Nghiên cứu tạo dòng đuôi ái lực Carbonhydrate Binding Module 20 (CBM20) hướng đến sử dụng trong tinh chế Protein tái tổ hợp.pdf

DANH MỤC CÁC HÌNHHình 1.1 Cấu trúc phân tử CBM20 được xác định bằng phương pháp NMR Hình 1.2 Sơ đồ các loại CBM khác nhau gắn kết với các vùng khác nhau của 1 chất nên polysaccharideHình

TÓNG QUAN TÀI LIỆU

Ngành protein tái tổ hợp

Kể từ cuối thế kỷ XIX, các nhà di truyền học đã nghiên cứu và thành công trong việc sử dụng các thao tác DNA để xác định, di chuyển và sắp xếp các gene vào vi sinh vật chủ Ngành công nghiệp công nghệ sinh học đã phát triển mạnh mẽ nhờ đó, với nhiều enzyme được ứng dụng trong sản xuất thương mại enzyme công nghiệp và protein sinh dược phẩm Việc tinh chế protein rất quan trọng để mô tả đặc tính, cấu trúc và tương tác của các protein quan tâm, đồng thời giúp giảm lãng phí tài nguyên từ các nguồn không đầy đủ hoặc chứa lượng protein thấp Quá trình tinh sạch protein, dựa trên các đặc tính về kích thước, lý hóa, khả năng tương tác và hoạt tính sinh học, đóng vai trò thiết yếu trong việc xác định chức năng, cấu trúc và các mối quan hệ tương tác của protein trong tế bào, mô hoặc cơ quan Các nguyên liệu chính để sản xuất protein thường lấy từ vi khuẩn, men và tế bào các loài động vật có vú.

Ngành sản xuất protein tái tổ họp đang nổi bật là một thị trường tiềm năng với khoảng 25% dược phẩm thương mại là dược phẩm sinh học (Maztinez et al., 2012) Năm 2008, doanh thu toàn cầu của ngành protein sinh học dược phẩm đạt khoảng 87 tỷ USD, tăng lên 167 tỷ USD vào năm 2014, cho thấy sự tăng trưởng đáng kể của thị trường này Các hệ thống biểu hiện protein dựa trên nấm men đã chứng minh là nguồn protein có lợi cho công nghiệp và sinh học cao hơn, trở thành một trong những phương pháp phổ biến nhất trong sản xuất protein quy mô cao (Miralles et al., 2009) Tuy nhiên, để đạt được quy trình sản xuất protein tái tổ họp có tính cạnh tranh, hiệu quả và kinh tế cao vẫn còn là một thử thách lớn.

Giới thiệu chung về CBM20

Thuật ngữ CBM (Carbohydrate-Binding Module) mô tả một chuỗi axit amin liên tiếp có liên kết với các carbohydrate hoạt tính trong enzyme, có thể có hoặc không có hoạt tính thủy phân tinh bột (Machovic và cộng sự, 2002) CBM đóng vai trò như một phương tiện thúc đẩy sự liên kết của enzyme với chất nền, từ đó nâng cao hiệu quả hoạt động của cellulase (Sorimachi và cộng sự, 1996) Ngoài ra, CBM còn có khả năng làm tăng hiệu quả xúc tác của các enzyme hoặc điều chỉnh đặc tính của các protein điều hòa (Porro và cộng sự, 2011).

Cấu trúc của CBM20 được nghiên cứu bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân và nhiệt xạ tia X đơn tinh thể, trong đó CBM20 từ Aspergillus niger GA (Paavilainen et al., 1993) được xem là đại diện chính của nhóm này Cấu trúc của nó đã được xác định ở cả trạng thái tự do và phức hợp với P-cyclodextrin, cho thấy một cấu trúc nep-gấp p-sandwich rõ ràng với tám sợi p phân bố trong hai tấm p Nếp gấp này tạo thành một p-trands bên ngoài với hai vòng dài đáng kể, trong đó bốn vòng đã được xác định rõ.

Hình 1.1 Cấutrúc phân từ của CBM20 được xác định bằng phương pháp NMR.

(ProteinData Bank code: 1KUL of the A niger GA CBM20)

Các CBM được phân loại thành nhiều họ dựa trên sự tương đồng trong trình tự amino acid, phản ánh nguồn gốc phátsinh và chức năng đa dạng của chúng Trong đó, CBM20, một trong các họ đầu tiên được nghiên cứu, chủ yếu liên quan đến khả năng liên kết tinh bột, đã được xác định trong các enzyme thủy phân tinh bột ngoại bào do nấm và vi khuẩn tiết ra Hiện nay, có 9 họ CBM đã được báo cáo có khả năng liên kết tinh bột, bao gồm các họ như CBM20, 21, 25, 26, 34, 41, 45, 48 và 53 CBM20 chứa từ 30 đến 200 amino acids, tồn tại dưới dạng đơn, đôi hoặc ba miền trong một protein, và thường xuất hiện trong enzyme nội bào, enzyme phân hủy tinh bột từ thực vật, động vật có vú, cùng các vi khuẩn Một đặc điểm nổi bật của CBM20 là khả năng liên kết với tinh bột hoặc glycogen, thường được sử dụng để hỗ trợ các quá trình chuyển hóa liên quan đến carbohydrate.

CBM20 và CBM21 dự đoán có cấu trúc sơ cấp và cấu trúc thứ cấp tương tự, với CBM20 ban đầu được phát hiện tại C-termini của các enzyme thủy phân tinh bột và CGTases, trong khi CBM21S định vị tại N-terminal như trong GA từ Rhizopus oryzae (Gilbert và ctv, 2013) Các CBM được phân loại thành ba loại chính dựa trên hình dạng, mức độ tương đồng của ligand, và cấu trúc của vùng liên kết, thể hiện rõ trong các khu vực liên kết với các phân tử saccharide mục tiêu của enzyme.

Loại A liên kết với các bề mặt tinh thể của polysaccharides cellulose và chitin, chẳng hạn như các họ CBM1, CBM2, CBM3, CBM5, CBM10 Vị trí liên kết của chúng thường nằm trên mặt phẳng và chứa nhiều dư lượng amino acid, tạo thành một nền tảng có cấu trúc tương đối phẳng, dễ dàng liên kết với bề mặt chitin và cellulose (Hình 1.2B) Các CBM loại A là duy nhất và khác biệt rõ ràng so với loại B hoặc C. -**Sponsor**Bạn đang tìm kiếm giải pháp để cải thiện bài viết của mình, đảm bảo tính mạch lạc và tuân thủ các quy tắc SEO? [Article Generation](https://pollinations.ai/redirect-nexad/WCnlhGYY?user_id=983577) có thể giúp bạn! Với Article Generation, bạn có thể dễ dàng tạo ra các bài viết chất lượng cao, tối ưu hóa SEO trong vài phút, tiết kiệm thời gian và tiền bạc Hoàn hảo cho các startup và doanh nghiệp muốn tăng cường sự hiện diện trực tuyến mà không tốn kém!

Loại B (endo-type) là loại liên kết các chuổi glycans bên trong phổ biến nhất, được ghi nhận nhiều nhất trong các nghiên cứu Các vị trí liên kết kiểu B thường xuất hiện dưới dạng các rãnh mở rộng hoặc khe hở, chứa các chuỗi liên kết thường dài hơn, góp phần vào chức năng và cấu trúc của phân tử.

4 bốn đơn vị monosaccharide Có một số ví dụ CBM trong các họ CBM6, CBM 13, CBM20, CBM36và CBM 60.

Loại C của glycans (exo-type) đặc trưng bởi ràng buộc termini và vị trí liên kết thường nằm trong các túi nhận dạng phân tử đường chứa 1-3 đơn vị monosaccharide, như các họ CBM9, CBM13, CBM32, CBM47, CBM66, CBM67 Các CBM loại C được xem như 'giống như lectin' và có khả năng bao gồm lectins, đóng vai trò quan trọng trong nhận dạng và liên kết các phân tử đường.

Hình 1.2 Sơđồ của các loại CBM khác nhaugắn kết với các vùng khác nhau của một chất nền polysaccharide (Nguồn: Alicia Lammerts van Bueren, 2013)

1.2.2 Vai trò và chức năng của CBM

CBM thực hiện bốn chức năng chính:

- Hiệu ứng nhắm mục tiêu: tùy thuộc vào cấu trúc của vị trí liên kết các CBM hướng các enzyme đến các vùng riêng biệttrên chất nền saccharide.

Hiệu ứng lân cận của CBM giúp tăng nồng độ enzyme ở gần vị trí liên kết saccharide, từ đó thúc đẩy quá trình phân hủy chất hiệu quả hơn và nhanh chóng hơn.

