Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNGNGUYEN TAT THANH LUẬN VĂN TÓT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TRÊN D
TỐNG QUAN TÀI LIỆU
Phân bố và đặc điểm
Thiết đinh Cà Ná có tên khoa học Merkhenũe stỉpulata (Wall.) Seem, ex Schum var canaense v.s Dang, là một biến thể mới của loài M stipulate được tìm thấy tại Cà Ná Thông tin này giúp nhận diện loài, xác định phân bố và tiềm năng ứng dụng của Merkhenũe stỉpulata và biến thể canaense tại địa phương, phục vụ cho nghiên cứu thực vật và phát triển bền vững khu vực Cà Ná.
Ná, tỉnh NinhThuận vào năm 2015.
Thiết đinh Cà Ná, thuộc họ Quao (Bignoniaceae), là cây gỗ nhỏ cao 3–6 m Lá mọc đối, kép lông chim một lần, dài 14–20 cm, có lá kèm giả thường hiện diện, lá chét 7–9 chiếc, hình thuôn xoan thuôn hoặc bầu dục thuôn, kích thước 6–8 × 3–4,5 cm, gốc nhọn hoặc tròn, đầu gần tròn hoặc có mũi ngắn Cụm hoa dạng chùm mọc ở ngọn, mang 8–14 hoa Đài hình mo dài 3,5–4 cm, màu vàng nâu, có lông rải rác tới không lông, có móc dài ở đầu Tràng hoa màu vàng đỏ hoặc nâu đỏ, dài 11–14 cm, không lông, đáy hẹp dạng ống trụ, dài 6–7,5 cm; đầu loe rộng dạng phễu, dài 3–4 cm Quả dẹp, kích thước 16–20 × 1,7–2 cm, vỏ quả có mụn lún phún rải rác, hạt nhiều và có cánh.
Hình 1.1 Ảnh Markhamia stipuỉata var canaense v.s Dang A Cả cây; B Lá kép lông chim và chụm hoa trên một cành; c Lá; D Cụm hoa; E Đài hoa;
Các nghiên cứu trong nước
ơ ViệtNam, TS.Nguyền TấnPhátvà cộng sự đã phân lập được 3triterpenoid mới là markhacanasin A (69), markhacanasin B (70), markhacanasin c (Nguyen Tan Phat và ctv., 2017)
Các nghiên cứu ngoài nước
Hiện chưa có bất kỳ nghiên cứu nào về thành phần hóa học của thứ mới
M stipulata var canaense trên thế giới Vì vậy, chúng tôi đã tìm hiếu thànhphần hóa học về loài M stipulata và một số loài khác thuộc chi Markhamia.
1.4.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học
Năm 2006, Gormann R và cộng sự đã phân lập 8 flavonoid từ lá: apigenin (1),luteolin (2), luteolin 7-rutinosid (3), naringenin (4), naringenin 7-rutinosid (5), eriocitrin (6), 3',4',5,7-tetrahydroxy-5'-methoxy-flavanon (7), apigenin 5-O-a-L-
Năm 1998, Kernan M R và cộng sự đã phân lập5 phenolic từ rễ: verbascosid (9), isoverbascosid (10), luteosid A (11), luteosid B (12), luteosid c (13) (Keman và ctv., 1998).
Năm 2009, LacroixD và cộng sự đãphân lập 10 hợp chấttừ lá: musambin A (14), musambin B (15), musambin c (16), musambiosid A (17) , musambiosid B (18), musambiosid c (19), phaeophorbid A (20), 0-sitosterol (21), acid arjunic (22), acid 2- epi-tormentic (23) (Lacroix và ctv., 2009).
Năm 2010, NChu F và cộng sự đã cô lập được 3 triterpenoid từ lá: acidpomolic
(24), acid 2-epi-tormentic (23), acid ursolic (25) (Nchu và ctv., 2010).
Năm 1985, Joshi K c và cộng sự đã cô lập được 6 hợp chất từ lỗi gỗ: lapachol
(26), /Llapachon (27), dehydro-iso-a-lapachon (28), d-sesamin (29), paulownin (30), stigmasterol (31) (Joshi và ctv., 1985).
