Đe tài có sáu nội dung: Xây dựng đường chuẩn tinh bột để đánh giá hoạt tính enzyme; khảo sát ảnh hưởng nồng độ agar và enzyme lên hoạt tính enzyme cố định; khảo sát ảnh hưởng nồng độ nat
Đại cương enzyme
Khái niệm enzyme
Enzyme là các chất xúc tác sinh học chủ yếu có dạng protein, một số ít có bản chất RNA, hiện diện trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học nhất định, đảm bảo các phản ứng này diễn ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ ổn định trong cơ thể sống.
Quá trình trao đổi chất trong cơ thể là tập hợp các phản ứng hóa học phức tạp được enzyme xúc tác kiểm soát chặt chẽ để điều chỉnh các quá trình sinh lý, giúp duy trì sự cân bằng nội môi Nhờ vào sự phối hợp chính xác của các phản ứng này, cơ thể mới có thể tồn tại và phát triển ổn định Các quá trình trao đổi chất liên quan chặt chẽ đến việc tổng hợp năng lượng, xây dựng và sửa chữa các tế bào, đảm bảo hoạt động sống diễn ra hiệu quả Điều này nhấn mạnh vai trò quan trọng của hệ thống trao đổi chất trong duy trì sức khỏe và sự sinh tồn của cơ thể.
Enzyme đóng vai trò là chất xúc tác quan trọng giúp cơ thể người và sinh vật phát triển và sinh trưởng Ngoài ra, enzyme còn giữ vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, y học và nhiều lĩnh vực khác.
1.1.2 Cấu trúc và đặc điểm xúc tác cũa enzyme
1.1.2.1 Cấu trúc enzyme Đại đa so enzyme có bản chất là protein và sự the hiện hoạt tính xúc tác phụ thuộc vào cấu trúc bậc 1, 2, 3 và 4 cùa phân tử protein và trạngthái tự nhiên của chúng
1 http://www.blogsinhhoc.com/2014/06/cac-bac-cau-truc-phan-tu-protein.html.
Cấu trúc bậc 1: là trình tự sắp xếp các gốc amino acid trong chuồi polypeptide, liên kết với nhau bằng liên kết peptide (liên kết cộng hóa trị).
Cấu trúc bậc 2 là sự tương tác không gian giữa các gốc amino acid gần nhau trong chuỗi polypeptide, chủ yếu hình thành qua liên kết hydrogen giữa các liên kết peptide kề nhau, cách nhau những khoảng xác định Do cấu trúc bậc 1 gấp khúc một cách ngẫu nhiên dưới điều kiện sinh học, các gốc R khác nhau tác động lẫn nhau theo nhiều cách, dẫn đến cấu trúc bậc 2 phân thành hai loại chính.
Chương 1 Tống quan tài liệu nhóm: xoắn alpha và lá phiến Phiến gấp nếp p là chuồi polypeptide được gấp nếp nhiềulần và được on địnhnhờcác liên kết hydro.
Cấu trúc bậc 3: là tươngtác không gian giữa các gốc amino acid ở xa nhautrong chuỗi polypeptide, là dạng gấp cuộn lại trong không gian của toàn chuồi polypeptide.
Cấu trúc bậc 4: Là tương tác không gian giữa các chuồi của các phân tử protein gồm hai haynhiều chuồi polypeptide hình cầu.
Cảu trúc bặc 3 cẩu trúc bậc 2
Hình 1.1 Các cấutrúc 1, 2, 3 và 4 của enzyme.
Chương 1 Tống quan tài liệu
1.1.2.2 Đặc điểm xúc tác ciia enzyme
Enzyme có cấu trúc không gian đặc biệt quan trọng đối với hoạt tính xúc tác của nó Trung tâm hoạt động của enzyme là vùng đặc biệt có khả năng gắn kết với cơ chất để thúc đẩy phản ứng chuyển đổi thành sản phẩm Các enzyme có thể có một, hai hoặc nhiều trung tâm hoạt động, gồm các nhóm hóa học và liên kết tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với cơ chất, đóng vai trò chính trong quá trình xúc tác Thành phần cấu tạo của enzyme thường bao gồm các thuật toán amino acid có nhóm hóa học hoạt tính cao như serin (nhóm -OH), cystein (nhóm -SH), glutamic (nhóm -COO), và lysin (nhóm -NH₂), giúp enzyme duy trì chức năng xúc tác hiệu quả.
- NH.V), histidin (có nhóm imidazol+), tryptophan (có nhóm indor), là những nhóm phân cực hoặc ion hóa có khảnăng tạo liên kết hydro hoặc ion với cơchất ’.
