Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH LUẬN VÀN TÓT NGHIỆP NUÔI CẤY, TĂNG SINH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN HỌC T
NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
Thời gian và địa điểm thực hiện
Đề tài nghiên cứu được triển khai từ tháng 2 đến tháng 8 năm 2018 tại phòng thí nghiệm Vi Sinh, thuộc Khoa Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Địa điểm thực hiện nằm tại số 2374, Quốc lộ 1, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, TP Hồ Chí Minh, đảm bảo điều kiện nghiên cứu chuyên sâu trong lĩnh vực công nghệ sinh học.
Nội dung nghiên cứu
Nuôi cấy và tăng sinh vi khuẩn c perfringen phân lập từ heo nhiễm bệnh theo phương pháp thường quy.
Giám định vi khuẩn c perfringen bằng phương pháp nhuộm gram và kỳ thuật PCR trên đoạn gen 16S RNA.
Xác định đặc tính di truyền học vi khuẩn c perfringen bằng phương pháp xác định câyphát sinh loài.
Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi c perfringen được phân lập từ mẫu bệnh phẩm heo nhiễm bệnh viêm ruột họai tử tại Ba Vì, HàNội vàtháng 2 năm 2016.
Vật liệu nghiên cứu
2.4.1 Thiết bị, dụngcụ thí nghiệm
Danh mục thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê chi tiết trong Bảng 2.1 và 2.2 dưới đây:
Bảng 2.1 Danh mục thiết bị dùng trong nghiên cứu
STT Thiết bị STT Thiết bị
1 Máy lytâm 10 Tủ cấy vô trùng
4 Máy ủ lắc 13 Bộ nguồn và bồn điện di
6 Máy cất nước 15 Tủ lạnh
8 Kính hiển vi 17 Lò vi sóng
Bảng2.2 Danh mục dụng cụ sử dụngtrongnghiên cứu
3 Bìnhtia 3 Micropipet 10 pl; 100 pl; 1000 pl
4 Que cấy trang 4 Pipet nhựa
5 Óng phancol 5 Đầutuýp các loại
6 Ống PCR 6 Hộp đựngđầu tuýp
8 Hộpnhựa 250 ml 8 Găng tay y tế
Bảng 2.3 Danh mục hóa chất và thuốcthử sử dụng trong nghiên cứu
STT Hóa chất và thuốc thử STT Hóa chấtvà thuốc thử
1 Cồn 70° 1 Brain Heart Infusion Broth
3 Bộ nhuộm Gram 3 Máu cừu
4 Dầu soi kính 4 Ethidium bromide
8 Brain Heart Infusion 8 Thang DNA
Môi trường sử dụng
Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy, cân chính xác 7,4 g Brain Heart Infusion Broth cho vào bình tam giác dung tích 500 ml, sau đó thêm 200 ml nước cất và khuấy đều Dùng giấy bạc bịt kín miệng bình, rồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 °C trong vòng 15 phút Sau khi khử trùng, môi trường được bảo quản ở 4 °C cho đến khi sử dụng, đảm bảo điều kiện vô trùng và hiệu quả nuôi cấy vi sinh vật.
Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy, tiến hành cân chính xác 7,4 g Brain Heart Infusion Broth và 4 g Agar, cho vào bình erlen cùng với 200 ml nước cất rồi khuấy đều cho tan Dùng giấy bạc bịt kín miệng bình và hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 phút Sau khi hấp xong, để nguội đến khoảng 50 °C và nhanh chóng đổ ra đĩa cấy trong điều kiện vô trùng của tủ cấy Khi thạch đông cứng, bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh để duy trì chất lượng môi trường.
2.5.2 Môi trường BHI - agar - máu cừu
Quy trình chuẩn bị môi trường nuôi cấy máu cừu gồm: cân chính xác 8,1 g Sheep Blood Agar Base và 4 g Agar, cho vào bình erlen cùng 200 ml nước cất rồi khuấy đều đến khi tan hoàn toàn Dùng giấy bạc bịt kín miệng bình và hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 phút Sau khi hấp, để nguội đến khoảng 50 °C, thêm 10 ml máu cừu vào, lắc đều và nhanh chóng rót ra đĩa cấy trong điều kiện vô trùng của tủ cấy Khi thạch đông lại, bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh để duy trì chất lượng môi trường nuôi cấy.