Các CBM đã được chứng minh có khả năng làm gián đoạn bề mặt của các polysaccharides liên kết chặt chẽ như sợi cellulose và hạt tinh bột, giúp làm nới lỏng chất nền Các vâị trò phá vỡ này đặc biệt liên quan đến các CBM như CBM2a và CBM44, liên kết với xenluloza Ngoài ra, khả năng liên kết của CBM20 từ enzyme glucoamylase của Aspergillus niger đã chứng minh rõ ràng việc làm gián đoạn bề mặt tinh bột, góp phần nâng cao hiệu quả phân giải polysaccharides trong các quá trình sinh học và công nghiệp.

CBM (Carbohydrate-Binding Module) có khả năng gắn kết mạnh mẽ với các thành phần của tế bào vi khuẩn, giúp enzyme bám chắc vào bề mặt tế bào để thực hiện chức năng xúc tác Ví dụ, CBM35 đã được chứng minh tương tác đặc hiệu với axit glucuronic chứa glucose trên bề mặt tế bào, từ đó nâng cao hoạt động enzym trên chất nền carbohydrate Trong nghiên cứu, Amycolatopsis orientalis cho thấy khả năng xúc tác hiệu quả trên chitosan nhờ sự gắn kết của các enzyme qua các module CBM.

1.2.2.2 Vai trò của CBM20 trong các enzyme.

Các báo cáo cho thấy vai trò quan trọng của vùng CBM20 trong cấu trúc và hoạt tính của enzyme, đặc biệt là trong quá trình thủy phân tinh bột A-Amylases của GHI3 là loại enzyme hoạt động theo cơ chế endo, có khả năng phân cắt các liên kết a- trong polysaccharide, nhờ vào sự hiện diện của CBM20 giúp tăng cường khả năng nhận diện và gắn với phân tử mục tiêu.

1,4-glucosidic là liên kết trong các loại tinh bột, xuất hiện phổ biến trong thực vật, động vật và nấm Trong đó, enzyme a-amylases của vi khuẩn có chứa vùng C-terminal CBM20 đã được nghiên cứu biểu hiện chức năng trong E coli Tuy nhiên, các cấu trúc và chức năng cụ thể của CBM20 trong a-amylase vẫn chưa được khám phá chi tiết, mở ra cơ hội nghiên cứu sâu hơn về vai trò của chúng trong quá trình phân hủy tinh bột.

CGTases của GHI3 có khả năng xúc tác quá trình tạo thành cyclodextrins từ tinh bột và các polysaccharide chứa liên kết 1,4-glucan Vai trò của vùng CBM20 từ chủng Bacillus circulans 251 đã được chứng minh là có đuôi ái lực cao với hạt tinh bột, điều này được thể hiện qua phản ứng của E coli như một protein cùng họ với P-galactosidase (Namori T và ctv, 1993).

Các enzyme có chứa CBM20 donamylolytic

Các CBM20 từ Arabidopsis thaliana, đặc biệt là GWD3, đại diện cho một loại mới của họ CBM20 trong thực vật, có vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy tinh bột Những CBM20 này có khả năng kết hợp yếu, tạo điều kiện tối ưu cho chức năng điều tiết của GWD3 trong quá trình xúc tác phân hủy tinh bột, góp phần nâng cao hiểu biết về cơ chế sinh học này (Lawson et al., 1994).

Giới thiệu chung về Neurospora crassa

Loài(species)N crassa Hình 1.3 Neurospora crassa.

Báo cáo lịch sử đầu tiên về Neurospora crassa xuất hiện từ năm 1843 khi nó được xác định là chất gây ô nhiễm của các tiệm bánh tại Pháp Vài năm sau, vào giữa những năm 1920, nhà nghiên cứu di truyền Bernard Dodge bắt đầu quan tâm đến lợi ích của loại nấm này trong nghiên cứu di truyền, thậm chí đề xuất nó có thể hỗ trợ nghiên cứu của nhà di truyền học nổi tiếng TH Morgan Trong thực tế, Carl Lindegren, được xem là cha đẻ của di truyền học N crassa, đã hợp tác với Dodge để phát triển các nghiên cứu di truyền trên sinh vật này vào những năm 1930, và bắt đầu làm việc tại Phòng thí nghiệm của Morgan ở California.

Các đột biến sinh hóa đầu tiên được mô tả trong N crassa trongnăm 1941 (Colot

H và ctv, 2006) phương pháp của công trình nghiên cứu này đã tạo ra các “đột biến sinh hóa” trong vi khuấn (cho phép sự tiến bộ trong sinh vật này như các marker thích hợp bây giờ có the được sử dụng) và trình diễn tái to hợp trong vi khuẩn E coli cùng với những khám phá này, xuất phát trực tiếp từ công việc trong N crassa, cho phép phát triển di truyền cùa vi khuẩn Những loại đột biến này sau đó được đưa vào men và các vi sinh vật khác. Điều gì đã làm cho N crassa như một mô hình tốt cho di truyền học? Đầu tiên,

N crassa thường là haploid, chỉ với một giai đoạn lường bội ngắn trước khi gây bệnh Ngoài ra, tốc độ tăng trưởng nhanh, dễ nuôi cấy và yêu cầu dinh dưỡng đơn giản, di truyền Mendelian chính thống, khả năng xác định kiêu gen của tất cả bốn sản phấm của meioses cá nhân và tính nhạy cảm với đột biến, khiến nó trở thành một ứng cử viên lý tưởng và đặt biệt nó không gầy bệnh Vào những năm 1950, E colinối lên như một sinh vật mô hình mới, nơi hầu hết các phát hiện mới về các mặt lợi ích đặc biệt trong các lĩnh vực sinh hóa và di truyền vi sinh vật Tuy nhiên, N crassavần là nguồn cung cấp mạnh mè trong các lĩnh vực như tái tổ hợp meiotic, sinh học ty thể, sinh học phát triến, động lực nhiễm sac the và những người khác) và nó nhanh chóng trở nên rõ ràng hơn sinh học eukaryotic khácvới E coli, làm cho N crassa là mô hình duy nhất eukaryote và trởthành mô hình nghiên cứu chiếm gần 70% trong số khoảng

1.3.2 Chu kì sinh sản của N crassa

N crasset chủ yếu sống ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trong tự nhiên, thường sinh sống trên thực vật chết sau cháy rừng, với chu kỳ sinh sản tự nhiên khoảng 22 giờ Sự hình thành cơ thể sinh dục xảy ra khi hai sợi nấm của các loại phối giống khác nhau kết hợp, chứng tỏ quá trình lai chéo được ưu tiên tự nhiên do các yếu tố như ánh sáng và nhiệt độ ảnh hưởng Giai đoạn sinh dưỡng bắt đầu khi một bào tử tình dục (ascospore) hoặc bào tử vô tính (conidium) nảy mầm, dẫn đến sự phát triển của các sợi nấm phân nhánh đa nhân Trong tự nhiên, sức nóng từ ngọn lửa giúp kích hoạt ascospore nảy mầm, trong khi các tế bào conidial nảy mầm một cách tự nhiên Hệ thống sợi nấm lây lan mạnh mẽ, tốc độ tăng trưởng tuyến tính vượt quá 5 mm/h, góp phần hình thành mạng lưới nấm phong phú và phát triển hiệu quả trong môi trường tự nhiên.

Quá trình hình thành “sợi nấm” diễn ra khi nhiệt độ khoảng 37°C, giúp sợi nấm phát triển và mở rộng Sau khi sợi nấm đạt đến mức độ ổn định, các conidiophores trên không bắt đầu phát triển mạnh mẽ để sản xuất ra lượng lớn conidia, đặc trưng nổi bật của dạng cothê Quá trình này đóng vai trò quan trọng trong chu trình phát triển của nấm và khả năng sinh sản của chúng.

Trong các loại nấm đa bào haploid như N crassa, quá trình meiosis diễn ra trong giai đoạn lưỡng bội ngắn, là một trong những quá trình phức tạp nhất của chúng Các giai đoạn thực vật đa bào, mặc dù có chất lớn hơn nhiều so với giai đoạn lưỡng bội, thường có cấu trúc mô đun đơn giản với ít sự khác biệt Đột biến lặn ảnh hưởng đến giai đoạn lưỡng bội của vòng đời N crassa rất phổ biến trong quần thể tự nhiên Khi gặp điều kiện thiếu dinh dưỡng, N crassa kích hoạt giai đoạn sinh trưởng bằng cách tạo ra các cơ thể sinh non gọi là protoperithecia Các chủng của một trong hai loại giao phối có thể hoạt động như “con cái” hoặc “con đực” Quá trình phát triển croziers dẫn đến các sự kiện như karyogamy, meiosis, và postmeiotic mitosis diễn ra trong tế bào trung gian hay tế bào mẹ ascus Đặc biệt, hạt nhân lưỡng bội hình thành sau karyogamy ngay lập tức đi vào trong cơ thể, khiến pha lưỡng cực của vòng đời, kéo dài khoảng 24 giờ, giới hạn trong một tế bào đang phát triển với bộ gene khoảng 40 megabase.

