Đe khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết từ cây trâm mốc, các phương pháp khuếch tán môi trường thạch và pha loãng cao chiết đe xác nồng độ ức chế tối thiếu vi khuân MIC được
TÍNH CÁP THIẾT VÀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh đang gia tăng trên toàn cầu, bao gồm cả Việt Nam, dẫn đến nguy cơ vi sinh vật kháng kháng sinh ngày càng nghiêm trọng đối với ngành Y tế Một trong những giải pháp tiềm năng là sử dụng các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính kháng khuẩn từ thực vật, đặc biệt ở các quốc gia nhiệt đới như Việt Nam, nơi có nguồn tài nguyên phong phú Trong số các loại thảo dược, cây trâm mốc được biết đến rộng rãi không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới, nổi bật với công dụng trong y học cổ truyền điều trị bệnh dạ dày và tiểu đường Các nghiên cứu hiện đại cũng chứng minh trâm mốc có khả năng kháng khuẩn, kháng oxy hóa, kháng viêm và kháng nấm, mở ra tiềm năng lớn trong việc phát triển nguồn dược liệu tự nhiên nhằm đối phó với kháng kháng sinh.
“Hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của các cao chiết từ trâm mốc” được thực hiện.
MỤC TIÊU NGHIÊN củu
Mục tiêu cụ thê
Nghiên cứu này tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn mạnh của chiết xuất từ cây trâm mốc bằng hai phương pháp: khuếch tán đĩa thạch và pha loãng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kết quả cho thấy chiết xuất từ trâm mốc có tiềm năng ứng dụng cao trong việc phát triển các chế phẩm kháng khuẩn tự nhiên, góp phần hỗ trợ điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và giảm thiểu tình trạng kháng thuốc hiện nay.
■ Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa cùa cao chiết từ trâm mốc bằng phương pháp DPPH.
■ Xác định một số hợp chất cótrongcao chiếttrâm mốc.
TÓNG QUAN
GIỚI THIỆU
Trâm mộc, có tên khoa học là *Syzygium cumini*, thuộc chi *Syzygium* trong họ *Myrtaceae*, là loài cây nhiệt đới phổ biến có nguồn gốc từ châu Mỹ nhiệt đới và Úc Chi *Syzygium* gồm khoảng 1.100 loài, phân bố rộng rãi từ châu Phi đến Madagascar, xuyên qua Nam Á và khu vực Thái Bình Dương Khu vực phát triển mạnh nhất của chi này là từ Malaysia đến đông bắc Úc, nơi tồn tại nhiều loài chưa được mô tả đầy đủ *Syzygium cumini* là một trong những loài tiêu biểu trong hệ thống phân loại thực vật nhiệt đới.
Lớp: Magnoliopsida Bộ: Myrtales Họ: Myrtaceae Chi: Syzygium
Thực vật thuộc họ Myrtaceae nổi bật với hàm lượng tinh dầu dễ bay hơi cao và đã được nghiên cứu rộng rãi về tiềm năng ứng dụng trong y học Nhiều loại trái cây thuộc chi này thường được sử dụng trong các bài thuốc y học cổ truyền, góp phần hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý Đặc biệt, một số loài thuộc chi Syzygium không chỉ có giá trị dược liệu mà còn được dùng làm thực phẩm và hiện đang được trồng phổ biến tại các vùng nhiệt đới trên toàn thế giới.
5 cumini là một loại cây có cỡ trung bình, phát triển nhanh, nổi tiếng với nhiều công dụng như làm thuốc, gồ, nhiên liệu, thực phẩm, trái cây, dược phẩm, cây cảnh. Trái cây chín có thể ăn được và cũng được sử dụng để chế biến đồ uống dinh dưỡng [3].
Lá cây trâm mốc, hay còn gọi là s cumini, là một loại thảo dược quý được sử dụng rộng rãi trong điều trị nhiều bệnh lý nhờ chứa các hợp chất có đặc tính dược lý mạnh như bảo vệ dạ dày, chống viêm loét, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng virus, chống nhiễm trùng và kháng nấm Loài cây này mọc hoang hoặc được trồng phổ biến trên toàn thế giới, và tại Việt Nam, nó được biết đến với tên gọi trâm mốc.
Hình 2.1 Hình ánh minh họa hình thải A Cây Trảmmốc s cumini, B Hoa, c Trái và D Lá của cây Trâm mốc(Mauro Halpern, 2009).
ĐẶC ĐIẾM
Trâm mốc (Syzygium cumini) là loài cây phổ biến tại Ấn Độ, có khả năng sinh trưởng mạnh mẽ trong cả điều kiện ẩm và khô Cây có thể phát triển ở độ cao lên tới 1.200 m tại dãy Himalaya và 1.800 m tại vùng Nilgiris, thậm chí chịu được đất mặn Nhờ tốc độ phát triển nhanh, loài này đã lan rộng tới Hawaii, quần đảo Cook, Polynesia thuộc Pháp và nhiều khu vực khác Trâm mốc thường mọc ở vùng đất trũng, giàu dinh dưỡng, nơi có lượng mưa trung bình hàng năm từ 900 đến 1.000 mm Tại Ấn Độ, cây được trồng xen trong các cánh đồng cà phê để tạo bóng mát, góp phần cải thiện môi trường canh tác.
Trâm mốc là cây gồ lớn với vỏ cây dày, màu nâu xám Gồ có màu trắng và chắc
Lá cây trâm mốc có hình thon dài, kích thước từ 6 đến 12 cm, với cuống lá mọc từ các nhánh bên dưới và dài khoảng 4 đến 6 cm Hoa của cây có mùi thơm đặc trưng, màu trắng xanh, mọc thành chùm với hình dạng tròn hoặc thuôn dài; đài hoa hình phễu dài khoảng 4 mm có răng, cánh hoa kết lại và rủ xuống, nhị hoa có chiều dài bằng đài hoa Trái cây có sự đa dạng về màu sắc và kích thước, bao gồm các loại có thịt quả màu tím hồng, tím than, trắng, và cả giống không hạt đã được lai tạo Quả thuộc loại quả mọng, hình thuôn dài từ 1,5 đến 3,5 cm, màu tím sẫm hoặc gần như đen, có mùi thơm đặc trưng và chỉ chứa một hạt duy nhất.
Cây trâm mốc (Syzygium cumini) duy trì tán lá xanh tốt trong suốt mùa hè từ tháng 4 đến tháng 8, nhưng bắt đầu rụng lá vào cuối tháng 2 đến tháng 3, rụng nhiều nhất từ tháng 4 đến tháng 5, với hiện tượng rụng lá theo mùa diễn ra từ tháng 12 đến tháng 1 năm sau Hoa của cây bắt đầu nở từ tháng 3 và đạt đỉnh vào tháng 4 đến tháng 5 Trong phần lớn môi trường sống, cây bắt đầu ra quả từ tháng 5, sau đó xuất hiện các chùm quả non.
Quá trình chín của quả diễn ra trong khoảng 15 đến 25 ngày, bắt đầu từ màu xanh lục, sau đó chuyển dần sang tím nhạt hoặc đỏ tía, và cuối cùng là tím đậm hoặc gần như đen khi quả chín hoàn toàn Sự thay đổi màu sắc này mất khoảng hai tuần để hoàn tất Mùa chín của quả thường bắt đầu từ tháng 6 đến tháng 7 và có thể kéo dài đến tháng 8 Khi đạt độ chín tối đa, quả sẽ bắt đầu rụng tự nhiên.