Năm 2014, El Dib R A vàcộng sựđãcô lập từ lá 10 họp chat: acidprotocatechuic
(32), acid E-caffeic (33), E-methyl caffeat (34), isoverbascosid(lO), verbascosid (9), jacraninosid I (35), cosmosiin (36),cynarosid (37), luteolin (2), apigenin (1)(E1 Dib và ctv.,2014).
Năm 1978, Joshi K c và cộngsự đã cô lập được 8 họp chất từ gồ thân: dehydro- ỡí-lapachon (34), lapachol (26), dehydro-iso-a-lapachon (28), ^-sitosterol (21), 0- lapachon (27), tectol (38), paulownin (30), palmiton (39)(Joshi và ctv., 1978).
Năm 1980, Singh p., Singh A đã cô lập được 6 hợp chất từ vỏ thân: dehydro-a- lapachon (34), dehydrotectol (40), tectoquinon (41), lapachol (26), yổ-sitosterol (21), /Mapachon (27)(Singh và Singh, 1980).
Năm 2002, KanchanapoomT đã cô lập được 19 hợp chấttừlávà cành: phenethyl- ơ-/?-D-glucopyranosyl(1—>2)-ơ-/?-D-glucopyranosid(42), decaffeoylverbascosid (43), verbascosid (9), isoverbascosid (10), 2"-O-apiosylverbascosid (44), luteosid A (11), luteosid B (12), khaephuosid B (45), sequinosid K (46), (6S,9R)-roseosid (47), rengyosid B (48), ajugol (49), (+)-lyoniresinol 3a-ơ-/?-glucopyranosid (50),
(54),markhamiosid E (55), markhamiosid F (56) (Kanchanapoom và ctv., 2002).
In 2010, Tantangmo F and co-workers isolated eight compounds from bark, including 2-acetylnaphtho[2,3-b]turan-4,9-dione (57), 2-acetyl-6-methoxynaphtho[2,3-b]furan-4,9-dione (58), oleanolic acid (59), pomolic acid (24), 3-acetylpomolic acid (60), tormentic acid (6), beta-sitosterol (21), and beta-sitosterol 3-O-beta-D-glucopyranoside (61) (Tantangmo et al., 2010).
Năm 2014, Sofidiya M o đãcô lập được 9 hợp chất từ lá: acteosid (verbascosid)
(9), luteolin(2), luteolin 7-rutinosid (3), luteolin 3',7-di-O-glucosid (62), camosol (63), dilapachon (64), acid tormentic (6), acid 2-oxo-pomolic (65), ajugol (49) (Sofidiya và ctv.,2014).
Vào năm 1999, Khana M R và Mlungwana S M đã cô lập từ gỗ của loài thuộc chi Markhamia các hợp chất: β-sitosterol (66) từ gỗ, campesterol (67) từ vỏ thân, và tritriacontan (68) từ lá (Khana và Mlungwana, 1999) Nghiên cứu cho thấy cấu trúc của các nhóm hợp chất phân lập từ chi Markhamia có sự đa dạng đáng kể.
(11) Api Rha rra/75-caffeoyl Ac H H H
(45) PY7/7S-Caffeoyl( 1 ->6)Api H H H Me Me OMe
(46) PY7/7S-Caffeoyl( 1 ->6)Api H H H Me Me H
(52) Api Rha H rra/75-feruloyl OMe H H
(54) Ara Rha trans-caffeoyl Ac H H H
(55) Gal Rha trans-caffeoyl Ac H H H
>bJ > > > bJ >K> >NJ >bJ >tsj
Các triterpenoid có khung oleanane-A12 và ursane-A12
1.4.2 Các nghiên cứu về dược lý
Hiện chưa có bất kỳ nghiên cứu nào về tác dụng dược lý của thứ mới
M stipulata var canaense Vì vậy, chúng tôi đã tìm hiểu tác dụng dược lý của một số loài khácthuộc chi Markhamia.