Trong N crassa có khoảng bảy nhiễm sắc thể với xấp xỉ 10.000 gen mã hóa protein dự đoán (ColotH và ctv, 2006) và tống chiều dài bảnđồ di truyền của khoảng

1000 đơn vị (Perkins D và ctv, 1997) Chỉ có ~9% bộ gen bao gồm ADN lặp đi lặp lại.

Hình 1.4 Vòng đời củaNeurospora crassa (Nguồn: Chaya và cộng sự -2013)

1.3.3 Methyl hóa DNA trong Neurospora crassa

Quá trình methyl hóa DNA ở sinh vật nhân chuẩn vẫn còn nhiều bí ẩn, đặt ra câu hỏi về điều kiện quyết định vùng nhiễm sắc thể bị methyl hóa và chức năng của quá trình này N crassa được xem là hệ thống lý tưởng để nghiên cứu kiểm soát và chức năng của methyl hóa DNA Một số sinh vật như Caenorhabditis elegans, S cerevisiae và S pombe thiếu methyl hóa DNA, giúp phân lập và nghiên cứu vai trò của methyl hóa riêng biệt Trong N crassa, khoảng 1,5% các cytosine được methyl hóa, nhưng quá trình này không phân phối đều, tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu di truyền Các nghiên cứu về chuyển đổi methyl và ức chế methyl hóa trong N crassa đã làm sáng tỏ vai trò của methyl hóa DNA trong kiểm soát gene (Perkins D và cộng sự).

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng methyl hóa de novo xảy ra phổ biến và nhanh chóng sau quá trình tái tạo gen Đặc biệt, các đột biến methyl hóa liên quan đến gen hoang dại và gen khiếm khuyết cho thấy sự thay đổi methyl hóa rõ rệt sau các thao tác di truyền Những phát hiện này cung cấp cái nhìn sâu hơn về cơ chế epigenetic trong quá trình chỉnh sửa gen và phát triển các chiến lược mới trong nghiên cứu di truyền.

Tống quan về phương pháp

N crassa là loài nấm có nhịp sinh học được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1959 (Stadler David, 1959) Loài này trải qua cả hai chu kỳ sinh sản hữu tính và vô tính, với quá trình chuyển mạch phát triển khi gặp các tín hiệu nhất định Trong quá trình này, sợi nấm bắt đầu hình thành các sợi nấm không phân đoạn và sản xuất bào tử vô tính gọi là macroconidia, còn gọi là conidia Conidia có màu cam sáng đặc trưng do chứa các sắc tố carotenoid và có khả năng kháng nước mạnh Quá trình sản xuất conidia này diễn ra theo chu kỳ hàng ngày và đạt đỉnh vào thời điểm trước bình minh.

N crassa, cùng với Drosophila, đã được nghiên cứu để xác định các vòng phản hồi phân tử cốt lõi của nhịp sinh học, giúp hiểu rõ các quá trình dao động sinh học trong sinh hóa, sinh lý và khả năng biểu hiện theo khoảng thời gian khoảng 24 giờ (Leslie J và cộng sự, 1985) Biểu hiện sinh lý của đồng hồ sinh học trong N crassa thể hiện rõ qua quá trình sản xuất conidial, đặc trưng bởi các vùng xen kẽ của sợi nấm và bào tử Trong môi trường agar nhỏ, các tế bào của N crassa có khả năng phát triển liên tục dưới ánh sáng và duy trì sự phát triển bán tuyến tính sau khi chuyển sang điều kiện tối, phản ánh khả năng thích nghi và duy trì nhịp sinh học theo chu kỳ hàng ngày.

1.4 Tổng quan về phương pháp

1.4.1 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction)

PCR là một phương pháp đột phá được phát triển bởi Kary Mullis vào những năm 1980, giúp khuếch đại trình tự nucleic acid mục tiêu một cách nhanh chóng và chính xác Phản ứng PCR sử dụng DNA polymerase, cặp mồi và nucleotide để tạo ra lượng lớn các đoạn DNA mục tiêu từ DNA khuôn ban đầu Nguyên tắc của phương pháp dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong việc tổng hợp mạch mới dựa trên chu kỳ nhiệt, giúp nhân đôi DNA một cách hiệu quả Các yếu tố thiết yếu để thực hiện phản ứng PCR bao gồm nhiệt kế, DNA khuôn, cặp mồi và các nucleotide cần thiết cho quá trình tổng hợp DNA.

Để thiết kế hai mồi oligonucleotide phù hợp, cần xác định trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn DNA cần nhân, đặc biệt là sợi khuôn DNA Độ dài của chuỗi DNA không quá dài, thường khoảng 1-1,5 kb, nhằm đảm bảo quá trình khuếch đại diễn ra hiệu quả hơn.

Hai đoạn mồi ngắn được sử dụng để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA, đảm bảo chính xác trong quá trình nhân giống Mồi dài khoảng 20 nucleotide, trong đó các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung, giúp tránh tạo cấu trúc kẹp tóc và tối ưu hóa hiệu quả phản ứng Thiết kế mồi phù hợp là yếu tố quan trọng để đảm bảo sự chính xác và hiệu quả trong quá trình tổng hợp DNA, đồng thời giảm thiểu các vấn đề liên quan đến cấu trúc không mong muốn.

- Môi trường đệm cung cấp ion Mg2+, nước sinhhọc phân tử và các enzyme phân hủy nucleic acid.

- Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq) do phảnứng luôn phải thực hiện ở nhiệt độ khác nhau Đặcđiểm của phản ứng PCR là chọn lọc và nhanh.

Hình 1.5 Các giai đoạn phản ứng của PCR (Nguồn: Kary Mullis - 1980).

Phản ứng PCR là quá trình thực hiện chuỗi các chu kỳ lặp đi lặp lại để nhân bản DNA, trong đó mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn chính: biến tính, bắt cặp và kéo dài Giai đoạn biến tính giúp tách phân tử DNA thành các chuỗi đơn, giai đoạn bắt cặp xúc tác sự liên kết của primer với DNA đích, còn giai đoạn kéo dài là nơi DNA polymerase tổng hợp chuỗi mới dựa trên đoạn khuôn mẫu Quá trình lặp lại các chu kỳ này đảm bảo số lượng DNA mục tiêu được nhân đôi một cách hiệu quả, là nền tảng của phương pháp PCR trong chẩn đoán y học và nghiên cứu sinh học.

Colony PCR là phương pháp nhanh chóng để kiểm tra sự hiện diện của DNA chèn trong các khuẩn lạc của nấm men hoặc vi khuẩn sau quá trình chuyển gen trên môi trường chọn lọc Các đoạn mồi được thiết kế đặc hiệu nhằm xác định chính xác DNA chèn trong cấu trúc plasmid, giúp kiểm tra xem chèn có chứa đoạn DNA mong muốn hay không Ngoài ra, mồi chứa DNA vector chèn vào còn được sử dụng để xác định kích thước phân tử chính xác của chèn, điều này thường được xác định qua kỹ thuật điện di trên gel agarose cùng với tiêu chuẩn DNA chuẩn.

1 Design primers 2 Set-up PCR 3 Analyze PCR product

Hình 1.6 Cácbước quan trọngtrong colony PCR.

(Nguồn: Beth Kenkel và cộng sự, 2016).

Ghi chú: 1- mồi được thiết kế đẻ phát hiện đoạn gene đc chèn, 2- Thiết lập phản ứng PCR, 3- Chạysảnphẩm PCRtrên gel để phântích kích thước của sản phẩm.

1.4.3 Phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl Amomnium Bromide).

Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo CTAB (Borges và cộng sự, 2009) kết hợp giữa cơ học (nghiền) và hóa chất nhằm phá vỡ màng tế bào để thu nhận DNA nguyên vẹn mà không bị phân hủy Dung dịch đệm CTAB có tác dụng phá vỡ màng tế bào và bào quan, giúp giải phóng DNA đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA EDTA trong dung dịch giúp ức chế hoạt động của enzyme Dnase, bảo vệ DNA, đồng thời phá vỡ các liên kết hóa học trong lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn làm cho lớp màng này suy yếu Các nguyên lý cơ bản của phương pháp này nhằm đảm bảo thu được lượng DNA cao, chất lượng tốt, phù hợp cho các phân tích sinh học tiếp theo.

