Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - Năm học 2017-2018Đe tài: Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 5 loại tỏi Allium sativum ở Việt Nam bằng kỳ thuật đa hình ADN khuếch đại ngầu nhiên
TÔNG QUAN ĐÈ TÀI
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúư
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ADN
3.1 Chiết tách và tinh sạch ADN
Trong nghiên cứu này, năm mẫu tỏi tươi được tách chiết ADN và chất lượng ADN được đánh giá bằng phương pháp điện di trên gel agarose Mẫu DNA được trộn với dung dịch GelRed trước khi nạp vào giếng để quan sát rõ Kết quả cho thấy sự hiện diện của ADN ở tất cả các mẫu tỏi Độ tinh sạch và nồng độ ADN được xác định bằng đo quang ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm Nồng độ ADN của 5 mẫu dao động từ 108 ng/µL đến 275 ng/µL, với tỷ lệ A260/A280 từ 1,8 đến 2,0, cho thấy độ tinh sạch đạt yêu cầu Do đó, các mẫu ADN này đủ tiêu chuẩn để thực hiện phản ứng RAPD-PCR.
LD HN LS HD DL ẸR
Hình 3.1 Kết quả định tính các mẫu ADN
HN: Hà Nội LS: Lý Sơn ĐL: Đà Lạt HD: Hãi Dương PR: Phan Rang LD Ikb: Thang chuân Ikb
Bàng 3.1 Ket quả đo quang của các mẫu tôi khảo sát
3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MÓI QUAN HỆ DI TRUYỀN GIŨA CÁC MẦU BẰNG PHƯƠNG PHÁP RAMDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC ADN (RAPD)
3.2.1 Kết quả phản ứng RAPD-PCR
Để đánh giá sự đa dạng di truyền nội loài tỏi, phản ứng RAPD-PCR được tiến hành với 10 mồi ngẫu nhiên (theo bảng 2.2) trên 5 mẫu tỏi tươi, sau đó các sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose nhằm xác định sự khác biệt về band giữa các mẫu Kết quả cho thấy có sự đa dạng di truyền đáng kể giữa các mẫu tỏi tươi, được thể hiện qua sự xuất hiện, mất đi và thay đổi kích thước của các band RAPD ở các vị trí khác nhau, từ đó ước lượng mức độ biến dị di truyền và mức độ liên hệ di truyền giữa các mẫu tỏi tươi.
Trong 10 moi ngầu nhiên được sử dụng, đa số các mồi cho kết quả thể hiện tính đa hình cao, đặc biệt là các mồi OPN-1, OPA-1, OPG-19, OPO-1, OPAB-18, OPP-13, OPC-9, OPD-3 Số liệu về các băng đa hình thu được từ mồi mồi và dải băng điện di được minh họa trong hình 3.2, 3.3, 3.4, 3.5.
HN LS HO DI PR HN LS
HD BL PR HN l.s HD DL PR O1 O1 O1 AHIS AB18 ABIS ABIS ABIS
HN: Hà Nội LS: Lý Sơn ĐL: Đà Lạt HD: Hài Dương PR: Phan Rang LD Ikb: Thang chuấn Ikb
Hình 3.2 Kết quả PCR của mồi OPG - 19, OPO - 1, OPAB - 18
DL PR LDIkb HN LS HD DI PR P13 P13 C9 C9 C9 C9 C9 HN LS HD DL PR
Hình 3.3 Ket quả PCR của mồi OPP - 13, OPC - 9, OPD - 3
HN LS HI) DL PR '('13 ten C13 -C13 CI3
Hình 3.4 Ket quả PCR của mồi OPC - 13
Hình 3.5 Kết quả PCR cua mồi OPN - 1, OPA -1, OPF - 5
Bảng 3.2 Ket quả dữ liệu về số băng, số băng đa hình trong phàn ứng PCR
HN LS HD ĐL PR E băng Băng đa hình
Số băng TB ciía mỗi mồi 16 12
Kết quả phân tích đa hình kiểu gen dựa trên cơ sở điện di, được trình bày trong bảng 3.2, cho thấy số băng khuếch đại từ các mồi PCR dao động trong khoảng 10–22 băng; tỷ lệ đa hình ở từng mồi khá cao, dao động từ 60% đến 85,7% Tổng số băng thu được sau phản ứng PCR là 160 băng, tổng số băng đa hình là 121, chiếm 76% tổng số băng Trung bình mỗi mồi được khuếch đại khoảng 16 băng, trong đó mồi OPO-1 khuếch đại nhiều nhất (22 băng) và mồi OPC-13 khuếch đại ít nhất (10 băng).