Trình tự thực hiệnthí nghiệmtrongnghiên cứu này được mô tả theo sơ đồ dưới đây:
1 Phân lập trên môi trường BHI - agar và BHI - agar - máu cừu ị Nhuộm gram quan sát hìnhthái vi khuẩn ị
Tăng sinh trong môi trường BHI ị Tách chiết DNA ị Phản úng PCR ị Điện di kiểm tra sản phẩm PCR ị
Giải trình tự sản phẩm PCR ị Định danh vi khuẩn trênngân hàng gen NCBI ị
Xây dựng cây phát sinh loài
Mầu bệnh phẩm bao gồm ruột non và phân: mầu ruột non lấy một đoạn khoảng
Mẫu bệnh phẩm được lấy trực tiếp từ trực tràng hoặc đoạn hồi tràng có tổn thương, với khoảng 10g phân Sau khi thu thập, mẫu được đựng vào ống nhựa vô trùng, đậy kín và bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2°C Quá trình vận chuyển đến phòng thí nghiệm phải được thực hiện trong vòng 24 giờ để đảm bảo chất lượng xử lý mẫu.
2.6.2 Phương pháp phân lập chủng c perfringens
Bước 1: Dùng cồn 70 % lau sạch bề mặt tủ cấy và các dụng cụ cấy.
Bước 2 trong quy trình cấy vi sinh yêu cầu chuẩn bị đầy đủ môi trường cấy, que cấy, que trải, giá đỡ, bình cồn xịt và đèn cồn Tất cả các thiết bị cần được bố trí đúng vị trí trong tủ cấy nhằm đảm bảo điều kiện vô trùng và thuận tiện cho thao tác, góp phần nâng cao hiệu quả và độ chính xác của quá trình cấy mẫu.
Bước 3: Bật đèn ƯV trong vòng 15 phút để sát trùngtoàn bộ phạm vi tủ cấy.
Bước 4: Sau đó bật hút tiếp 30 phút.
2.Ó.2 2 Cấy ria bằng que cấy
Phương pháp thuần khuẩn lạc nhằm đảm bảo mẫu cấy không bị nhiễm tạp, giúp phân lập vi khuẩn chính xác Trước khi tiến hành, đầu que cấy cần được khử trùng bằng cách nhúng vào cồn 90% và hơ kỹ trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó để nguội hoàn toàn trước khi kiểm tra bằng cách chạm nhẹ vào một góc đĩa thạch Việc cấy ngay sau khi hơ que có thể khiến khuẩn lạc bị chết Mẫu được lấy và ria cấy trên đĩa thạch theo bốn đường hình z để đảm bảo phân bố đều và dễ quan sát (Hình 2.1).
Hình 2.1 Phân lập khuẩn lạc bằng que cấy (Shmoop, 2008).
Lấy 5 pl dung mẫu vi khuẩn cho vào 1 góc bề mặt đĩa thạch, ta dùng que trải trải đều hết bề mặtthạch.
Hình 2.2 Phân lập vi khuẩnbằng que trải (Nisha Rijal, 2018).
2.Ó.2 4 Nuôi tăng sinh trong môi trường lỏng
Bước 1: Chọn khuẩn lạc khỏe đã phân lập từ đĩa thạch, dùng que cấy phết 1 khuẩn lạc và cấy vào 5 ml dung dịch BHI trong ốngphalcol.
Bước 2: Vortex cho đều hồn họp môi trường.
Bước 3: cố định ống phalcol vừa phân lập vào máy lắc, điều chỉnh nhiệt độ
37 °C, 200 vòng/phút và thời gian24 h.
2.6.3 Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn c perfingen
Để bảo quản vi khuẩn kị khí hiệu quả, cần chuẩn bị hộp nhựa kín hơi dung tích 250 ml chuyên dụng, túi hút khí Campy Gentm của hãng Thermo và giống vi khuẩn cần bảo quản Quy trình thực hiện gồm các bước cụ thể nhằm đảm bảo môi trường nuôi cấy phù hợp, giúp duy trì hoạt tính và chất lượng của vi khuẩn trong thời gian dài.