Có hai giả thuyết được đưa ra về quan hệ giữatrungtâm hoạt động và cơ chất1:
Giả thuyết thứ nhất: là “Ỏ khóa và chìa khóa” hay (“lock and key”) Của Fisher
E (1890) đề cập đến tác động của enzyme thông qua lý thuyết về tương tác giữa enzyme (E) và cơ chất (S) Theo đó, quá trình gắn kết giữa enzyme và cơ chất tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES), giống như mối quan hệ giữa “chìa khóa” và “ổ khóa” Điều này có nghĩa là enzyme chỉ xúc tác cho một loại cơ chất nhất định, phản ánh tính đặc hiệu tuyệt đối của enzyme Tuy nhiên, thuyết này không giải thích được tính đặc hiệu tương đối của enzyme.
Mô hình cảm ứng không gian (induced fit model) của Koshland D (1958) giải thích tính đặc hiệu tương đối của enzyme bằng cách nhấn mạnh rằng trung tâm hoạt động của enzyme có tính mềm dẻo và linh hoạt, có khả năng biến đổi cấu hình không gian trong quá trình tương tác với cơ chất Thuyết này cho rằng enzyme điều chỉnh cấu hình của mình phù hợp với cấu hình không gian của cơ chất, từ đó hình thành phức hợp enzym-cơ chất (ES).
Chương 1 Tống quan tài liệu
Hình 1.2 Mô hình Fisher(a) và mô hình Koshland (b)1
Theo hiệp hội hóa sinh quốc tế (IUB) đà phân enzyme thành 6 lóp sau 1 http://kkhtn.duytan.edu.vn/Home/ArticleDetail/vn/92/1848/phan-loai-enzyme:
Oxydoreductase là loại enzyme xúc tác cho các phản ứng oxy hoá - khử, tham gia vào quá trình vận chuyển hydro và electron Các phản ứng này còn liên quan đến quá trình oxy hóa bởi oxy phân tử, peroxythydro hoặc các chất oxy hóa khác, giúp duy trì quá trình sinh học của tế bào.
Phản ứng xúc tác có dạng: AH? + B —> A + BH2.
Transferase', các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển vị Nghĩa là các phản ứng vận chuyển một nhómnào đó từ chất này sang chất khác.
Phản ứng xúc tác có dạng: AB + CD AC + BD.
Hydrolase là nhóm enzyme chịu trách nhiệm xúc tác các phản ứng thủy phân trong quá trình trao đổi chất, đặc biệt là phân hủy ester, glucoside, amid, peptide và protein Các enzyme thủy phân này đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và chuyển hóa sinh học, giúp phân giải các hợp chất phức tạp thành dạng đơn giản hơn để cơ thể dễ hấp thụ và sử dụng Hiểu rõ về hydrolase góp phần nâng cao kiến thức về các phản ứng sinh hóa cần thiết cho hoạt động sống của hệ sinh thái.
Phản ứng xỳc tỏc cú dạng: AB + H2O ô AOH +BH.
Lyase là các enzyme xúc tác cho các phản ứng phân cắt một nhóm chức khỏi hợp chất mà không cần nước, tức là không xảy ra quá trình thủy phân Trong nhóm enzyme lyase bao gồm các enzyme như aldolase, dehydratase và decarboxylase, đóng vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa sinh học.
Phản ứng xúc tác có dạng: AB A + B.
Phân loại enzyme
Theo hiệp hội hóa sinh quốc tế (IUB) đà phân enzyme thành 6 lóp sau 1 http://kkhtn.duytan.edu.vn/Home/ArticleDetail/vn/92/1848/phan-loai-enzyme:
Oxydoreductase là loại enzyme chuyên xúc tác các phản ứng oxy hóa - khử, đóng vai trò cốt lõi trong quá trình vận chuyển hydro và electron Các phản ứng do enzyme này thúc đẩy gồm sự oxy hóa bởi oxy phân tử, peroxythydro, hoặc các chất oxy hóa khác Nhờ hoạt động của Oxydoreductase, các phản ứng sinh hóa quan trọng trong cơ thể diễn ra một cách hiệu quả và liên tục.
Phản ứng xúc tác có dạng: AH? + B —> A + BH2.
Transferase', các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển vị Nghĩa là các phản ứng vận chuyển một nhómnào đó từ chất này sang chất khác.
Phản ứng xúc tác có dạng: AB + CD AC + BD.
Hydrolase là nhóm enzyme tham gia xúc tác cho các phản ứng thủy phân, giúp phân giải các phân tử lớn thành các hợp chất nhỏ hơn Các enzyme thủy phân trong nhóm này bao gồm enzyme thủy phân este, glucoside, amid, peptide, và protein, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và chuyển hóa sinh học.
Phản ứng xỳc tỏc cú dạng: AB + H2O ô AOH +BH.