- Phávỡ tế bào, màngtếbào và mô (CTAB có tác dụng bào mòn màngtế bào)

- Loại bỏ tạp chất không phải DNA (màng te bào là lớp đôi phospholipid CTAB làmbiến tính protein, phospholipid bị hòa tan lipid).

- Trongdung dịch đệm có các thành phần:

• Tris-HCl: ổn định pH

• Ethanol 99 %: loại bỏ một số muối lần tạp trong dung dịch mà chúng kết tủa theo DNA

Phenol chloroform isoamyl alcohol (25:24:1) giúp loại bỏ và giảm khả năng tạo bọt trong quá trình xử lý mẫu Đồng thời, hỗn hợp này còn tăng cường khả năng tủa protein và hỗ trợ quá trình phân lập DNA hiệu quả hơn Sau khi ly tâm với dung dịch Phenol chloroform isoamyl alcohol, sẽ xuất hiện hiện tượng phân lớp rõ ràng, thể hiện rõ ràng sự tách biệt giữa các pha trong quá trình phân lập DNA hoặc protein.

+ Lóp trên: chứaDNA + Lớp giữa: chứa protein + Lóp dưới: chứa xác cặn cùa tế bào và dung dịch chloroform.

TE IX có khả năng bảo quản màu lâu dài nhờ vào thành phần EDTA, giúp che chắn ion kim loại và bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy bởi enzyme, đảm bảo protein và nucleic acid duy trì tính toàn vẹn trong quá trình lưu trữ.

1.4.4 Phương pháp điện di Điện di là một phương pháp được sử dụng rộng rãi và quan trọng để phân tích các phân tử sinh học (thường là DNA và RNA) Sau khi tách chiết DNA người ta thường sử dụng phương pháp điện di để kiểm tra chất lượng, hàm lượng cũng như độ tinh sạch và sự nguyên vẹn của phân tử DNA Nguyên tắc hoạt động dựa vào đặc tính cấu trúc của nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau, được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thíchhợp và chịu sựtác dụng của điện trường.

1.4.4.1 Đặc điểm của gel agarose

Agarose có cấu trúc polymer thẳng, chiết xuất từ rong biển, được hình thành từ các đơn vị lặp lại của agarobiose, một monomer trong polymer agarose Các ion chaotropic giúp làm tan màng sinh học bằng cách làm mất ổn định liên kết hydro, lực van der Waals và tương tác kỵ nước Một chuỗi polymer agarose chứa khoảng 400 monomer, với khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là thành phần chính của agar chiếm 70%, phần còn lại là Agaropectin chiếm 30% Agarose là polymer mạch thăng không chứa sulfates, gồm các gốc D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose Chất này trong suốt hoặc mờ, hình thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng trên 100°C rồi làm lạnh, tạo thành gel ở nhiệt độ khoảng 40-45°C.

Gel agarose được sử dụng rộng rãi như một giá thể cho các acid nucleic trong kỹ thuật điện di ngang, giúp phân tích và xác định DNA, RNA một cách chính xác Ngoài ra, gel agarose còn được ứng dụng làm nền cho môi trường nuôi cấy virus bacteriophage, hỗ trợ nghiên cứu và phát triển các phương pháp loại trừ virus hiệu quả trong lĩnh vực vi sinh.

Hình 1.7 Cấutrúc phân tử của agarose (Nguồn: Sinh học ViệtNam - 2014)

1.4.4.2 Qui trình điện di gelagarose

Tốc độ di chuyển của các phân tử DNA trong gel phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel và lực điện trường, với các phân tử DNA có khối lượng phân tử lớn hơn sẽ di chuyển chậm hơn Phương pháp điện di trên gel agarose được xem là tối ưu để xác định độ tinh sạch của DNA, giúp phân loại DNA dựa trên sự hiện diện và lượng DNA, nhưng không cung cấp thông tin về độ tinh khiết chính xác Hình ảnh của sản phẩm điện di cho thấy các dải băng rộng hoặc nhiều vạch, điều này cho thấy DNA bị đứt gãy hoặc hiện diện RNA Ngược lại, các băng gọn, rõ nét trên gel chứng tỏ DNA còn nguyên vẹn, không bị đứt gãy hay nhiễm tạp chất Để thực hiện quá trình này, agarose gel được đổ vào khuôn phù hợp, và sau đó các mẫu DNA được đặt trong khuôn gel để tiến hành điện di.

Hình 1.8 Sơđồ minh họa các bước trongquátrình điện di trên gelagarose

(Nguồn: Sinh học Việt Nam -2014)

1.4.4.3 Uu điếm và nhược điểm của phương pháp điện di trên gel agarose Ưuđiếm của phươngpháp này là gel được đổ dễ dàng, không gâybiến tính mầu, và bền vừng vậtlý hơn polyacrylamide Mầu có thể được thu hồi dễ dàng.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Từ khi có bằng chứng đầu tiên về sự tồn tại của các protein liên kết, các nhà nghiên cứu đã quan tâm đến cấu trúc và mối quan hệ cấu trúc/chức năng của CBM Dữ liệu cấu trúc đã được xác định cho nhiều CBM, giúp hiểu rõ hơn về vai trò của chúng trong các protein bản địa cũng như trong các protein phức hợp với oligosaccharides.

Nhờ sự phát triển của ngành sinh học phân tử, các nhà nghiên cứu đã nỗ lực nghiên cứu và phát triển các tính chất liên kết carbohydrate của protein Năm 2002, Simpson đã tiếp cận dữ liệu cấu trúc của CBM4-2 để xây dựng và dự đoán sự ổn định trong dữ liệu tái tổ hợp của CBM Từ những cơ sở dữ liệu có sẵn, năm 2005, Khoa Công nghệ Miễn dịch học của Đại học Lund, Thụy Điển, đã xác định chính xác vị trí gắn kết của carbohydrate trên protein, góp phần quan trọng vào hiểu biết về tính chất liên kết carbohydrate-protein.

CBM4-2 phản ánh quá trình tiến hóa của các biến thể phân tử với đặc tính khác nhau, giúp xác định các chất dư thừa chịu trách nhiệm về tính đặc hiệu của CBM; điều này hỗ trợ phát triển công nghệ phân tử trong lĩnh vực carbohydrate binding module chịu nhiệt Năm đó, Machovic cùng nhóm đã tiến hành nghiên cứu nhóm mới của họ dựa trên phân tích tin sinh học nghiêm ngặt trong lĩnh vực liên kết tinh bột, tập trung vào các mô-đun CBM20 và CBM21.

Carbohydrate là một trong những phân tử phong phú nhất trong tự nhiên, và nghiên cứu về carbohydrate đang hướng tới các giải pháp nâng cao năng lượng sinh học, phát triển công nghệ y sinh học để tạo ra các công cụ chẩn đoán, quản lý dược phẩm và vaccine mới Các phương pháp nghiên cứu tiên tiến cho phép phân tích carbohydrate mà không làm hư hỏng cấu trúc, lắp ráp, hay chức năng của chúng Một ví dụ nổi bật là việc nhân bản đoạn gene mã hóa CBM20 trong gene amylopullulanase (APU) từ vi khuẩn hyperthermophilic Thermoanaerobacter pseudoethanolicus 39E, được biểu hiện lần đầu trong Escherichia coli, góp phần mở rộng hiểu biết về cấu trúc và chức năng của carbohydrate.

Năm 2008 Machovic và Janecek đã chỉ ra được một số APUs cũng có CBM, tuy nhiên, ở đó khôngđủ kết quảthực nghiệm về vai trò cùa CBM trong các APƯ.

Năm 2009, Christiansen và cộng sự đã nghiên cứu mô hình liên kết tinh bột thông qua liên kết CBM20 của phosphorylator glucan Arabidosis, Phosphoglucan, water dikinase chloroplastic (GWD3) với khả năng ái lực thấp gấp 50 lần so với CBM20 từ glucoamylase nấm (GA) Nghiên cứu về tính đồng nhất của mô hình này đã xác định các yếu tố cấu trúc chịu trách nhiệm cho sự gắn kết yếu của CBM20 nội bào.

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện tại, tại Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu về việc sử dụng đuôi ái lực CBM20 vẫn còn mới và chưa được nhiều nhà khoa học quan tâm thực hiện các công trình nghiên cứu Đây là một lĩnh vực tiềm năng và đang cần nhiều nghiên cứu approfond để khám phá ứng dụng của đuôi ái lực CBM20 trong các công trình khoa học đất, vật liệu xây dựng và các lĩnh vực liên quan Việc mở rộng nghiên cứu về đuôi ái lực CBM20 sẽ góp phần phát triển công nghệ mới và nâng cao hiệu quả ứng dụng trong thực tiễn.