Bước 1: Đặt giống vi khuẩnvào hộp nhựa.
Bước thứ hai trong quy trình sử dụng túi hút khí Campy Gentm là nhanh chóng xé lớp vỏ bên ngoài bằng tay, sau đó lấy gói nhỏ bên trong và đặt vào hộp nhựa trong vòng 30 giây, cuối cùng đậy kín nắp hộp để đảm bảo hiệu quả bảo quản tối ưu.
Bước 3: Sau đóta đặt hộp nhựavào tủ ấm.
Bước 4: Trong vòng một giờ lượng Ơ2 trong hộp sẽ còn khoảng 6,2 - 13,2 % và hàm lượng CO2 sẽ còn khoảng 2,5 - 9,5 % trong vòng 24giờ.
2.6.4 Phuong pháp nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Để phân biệt hai nhóm vi khuẩn Gram âm (Gram negative) và Gram dương (Gram positive) người ta áp dụng phương pháp nhuộm Gram dựatrên đặc tính sinh lý của thành tế bào Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 - 1938), ông phát hiện kỳ thuật này vào năm 1884, về sau được Hucker và nhiềungười khác cải tiến.
Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, chiếm từ 50–90% cấu trúc vỏ tế bào, được tạo thành từ peptidoglycan dạng lưới, giúp giữ lại màu tím của thuốc nhuộm Crystal violet Ngược lại, vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng hơn, chỉ khoảng 10%, và được bao phủ bởi màng lipopolysaccharide bên ngoài, khiến chúng không giữ được màu tím kết tinh mà chỉ bắt màu hồng của thuốc nhuộm Safanin hoặc Đỏ Fucshin.
Bước 1: Ghitên mầu và ngày tháng sau mặt kính.
Để chuẩn bị mẫu vi sinh vật, trước tiên cần hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn nhằm loại bỏ dầu mỡ và vi khuẩn còn sót lại, đảm bảo bề mặt sạch sẽ Sau đó, lấy một khuẩn lạc tiêu biểu và phết đều lên lam kính đã được khử trùng, tiếp tục hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để làm khô mẫu, giúp quá trình quan sát dưới kính hiển vi đạt hiệu quả cao.
Bước 4: Nhỏ vài giọt Crytal Violet cho lan đều bề vế phết khuẩn lạc vàđể yên trongvòng một phút, sauđó rửa nhanh bằng nước.
Bước 5: Phủ đều bề mặc phết vài giọt Lugol và để yên một phút, sau đó rửa nhanh bằng nước.
Bước 6: Nhỏ vài giọt Alcohol lênvết phết để làmphai màu thuốc nhuộm (lưu ý nhỏ thật nhanh 5 đến 10 giây), sau đó rửa nhanh lại bằng nước.
Bước 7: Nhỏ vài giọt Safranie cho phủ đều bề mặt vết phết nhuộm và để một phút, sau đó rửanhanh bằng nước.
Bước cuối cùng trong quy trình nhuộm soi vi khuẩn là để tiêu bản khô tự nhiên hoặc sử dụng giấy thấm khô, sau đó tiến hành quan sát hình thái và đặc điểm bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu, giúp xác định chính xác loại vi khuẩn và hỗ trợ chẩn đoán hiệu quả.
Hình 2.3 Các bướcnhuộm Gram (Editorial Team, 2016)
2.6.5 Phuongpháp giữ giống vi khuẩn
Trong bước đầu tiên của quy trình tách chiết vi khuẩn, sử dụng pipet 1000 µl để lấy 1000 µl môi trường nuôi cấy vi khuẩn và cho vào ống eppendorf, sau đó tiến hành ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong vòng 4 phút Sau khi ly tâm, loại bỏ phần nước trong và giữ lại phần cặn để phục vụ cho các bước xử lý tiếp theo.
Bước 2: Hút 500 pl ethylene glycol nguyên chất hòa vào phần cặn, sau đó bổ sung thêm 500 pl môi trường nuôi cấyvi khuẩn BHI.
