thế kỷ qua, giúp cải thiện việc thu nhận, nhận diện và phân loại vi khuẩn Để nuôi cấy vi khuẩn từ một quần thể tự nhiên, cần tách chúng ra khỏi hỗn hợp và xác định dựa trên đặc điểm tăng trưởng cũng như các tiêu chí sinh học khác Vi khuẩn được nuôi cấy hiện nay thường dựa trên các đặc điểm tăng trưởng để xác định danh tính và tính chất của chúng.
Những môi trường cơ bản như máu cừu, máu thỏ, máu dê được sử dụng rộng rãi và đơn giản hơn rất nhiều.
Nghiên cứu cho thấy nuôi cấy vi khuẩn Haemophilus paragallinarum từ chim cút ở Indonesia là một ví dụ điển hình về đặc điểm hình thái thuộc địa trên đĩa thạch máu của mẫu bệnh phẩm Các khuẩn lạc của H paragallinarum trên đĩa thạch máu cho thấy hình tròn, màu trắng, trong, bóng, trơn và mịn như giọt sương, phản ánh những đặc trưng nhận dạng quan trọng của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi nuôi cấy chủng vi khuẩn H paragallinarum trên hai môi trường thạch là BHI-agar và BHI-agar máu, quan sát và ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc ở 37°C trong khoảng thời gian từ 24–48 giờ Kết quả cho thấy khuẩn lạc của H paragallinarum có kích thước đồng đều và không bị nhiễm khuẩn lẫn, như được minh họa trong Hình 3.1.
Môi trường BHI-agar- máu cừu
Thời gian Môi trường BHI-agar
Hình 3.1 Hìnhthái vi khuấnH paragalỉỉnarum được nuôi cấytrên 2 môi trường thạch
BHI - agarvà BHI - agar-máu cừu.
Trên môi trường thạch BHI-agar, khuẩn lạc phát triển tương đối nhanh trong vòng 24 giờ và sau đó tiếp tục lan rộng trên bề mặt đĩa thạch; chúng có hình tròn, căng bóng, màu trắng sữa, riêng biệt và bám sát vào bề mặt đĩa Trên môi trường BHI-agar máu cừu, khuẩn lạc cũng phát triển nhanh, sau 24 giờ hình thành rõ rệt, với các đặc điểm hình tròn, mỏng, căng bóng, màu trắng đục và riêng rẽ Ở cả hai môi trường thạch BHI-agar và BHI-agar máu cừu, khuẩn lạc có kích thước nhỏ, trơn, bóng, hình tròn và màu trắng đục, tương đối giống với hình thái khuẩn lạc nuôi cấy từ chim cút ở Indonesia đã được công bố.
Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc H paragallin arum trên môi trường thạch máu cừu
3.1.2 Ketquả nuôităng sinh vi khuẩn H paragallinarunt trên môi trường lỏng