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: từ tháng02 đến tháng 8 năm 2018. Địa điếm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Viện Kỳ thuật Công nghệ caoNTT.

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thiết kế mồi cho phản ứng PCR

- Sử dụng ngân hàng NCBI đe tìm trình tự gene mà hóa CBM20 của nấm

- Thiết kế trình tự mồi đặc hiệu đe khuếch đại trình tự CBM20 có trong nấm

- Thiết kế trình tự mồi đặc hiệu để mởvòng plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH.

Nội dung 2: Chuẩn bị vật liệu chạy phản ứng ghép nối plamsid pGEX-4T3- CBM20/DOHH

- Tách DNA tống củanấm N.crassa bằng phương pháp CTAB.

- Chạy PCR bằng mồi đặc hiệu với DNAN.crassa để khuếch đại trình tự CBM20, đồng thời gắn trìnhtự enzyme cắt giới hạn tại 2 đầu.

- Tạo dòng tế bào E.coli mang plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH bằng phương pháp heatshock.

- Tiến hành tách plasmid để thu được lượng lớn plasmid.

- Thực hiện phản ứng PCR mở vòng plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH, cắt bỏ trình tự GST để thay thế bằngtrình tự CBM20.

Nội dung 3: Thực hiện phản ứng cắt - nối bang enzyme

- Các trình tự được xử lý bằng 2 enzyme cắt giới hạn.

- Plasmid sau khi mở vòng và xử lý bang enzyme cắt giới hạn được đem đi khử phosphat băng phosphatase.

- Nối hai trình tự bằng T4 ligase và biến nạp vào tế bào E.coli DH5a để tạo dòng tếbào chứa plasmid pGEX-4T3-CBM20/DOHH.

Nội dung 4: Kiểm tra sự hiện diện của trình tự CBM20 trong plasmid.

- Tiến hành chạycolonies PCR bằng trình tự mồi phù hợp, kiểm tra sự hiện diện của CBM20 bằng phương pháp điện di.

- Tiến hành tách và thu lượng lớnplasmid, gửi mầu đe giải trình tự.

Thiết bị, vật liệu, hóa chất

Trong nghiên cứu, danh mục thiết bị chính bao gồm máy đo quang phổ, máy PCR, máy ổn nhiệt và máy li tâm, như đã trình bày ở Bảng 2.1 và Hình 2.1 minh họa rõ các thiết bị này Ngoài ra, danh mục dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu cũng được liệt kê chi tiết tại Bảng 2.2 để đảm bảo tính rõ ràng và đầy đủ trong quá trình thực hiện các thí nghiệm.

Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Thiết bị STT Thiết bị

2 Tủ lạnh -20 °C 12 Micropipet các loại

4 Máy li tâm 14 Tủ ủ lắc 37 °C

7 Máy điện di 17 Cân phân tích

8 Máy PCR 18 Lò vi sóng

9 Đèn uv 19 Nồi hấp khử trùng

10 Máy đo quang 20 Máy ly tâm nhỏ (Centrifuge phổ spin)

Máy đo quangphổ Máy PCR

Máy ly tâm Máy ốnnhiệt

Hình 2.1 Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sừ dụng trong nghiên cứu

STT Dụng cụ STT Dụng cụ

1 Túi zipper 10 Cốc đong các loại

12 Đầu tuýp lOpl, lOOpil, lOOOpl

4 Hộp đựng eppendorf 13 Eppendorf 0.2, 1.5 ml

5 Khâu trang 14 OngFalcon 15ml và 50ml

8 Đĩa petri 17 Khay đựng eppendorf

Danh mục hoá chất sử dụng được trình bày trong Bảng 2.3.

Bảng 2.3 Danh mục hóachất sử dụng trong nghiên cứu

STT Hóa chất STT Hóa chất

6 CaCl2 17 DNA ladder lOObp, Ikp

Đối tượng nghiên cứu

Chủng nấm Neurospora crassa, chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5a được trữ ở Viện kỳthuật Côngnghệ cao NTT.

Plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH có chứa gene mà hóa DOHH và trình tự đuôi GST tại đầuN được cung cấp bởi TS Myung-HeePark ở NIH.

Các enzyme cắt giới hạn được cung cấp bởi Bioline:BamH{, Aflll.

Phương pháp nghiên cứu

Trình tự nghiên cứu được the hiệntheo sơđo dưới đây:

2.5.1 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR

2.5.1.1 Thiết kế mồi phản ứng mởvòng plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH.

Dựa vào trình tự của plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH, chúng tôi thiết kế cặp mồi la và Ib đặc hiệu để mở vòng plasmid Quá trình này giúp thay thế đoạn GST bằng CBM20 bằng cách thêm các trình tự nhận biết bởi enzyme cắt giới hạn tại hai đầu, đảm bảo chính xác và hiệu quả trong quá trình chỉnh sửa DNA.

2.5.1.2 Thiết kế mồi tách CBM20 từ NCU08746 của Neurospora crassa

Dựa trên trình tự gene CBM20 của N crassa (NC_026502.1) từ ngân hàng gene NCBI, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi 2a và 2b để thực hiện khuếch đại trình tự đoạn gene mục tiêu CBM20.

Sử dụng trang web T-Coffee đê kiếm tra vùng bảo tồn, các nucleotide có màu đỏ cho thấy vị trí vùngbảo tồn (Hình 2.3). vùng bảo tồn

XM 958514• 2 584 CTCGTGCGCCGACATCGCCATTGTCGGCGAC- AGCG CCTCCACCACCAAAGT B~X8425951i_47§9 CTCGTGCGCCGXCATCGCCXTTGTCGGCQAC- ẠGCỖ - - C£TCCACCXCXAAA0T XM_009853496.1- CTCGTGCGCCGACATTGCCATTGTCGGCGGC- - -GỘệGẠGẠCCẠẠGCCCtệCẶCTẶệCẶẶGẠệ XM—003344965 Ị- CYC0TGCGCTGXcX12r0CCXi“rGTCGGCX0CGGCGGCGAGACCAACCCCTCCAGCACCAAGAC

XM 958514 2 584 CTCTGCCACCGCCACGACTCTTGTCACCAGCAGCAAGACTGCCAGCGCCTCTTGCACCCCCGC B.X84 2505 Ji_4 789 ệỵctặÕCẠỘẽÕgỌẠCÕÀỌTẽÌ2rgtCẠCCẠGCÀGCẠẠGẠCTÕỘCẠGCỘCCTCÌ2ỆGCẠCCCỘCỌỘ XM_00?853496•ị- ễẬỖIGCẠẠẽẹọẹẽẠẹỌẠệTẽTTGTệẠCCẠặẹẠÕệẠẠGẠCTCẽệẠGCGCITCTTGẽẠCCềẽệGC XM2Q03344965.Ị- cACCGCCACCGCCACGACTCTTGTCACCAGCAGCAAGACTGCGGGCGCTTCTTGCGTTCCGGT XM2008097350.1_ - -77777-77777_77-7:7:-7: 7177777777:17771177771 cons

XM958514.2 584 CGCCACCGTCGCTGTGACTTTCAACCACCTCGCCAGCACCAGCTACGGCGAGTCCATCAAGAT 8X84259521 4 789 CGCCÀCCGTCGCTGTGÀCtTTCẠÀCCÀCCTCGCCẠGCẠCCẠGCTẠCGGCGẠGTCCẠTCẠẠGẠT XM_009853496.I- CGCCACCGTCqCTGTGACCTTCAACCACCTTGCCAGCACCAGCTACGGCGAGTCCATCAAGCT XM29Q3344065.Ị- TGCCACCGTTGCTGTGACCTTCAACCACCTTGTCAGCACCAGCTACGGCGAGTCCATCAAGCT

XM—958514,2584 CGTTGGTTCGATCTCGCAGCTCGGCAGCTGGAGCGCCTCGTCCGGCGTTGCCTTGTCTGCGTC 8X8^2595 Jị_47Ỗ9 CGTTGGTTCGATCTCGCAGCTCGGCAGCTGGAGCGCCTCGTCCGGCGTTGCCTTGTCTGCGTC Xbi_ 00985 3496 Ị- TÕTT§ÕCTẹCẠTẹTẹộẽẠÕẽTẽÕÕẽẠộẽTGGẠặẹọẹCTẹẹTẹẹÕ§CÕTTẹệẹtTÕTẹtÕệẹTẹ xi-i_003344965.1“ TGTTGGTTCCATATCGCAGCTCGGCAGCTGGAGCACCTCATCCGGTGTTGGCCTGTCCGCCTC