Cây trâm mốc chứa nhiều hợp chất sinh học quý như anthocyanin, glucoside, ellagic acid, isoquercetin, kaemferol và myrecetin, có tác dụng chống oxy hóa mạnh Hạt của cây chứa alkaloid, jambosine và glycoside jambolin hoặc antimellin, giúp ức chế quá trình chuyển hóa tinh bột thành đường, đồng thời chiết xuất từ hạt có khả năng làm giảm huyết áp đến 34,6% nhờ hàm lượng ellagic acid cao Flavonoid trong hạt bảo vệ enzyme bằng cách khử gốc tự do Thịt quả chiếm 75% trọng lượng, giàu khoáng chất như Ca, Mg, P, Fe, Na, K, Cu, S, Cl và các vitamin như C, A, riboflavin, nicotinic acid, choline, folic acid Glucose và fructose là nguồn đường chính, không có sucrose Maleic acid chiếm 0,59% trọng lượng quả, là acid hữu cơ chủ yếu Tannin trong quả chủ yếu là gallic acid, có tác dụng bảo vệ dạ dày và phòng chống ung thư Màu tím của quả do cyanidin diglycosides tạo thành.
Báng 2.1 Thànhphần hóa học trong từng bộ phận trâm mốc.
Thành phần hóa học Bộ phận thực vật Thành phần hóa học Bộ phận thực vật
Gallic acid Thịt quả, hạt, vỏ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC
- Myricyl alcohol Quercetin kaempferol Bergenins
Monoterpenoid Sesquiterpene -Cadalane type -Azulene type
Tinh dầu (EO) là hỗn hợp phức tạp của các thành phần dễ bay hơi, được chiết xuất từ nhiều bộ phận của thực vật như hoa, chồi, hạt, lá, cành, vỏ cây, trái và rễ EO có ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như mỹ phẩm, dược phẩm, nông nghiệp và công nghiệp nhờ vào khả năng tăng cường sức khỏe và bảo vệ con người Các thành phần của EO đã được chứng minh có đặc tính kháng virus, kháng độc, kháng nhiễm trùng và diệt côn trùng Ngoài ra, EO còn được sử dụng như hợp chất tự nhiên và hương liệu trong sản xuất.
2.3.1.1 Thành phần hóa họccủa tinh dầu (EO) trong lả
Thành phần chính của tinh dầu (EO) trong lá thường là a-pinene, tuy nhiên tỷ lệ và thành phần của EO có thể thay đổi đáng kể tùy thuộc vào điều kiện địa lý và môi trường sinh trưởng Các hợp chất phổ biến được tìm thấy trong EO ở nhiều khu vực bao gồm a-pinene, p-pinene, limonene, cadinene, a-terpineol, cis-ocimene, trans-ocimene và perillaldehyde.
2.3.1.2 Thành phần hóa họccủa tinh dầu (EO) trong quả
Tinh dầu (EO) chiết xuất từ quả trâm mốc chứa nhiều hợp chất hóa học quan trọng, góp phần tạo nên hương vị đặc trưng Theo nghiên cứu của Craveiro năm 1983, a-pinene chiếm tỷ lệ cao nhất với 30,89%, tiếp theo là p-pinene với 10,81% Vijayanand (2001) xác định các chất dễ bay hơi như trans-ocimene, cis-ocimene, p-myrcene và a-terpineol là thành phần chủ yếu, cùng với ba este gồm dihydrocarvyl acetate, geranyl butyrate và terpinyl valate Nghiên cứu mới nhất của Abdelhady (2012) ghi nhận 24 hợp chất hóa học trong EO, với tỷ lệ chiết xuất đạt 1,2%, trong đó methyl eugenol (22,5%), limonene (14,43%) và a-terpineol (12,04%) là các thành phần chính.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng monoterpenoid là thành phần chủ yếu trong tinh dầu (EO), được phân loại thành ba nhóm: acyclic, monocyclic và bicyclic Monoterpenoid acyclic là dẫn xuất của 2,6-dimethyloctane, hình thành từ sự kết hợp của hai phân tử isoprene Trong các monoterpenoid, vòng hợp chất gồm 6 nguyên tử carbon là cấu trúc phổ biến nhất Monoterpenoid bicyclic được tạo ra thông qua hai phản ứng tuần hoàn liên tiếp của geranyl pyrophosphate Danh sách các hợp chất thuộc nhóm monoterpenoid được trình bày chi tiết trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2 Thành phần hợp chất thuộcnhóm monoterpenoid.
Nhóm monoterpenoid Tên hợp chất
Acyclic Monoterpenoid p-Ocimene vàđồng phân hình học củanó (E)-p-ocimene
Monocyclic Monoterpenoid a-Limonene L-limonene a-phellandrene p-phellandrene a-terpinolene y-terpinene
Bicyclic Monoterpenoid a-Pinene p-pinene Camphene 2-chlorocamphane Bomylene
Borneol a-bomyl acetate Isobomyl acetate 1,8-cineole
Cis-sabinene hydrate Trans-sabinene hydrate Sabinyl acetate a-thujene Fenchol Fenchyl acetate Fenchyl alcohol, (3-fenchyl Alcohol, (+)-2-carene 2-acetylmethyl-(+)-3-carene Ô-3-carene
Theo nghiên cứu của Sudhir Kumar (2017), quả trâm mốc (Syzygium cumini) chứa nhiều sesquiterpenoid tự nhiên, là những hợp chất có cấu trúc đa dạng và được phân loại thành 11 nhóm chính gồm: caryophyllane, aromadendrane, cadinane, eudesmane, farnesane, bisabolane, copaane, elemane, guaiane, himachalane và widdrane Các thành phần sesquiterpenoid này đóng vai trò quan trọng trong đặc tính sinh học của quả trâm mốc và được trình bày chi tiết trong Bảng 2.3 của nghiên cứu.
Báng2.3 Thànhphần hợp chấtthuộc nhómsesquiterpenoid.
Nhóm sesquiterpenoid Tên họp chất Nhóm sesquiterpenoid Tên họp chất
Eremophilene Valencene a-selinene P-selinene P-eudesmol
Globulol Epiglobulol spathulenol Viridiflorol Ledol
Famesene a-famesene Cis-a-famesene p-famesene Cis-P-famesene Cis-famesol Cis-nerolidol Trans-nerolidol
Torreyol a-amorphene Cadina-l,4-diene Calacorene a-muurolene a-muurolol y-cadinene ô-cadinene
Copaane a-ylangene a-copaeneElemene p-elemeneGuaiene p-guaieneHimachalane a-himachaleneWiddrane Widdrol
2.3.2.1 Lipidvàhydrocarbon trong hạt trâm mốc
Theo nghiên cứu của Sudhir Kumar và cộng sự (2017), dầu hạt của cây trâm mốc (Syzygium cumini) chứa nhiều loại acid béo quan trọng như acid béo bão hòa, acid béo không bão hòa, epoxy và cyclopropenoid Các acid béo phổ biến được tìm thấy trong dầu hạt trâm mốc bao gồm những hợp chất có giá trị sinh học cao, góp phần làm tăng tiềm năng ứng dụng của loại dầu này trong ngành thực phẩm và dược phẩm.
Báng2.4 Tỷ lệ các acidbéo trong dầu hạt cùa trâm mốc (S cuminí).
Các acid béo Tỷ lệ (%) Tài liệu thamkhảo
Epoxy fatty acid, vemolic acid
Cao chiết từ hạt trâm mốc đã được xác định chứa các hợp chất như 4-(2-2-dimethyl-6-6-methylenecyclohexyl), butanol, decahydro-8a-ethyl-1,1,4a,6-tetramethylnapthalene, octadecane, 1-chlorooctadecane và tetratetracontane thông qua phương pháp sắc ký khí do Kumar và cộng sự thực hiện Ngoài ra, eleostearic acid cũng được phát hiện trong dầu hạt trâm mốc bằng phương pháp quang phổ bởi Das và nhóm nghiên cứu của ông, cho thấy tiềm năng sinh học đáng chú ý của loại hạt này.