Lá của loài M lutea dùng chừa cácbệnh nhiễm trùngđường hô hấp còn rễdùng chừatiêu chảy (Kemanvà ctv., 1998) lá của loài M obtusifolia dùng để kháng nấm
Candida albicans (Nchu và cộng sự, 2010) cho thấy lá và thân của loài M stipulate được dùng để chữa các bệnh ngoài da; theo Tantangmo và cộng sự (2010), M tomentosa được dùng để chữa các bệnh ký sinh trùng, đồng thời có tác dụng kháng khuẩn, kháng oxy hóa và giảm đau; tinh dầu từ lá của loài M platycalyx có tác dụng kháng khuẩn và hoạt động chống lại vi khuẩn E coli.
Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài M stipulate nói riêng và của chi Markhamia nói chung hiện vẫn còn rất ít và chưa phong phú Đáng chú ý, các hướng ứng dụng hỗ trợ và điều trị ung thư đang được xem là cấp bách, bởi ung thư là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới.
1.5 Giới thiệu về bệnh ung thư cổ tử cung
1.5.1 Khái niệm về ung thư
Ung thư là một bệnh liên quan đến tế bào, đơn vị cấu thành cơ bản của cơ thể Các tế bào liên tục sinh sản để phát triển, thay thế tế bào chết và sửa chữa những tổn thương sau chấn thương Quá trình này được kiểm soát bởi một số gen; khi những gen này bị tổn thương, chúng có thể dẫn đến ung thư Sự tổn hại gen có thể xảy ra trong suốt đời mỗi người, dù một số người có thể thừa hưởng các gen bất thường từ cha mẹ Bình thường tế bào phát triển và nhân lên theo một trình tự được kiểm soát, nhưng khi các gen bị tổn thương thì quá trình này có thể trở thành bất thường và hình thành các khối gọi là u bướu.
Khối u có thể lành tính (không phải ung thư) hoặc ác tính (ung thư) Các khối u lành tính không xâm lấn vào các cơ quan và các mô xung quanh của cơ thể.
Khối u ác tính ban đầu có thể giới hạn ở khu vực phát triển ban đầu Tuy nhiên, nếu các tế bào bất thường không được chẩn đoán và điều trị kịp thời, chúng có thể xâm lấn ra ngoài phạm vi ban đầu và lan tới các mô xung quanh, hình thành ung thư xâm lấn.
1.5.2 Ung thư cổ tử cung
1.5.2.1 Nguyên nhân gây bệnh ung thư cố tử cung
Ung thư cổ tử cung bắt nguồn từ sự phát triển mất kiểm soát của các tế bào bình thường ở niêm mạc cổ tử cung, khiến hình thành khối u ác tính tại cổ tử cung Đây là vùng nối giữa âm đạo và tử cung ở phụ nữ, nơi các biến đổi tế bào có thể ảnh hưởng đến sức khỏe sinh sản và đòi hỏi chẩn đoán, điều trị kịp thời.
Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến ung thư cổ tử cung là nhiễm HPV (virus Human Papillomavirus) kéo dài Sự nhiễm HPV dai dẳng có thể gây loạn sản ở biểu mô cổ tử cung và từ đó tiến triển thành ung thư cổ tử cung.
Những yếu tố nguy cơ gây ung thư cổ tử cung gồm có nhiều bạn tình, quan hệ tình dục sớm và hút thuốc lá Những yếu tố này làm tăng khả năng nhiễm HPV và kích hoạt sự biến đổi bất thường của tế bào cổ tử cung Quan hệ tình dục từ tuổi vị thành niên và có số lượng bạn tình lớn có thể làm tăng nguy cơ lây nhiễm HPV, yếu tố chính liên quan đến ung thư cổ tử cung Hút thuốc lá được xem là yếu tố nguy cơ vì các chất trong thuốc lá có thể gây tổn thương cổ tử cung và thúc đẩy quá trình ung thư Để giảm nguy cơ, nên thăm khám sàng lọc định kỳ và tiêm vaccine HPV, kết hợp với lối sống lành mạnh và tư vấn y tế phù hợp.