XM_958514- 2 584 GCAGTACACCACCAGCAACCCGCTTTGGACTGCCACGGTCAGTCTCCCGGCGGGCACCAAGTT BX842595Ji 4709 ặCẠÕTẬCẠệCẠCCẠÕẽẠẠỌCÕộCTtTGGẠCTÕCÕẶCộÕTCẠÕTCTCCCGGệộÕÕCẠỘẹẠẠÕTT XM_009853490.1_ ỘỘẠỌTẠCẠẽCẶẹềẠỌẹẠẠCCẽộẽTCTỌÕẠẹtộộệẠẹẹộTẹẠỌtệĩỌCÕCGẽAgÕệẠẹẹẠẠẹTT XM—QQ3344965'ị“ GCAGTACACTACCAGCAACCCGCTCTGGACCGCCACAGTCAAGCTCCCTGCTGGCACCAAATT Xi-12008097350.1- 77.7: 7.7: 77.77 77777 ■ 7 ■ 7 777 - 7.7 : 7 7-777.77-777-77 :

Hình 2.3 Vùngbảo tồn cùa cáctrình tự.

Kiêm tra vị trí đoạn linker và vị trí enzyme cắt bằng trang wep NEBCuter (Hình 2.4).

Hình 2.4 Vị trí gene CBM20 và đoạn linkertrongN crassa

2.5.2 Chuẩn bị vật liệu chạy phản ứng ghép nối plamsid pGEX-4T3- CBM20/DOHH

2.5.2.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp E.coli DH5a bằng phưong pháp hóa biến nạp

Các tế bào E coli được phát triển mạnh mẽ trong pha log, là giai đoạn lý tưởng để tiến hành các bước xử lý Quá trình chuẩn bị tế bào gồm ly tâm và huyền phù tế bào trong dung dịch CaCl₂ giúp tạo điều kiện thuận lợi cho khả năng nhiễm DNA (khả năng nạp DNA) Các bước này đảm bảo tế bào E coli sẵn sàng cho quá trình biến nạp DNA một cách hiệu quả.

Trong quá trình phát triển, 26 sợi DNA này đã thích nghi với môi trường không chọn lọc để tổng hợp các protein kháng kháng sinh Sau đó, các khuẩn lạc chứa plasmid đã được nuôi trên môi trường chứa kháng sinh nhằm xác định khả năng kháng thuốc của vi khuẩn Quá trình này bao gồm các bước chính nhằm đảm bảo sự thành công trong việc phát hiện và phân tích các plasmid mang gen kháng kháng sinh.

Bước 1: Cấy 1 khuẩn lạc E coli N&O 5 ml môi trường LB lỏng Nuôi cấy qua đêm ở điềukiện lắc 185 vòng/phút, ở 37 °C.

Bước 2: Tiến hành cấy 1 ml dịch nuôi cấy vào 10 ml môi trường LB lỏng Để nuôi cấy, duy trì lắc với tốc độ 185 vòng/phút ở nhiệt độ 37°C Quá trình này cần tiếp tục cho đến khi giá trị OD600 của dịch nuôi cấy đạt khoảng 0,375, không vượt quá 0,6 để đảm bảo điều kiện nuôi cấy tối ưu.

Bước 3: Chuyển dịch nuôi cấy vào các eppendorf, ly tâm thu sinh khối tế bào ở

6000 rpmtrong 10 phút ở 4 °C Thu tủa bỏ dịch.

(Tấtcả cácbước tiếp theo đều thực hiện trongđá lạnh)

Bước 4: Huyền phù sinh khối trong 100 p.1 MgCb lạnh Ly tâm 3000 rpm trong

Bước 5: Đổ bỏ phần dịch nổi, thêm 200 pl CaCh Ngâm trong nước đá 20 phút. Bước 6: Thu nhận tếbàobằng cách ly tâm 3000 rpm trong 15 phút ở4 °C.

Bước 7: Huyền phù sinh khối trong 500 pl dung dịch CaCỈ2 85mM và 500 pl glycerol lạnh 40 % để đạt nồng cuối là 20 % Lưu trừ ở tủđông -80°C.

2.S.2.2 Tách DNA tổng ciia nấm N crassa bằng phương pháp CTAB.

Bước 1: Cho tế bào nấm N crassa đã tăng sinh vào ống eppendorf, thêm 1 ml nước cất vô trùng mang đi ly tâm 10000 rpmtrong 15 phút.

Bước 2: Sau khi ly tâm thu tủa bỏ dịch, cho 800 |11 CTAB vào vortex mạnh Mang ủ ở bể ổn nhiệt (60°c/lh)

Bước 3: Ly tâm 13000 rpm trong 15 phút, thu dịch (600 pl) vào eppendofmới.

Bước 4: Thêm 600 pl P:C:I (phenol chloroform isoamylacohol) (25:24:1) vào (mix lạnh 2 phút), ly tâmlạnh 14000 rpm trong 10 phut ở4 °C (lặp lại 2 lần)

Bước 5: Sau khi ly tâm hồn họp tách thành 3 lóp, cẩn thận hút lớp trên cùng cho vào eppendof mới.

Bước 6: Tủa DNA bằng Ethanol tỷ lệ 1:2.5 ủ ở -80 °C khoảng 30 phút.

Bước 7: Ly tâm 14000 rpmtrong 15 phút ở 4 °C, bỏ dịch thu tủa.

Bước 8: Mang ủ ở bế ốn nhiệt làm bayhơi hết Ethanol trong eppendof.

Bước 9: Sau khi Ethanol đã bayhơi, cho 50 pl nước SHPT, đe qua đêm.

❖ Kiểm tra độ tinh sạch ciia DNA

Bước 10: Đo độ tinh sạch của DNA bằng cách sừ dụng TrayCell Jenway Genova và so sánhkết quả Trừ mẫu ở -20 °C đến khi sử dụng.

2.5.2.3 Khuếch đại trình tự CBM20 có trong N crassa bằng phản ứng PCR. 2.5.2.3.1 Thành phần phản ứng

Thành phần phản ứng được trình bày chi tiết trong Bảng 2.4.

Bảng 2.4: Thành phầnphản ứng PCR khuếch đại trình tự CBM20.

STT Thành phần Thể tích 50 pl

Bảng 2.5 Chutrình nhiệtphản ứng PCRcủa N crassa

Số chu ki Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thòi gian

2 Biến tính ban đầu 98 30 giây

2.5.2.4 Tạo dòng tế bào E coli mang plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH bằng phương pháp sốc nhiệt (heatshock)

Quá trình biến nạp được thực hiệnnhư sau:

Bước 1: Lấy các tế bào khả nạp E coli DH5a từ tủ đông -80 °C và rã đông trênđá.

Bước 2: Thêm 1 plasmid vào 50 µL tế bào E coli, rồi ủ trên đá trong 10 phút để chuẩn bị cho quá trình biến nạp Bước 3: Đặt các eppendorf chứa E coli vào nhiệt 42°C trong 30 giây để thúc đẩy sự tiếp nhận plasmid Bước 4: Chuyển các eppendorf trở lại trên đá trong vòng 2 phút để làm lạnh, giúp tế bào E coli cố định và tăng khả năng biến nạp thành công.

Bước 5, thêm vào 1ml dung dịch LB không chứa kháng sinh và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ để kích thích sự phát triển của tế bào Sau đó, tại bước 6, tiến hành ly tâm ở vận tốc 6000 rpm trong 10 phút ở nhiệt độ 26°C để thu nhận tế bào Cuối cùng, lấy khoảng 100 μl dung dịch kết quả và trải đều trên đĩa thạch LB chứa kháng sinh phù hợp, với nồng độ 100 pg/ml, để tiến hành cấy và phân tích.

Bước 7: Thu nhận vi khuấn sau khoảng 12-16 giờ, ủ ở 37 °C.

Các bước được thực hiện theo qui trình Isolate II plasmid mini kit (Bioline):

Bước 1: Thu nhận tếbào bằng cách ly tâm 13000 rpmtrong 1 phút.

Bước 2: Thu tủa bỏ dịch, huyền phù trong 250 ul Buffer Pl.

Bước 3: Thêm 250 ul Lysis Buffer P2:

+ Trộn nhẹ bằng cách nghiên ống 6-8 lần.

+ ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút cho đến khi sản phẩm phân giải xuất hiện (dịch trong suốt).