Vì tỉ lệ băng đa hình cao nên có thể sử dụng một số mồi làm marker để nhận diện một vài mẫu khảo sát Ví dụ, mồi OPA-1 chỉ có một băng có kích thước lớn hơn 1500 bp và xuất hiện ở màu LS; mồi OPN-1 chỉ có một băng 1000 bp xuất hiện ở màu PR; mồi OPF-5 chỉ có một băng 1000 bp xuất hiện ở màu LS; mồi OPG-19 chỉ có một băng 1000 bp xuất hiện một lần và băng này hiện diện trên mẫu ĐL.
3.2.2 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền tỏi
Dựa vào kết quả điện di, ta lập bảng ma trận số liệu trên Excel (phần phụ lục) Từ bảng dữ liệu này, ta tính được tỷ lệ tương đồng giữa 5 màu tỏi dựa trên hệ số tương ứng đơn giản (SM coefficient) nhờ phần mềm NTSYS-pc 2.1 (bảng 3.3), nhằm cung cấp một so sánh chuẩn xác giữa các mẫu tỏi trong phân tích đa biến.
Qua xử lý dữ liệu bằng phần mềm NTSYS-pc 2.1, hệ số tương đồng di truyền giữa năm mẫu tỏi được xác định và từ đó xây dựng sơ đồ hình cây phát sinh loài cho quan hệ di truyền giữa các mẫu Sơ đồ này (hình 3.6) cho thấy sự phân nhóm dựa trên thuật toán UPGMA và phương pháp SAHN, cung cấp cái nhìn trực quan về mức độ liên hệ di truyền giữa 5 mẫu tỏi dựa trên các giá trị tương đồng đã tính được.
Bảng 3.3 Tỉ lệ tương đồng giữa 5 mẫu tỏi
HN LS HD ĐL PR
Để khảo sát mức độ sánh tương quan di truyền giữa các màu, nghiên cứu đã phân tích 10 cặp mẫu được tạo từ 5 màu khảo sát, với hệ số tương quan di truyền của từng cặp nam dao động từ 46% đến 76% Cặp mẫu LS và ĐL có hệ số tương quan di truyền thấp nhất (46%), cho thấy mối quan hệ di truyền giữa hai màu này khá xa; ngược lại, cặp mẫu HN và HD có hệ số tương quan di truyền cao nhất (76%), cho thấy mối quan hệ di truyền giữa chúng gần nhất Hệ số tương quan di truyền trung bình đạt 59,8% Trong 10 cặp, 4 cặp có hệ số tương quan dưới 55% và 6 cặp có hệ số trên 55%, cho thấy mức độ tương quan di truyền của các màu khá thấp và phần lớn vẫn ở khoảng cách di truyền xa Chỉ một số ít cặp màu có quan hệ di truyền gần như cặp HN và HD (76%), hoặc ĐL và HD (75%).
Hình 3.6 Sơ đồ cây phát sinh loài
Kết quả xếp nhóm 5 màu tỏi được khảo sát trình bày thông qua sơ đồ cây phát sinh loài (hình 3.6) Kết quả cho thấy khoảng cách di truyền giữa 5 màu dao động từ mức thấp đến mức cao, phản ánh sự phân hóa di truyền giữa các màu và gợi ý các mối quan hệ tiến hóa cũng như nguồn gốc phát sinh của từng nhóm màu.
46% - 76% Xét ở khoảng cách di truyền 52%, có 2 nhóm lớn được hình thành là nhóm I và II:
- Nhóm I gồm 3 mẫu, và được chia thành 2 phân nhóm AI và A2 có khoảng cách di truyền là 71%
• Tiểu nhóm AI chứa mầu ĐL
• Tiểu nhóm A2 chứa mẫu HDvà HN
- Nhóm II gồm 2 mầu, và được chia thành 2 phân nhóm BI và B2 có khoảng cách di truyền là 64%.