2.3.2.2 Lipid và hydrocarbon trong lá trảm mốc
The chemical composition of *Litsea cubeba* leaves primarily consists of monoterpenoids and sesquiterpenoids Studies have identified various fatty acids and paraffins such as heptacosane, nonacosane, triacontane, hentriacontane, and aliphatic alcohols including octacosanol, triacosanol, and dotriacosanol Additional compounds like octacosane, tricontane, eicosane, and hexadecane have also been reported Furthermore, the essential oil extracted from *Litsea cubeba* leaves contains simple aliphatic hydrocarbons such as 1,3,6-octatriene, along with alcohols like 1-hexanol, cis-3-hexenol, nonyl alcohol, and hexylene glycol.
Jamun berries (Syzygium cumini) are rich in flavonoids, primarily classified into flavone, flavonol, dihydroflavonol, and anthocyanidins A study by Carvalho et al (2016) using HPLC-DAD-electrospray (ESI)-MS/MS identified approximately 74 distinct phenolic compounds in jamun fruit These include 9 anthocyanins—mainly delphinidin, petunidin, and malvidin—9 flavonols such as myricetin, laricitrin, and syringetin glycosides, 19 flavanonols including dihexosides of dihydromyricetin and methylated derivatives, 8 flavan-3-ol monomers like gallocatechin, 13 gallotannins, 13 ellagitannins, and several proanthocyanidins (galloylated prodelphinidins), along with free gallic and ellagic acids.
2.3.3.2 Hợp chat flavonol và flavone
Trong trâm moc, Kumar (2017) đã phát hiện có 4 flavonol, 1 dihyhydroflavonolvà
1 flavone Các thành phần hóa học thuộc họp chất này gồm có kaempferol, quercetin
[18], dihydromyricetin, 5,7,3',4',5'-pentahydroxyflavone [19], myricetin [20], kaempferol-7-O-methylether [21].
Các hợp chất tannin được tìm thấy trong hầu hết các bộ phận của cây trâm mốc, bao gồm trái cây với hàm lượng tannin đạt 4,2%, lá, hạt, thân cây, vỏ và hoa Đặc biệt, ellagitannin là nhóm hợp chất chiếm tỷ lệ đáng kể, nổi bật với khả năng chống oxy hóa mạnh và hoạt động kháng phân bào, góp phần vào tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm và chăm sóc sức khỏe.
TÁC DỤNG Y HỌC CÓ TRUYỀN
Cây trâm mốc là một vị thuốc quý trong y học cổ truyền, với các bộ phận như hạt, quả, lá, hoa và vỏ cây đều có giá trị chữa bệnh Tại Ấn Độ, các bác sĩ y học cổ truyền đã sử dụng cây trâm mốc để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý như tiểu đường, mụn nước do ung thư miệng, tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa và đau dạ dày.
Quả trâm mốc là loại trái cây được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền trên toàn thế giới, nổi bật với công dụng hỗ trợ điều trị các bệnh như ho, tiểu đường, kiết lỵ, viêm, tiêu chảy mãn tính và rối loạn đường ruột Ngoài ra, quả trâm mốc còn được biết đến như một loại thuốc bổ gan, bổ máu, giúp bảo vệ răng và nướu Nước ép từ quả trâm mốc không chỉ giúp giảm cơn khát mà còn có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh tiểu đường Với vị chát và ngọt đặc trưng, quả trâm mốc có tác dụng làm mát cơ thể, se ruột và khử mùi hôi miệng, góp phần nâng cao sức khỏe tổng thể.
Hạt trâm mốc có vị ngọt, mang lại nhiều lợi ích sức khỏe như làm se ruột, lợi tiểu và hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường Loại hạt này thường được chế biến thành bột để sử dụng như một phương thuốc tự nhiên cho người mắc tiểu đường Ngoài ra, chiết xuất từ hạt trâm mốc còn có tác dụng giảm ho, cảm lạnh, sốt và cải thiện các vấn đề về da như phát ban, loét miệng, cổ họng, ruột và đường sinh dục do nấm Candida albicans gây ra.
Theo y học cổ truyền, tro lá được sử dụng để hỗ trợ bảo vệ răng và nướu, trong khi dầu chiết xuất từ lá có hiệu quả trong điều trị các bệnh lý về da Ngoài ra, nước ép từ lá trâm mốc và lá xoài kết hợp với mận anh đào, sữa dê và mật ong được xem là bài thuốc tự nhiên giúp chữa bệnh kiết lỵ hiệu quả.
Theo nghiên cứu của Kirtikar (1975), vỏ cây trâm mốc có vị chát và ngọt, giúp hỗ trợ tiêu hóa, làm se ruột, chống giun sán và được sử dụng như một phương thuốc hiệu quả trong điều trị đau họng, viêm phế quản, hen suyễn, nhiễm trùng và kiết lỵ Đặc biệt, vỏ cây trâm mốc còn được điều chế thành nước súc miệng giúp trị viêm loét miệng, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe răng miệng.
TÌNH HÌNH NGHIÊN củu
2.5.1 Nghiên cứu trên thế giói
2.5.1.1 Hoạt tính khảng khuẩn và virus
Năm 2007, Oliveira và cộng sự đã công bố nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá Syzygium cumini, cho thấy cao chiết cồn thô từ lá cây này có hiệu quả ức chế mạnh đối với nấm Candida krusei với vòng kháng khuẩn đạt 14,7 ± 0,3 mm và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 70 pg/ml Ngoài ra, cao chiết còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến như Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Staphylococcus aureus, mở ra tiềm năng ứng dụng trong điều trị nhiễm khuẩn.
Theo nghiên cứu của Kothari và cộng sự (2011), cao chiết methanol và ethanol từ hạt S cumini cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đáng kể đối với vi khuẩn Staphylococcus cholermidis Thí nghiệm được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), cho thấy hai loại cao chiết này có khả năng ức chế vi khuẩn trong khoảng nồng độ từ 154 µg/mL trở lên Kết quả này góp phần khẳng định tiềm năng ứng dụng của S cumini trong lĩnh vực dược phẩm và điều trị nhiễm khuẩn.
656 pg/ml, trong đó, cao chiết từ ethanol có hoạt tính kháng khuấn cao hơn cao chiết từ methanol [39].
Một nghiên cứu của Tahir và cộng sự (2012) đã chứng minh rằng cao chiết từ lá s cumini bằng nước, methanol, hexane và ethyl acetate có hoạt tính kháng khuẩn mạnh chống lại các vi khuẩn gây sâu răng như Streptococcus viridans, S mutans, E coli, P aeruginosa, S aureus và B subtilis Đặc biệt, chiết xuất methanol cho thấy vùng ức chế lớn nhất đối với E coli lên đến 20 mm, trong khi giá trị MIC xác định cho các vi sinh vật khác đều đạt vùng ức chế trên 8 mm Kết quả này khẳng định lá s cumini có tiềm năng cao trong việc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị sâu răng do vi khuẩn gây ra.
Hoạt tính kháng nấm của chiết xuất lá s cutnini từ methanol kháng nấm
Chiết xuất từ 5 cumini bằng methanol đã được Javaid và Samad (2011) chứng minh có khả năng ức chế sinh khối nấm Alternaria alternata từ 82% đến 88% ở các nồng độ 1%, 2% và 5% w/v Trong nghiên cứu của Richa Sood và cộng sự (2012), chiết xuất thô từ lá và vỏ cây trâm mốc cho thấy hiệu quả kháng virus H5N1 mạnh mẽ trên gia cầm, với khả năng ức chế virus lên đến 100% và giảm sự phát triển virus từ 98% đến 99% Chỉ số chọn lọc cao của chiết xuất nước nóng (248) và nước lạnh (43,5) từ vỏ cây trâm mốc cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm kháng virus H5N1.