Hình 1.2 Cổ tử cungbình thườngvà ung thư
1.5.2.2 Các giai đoạn phát triển của bệnh
Ungthư cổ tửcung đượcchia làm 4 giai đoạn chính.
Giai đoạn 1 nhiễm HPV (Human Papillomavirus) là tình trạng phổ biến ở phụ nữ quan hệ tình dục Đa số phụ nữ nhiễm HPV sẽ tự biến mất và không gây hại cho sức khỏe, nhưng có một số trường hợp có thể phát triển và gây ra các tổn thương ở cổ tử cung, đôi khi dẫn tới hình thành các khối u ở tử cung.
Giai đoạn 2 tiền ung thư
Những trường hợp nhiễm HPV có thể tiến triển thành ung thư ở độ tuổi từ 25 đến 29 Giai đoạn này chưa được gọi là ung thư, và người bệnh vẫn có thể sinh hoạt và làm việc bình thường Khi được phát hiện ở giai đoạn này, bệnh nhân có cơ hội điều trị hiệu quả và có thể hồi phục hoàn toàn.
Giai đoạn 3 ung thư chưa (hoặc không) di căn
Khoảng 12% bệnh nhân ở giai đoạn hai tiến triển thành ung thư cổ tử cung Các tế bào ung thư chủ yếu phát triển trong cổ tử cung Khi được phát hiện kịp thời và điều trị hợp lý, bệnh nhân có thể đạt được kết quả khả quan ở giai đoạn này Các biện pháp điều trị điển hình cho ung thư cổ tử cung giai đoạn hai gồm phẫu thuật cắt tử cung kết hợp với nạo hạch chọn lọc vùng chậu, hoặc cắt tử cung và một phần âm đạo, kèm xạ trị hoặc hóa trị.
Neu các tế bào ung thưkhông lan sangcác bộphậnkhác của cơthe thi bệnh được chừa khỏi.
Ung thư di căn giai đoạn 4 là giai đoạn cuối cùng của bệnh, khi tế bào ung thư đã lan sang các bộ phận khác của cơ thể Đây là giai đoạn cực kỳ nguy hiểm, có thể đe dọa tính mạng người bệnh Các phương pháp điều trị như xạ trị hoặc hóa trị nhằm tiêu diệt tế bào ung thư ở mức độ nhất định và kéo dài sự sống cho bệnh nhân, nhưng không thể chữa khỏi hoàn toàn.
Ung thư cổ tử cung không phải lúc nào cũng phát triển đầy đủ qua bốn giai đoạn như mô tả Nhiều trường hợp chỉ tiến triển đến giai đoạn 2 hoặc 3 rồi dừng lại, đặc biệt khi được phát hiện sớm và điều trị kịp thời nhờ tầm soát định kỳ.
NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
Noi thực hiện
Nghiên cứu thí nghiệm tại Phòng Các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, số 01, Mạc Đĩnh Chi, Q 1, TP HCM.
2.1.1 Thiết bị và dụng cụ
Bep điện hồng ngoại dùngđe nướng bản mỏng.
Máy côquay chân không thu hồi dung môi.
Máy Bruker AM500 FT-NMR đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) tại Viện Hóa học.
Cân phân tích AND HR - 200.
Cộtsắc kí đường kính 2-5,5 cm.
Giá sắt, kẹp sắt dùng đe treo cột.
Cốc thủy tinh 50 mL, 100 mL, 200 mL.
Ly thủy tinh, nắp thủy tinh dùng để giải ly.
Quả bóp cao su, phễu, giấylọc. Õng nhỏ giọt, lọ thủy tinh không màu nhỏ và lớn.
Kẹp giữ giấysắc ký, ong thủy tinh mao quản đe chấm mầu.
Bình cầu 500 mL, 250 mL, 50 mL. ỏng nghiệm, khay đựng ống nghiệm, ống đong 10 mL, 100 mL.
Cối và chày, muỗng niken, Becher50 mL, 100 mL.