• Tiểu nhóm B2 chứa mầu LS
3.3.1 Hiệu suất tách chiết ADN
Theo phương pháp của Doyle và Doyle [14], ADN thu được có độ tinh sạch cao (1,8–2,0) và không có vạch smear trên gel điện di, cho thấy phương pháp tách chiết DNA này khá tối ưu; các thành phần hữu cơ, RNA… được loại bỏ trong quá trình làm sạch Lượng ADN thu được từ 5 mẫu theo phương pháp này dao động từ 108 ng/µl đến 275 ng/µl, đủ để thực hiện phản ứng RAPD Kết quả tách chiết ADN của đề tài tương tự với nghiên cứu của Olga Sá và cộng sự trên cây dâu với hàm lượng ADN khoảng 122 ng/µl.
278 ng/pl Tuy nhiên, nghiên cứu này có sử dụng PVP (Polyvinyl pyrrolidone), và DTT (1,4-dithiothreitol) [20] so với phương pháp được sửdụng trongđề tài.
3.3.2 Khảo sát phản úng RAPD - PCR
Trong phản ứng PCR, tổng số băng thu được là 160 và tổng số băng đa hình là 121, cho thấy số băng khuếch đại được từ các mồi dao động trong khoảng 10–22 băng Tỷ lệ đa hình của từng mồi khá cao, dao động từ khoảng 60% đến 85,7% Các mồi cho thấy tính đa hình cao như OPN-1, OPA-1, OPG-19 và OPO-1 Theo nghiên cứu của M Al-Zahim và cộng sự về đa dạng di truyền của các loại tỏi ở nhiều nước như Ý, Trung Quốc và Argentina, kết quả cũng cho thấy những mồi có tính đa hình cao và lặp lại như OPN-1, OPA-1, OPG-19 và OPO-1.
OPN-1, OPO-1 và OPG-19 là các mồi được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền tỏi Bên cạnh đó, nghiên cứu của Abdoli M và cộng sự về mối quan hệ di truyền của các loại tỏi ở Iran cho thấy tính đa hình cũng được lặp lại ở mồi OPA-1 Những kết quả từ các nghiên cứu này cho thấy có một số mồi đặc trưng thể hiện tính đa hình ở tỏi, không chỉ ở quy mô toàn cầu mà còn tại Việt Nam.
3.3.3 Phân tích mối quan hệ di truyền cua 5 loại tỏi bằng phưong pháp RAPD
Theo kết quả phân nhóm di truyền, nhóm I gồm các màu ở Hà Nội, Hải Dương và Đà Lạt Trong đó Hà Nội và Hải Dương thuộc phân nhóm A2.
Kết quả nghiên cứu cho thấy sự phân nhóm di truyền theo khu vực địa lý giữa các màu sắc: màu ở Đà Lạt thuộc nhóm I, trong khi nhóm II gồm các màu ở Lý Sơn và Phan Rang Các mẫu cùng khu vực có mối quan hệ di truyền gần nhau, còn giữa các màu ở khu vực khác thì mối quan hệ di truyền xa hơn Cặp màu Hà Nội và Hải Dương (cùng thuộc Bắc Bộ) cho thấy hệ số tương quan di truyền cao nhất, biểu thị mối quan hệ di truyền gần nhất giữa hai màu này Ngược lại, mẫu màu Lý Sơn, đảo tách biệt với phần đất liền của lãnh thổ Việt Nam, có hệ số tương quan di truyền thấp nhất so với các màu khác, cho thấy mối quan hệ di truyền xa nhất.
Nguyên nhân chính gây phân li di truyền giữa các quần thể là sự khác biệt về khoảng cách địa lý và áp lực chọn lọc phân bố không đồng đều: các mẫu ở khoảng cách gần có môi trường sống tương tự nên ít khác biệt về kiểu gen, trong khi các mẫu ở khoảng cách xa với áp lực tiến hóa không đồng đều dần dẫn tới sự phân li di truyền giữa các quần thể Tuy nhiên, ngoài yếu tố này, sự du nhập các nguyên liệu thực vật như hạt giống và phấn hoa có thể làm cho các quần thể ở xa địa lý có mức độ đồng nhất về kiểu gen cao hơn Đột biến trong quần thể cũng tạo ra sự đa dạng di truyền giữa các cá thể trong cùng quần thể, từ đó góp phần vào quá trình phân li di truyền.