2.5.1.2 Hoạt tỉnh kháng oxy hóa
Theo nghiên cứu của Ping và cộng sự (2008), hoạt tính kháng oxy hóa của chiết xuất lá *Syzygium cumini* đã được đánh giá thông qua hai phương pháp DPPH và FRAP Các loại dung môi như methanol, ethyl acetate, chloroform và n-hexane đều cho thấy khả năng kháng oxy hóa, trong đó chiết xuất từ ethyl acetate thể hiện hiệu quả vượt trội Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng của chiết xuất ethyl acetate từ lá *S cumini* trong việc chống lại quá trình oxy hóa, góp phần bảo vệ sức khỏe và ngăn ngừa các bệnh lý liên quan đến stress oxy hóa.
Theo nghiên cứu của Mohamed (2013), chiết xuất methanol từ lá cây S cumini có hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn vượt trội so với chiết xuất methylene chloride và tinh dầu Hàm lượng các hợp chất phenolic và flavonoid trong chiết xuất methanol cũng cao hơn đáng kể, góp phần tăng hiệu quả bảo vệ Nhờ đặc tính sinh học này, chiết xuất lá S cumini được đánh giá là tiềm năng để sử dụng làm chất bảo quản tự nhiên trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.
2.5.1.3 Hoạt tỉnh kháng ung thư
Trong nghiên cứu in vitro của Li và cộng sự (2009), các chất chiết xuất đã cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 và MDA-MB-231, nhưng ít hiệu quả trên tế bào MCF-10A Theo báo cáo của Aquil (2012), hợp chất anthocyanin và polyphenol chiết xuất từ ethanol có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư phổi A549 ở người, với các thành phần hoạt tính chính gồm 5-anthocyanidin, ellagic acid và ellagitannin Tuy nhiên, kết quả này cần được so sánh với các nghiên cứu in vitro khác như của Sabira Mohammed để đánh giá tính nhất quán và tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất từ quả, hạt và vỏ cây Syzygium cumini có khả năng kích hoạt quá trình chết rụng tế bào (Apoptosis) trong các dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) và ung thư tuyến tiền liệt (PC-3) ở người Trong ba loại chiết xuất, Sabira (2017) kết luận rằng chiết xuất từ quả có hoạt tính sinh học mạnh nhất Bên cạnh đó, Yadav và cộng sự (2011) cũng ghi nhận rằng chiết xuất hạt S cumini bằng ethanol có thể gây ra Apoptosis trong nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau, cho thấy tiềm năng chống ung thư của loại cây này.
2.5.1.4 Hoạt tỉnh chổng đái tháo đường
Năm 2009, Fei và cộng sự đã nghiên cứu tám hợp chất chiết xuất từ rễ cây *Syzygium cumini* và đánh giá khả năng tăng cường tiêu thụ glucose trong tế bào cơ kháng insulin L6 Kết quả cho thấy tất cả các hợp chất đều cải thiện đáng kể mức tiêu thụ glucose, cả khi có và không có insulin, đặc biệt Friedelin ở nồng độ 10 pg/mL giúp tăng 17,35% và hợp chất 5,7,3,4,5'-pentahydroxy flavone ở nồng độ 0,1 g/mL giúp tăng 51,11% Năm 2012, Middha và cộng sự tiếp tục nghiên cứu các bài thuốc hạ đường huyết theo y học cổ truyền, sử dụng các nguyên liệu như *S cumini*, *Trigonella foenum-graecum*, *Moringa alba*, *Punica granatum*, *Emblica officinalis* và *Momordica charantia* Trong số đó, *S cumini* và *T foenum-graecum* được chứng minh có hiệu quả hạ đường huyết vượt trội hơn so với các nguyên liệu còn lại.
Nghiên cứu của Binh T.D Trinh và cộng sự (2016) đã tiến hành sàng lọc 18 loại thực vật, bao gồm trâm mốc, nhằm đánh giá tiềm năng điều trị bệnh đái tháo đường từ thảo dược cổ truyền Việt Nam thông qua khả năng ức chế enzym a-glucosidase và a-amylase Kết quả cho thấy, trong phương pháp a-glucosidase, trâm mốc chiết xuất từ nước đạt giá trị IC50 là 20,9 ± 1,8 pg/mL, đứng thứ hai về hiệu quả ức chế so với các loại thực vật còn lại, khẳng định tiềm năng ứng dụng của trâm mốc trong hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường.
Cây Trâm mốc là một loại thảo dược quý tại Việt Nam, đã được ghi nhận chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học qua các nghiên cứu quốc tế Tuy nhiên, việc nghiên cứu và tách chiết các hợp chất mới từ cây Trâm mốc, đặc biệt là các hoạt chất có khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa, vẫn còn nhiều tiềm năng chưa được khai thác Trong bối cảnh Việt Nam là quốc gia nhiệt đới giàu tài nguyên thực vật, nhưng các nghiên cứu trong nước về cây Trâm mốc còn hạn chế, đề tài khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết từ cây Trâm mốc được thực hiện nhằm đánh giá bước đầu tiềm năng ứng dụng và phát hiện các hợp chất mới có giá trị trong lĩnh vực dược liệu.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu
NGUYÊN LIỆU
Cao chiết trâm mốc (S cumini) được chiết xuất từs cumini sử dụng dung môi là nước, ethanol, diethyl ether được trình bày trong quy trình Hình 3.1.
Hình 3 ỉ Sơ đồ quy trình chiết xuất các cao chiết trâm mốc.
Các cao chiết trâm mốc sử dụng trong nghiêncứu được kí hiệu theo Bảng 3.1.
Bảng3.1 Kí hiệu tên các cao chiết trâm mốc đượcsử dụng trong nghiên cứu.
Cao chiết từ diethyl ether Cao 10D
Hai chủng vi khuẩn Gram dưong (Bacillus cereus và Staphylococcus aureus') và hai chủng vi khuan Gram âm (Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coif) được kí hiệutheoBảng 3.2.
Bàng3.2 Kí hiệu tên các chúngvi khuân đượcsử dụng trong nghiên cứu.
DỤNG CỤ - THIẾT BỊ - HÓA CHÁT
Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 3.3.
Bàng3.3 Danh sách các thiếtbị, dụng cụđược sử dụng trongnghiên cứu.
STT Thiết bi - dụng cụ Hãng sản xuất/quốc gia
Các hóa chất sử dụngtrongđề tài nghiên cứu được liệt kêtrongBảng 3.4.
4 Tủ vi sinh Biobase- Trung Ọuốc
5 Máyhấp tiệt trùng Hirayama Nhật Bản
9 Máyđo OD cuvette JenWay Genova Plus- Anh
10 Máyđo OD đĩa 96 BiOTeK- Mỳ
11 Tủ đông Sanyo 300L Trung Quốc
12 Tủ mát Alaska Trung Quốc
13 Bình tam giác Erlen Đức
1000 pL Thermo scientific- Phần Lan
18 Đầu tip xanh 100-1000 pL Biologix -Mỳ
19 Đầu tip vàng 2- 200 pL Biologix -Mỳ
21 Đèn cồn thủy tinh ViệtNam
Bàng3.4 Danh sách các hỏachấtđược sử dụng trong nghiên cứu.
Phương pháp nghiên cứu Hóa chất
Phương pháp hoạt tínhkháng khuẩn
DMSO Peptone 10g/L Cao chiết nấmmen (Yeast extract) 5g/L NaCl 5g/L
NaCl 8 g/L KC1 0,2 g/L Na2HPO4 1,44 g/L KH2PO4 0,24 g/L
Phương pháp hoạt tính khángoxy hóa
Methanol DMSO 2-2-diphenyl-picrylhydrazyl (DPPH) Acidascorbic (vitamin C)
Phươngpháp định tínhmột số hợp chất
Ethanol Bột Zn(kẽm) Dung dịch HC1 36,5%
THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIẾM NGHIÊN cứu
Thời gian nghiên cứu từ tháng4 năm 2019 đen tháng 10 năm 2019.