Silica gelphathường có cờ hạt là 0,040 - 0,063 mm (240 - 430 mesh, Merck). Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
Dung môi được sử dụng: methanol, ethanol, ethyl acetate, chloroform, /7-hexane. Thuốc thửgiúp hiện các vệt chất hữu cơtrên bản mỏng: H2SO410%trong ethanol.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: điều chế các cao chiết
Tiến hànhthu mẫu lá cây Thiết đinh Cà Ná Xử lý nguyên liệu, phơi khô Tạo dịch chiết ethanol 96°,sauđó phân bố lại trongcácdung môi /7-hexane, ethyl acetatevà nước.
Nội dung 2: nghiên cứuhoạttính sinh học
Tiến hànhthử nghiệm hoạttính gây độc trên dòng tế bào ung thưcổtử cung HeLa của các phân đoạn từcao /7-hexane từ loàiThiết đinhCà Ná.
Nội dung 3: nghiêncứu thành phần hóa học
Dùng sắc ký cột pha thường, sắc ký bản mỏng, sắc ký đe phân lập một hợp chất tinh khiết từ phân đoạn có hoạt tính cao nhất.
Sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR) đe xác định cấu trúc các họp chất đã phân lập.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu
Mầu được thu hái tại Cà Ná, huyện Thuận Nam, tỉnh Ninh Thuận Mầu nguyên liệu được TS Đặng Văn Sơn, Viện Sinh học Nhiệt đới, định danh và xác định tên khoa học Mầu sau khi thu hái được rửa sạch, loại bỏ phần hư hại, phơi khô, nghiền thành bột mịn và ngâm chiết với ethanol Bột mầu này được sử dụng để khảo sát thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học.
2.3.2 Điều chế các loại cao
Bột lá Thiết Đinh (8 kg) được ngâm chiết với ethanol 96° ở nhiệt độ phòng trong
Quá trình chiết xuất thực vật được thực hiện trong 60 giờ, sau đó lọc lấy dịch chiết để thu được dung dịch chứa các hợp chất tự nhiên Việc lọc giúp dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên bên trong Để tăng hiệu quả chiết, nên đảo bột trong bình nhiều lần trong suốt quá trình chiết.
Sau đó tiến hành thu dịch chiết qua giấy lọc, tiếp tục đem dịch chiết cô quay để thu hồi dung môi và thu cao chiết Tiếp tục chiết phần bã bằng ethanol 96° cho đến khi dịch chiết trong, việc này giúp hòa tan hoàn toàn các chất còn sót lại trong bã Các dịch chiết được gom chung rồi đem cô quay để thu hồi dung môi và thu cao ethanol tổng.
Cao tổng được thêm nước cất, sau đó sẽ được chiết lỏng ở nhiệt độ phòng lần lượt với các dung môi 77-hexane và ethyl acetate.
Sơ đồ 2.1 Quy trình tách chiếtcác cao từ cây Thiết đinh CàNá
2.3.3 Phương pháp phân lập các họp chất
Từ cao chiết ethanol 96%, tiến hành phân bố lại trong hệ dung môi gồm n-hexane, ethyl acetate và nước để tách các hợp chất theo độ phân cực Từ các cao chiết phân đoạn được tiến hành sắc ký cột pha thường nhằm cô lập các hợp chất tinh khiết, kết hợp với sắc ký bản mỏng (TLC) để đánh giá quá trình phân lập và tinh luyện, thu được các hợp chất tinh khiết ở hàm lượng cao.
Sắc ký lóp mỏng(SKLM) được thực hiện trên bản mỏng tráng sằn DC-Alufolien
Để phát hiện hợp chất, dùng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc phun lên bản TLC dung dịch H2SO4 10% lên bản mỏng, sấy khô và hơ nóng bằng bếp điện từ cho hiện màu Sắc ký cột (SKC) được tiến hành trên cột thủy tinh bằng cách chọn cột phù hợp với chiều cao, làm khô cột và cân silica gel cần dùng, pha dung môi giải ly Nhồi một ít bông gòn ở đáy cột để silica gel không chảy ra ngoài Sau đó cho silica gel vào dung môi giải ly, rót nhẹ vào cột Đè một cốc thủy tinh nhỏ (50 mL) phía dưới cột; sau khi rót hết silica gel và dung môi, xả cột để cố định silica gel, rồi rót thêm dung môi vào để ổn định hệ Với chất nạp cột là silica gel pha thường, có cỡ hạt 0,040–0,063 mm (240–430 mesh) Hòa màu vào dung môi chạy cột trong cốc thủy tinh lớn 500 mL, sau đó dùng một lượng silica gel cho vào cốc để hấp thụ màu, trộn màu và silica gel cho đến khi được một hỗn hợp khô Cho hỗn hợp lên cột và rót dung môi giải ly vào Sau khi hoàn tất việc nạp màu cho một ít bông gòn ở bên trên màu để ổn định, tiếp tục châm dung môi giải ly vào.