Bước 3: Vortex cho hồn họp đồng nhất, sau đó giữ lạnh ở nhiệt độ -80 °C.
2.6.6 Phương pháp tách chiết DNA bằngphưong pháp shock nhiệt
Mầuvi khuẩn c perfringen đã được phân lập và nuôi tăngsinh trong môi trường BHI lỏng đượcdùng để tách DNA.
DNA được thu nhận bằng phương pháp shock nhiệt, các bước tiếnhành như sau: Bước 1: Lấy 0,5 ml dịch tăng sinh cho vào ống tube 1,5 ml.
Bước 2: Ly tâm 13000 rpm/5 phút, sauđó bở phần dịch nổi, giữ phần vi khuẩn lắng dướiđáy.
Bước 3: Tiếptục cho 500 pl nước cất và vortex cho tan đều.
Bước 4: Ly tâm 13000 rpm/5 phút; bỏ phần nổi, giữ phần vi khuẩn lắng dưới đáy Lặp lạiba lần.
Bước 5: Bổ sung 300 pl nước cất, vortex cho tan đều; giữ ống vi khuẩn trong khay đá hoặc để trong tủ -20 °C trong 5-10 phút.
Bước 6: Cho vào bể ổn nhiệt (water bath) ở 95 °C trong 15 phút.
Bước 7: Ly tâm 13000 rpm/5 phút, thu phần nổi chứa DNA của vi khuẩn.
Bước 8: Bảo quản DNA ở ngăn mát tủ lạnh (2-8 °C, tạm thời), hoặc ở -20 °C (lâu dài) nhầm phục vụ cho các mục đích tiếp theo (PCR; reald - time PCR).
2.6.7 Giám định loài vi khuẩn c perfringen đã phân lập theo phương pháp phát hiện gene 16S bằng kỹ thuật PCR
2.6.7.1 Trình tự cặp mồi(primer pair) sử dụng cho PCR
2.Ó.7.2 Thành phần phản ứng PCR
Bảng 2.4 Thành phần phản ứngPCR
STT Thành phần Thể tích (pỉ)
Chuẩn bị một ống PCR sạch, đánh dấu rõ ràng trên nắp bằng bút không phai theo ký hiệu riêng để tránh nhầm lẫn Sử dụng pipet để lần lượt thêm các thành phần đã chuẩn bị vào ống PCR theo đúng thứ tự quy định, bắt đầu với bước đầu tiên là lấy 12 µl dung dịch ddLLO Việc tuân thủ quy trình này đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong phản ứng PCR.
Bước 3: Lấy 1 pl mồi ngược.
Bước 4: Lấy 1 pl DNA khuôn mầu.
Bước 6: Đậy nắp lại và trộn đều bằng máy vortex.
Bước 7: Lắng hồn họp phản ứng bằng máy spindow.
Sau đó ta đặt hồn họp vào máy PCR và cày đặt chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Số chu kì Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian
1 Làm mát sau phản ứng 4- 10 00
Bước 1: Cho 0,5 g bột agarosevào Erlen bổ sung 50 ml TBE, lắc cho tan đều. Bước 2: Cho vào lò vi sóng đun soi 1 - 2 phút.
Bước 3: Để nguội khoảng 50°C thì đổ vào khuônđã cài sằn lượt.
Bước 4: Đểyên 15 phút cho gelđông lại.
2.6.10.2 Bom mẫu vào giếnggel và chạy điện di
Bước 1: cho miếng gel đã chuẩn bị vào bể điện đi có chứa ddTBE, phần giếng của miếnggel quay về hướng cực âm.
Bước 2: làm sạchgiếng bằng cáchhút rồi thả lênxuống pipetttại miệng giếng. Bước 3: hút 1 pl thuốc nhuộm gelredbổ sung 1 pl mẫu trộn đều.
Bước 4: bơm toàn bộ 2 pl hồn họp vào giếnggel.
Bước 5: bơm thang DNA vào giếng kế tiếp.
Bước 6: đậynấp bể điện di và cấmnguồn điện. Điện di thực hiện trong 30 phút ở 80 mA.
Sau khi điện di xong ta vớt miếng gelra và đặt vào máy soi gel.
Quansát và chụp hình kết quả.