3.3.2 Địa điểm nghiên cứu Đe tài được thực hiện tại Viện kỳ thuật Công nghệ cao, trường Đại học NguyễnTấtThành Địa chỉ: 1/7K Hoàng Diệu, phường 13, Quận 4, thànhphố Hồ Chí Minh.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
3.4.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng
Để đảm bảo độ chính xác trong các thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, mật độ vi khuẩn cần đạt chuẩn theo quy định Vì vậy, việc xác định mối tương quan giữa mật độ quang học và mật độ vi khuẩn được thực hiện thông qua việc xây dựng đường cong tăng trưởng của vi khuẩn, giúp tối ưu hóa quy trình phân tích và nâng cao độ tin cậy của kết quả nghiên cứu.
Môi trường Lysogeny broth (LB) được chuẩn bị theo công thức tiêu chuẩn và khử trùng ở 121°C trong 20 phút, sau đó bảo quản lạnh khi không sử dụng Đối với phương pháp khuếch tán đĩa, môi trường thạch LB agar được pha chế với nồng độ agar 1,7%, hấp khử trùng tương tự và rót vào đĩa petri trong điều kiện vô trùng khi nguội đến khoảng 70°C, đảm bảo độ dày đồng đều 4 mm Các đĩa thạch sau khi nguội đến nhiệt độ phòng được lưu trữ trong tủ lạnh và làm ấm trước khi tiến hành nuôi cấy.
Báng 3.5 Côngthức chuẩn bị môi trường Lysogeny broth (LB)
Cao nấm men (Yeast extract) 5
Trong thí nghiệm này, các chủng vi khuẩn được sử dụng bao gồm hai chủng Gram dương (Bacillus cereus và Staphylococcus aureus) cùng hai chủng Gram âm (Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli) Các chủng vi khuẩn được pha loãng trong môi trường LB đến khi đạt mật độ quang học OD600nm là 0,0006, đảm bảo điều kiện chuẩn cho quá trình thử nghiệm vi sinh.
Chuẩn bị các chuỗi pha loãng vi khuẩn: Trong quá trình thí nghiệm, sau các mốc thời gian 0, 2, 4, 6, 8, 10, 22, 24 và 48 giờ, vi khuấn được đo độ đục ở bước sóng
600 nm và tính mậtđộ vi khuẩn bằng phưong pháp cấy trải.
Để xây dựng đường cong tăng trưởng vi khuẩn chính xác, dữ liệu đo mật độ quang tại bước sóng 600 nm và mật độ vi khuẩn trong suốt 48 giờ nuôi cấy được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel Phân tích này giúp xác định đặc điểm sinh trưởng của từng chủng vi khuẩn, hỗ trợ nghiên cứu vi sinh và tối ưu hóa quy trình nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.
3.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từcây trâm mốc
3.4.2.1 Phương pháp khuếch tản trên môi trường thạch
Cao chiết từ mồi giếng thạch có khả năng khuếch tán trên môi trường Lysogeny broth agar (LB agar), với nồng độ giảm dần khi khoảng cách xa dần trung tâm Hiệu quả kháng khuẩn của cao chiết được thể hiện rõ qua sự hình thành vòng tròn kháng khuẩn sau quá trình nuôi cấy, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong kiểm soát vi sinh vật.
Cao chiết từ cây trâm mốc được sử dụng làm chất kháng khuẩn trong thí nghiệm nhằm đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của nó Quá trình chiết xuất sử dụng các dung môi như nước, ethanol và diethyl ether, được pha trong dung dịch DMSO với nồng độ 50 mg/mL để đảm bảo độ tinh khiết và hiệu quả tối ưu trong nghiên cứu.
Trong quá trình chuẩn bị vi khuẩn cho thí nghiệm, các mẫu vi khuẩn được pha loãng trong môi trường LB đến nồng độ 1,5 x 10⁸ CFU/mL, tương đương với chuẩn 0,5 McFarland Thí nghiệm sử dụng bốn chủng vi khuẩn phổ biến gồm hai chủng gram dương là *Bacillus cereus* và *Staphylococcus aureus*, cùng hai chủng gram âm là *Pseudomonas aeruginosa* và *Escherichia coli*, nhằm đánh giá hiệu quả trong các điều kiện kiểm nghiệm vi sinh.
Quy trình thực hiện thí nghiệm bắt đầu bằng việc cấy vi khuẩn có nồng độ 10⁸ CFU/mL lên bề mặt đĩa petri chứa môi trường LB agar theo hình zig-zag bằng tăm bông tiệt trùng, sau đó để khô và đục 4–5 giếng có đường kính khoảng 6 mm Cao chiết từ trâm mốc được pha loãng trong DMSO ở nồng độ 50 mg/mL, tuy nhiên kết quả khảo sát cho thấy cao chiết từ diethyl ether có hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn nên được sử dụng ở các nồng độ 2 mg/mL, 10 mg/mL và 50 mg/mL Mỗi giếng thạch được bổ sung 50 µL dịch chiết đã pha loãng và ủ ở 37°C trong 24 giờ Mẫu đối chứng âm là DMSO, mẫu đối chứng dương là kháng sinh Kanamycin ở nồng độ 10 µg/mL pha trong môi trường LB Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng cách đo đường kính vòng ức chế vi sinh vật, thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy giá trị trung bình Công thức tính đường kính kháng khuẩn là: d = d₁ - d₂, trong đó d là đường kính vòng kháng khuẩn, d₁ là đường kính vòng lớn và d₂ là đường kính DMSO.
Công thức tính đường kínhvòng kháng khuẩn của khángsinh Kanamycin:
^■Kanamycin — dỵ — dnưfrc dịCanamycin: đường kính vòng kháng khuẩn của Kanamycin. di: đường kính vòng lớn. dnước: đường kính vòng kháng khuấn của nước (bằng 0).
3.4.2.2 Phươngpháp pha loãngcao chiết đểxác định MIC
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các cao chiết thực vật được thực hiện bằng cách pha loãng mẫu trên đĩa 96 giếng, kết hợp với chất chỉ thị màu resazurin MIC được định nghĩa là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ thử nghiệm có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, thể hiện qua việc không làm đổi màu resazurin.
Chuẩn bị vi khuẩn: Bốn chủng vi khuẩn được pha loàng trong môi trường LB đến nồng độ tương đương5 X 106 CFƯ/mL.
Thuốc thử Resazurine được chuẩn bị bằng cách pha loãng với dung dịch PBS để đạt nồng độ 0,01%, đảm bảo hiệu quả trong các thí nghiệm sinh học Công thức chi tiết để pha dung dịch PBS được trình bày trong Bảng 3.6, giúp người dùng dễ dàng tái tạo quy trình chuẩn bị thuốc thử một cách chính xác và nhất quán.
Báng 3.6Công thức chtiân bịdung dịch BBS.
Nguyên tắc đổi màu của thuốc thử Resazurine dựa trên hoạt động của enzyme reductase trong ty thể của vi khuẩn, giúp chuyển đổi Resazurine từ màu xanh tím sang resorufin màu hồng Sự thay đổi màu sắc từ xanh sang hồng trong các giếng phản ứng là dấu hiệu rõ ràng cho thấy sự phát triển của vi khuẩn, hỗ trợ hiệu quả trong việc đánh giá hoạt tính sinh học và kiểm tra vi sinh vật.
Hình 3.2Mô tá nguyên tắc đôi màucủa Resazurin [52].