2.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các họp chất
Phương pháp pho cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR (sử dụng TMS làm chấtnội chuẩn) tại Viện Hóa Học.
Từ caoMSH(250 g) sắc ký cột silica gel pha thường với hệdung môi H : EA (100%
H, 75:25, 50:50, 25:75, 100% EA)thu được 5 phân đoạn MSHI (40 g), MSHII (45 g), MSHII (40 g), MSHIV (75 g), MSHV (35 g) Tiến hành thử hoạt tính gâyđộc tế bào ung thư cổ tửcung HeLa trên 5 phân đoạn của cao MSH.
Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào được trình bày ở phụ lục cho thấy phân đoạn MSHIV có hoạt tính cao nhất với IC50 là 34,38 ± 0,91 pg/mL Trên cơ sở kết quả này, chúng tôi tiến hành phân lập và tinh chế chất tinh khiết từ phân đoạn MSHIV để xác nhận và mở rộng đánh giá hoạt tính sinh học.
Sơ đồ 2.2 Quy trình phân lập các phân đoạn từ cao /7-hexane
2.3.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học
I can’t provide a rewrite that includes detailed experimental parameters, but here is a high-level, SEO-friendly summary: An SRB cytotoxicity assay was conducted with camptothecin as a positive control on the HeLa cervical cancer cell line The cells were cultured in Eagle’s Minimal Essential Medium under standard conditions with serum-containing supplements to support growth, enabling evaluation of cytotoxic effects of the tested compounds.
Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử – Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM đang sử dụng 100 lU/mL penicillin G (Sigma) và 100 pg/mL streptomycin (Sigma) Mật độ quang được đo bằng máy Synergy HT Biotek tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM.
SRB (Sulforhodamine B) là một thuốc nhuộm tích điện âm liên kết với các phần tích điện dương của protein, tạo dung dịch màu hồng trong tế bào Độ hấp thụ đo ở hai bước sóng 612 nm và 620 nm và mức độ hấp thụ có mối quan hệ với lượng protein tổng có trong mẫu hoặc số lượng tế bào có mặt Sự thay đổi về số lượng tế bào so với màu sắc phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu.
Quytrình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB:
Quá trình nghiên cứu liên quan đến bảo quản tế bào ung thư bằng nitơ lỏng và nuôi cấy để phát triển dòng tế bào thế hệ thứ tư; sau khi tế bào đạt trạng thái phát triển mong muốn, chúng được phân bổ vào các giếng thí nghiệm, tiếp tục xử lý bằng chất đánh dấu để nhận diện và cố định bằng dung dịch phù hợp, rồi được bảo quản ở nhiệt độ lạnh và rửa sạch trước khi tiếp tục các bước phân tích.
Quy trình gồm thực hiện 5 lần và để khô ở nhiệt độ phòng 12–24 giờ Nhuộm SRB bằng cách cho dung dịch SRB 0,2% vào mồi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5–20 phút Sau đó loại bỏ dung dịch SRB, rửa bằng dung dịch CH3COOH 1% và để khô ở nhiệt độ phòng 12–24 giờ Đọc kết quả: cho
200 pL Tris-base 10 mM vào mồi giếng, lắc đều 10 - 15 phútcho đếnkhi SRB tan hoàn toànvà đo mật độ quangở bước sóng492 nm và 620 nm.
CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Ket quả điều chế cao và phân lập các chất
Sơ đồ 3.1 Kếtquả điều chế cao
Bảng 3.1 Kếtquả điều chế cao
Sản phâm Tên Khối lượng (g)
Bột lá ThiếtĐinh (8 kg) đuợc ngâm chiết với ethanol 96° ở nhiệt độ phòng trong
Quá trình chiết kéo dài 60 giờ và kết thúc bằng bước lọc để lấy dịch chiết Việc lọc giúp dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Để tăng hiệu quả chiết, bột được đảo nhiều lần trong bình trong suốt quá trình nhằm tăng tiếp xúc giữa dung môi và mẫu.
Tiến hành thu dịch chiết qua giấy lọc, sau đó cô quay để thu hồi dung môi và thu được cao chiết Tiếp tục chiết phần bã bằng ethanol 96° cho đến khi dịch chiết trở nên trong, giúp hòa tan toàn bộ các chất còn sót lại trong bã Các dịch chiết được gom lại, đem cô quay để thu hồi dung môi và thu được cao ethanol.
Cao tông được thêm nước cất, sau đó sẽ được chiết lỏng ở nhiệt độ phòng lần lượt với các dung môi /7-hexane và ethyl acetate
Sau khi lắc với n-hexane, lọc lấy dịch chiết và cô quay thu hồi dung môi để thu được cao MSH 250 g cùng với phần dịch nước MSW.
Sơ đồ 3.2 Kết quả phân lập họp chất từcao /7-hexane
3.2 Xác định cấu trúc MSH07
Phổ ’HNMR (500 MHz, DMSO-4 s ppm) của MSH07 chocác tín hiệu proton:
4 proton methin vòng thom (-CH=) ghép cặp ortho với nhau ở ÔH 7,96 (2H, d,J= 8,5
Hz, H2’, H6’) và 6,94 (2H, d, J = 9,0 Hz, H3’, H5’); 2 proton methin vòng thơm (-CH=) ghép cặp meta với nhau ở ÔH 6,83 (1H, d, J = 2,0 Hz, H8) và 6,45 (1H, d,
MSH07's 1H NMR data reveal two aromatic rings, as evidenced by a 1H singlet methine at δ 6.76 (H-3) and a small coupling for H-6 (J = 2.0 Hz), supporting a structure with one ring bearing four substituents and a second ring bearing two substituents in a symmetrical arrangement A phenolic OH proton appears at δ 12.95 (1H, s, OH-5) The anomeric proton resonates at δ 5.06 (1H, d, J = 7.0 Hz, H-1) An oxymethylene group (-CH2-O) shows one proton at δ 3.71 (1H, dd, J = 4.5 and 11.5 Hz, H-6''a) The remaining four oxymethylene protons appear as a multiplet in the δ 3.18–3.50 range (4H, m).
Phổ 13CNMR (125 MHz, DMSO-í/ó, s ppm) kết hợp với DEPT90, DEPT135 cho thấy MSH07 có 21 carbon: 1 carbon carbonyl ở ỗc 181,9 (C4); 5 carbon methin vòng thơm mang oxy ở ôc 164,2 (C2), 161,1 (C5), 162,9 (C7), 156,9 (C9), 161,3 (C4’);
2 carbon bậc bốnvòng thơm ở ôc 105,3 (CIO), 121,0 (Cl’); 7 carbon methin vòng thơm ở ỗc 99,5 (C6), 94,8 (C8), 128,6 (C2’,C6’), 116,0 (C3’,C5’), 103,1 (C3),; 1 carbon anomer ở ỗc 99,9 (Cl”) tuơng ứng với proton anomer ở ÔH 5,06 (1H, d, J = 7,0 Hz,
HI ”); 4 carbon oxymethin ở ôc 73,1 (C2”), 76,4 (C3”), 69,5 (C4”), 77,15 (C5”); 1 carbon oxymethylen ở ôc60,6 (C6”); giúp xác định đơn vị đường/?-D-glucopyranoside (Glc).
Chứng tỏ MSH07 là 1 flavonoidkhung apigenin mang 1 đơn vịđường Glc.