Bước 4: Huyềnphù dung dịch trong 300 ul dung dịch trung hòa P3 Ly tâm

Bước 5: Chuyến tối đa 750 ul phần dịch noi quacột Isolate II Plasmid mini spin Ly tâm 13000 rpm trong 1 phút.

Bước 6: Thêm 500 pl Wash Bufer PW1 (làm nóng 50 °C) Ly tâm 13000 rpmtrong 1 phút (lặp lại 2 lần nếu dịchly tâm còn đục màu).

Bước 7: Thêm 600 pl Wash Bufer PW2 Ly tâm 11000 rpmtrong 1 phút.Bước 8: Làm khô màng bằng cách ly tâm 11 000 rpm trong 2 phút nhằm loại bỏ ethanol dư.

Bước 9: Chuyểncột Isolate II Plasmid mini spin vào eppendorf 1,5 ml mới Thêm 50 pl ElutionBuffer p trực tiếp vào trungtâm màng, ủ ởnhiệt độ phòngtrong 1 phút.

Bước 10: Ly tâm thu dịchở 11000 rpm trong 1 phút Lưu trừ ởtủ-20 °C.

2.5.2.Ó Mở vòng plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH, cắt bỏ trình tự GST để thay thế bàng trình tựCBM20 bằngphương pháp PCR

Thành phần của phản ứng mở vòng PCR mở vòng plasmid được trình bày trong Bảng 2.6.

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCRmởvòng plasmid

STT Thành phần Thể tích 50 pl

Bảng 2.7 Chutrình nhiệt phản ứng PCR mởvòng plasmid

Số chu ki Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian

2 Làm mát sau phản ứng 4 00

2.S.2.7 Kiểm tra sự hiện diện của gene bằng phương pháp điện di

Kiếm tra sự sản phấm bằng cách điện di trên gel agarose 1 % trong dung dịch đệm TAE IX ở hiệu điện thế 80 V Qui trìnhthực hiện gồm:

Bước 1: Cân 0,5 g agarose cho vào 50 ml TAE IX, đặt vào lò vi sóng trong 3 phút.

Bước 2: Đe nguội (khi nhiệtđộ hạ xuống 45- 50 °C) đổvào khuôn gel.

Sau 20-30 phút, khi gel đã đông cứng hoàn toàn, cần chuyến khay chứa bản gel vào bể điện di và đổ đệm TEA IX vào buồng điện di sao cho đệm ngập khoảng 1 cm bản gel Bảo đảm đặt giếng lược của bản gel quay về phía cực âm trong buồng điện di để quá trình diễn ra hiệu quả.

Bước 4: Tra 5 pl mẫu vào giếng trên gel và 1 pl loading dye, thực hiện tương tự cùng với thang DNA chuẩn 1000bp.

Bước 5: Chạy điện di với hiệu điện thê 80 V, cường độ dòng điện 100 mA,

Bước 6: Quan sát các băng DNA xuất hiện trên máy đọc gel.

2.5.2.8 Phương pháp tinh sạch sản phẩm điện di (PCR).

Sản phẩm sẽ được tinh sạch qua cột bằng Isolate II PCR and Gel kit (Bioline). Qui trình thực hiện:

Để bắt đầu, pha 200 μl Binding Buffer CB vào 100 mg gel, sau đó ủ ở nhiệt độ 50°C trong 5 phút Trong quá trình ủ, vortex nhẹ nhàng để đảm bảo gel tan hoàn toàn, đặc biệt quan trọng khi xử lý sản phẩm PCR bằng 200 μl Binding Buffer CB và 100 μl mẫu PCR, giúp tối ưu hiệu quả phản ứng và đảm bảo kết quả chính xác.

Bước 2: Cho mầuvào cột Ly tâm 11000 rpm trong 30 giây Bỏ dịch

Bước 3 Rữa màng: thêm 700 pl Wash Buffer CW Ly tâm 1000 rpm trong 30 giây (Lặp lại 2 lần).

Bước 4: Làm khô màng: ly tâm 11000 rpm trong 1 phút.

Bước 5: Rừa giải DNA: thêm 30 pl ElutionBuffer c vào giữa trung tâm màng, ủ ởnhiệt độ phòng trong 1 phút.

Bước 6 Thu DNA: ly tâm 11000 rpm trong 1 phút Trừ mầu ở-20 °C.

2.5.3 Thực hiện phản ứng cắt- nối bằng enzyme cắt giói hạn và AflII.

Thành phần Thực hiện phản ứng cắt và nối bang enzyme cắt giới hạn ổứmHI và AÍ1II được trìnhbày chi tiết trong Bảng2.8 và Bảng 2.9.

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt (pGEX 4T3-DOHH và CBM20/NCU08746)

STT Thành phần Thể tích 50 pl

Bước2: Bất hoạtEnzyme ở 80 °C trong 10 phút.

Bước 3: Sừ dụng PCR clean up KIT (Bioline) tinh sạch- elute với 15 pl.

Vector: 10,534 pg/ml Insert: 31,99 pg/ml

Sử dụng T4 ligase đe thực hiệnphản ứng nối.

Bảng 2.9 Thành phần phản ứng nối bằng T4 ligase.

STT Thành phần Thể tích 20 pl

Bước 1: u ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Sau đó ủ ở 65 °C trong 10 phút để bất hoạt enzyme.

Bước 2: Tiến hành hóa biến nạp (5 pl plasmid + 50 pl competent cells)

Bước 3: Đặt2 phản ứng, trải trên2 đĩa.

Sau 24 giờ: đìa có 3 khuẩn lạc mọc, tiến hành kiểm trabằng colony PCR với cặp mồi la và Ib.

2.5.4 Kiểm tra sựhiện diện ciia CBM20/NCU08764 bằng colony PCR

Thànhphần của phản ứng clony PCR được trình bày trong Bảng 2.10 Chu trình nhiệt của phản ứng clonyPCR được trình bày trong Bảng 2.11.

Bảng 2.10 Thành phần phản ứng colony PCR

STT Thành phần Thể tích 50 pl

Bảng 2.11 Chutrình nhiệt phản ứng colony PCR

Số chu kì Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Trình tự mồi cho các phản ứng PCR

502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared

Bảng 3.1 Danh sách mồi thiết kế sử dụng trong nghiên cứu.

Tên mồi Trình tự la 5GGTAGCCTTAAGGAATACTGTTTCCTGTGTGAAA-3’

2a 5 ’ - ATATATCTT AAG ATG AGCGCCTCC ACCACCA A -3’

502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared

502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared

Hình 3.1 Mởvòng vector, loại GST

Để gene hoạt động và biểu hiện ra sản phẩm protein, gene cần nằm trong một cấu trúc hoàn chỉnh gồm đoạn mở đầu và đoạn kết thúc, giúp gene hoạt động hiệu quả trong tế bào chủ (Alasdair D và Bruun R., 2000) Trong quá trình thiết kế mồi tách CBM20 từ NCU08746 của N crassa, trình tự DNA mang mã di truyền của CBM20 phải được lắp ghép đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và kết thúc phù hợp với trình tự của plasmid pGEX-4T3-DOHH để đảm bảo biểu hiện gen đạt hiệu quả cao.

Dựa trên trình tự của đoạn gene CBM20 của N crassa từ ngân hàng gene NCBI, đã thiết kế hai đoạn mồi nhằm khuếch đại trình tự gene này trong nấm N crassa Các đoạn mồi được bổ sung trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn tại hai đầu để tạo ra sản phẩm phù hợp cho quá trình PCR Đoạn mồi Forward (Moi 2a) chứa trình tự enzyme cat AflII nằm bên trái gene CBM20, trong khi đoạn mồi Revert (Moi 2b) mang trình tự enzyme cắt BamHI nằm bên phải gene CBM20, giúp tăng độ chính xác và hiệu quả của phản ứng khuếch đại gene.

Hình 3.2 Gắn Restriction Enzyme vào CBM20.

3.2 Ket quả tách DNA tổng số từ nấm N crassa

DNA từ nấm N crassa được tách chiết bằng phương pháp CTAB, sau đó đo bằng máy Nanodrop để xác định nồng độ DNA, đạt mức 1017,8 pg/ml Độ tinh khiết của DNA được đánh giá qua tỷ lệ hấp thụ tại các bước sóng khác nhau: sử dụng bước sóng 280 nm để kiểm tra tạp chất protein hoặc RNA với giá trị hấp thụ ở 260 nm và 280 nm là 1,684, và bước sóng 230 nm để kiểm tra tạp chất dung môi hữu cơ hoặc muối dư, cho tỷ lệ hấp thụ 230/260 là 1,820, giúp xác định chất lượng mẫu DNA chính xác.