Quy trình thí nghiệm được tiến hành bằng cách nạp vi khuẩn với nồng độ 5 x 10⁶ CFU/mL và môi trường LB vào từng giếng của đĩa 96 giếng theo chuẩn Being 3.7 Các cao chiết từ trâm mốc bằng nước, ethanol và diethyl ether được pha loãng trong dung dịch DMSO với các nồng độ khảo sát 50 mg/mL, 25 mg/mL và 12,5 mg/mL Nồng độ cuối cùng của cao chiết trong các giếng chứa vi khuẩn E coli, B cereus và S aureus lần lượt là 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL và 0,625 mg/mL; đối với vi khuẩn P aeruginosa là 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL và 0,25 mg/mL Mỗi nồng độ khảo sát được lặp lại hai lần, sử dụng DMSO làm đối chứng âm và giếng chỉ chứa môi trường nuôi cấy làm nền Các nồng độ khảo sát tiếp theo được xác định dựa trên kết quả ban đầu và lặp lại ba lần ở mỗi nồng độ Đĩa thí nghiệm và đối chứng được ủ ở 37°C trong 24 giờ, sau đó thêm 20 µL thuốc thử Resazurine 0,01% vào mỗi giếng và tiếp tục ủ để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn.
1 giờ Sauđó, quan sát sựthayđổi màu cùa các giếng chứa cao chiết so với đối chứng và ghi nhận giá trị MIC Thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Bàng 3.7 Thế tích vi khuấn vàcao chiết đượcnạp vàomỗigiếng.
Vi khuẩn Thể tích vi khuẩn
(pL) Thể tích cao chiết (pL)
3.4.3 Khảo sát khả năng ức chế gốc tựdo DPPH ciía cao chiết trâm mốc
Các chất chống oxy hóa có khả năng trung hòa gốc tự do DPPH thông qua việc cung cấp hydrogen, từ đó làm giảm độ hấp thu ánh sáng tại bước sóng 517 nm Quá trình này khiến màu sắc của dung dịch chuyển dần từ tím sang vàng nhạt, phản ánh hiệu quả của hoạt tính kháng oxy hóa.
Trong quá trình chuẩn bị hóa chất cho thí nghiệm, dung dịch DPPH gốc được pha trong methanol (MetOH) với nồng độ 0,5 mg/mL, sau đó tiếp tục pha loãng 10 lần để đạt nồng độ 50 pg/mL Đồng thời, dung dịch đối chứng Ascorbic acid (vitamin C) cũng được pha trong methanol với nồng độ 2 mg/mL nhằm đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong phân tích khả năng chống oxy hóa.
Trong thí nghiệm này, cao chiết từ cây trâm mốc được sử dụng như một chất kháng oxy hóa nhằm đánh giá đặc tính chống oxy hóa của nó Quá trình chiết xuất được thực hiện bằng cách sử dụng các dung môi như nước, ethanol và diethyl ether, sau đó pha loãng trong DMSO với nồng độ 50 mg/mL để đảm bảo hiệu quả phân tích.
Cách tiến hành: Mầu đối chứng vitamin c đượcchuẩn bị theo các nồngđộ 0, 1,5,
20 (pg/mL) Thành phần các dung dịch trong thí nghiệm được thế hiện trong Bảng 3.8.
Báng3.8 Các nồng độ pha loãngcùamầu đổi chứng Vitamin c.
Thể tích DPPH 50 ụg/mL (ụL) 800
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Mối tương quan giữa mật độ quang và mật độ vi khuẩn
Để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Trâm mốc, các thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và khuếch tán đĩa thạch đã được tiến hành Theo tiêu chuẩn thử nghiệm, mật độ vi khuẩn cần thiết cho thí nghiệm MIC là khoảng 10⁶ CFU/mL, trong khi thí nghiệm khuếch tán đĩa thạch yêu cầu mật độ khoảng 10⁸ CFU/mL Đối với chủng S aureus, mật độ 5 × 10⁶ CFU/mL tương ứng với độ đục OD₆₀₀nm = 0,0006, cho thấy điều kiện phù hợp để thực hiện thí nghiệm MIC Sau 3 giờ nuôi cấy, độ đục OD₆₀₀nm đạt 0,2, tương ứng với mật độ vi khuẩn 1,0 × 10⁸ CFU/mL, đáp ứng yêu cầu cho thí nghiệm khuếch tán trên môi trường thạch.
Mật độ tếbào củas aureus (CFU/tnL) (B)
Hình 4.1 Đường cong tăngtrườngtheo mậtđộ quang (A) và mật độ vikhuân s aureus (B).
Biểu đồ đường cong tăng trưởng của chủng vi khuẩn P aeruginosa cho thấy tại giá trị mật độ quang OD là 0,0006, mật độ vi khuẩn đạt 5 × 10⁶ CFU/mL, phù hợp để tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Sau 4,2 giờ nuôi cấy, mật độ vi khuẩn tăng lên 1,5 × 10⁸ CFU/mL tương ứng với mật độ quang 0,06, cho thấy điều kiện này thích hợp để thực hiện thí nghiệm khuếch tán trên môi trường thạch Đây là những thông số quan trọng trong nghiên cứu sinh trưởng của chủng P aeruginosa.
Mậtđộ tế bào củap aeruginosa (CFU/tnL) (B)
Hình 4.2 Đường congtăng trường theo mật độ quang (A) vàmật độ vi khuân p aeruginosa
Tiếp theo, tại giá trị ODóoonm là 0,0006, mậtđộ vi khuẩn B cereusđạt được là 5 X
106 CFƯ/mL Ket quả cho thấy, tại mật độ quang 0,0006 là phù hợp đế tiến hành thí nghiệm MIC Bên cạnh đó, sau 7 giờ nuôi cấy, mật độ vi khuẩn đạt được 1,0 X 108CFU/mL tương đương với mật độ quang là 0,08 Do đó, đế tiến hành thí nghiệm khuếch tán môi trường thạch, độ đục của vi khuan B cereus phải đạt 0,08 (Hình 4.3).
Mật độ tế bào củaB cereus (CFU/mL) (B)
Mật độ quang có vai trò quan trọng trong việc xác định điều kiện tối ưu cho các thí nghiệm vi sinh Đối với vi khuẩn Escherichia coli, mật độ vi khuẩn đạt 5 × 10⁶ CFU/mL tại giá trị OD₆₀₀nm tương đương mật độ quang 0,0006, cho thấy đây là mức phù hợp để tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Ngoài ra, sau 3 giờ nuôi cấy ở mật độ quang 0,08, mật độ vi khuẩn đạt 1,5 × 10⁸ CFU/mL, chứng minh rằng mức này thích hợp để thực hiện thí nghiệm khuếch tán trên môi trường thạch.
Khả năng kháng khuẩn cua cao chiết trâm mốc
Hình4.4 Đường cong tăngtrường theo mật độ quang(A) và mật độ vi khuân E coli(B).
Dựa trên kết quả nghiên cứu, tại giá trị OD 600 nm tương ứng với mật độ quang 0,0006, cả bốn chủng vi khuẩn đều đạt mật độ 5 × 10⁶ CFU/mL, phù hợp với tiêu chuẩn thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Tuy nhiên, do đặc điểm sinh trưởng khác nhau của từng chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn tại các thời điểm thu mẫu cũng biến đổi, và chỉ khi đạt đến 1,5 × 10⁸ CFU/mL mới đảm bảo yêu cầu cho thí nghiệm khuếch tán trên môi trường thạch.
4.2 Khả năng kháng khuẩn ciia cao chiết trâm mốc
4.2.1 Phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch
Hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết từ cây trâm mốc, bao gồm chiết nước (10W), ethanol (10E) và diethyl ether (10D) ở nồng độ 50 mg/mL, đã được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch Thí nghiệm sử dụng bốn chủng vi khuẩn gây bệnh: hai chủng gram dương (Bacillus cereus và Staphylococcus aureus) và hai chủng gram âm (Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli) Hiệu quả kháng khuẩn được xác định thông qua đường kính vòng kháng khuẩn trên đĩa petri, với đường kính càng lớn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn càng mạnh Kết quả khảo sát được trình bày chi tiết trong Bảng 4.1.
Bàng 4.1 Đườngkính vòng khảng bắn chùng vi khuẩn cùa ba cao chiết trâm mốc.
Chủngvỉ khuẩn Cao chiết trâm mốc Đường kính vòng khuẩn ± SD
Kết quả khảo sát trong Bảng 4.1 cho thấy cao chiết 10D có hoạt tính kháng khuẩn vượt trội so với hai cao chiết còn lại, với khả năng kháng hiệu quả đối với cả bốn chủng vi khuẩn gồm S aureus, P aeruginosa, B cereus và E coli Đặc biệt, cao chiết 10D tạo vòng kháng khuẩn có đường kính trung bình lớn nhất là 21,3 ± 4 mm đối với S aureus, cho thấy hiệu quả kháng khuẩn mạnh mẽ và tiềm năng ứng dụng cao trong nghiên cứu và phát triển sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên.
Hình 4.5 Vòng khảng khuân cùa cao chiết 10D lên bốn chúng vi khuẩn SA - s aureus, PA - p. aeruginosa, BC - B cereus và EC - E coli.
Khác với cao chiết 10D, các mẫu cao chiết 10W và 10E cho thấy hiệu quả kháng khuẩn thấp trên cả bốn chủng vi khuẩn được thử nghiệm Đặc biệt, cao chiết 10E gần như không tạo vòng kháng khuẩn đối với vi khuẩn B cereus, chứng tỏ không có khả năng kháng lại chủng này Tuy nhiên, cao chiết 10E lại thể hiện khả năng kháng khuẩn tốt đối với vi khuẩn P aeruginosa với đường kính vòng kháng trung bình đạt 7,5 ± 3,5 mm, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong kiểm soát vi khuẩn gây bệnh.
Hình 4.6 Vòng khảng khuân của cao chiêt 10E lên các chùng vi khuân SA - s aureus, PA - p. aeruginosa, BC - B cereus và EC — E Coli.
Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết 10W có vòng kháng trung bình dao động từ 2,5 ± 0,7 mm đối với chủng B cereus đến 10 ± 1,4 mm đối với chủng P aeruginosa Điều này cho thấy rằng, mặc dù cao chiết 10OE và 10W không có khả năng kháng khuẩn mạnh như cao chiết 10D, nhưng vẫn thể hiện hiệu quả kháng tốt đối với chủng P aeruginosa, trong khi khả năng kháng đối với chủng B cereus lại yếu hơn.
Hình 4.7 Vòngkháng khuân củacao chiết low lên các chủng vi khuẩn SA - s aureus, PA - p. aeruginosa, BC - B cereus và EC — E Coli.
Mẫu đối chứng dương sử dụng kháng sinh Kanamycin với nồng độ 10 pg/mL đã tạo ra các vòng kháng khuẩn rõ rệt trên bốn chủng vi khuẩn PA, BC, SA và EC, với kích thước lần lượt là 12 mm, 9 mm, 28 mm và 27 mm, minh chứng hiệu quả kháng khuẩn mạnh mẽ của Kanamycin như thể hiện trong Hình 4.8.
Hình 4.8 Vòng kháng khuân cùamầu đốichứng dươngKanamycin trên SA - s aureus, PA - p aeruginosa, BC-B cereus và EC -E Coli.
Nghiên cứu cho thấy cao chiết diethyl ether từ trâm mốc (mẫu 10D) có hoạt tính kháng khuẩn vượt trội so với các mẫu khác Vì vậy, mẫu 10D được tiếp tục thử nghiệm ở hai nồng độ 10 mg/mL và 2 mg/mL trên bốn chủng vi khuẩn gồm S aureus (SA), B cereus (BC), P aeruginosa (PA) và E coli (EC) Kết quả về đường kính vòng kháng khuẩn của mẫu 10D ở hai nồng độ này được trình bày chi tiết trong Bảng 4.2.
Báng4.2 Đườngkỉnh vòng khángcủa các nồngđộ cao 10D trênbốn chùng vikhuấn.
Chủng vi khuẩn Nồng độ cao 10D
(mg/mL) Đường kính vòng kháng
Cao chiết 10D ở nồng độ 10 mg/mL vẫn thể hiện khả năng kháng khuẩn thông qua vòng kháng, tuy nhiên đường kính vòng kháng nhỏ hơn so với nồng độ 50 mg/mL Kích thước vòng kháng của cao chiết 10D trên bốn chủng vi khuẩn SA, PA, BC và EC lần lượt là 13 mm, 20 mm, 12 mm và 9 mm, cho thấy hiệu quả kháng khuẩn khác nhau tùy theo từng loại vi khuẩn.
4.9A) ờ nồng độ 2 mg/mL, vòng kháng của cao chiết 10D thể hiện rõ trên chùng PA với kích thước vòng là 10 mm Các vòng kháng trên ba chủng SA, BC, EC khá thấp có các kích thước lần lượt là 4, 4, 2 mm (Hình 4.9B).
Hình 4.9 Vòng kháng khuân cùacao chiết 1OD ớcác nôngđộ A 10 mg/tnL vàB 2mg/nìL lên bốn chúng vi khuân SA - s aureus,PA - p aeruginosa, BC - B cereus và EC.- E coli.
Theo kết quả khảo sát, cao chiết 10D thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vượt trội so với cao chiết 10E và 1ow Dựa trên phương pháp khuếch tán môi trường thạch – nền tảng cho xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), cao chiết 10D được lựa chọn để tiến hành xác định MIC của cao chiết trâm mốc, khẳng định tiềm năng ứng dụng trong nghiên cứu kháng khuẩn.
4.2.2 Phương pháp pha loãng cao chiết 10D xác địnhMIC
Cao chiết trâm mốc từ diethyl ether (10D) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vượt trội so với hai cao chiết khác, do đó được lựa chọn tiếp tục nghiên cứu trong phương pháp này Kết quả kháng khuẩn của cao chiết 10D được minh họa rõ ràng trong Hình 4.10.
B - mg/mL mg/mLmg/mL S1 £ I |(Ệ lỆỊlễc 0 s aureus
B mg/m mg/mL mg/mL c 1.0 0,5 0,25
B mg/mL mg/mL mg/mL P1
_ _ „ 0,2 0,1 0,05 p aeruginosa B mg/mL mg/mL mg/mL
Cao chiết 10D thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn s aureus ở các nồng độ 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL và 0,625 mg/mL, được xác định qua màu xanh tương ứng với giếng nền Khi pha loãng xuống các nồng độ thấp hơn như 0,6 mg/mL, 0,3 mg/mL và 0,15 mg/mL, chỉ ở mức 0,6 mg/mL cao chiết vẫn duy trì hiệu quả kháng khuẩn, trong khi ở 0,3 mg/mL và 0,15 mg/mL không còn khả năng ức chế, thể hiện qua màu hồng của đối chứng âm Thử nghiệm thêm ở nồng độ 0,4 mg/mL và 0,5 mg/mL cũng cho thấy không có hiệu quả kháng khuẩn Do đó, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết 10D đối với s aureus được xác định là 0,6 mg/mL.
Cao chiết 10D cho thấy khả năng ức chế mạnh đối với vi khuẩn E coli tại các nồng độ từ 2,5 mg/mL đến 0,5 mg/mL ở strip El và E2 Tại strip E3, khi được pha loãng xuống 0,4 mg/mL, cao chiết vẫn duy trì hiệu quả kháng khuẩn, tuy nhiên ở nồng độ 0,3 mg/mL thì không còn khả năng ức chế sự phát triển của E coli Vì vậy, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết 10D đối với E coli được xác định là 0,4 mg/mL.