I CZQLI MSQ-xaen ôLJLJI ỉ.aao-Á3eD

Hình 3.3 Kết quả đo DNA tổng số của nấmN crassa

3.3 Kết quả PCR khuếch đại trình tự CBM20

KẾT QUA VÀ THẢO LUẬN

Kết quả PCR khuếch đại trình tự CBM20

Chúng tôi thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 2a và 2b để xác định sự hiện diện của gene CBM20 được tách chiết từ DNA tổng số của nấm N crassa Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% với hiệu điện thế 80 mA trong vòng 30 phút, sử dụng máy soi gel Gene DireX Kết quả điện di cho thấy giếng chứa sản phẩm PCR của đoạn gene CBM20 có băng đậm và sáng, với kích thước đặc trưng là 384 bp, xác nhận thành công trong việc xác định gene (Hình 3.4).

Hình 3.4 Ketquảđiện di sản phẩm PCR CBM20 (giếng 1); Thang đo 1 kb (giếng 2)

Kết quả PCR mở vòng plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH

PCR sử dụng cặp mồi LA và IB cùng với các trình tự của enzyme cắt giới hạn tại hai đầu để xác định chính xác kích thước của plasmid pGEX-4T3-DOHH Giếng 1 kiểm tra sản phẩm PCR của plasmid pGEX-4T3-DOHH, phản ánh đúng kích thước của plasmid này, trong khi giếng 2 dùng để đối chứng với thang DNA 1 kb Kết quả trên hình 3.5 cho thấy cả hai giếng đều xuất hiện băng sáng đậm, phản ánh đúng kích thước của plasmid pGEX-4T3 Trong đó, giếng 1 cho thấy sản phẩm đã được cắt bỏ đoạn gen GST, có kích thước khoảng 4.968 nu (tương ứng đoạn gene DOHH dài 1115 nu), còn ở giếng 2 có hai băng do plasmid dạng vòng tồn tại ở hai dạng xoắn và siêu xoắn, trong đó dạng siêu xoắn di chuyển nhanh hơn.

Hình 3.5 Kết quả điện di plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH và sản phẩmPCR

3.5 Kết quả gắn đoạn gen CBM20 vào plasmid mởpGEX-4T3-GST/DOHH Đe đưa được trình tự đoạn gene CBM20 vào plasmid pGEX-4T3-DOHH tiến hành xử lí với enzyme cắt ỔÍ//7/HI và Afin Sản phẩm cat bang enzyme giới hạn được tinh sạch từ gel agarose và thực hiện phản ứngghép nối nhờ tác dụng của Enzyme T4 ligase Do hai enzyme Ba/ìỉHĩ và Aflll có khả năng tạo ra các sản phẩm cat bằng enzyme giới hạn có đầu dính giống nhau nên đoạn gene CBM20 có the ghép nối được trực tiếp vào vector pGEX-4T3-DOHH đà được xử lí trước đó với Quick CIP (Protocol Restriction Enzyme - Bioline) de khử goc phosphate nhằm loại bỏ khả năng tự đóng vòng trong phản ứng ghép nối.

Sau khi thực hiện phản ứng cắt và nối, plasmid pGEX-4T3-CBM20/DOHH được biến nạp vào E coli DH5α để sản xuất protein Bacteria mang plasmid này được nuôi cấy trên môi trường LB chứa kháng sinh ampicillin, giúp chọn lọc các dòng đã biến nạp thành công Sau 24 giờ nuôi cấy, các khuẩn lạc xuất hiện, mọc riêng rẽ, có màu trắng đục, xác nhận thành công trong quá trình biến nạp và nhân sinh trưởng của vi khuẩn.

Hình 3.6 Hình ảnhkhuẩn lạc mang plasmid pGEX-4T3-CBM20/DOHH.

3.6 Kiểm tra sự hiện diện của CBM20/NCU08764 bằngcolony PCR.

Phương pháp PCR clone sử dụng cặp mồi 2a/2b để xác định sự có mặt của gen CBM20, cho thấy đoạn gen đã được chèn thành công vào plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH Kết quả PCR cho thấy dòng vi khuẩn mang plasmid pGEX-4T3-CBM20/DOHH đã được tạo ra thành công, xác nhận sự chèn gen chính xác (Hình 3.7 A).

Chúng tôi tiến hành nuôi rộng rãi dòng tế bào E coli DH5α mang plasmid pGEX-4T3-CBM20/DOHH, sau đó thu plasmid và sử dụng enzyme cắt để xác định kích thước DNA Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy xuất hiện hai băng rõ ràng: băng thứ nhất khoảng 5000 bp, phản ánh plasmid pGEX-4T3-DOHH, và băng thứ hai khoảng 384 bp, tương ứng với gene CBM20.

Hình 3.7 Kếtquả điện di sản phẩm (A) Colony PCR, (B) cắt enzyme (ổữ/nHI và AflII)

Tóm lại, chúng tôi đã tạo vector tái tổ họp pGEX-4T3-CBM20/DOHHchứa đoạn gene CBM20 thành công.

KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ

Thiết kế thành công cặp moi đặc hiệu đe khuếch đại trình tự CBM20 có trong nấm N crassa và mở vòng plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH.

Tách DNA tổng của nấm N crassa, khuyếch đại trình tự CBM20 bằng cặp mồi đặc hiệu đong thời gắn trình tự enzyme cắt giới hạn tại 2 đầu.

Tạo dòngtế bàoE coỉi mang plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH.

Tạo dòng tế bào E coli DH5a mang trình tự đuôi ái lực CBM20 (chứa plasmid pGEX-4T3-CBM20/DOHH). Đề nghị:

Tiếp tục mang plasmid pGEX-4T3-CBM20/DOHH biếu hiện huớng đếnứng dụng tinhsạch protein mục tiêu bằngtrình tự đuôi ái lựcCBM20.

Kiểm tra sự hiện diện của CBM20/NCƯ08764 bằng colony PCR

1 Martinez, J L., Liu, L., Petranovic, D & Nielsen (2012) Pharmaceutical protein production byyeast: towards production ofhuman blood proteins by microbial fermentation Curr Opin Biotechnol,23:965-91\.

2 Fexby, s., Ihre, H., Van Alstine, J & Bulow (2004) N-Terminal tagged lactate dehydrogenase proteins: evaluation of relativehydrophobicity by hydrophobic interaction chromatography and aqueous two-phase system partition J.

3 Díaz-Guillén, M R., Diaz-Guillen, J A., Fuentes, A F., Santamaria, J & León

(2010) Crossover to nearly constant loss in ac conductivity of highly disordered pyrochlore-type ionic conductors Phys Rev B 82

4 Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J L., Vazquez, E &

Villaverde (2009) Microbial factories forrecombinant pharmaceuticals Microb.

5 Machovic, M., Svensson, B., MacGregor, E A & Janecek (2002) A new clan of CBM families based on bioinformatics of starch-binding domains from families CBM20and CBM21 FEBS/272:5497-5513

6 Sorimachi K,JacksAJ, LeGal-Coeffet MF, Williamson G, Archer

DB, Williamson MP (1996) Solution Structure of the Granular StarchBinding Domain of Glucoamylase fromAspergillusnigerby NuclearMagnetic Resonance Spectroscopy J Mol 5zo/, 259:970-987.

7 Porro, Gasser B, Fossati T, Maurer M, Branduardi p, Sauer M, Mattanovich D

(2011) Production of recombinant proteins and metabolites in yeasts: whenare these systems better than bacterial production systems? Appl Microbiol

8 Paavilainen, p.,Jiang, D., Lavikainen, J & Năătănen (1993) Stimulus duration and the sensory memory trace: An event-related potential study Biol Psychol, 35:139-152.

9 Sogaard, M., Abe, J., Martin-Eauclaire, M F & Svensson (1993) a-amylases: structure and function Carbohydr Polym,2\:\31-]A6.

10 Christiansen c, Abou Hachem M, Janecek s, Vikso-Nielsen A, Blennow

A, Svensson B (2009) The carbohydrate-bindingmodule family 20-diversity, structure, and function FEBSJ,216:5006-5029.

11 Gupta and Birkhauser(2013) Methods for Affinity-Based Separations of

12 Gilbert, H J., Knox, J p & Boraston (2013) Advances in understanding the molecular basis of plant cell wall polysaccharide recognition by carbohydrate- binding modules Carr Opin Struct Biol,23:669-677.

13 Montanier c, van Bueren AL, Dumon c, Flint JE, Correia MA, Prates

JA, Firbank SJ, Lewis RJ, Grondin GG, Ghinet MG, Gloster TM, Herve c, Knox