Cao chiết 10D cho thấy khả năng ức chế hoàn toàn vi khuẩn P aeruginosa khi được sử dụng ở các nồng độ 1 mg/mL, 0,5 mg/mL và 0,25 mg/mL trên strip Pl, chứng minh hiệu quả kháng khuẩn mạnh mẽ của hợp chất này (Hình 4.10C).
Cao chiết 10D thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn P aeruginosa ở nồng độ 0,2 mg/mL, trong khi tại nồng độ 0,1 mg/mL xuất hiện màu tím hồng cho thấy vi khuẩn không bị ức chế hoàn toàn Các thử nghiệm tiếp theo ở nồng độ 0,12 và 0,15 mg/mL cũng không ghi nhận hiệu quả kháng khuẩn rõ rệt Do đó, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết 10D đối với vi khuẩn P aeruginosa được xác định là 0,2 mg/mL.
Khảo sát khả năng ức chế gốc tự do DPPH của cao chiết trâm mốc
Để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, các mẫu cao chiết trâm mốc 10D, 10E và 1ow được pha loãng ở nhiều nồng độ khác nhau trong dung dịch methanol Mẫu đối chứng dương sử dụng là acid ascorbic (vitamin C) với các nồng độ 0; 1; 5; 20 µg/mL Kết quả tỷ lệ ức chế gốc tự do DPPH của các mẫu cao chiết và mẫu đối chứng được thể hiện rõ qua Hình 4.11, cho thấy tiềm năng chống oxy hóa của các mẫu nghiên cứu.
Nồng độ (mg/mL) low o 100
Nong độ (mg/mL) Nòng độ (mg/mL)
Hình 4.11 Khá năng ức chế gốc tự do DPPH của các mầutại nhiều nồng độ A Mầu đổi chứng
Vitamin c, B Mau cao chiết ỉ OE, c Mầu cao chiết low, D Mầu cao chiết 10D.
Kết quả từ Hình 4.11 cho thấy nồng độ pha loãng càng cao thì khả năng ức chế gốc tự do DPPH của các mẫu cao chiết càng mạnh, chứng minh mối quan hệ tỷ lệ thuận giữa nồng độ và hoạt tính kháng oxy hóa Cụ thể, mẫu cao chiết 10E ở nồng độ 0,06 mg/mL và 10W ở nồng độ 0,1 mg/mL đạt hiệu quả ức chế lần lượt là 92% và 95,94%, trong khi mẫu 10D dù ở nồng độ cao hơn (2,5 mg/mL) chỉ đạt mức ức chế 50,4%.
Dựa trên các kết quả nghiên cứu, giá trị IC50 – tức nồng độ mẫu cần thiết để ức chế 50% gốc tự do – được xác định thông qua phương pháp hồi quy tuyến tính với phương trình y = ax + b, trong đó y là phần trăm ức chế và x là nồng độ mẫu Từ phương trình này, giá trị IC50 của các mẫu cao chiết đã được tính toán và trình bày chi tiết trong Bảng 4.3.
Báng 4.3 Giả trịIC50của các mầucao chiết.
Mầu cao chiết ICso(mg/mL)
Theo dữ liệu từ Bảng 4.3, cao chiết 10E thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50 thấp nhất là 0,0325 mg/mL, trong khi cao chiết 10D có giá trị IC50 cao nhất là 2,51 mg/mL So sánh với các mẫu cao chiết khác như 10D và 10W, cao chiết 10E cho thấy hiệu quả vượt trội về khả năng kháng oxy hóa Tuy nhiên, hoạt tính này vẫn yếu hơn so với chất đối chứng Ascorbic acid (IC50 = 9,5859 pg/mL) khoảng 3,4 lần.
4.3 Định tính các hợp chất có trong trâm mốc
4.3.1 Định tính Phenolic Đe nhận biết sự có mặt của hợp chat Phenolic có trong ba cao chiết 10D, 10E, 10W, các mầu được phản ứng với dung dịch FeCE 0,1% Ketquả cho thấy, so với mầu đối chứng, cao chiết 10D không xuất hiện màu xanh đậm the hiện không có sự hiện diện Phenolic (Hình 4.12B) Trong khi đó, cao chiết 10E và 10W có màu là xanh lá đậm (Hình 4.I2C, D) Sự đoi màu này là do sự hiện diện cùa Phenolic phản ứng với FeCh tạo raphức có màu xanh đậm được thể hiện trong phương trìnhhóahọc sau:
6C6H5OH + FeCl3 -> [Fe(OC6H5)6]3~ + 3cr + 6H+ Định tính Phenolic
Hình 4.12 Định tinh hợp chất Phenoliccùa ba cao chiết trâm mốc A Đối chứng âm B.
Hình 4.12 minh họa rằng cao chiết trâm mốc từ ethanol và nước chứa hợp chất Phenolic, góp phần tạo nên hoạt tính kháng oxy hóa mạnh cho cả hai loại cao chiết 10E và 10W.
Sự hiện diện của Flavonoid trong ba mẫu cao chiết trâm mốc được xác định thông qua phản ứng với dung dịch HCl đậm đặc và bột kẽm kim loại Kết quả cho thấy cao chiết 10W có hiện tượng đổi màu hồng và phát sinh khí gas, chứng tỏ phản ứng khử giữa kim loại kẽm và nhóm carbonyl của hợp chất Flavonoid đã xảy ra Trong khi đó, cao chiết 10D có màu trong suốt và 10E có màu nâu đậm, không thể hiện rõ sự có mặt của Flavonoid Vì vậy, cao chiết 10W được xác định là chứa Flavonoid rõ ràng nhất, đồng thời thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh mẽ.
Hình 4.13 Định tínhhợp chat Flavonoid của bacao chiết trâm mốc A Đoichứngâm, B
Phương pháp nhận biết Saponin trong các mẫu cao chiết được thực hiện đơn giản thông qua việc quan sát độ bền của lớp bọt khí dưới tác động lực học Kết quả thí nghiệm cho thấy cao chiết 10E tạo lớp bọt dày và ổn định trong vòng 10 phút, vượt trội so với mẫu đối chứng, trong khi cao chiết 10W tạo lớp bọt ít hơn, phản ánh sự khác biệt về hàm lượng Saponin giữa các mẫu.
Cao chiết 1 OE thể hiện sự hiện diện rõ ràng nhất của Saponin trong ba loại cao chiết được nghiên cứu, cho thấy tiềm năng ứng dụng cao trong các sản phẩm tạo bọt Ngược lại, lớp bọt của cao chiết 10D lại ít và kém bền, không đáp ứng tốt yêu cầu về độ ổn định trong quá trình sử dụng.
Hình 4.14Định tính hợp chất Saponin cùa ba cao chiết trâm mốc A Đoi chứng âm, B 10D, c 10E, D low.
Thí nghiệm định tính Terpenoid được thực hiện bằng cách pha ba mẫu cao chiết trâm trong chloroform, sau đó thêm vài giọt thuốc thử HCl đậm đặc Kết quả cho thấy cao chiết 10E và 10W có sự thay đổi màu sắc thành nâu và hiện tượng tách lớp, trong khi mẫu 10D không có biến đổi nào Điều này chứng minh rằng Terpenoid hiện diện rõ rệt nhất trong hai mẫu cao chiết 10E và 10W, góp phần xác định thành phần hóa học đặc trưng của chúng.
Hình 4.15 Định tínhhợp chất Terpenoid cùa bacao chiết trâm mốc A Đốichứngảm, B
Qua các thí nghiệm định tính, cao chiết trâm mốc từ nước và ethanol cho thấy phản ứng rõ rệt, chứng minh hoạt tính kháng oxy hóa mạnh của hai loại dung môi này Ngược lại, cao chiết từ diethyl ether gần như không chứa các hợp chất có hoạt tính, dẫn đến khả năng kháng oxy hóa yếu.