Lyase là các enzyme xúc tác cho các phản ứng phân cắt một nhóm nhất định khỏi hợp chất mà không cần sự tham gia của nước, tức là quá trình này không xảy ra thủy phân Các enzyme thuộc nhóm lyase bao gồm aldolase, dehydratase và decarboxylase, đóng vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa sinh học.
Phản ứng xúc tác có dạng: AB A + B.
Chương 1 Tống quan tài liệu
Isomerase là các enzyme chuyên xúc tác cho các phản ứng chuyển đổi giữa hai dạng đồng phân của một chất, như đồng phân quang học L và D hoặc đồng phân hình học cis và trans Ngoài ra, isomerase còn giúp chuyển đổi các dạng cấu trúc như từ dạng aldo sang dạng ceto Những enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa sinh học, đảm bảo sự linh hoạt và điều chỉnh các dạng isomer khác nhau của hợp chất trong cơ thể Tìm hiểu về isomerase giúp mở rộng kiến thức về enzyme và cơ chế chuyển hóa trong sinh học.
Phản ứng xỳc tỏc cú dạng: ABC ô ACB.
Ligase (synthetase): là các enzyme xúc tác cho các phản ứngtồng hợp sửdụng liên kết giàu năng lượng ATP, đe giải phóng AMP hoặc ADP.
Phản ứng xúc tác có dạng: A + B —> AB.
Các ứng dụng của enzyme
Hiện nay, sản xuất các loại chế phẩm enzyme đã trở thành một lĩnh vực phát triển mạnh mẽ trong ngành công nghiệp tại Việt Nam Các enzyme phổ biến như amylase, protease, lipase, catalase, glucose oxidase và cellulase đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khác nhau, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất và đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường.
Trong ứng dụng hóa học, enzyme có tính cảm ứng cao với nhiệt độ, độ pH và các biến đổi của môi trường, ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của chúng Hiện nay, các ứng dụng chế phẩm enzyme đang được chú ý đặc biệt nhờ vào việc sử dụng các chất mang để gắn enzyme nhằm tối ưu hóa quá trình xúc tác phản ứng hóa học.
Trong ứng dụng y học, enzyme thường được sử dụng để định lượng và định tính các chất trong phòng thí nghiệm Hiện nay, enzyme còn được dùng để chuẩn đoán và phân tích nồng độ các hợp chất, nhờ sự hỗ trợ của thuốc thử enzyme đã được đánh dấu Các enzyme còn đóng vai trò quan trọng trong điều trị bệnh tắc nghẽn tim mạch, giúp làm thông đường hô hấp, chống viêm, và là thành phần trong các loại thuốc dùng trong da và mỹ phẩm.
Trong ứng dụng công nghiệp, enzyme được sử dụng để biến đổi các sản phẩm thực phẩm như thịt, sữa, bánh mì, bánh kẹo nhằm nâng cao chất lượng và hiệu quả sản xuất Ngoài ra, enzyme còn đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp rượu bia, phương pháp và mỹ phẩm, cũng như trong các quy trình sản xuất dệt và thuộc da, giúp tối ưu hóa quy trình và giảm thiểu tiêu hao nguyên liệu.
Đại cương về enzyme a - amylase
Khái niệm
a - amylase là enzyme thuộc nhóm amylase được dùng phổ biến để thủy phân hay xúc tác cho cácphản ứng phân giải liên kết nội phân tử của polysaccharide3.
Chương 1 Tống quan tài liệu
Enzyme amylase thủy phân tinh bột và glycogen thành glucose, maltose, và dextrin Quá trình phản ứng là RR + H -OH → RH + R OH Amylase thường có nhiều trong tuyến nước bọt và dịch tiêu hóa của người và động vật, cùng có trong nấm men, vi khuẩn, và trong hạt nảy mầm Các enzym này giúp chuyển đổi các polysaccharide thành các đường đơn dễ tiêu hóa hơn, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa carbohydrate.
Phân loại enzym a - amylase
Hiện nay người ta phân enzyme amylase làm 6 loại chia thành 2 nhóm chínhlà 3:
Endoamyỉase là enzyme nội bào gồm các loại như amylase và nhóm enzyme khử nhánh bao gồm pullulanase (hoặc a-dextrin 6-glucosidase) và các enzyme khử nhánh gián tiếp như transglucosilase (hoặc oligo-1,6-glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase Các enzyme này có khả năng thủy phân các liên kết bên trong chuỗi polysaccharide, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân giải tinh bột và carbohydrate trong tế bào.
Exoamylase (enzyme ngoại bào) gồm: p - amylase và Y-amylase, đâylà những enzyme thủy phân tinh bột từ đầukhông khử của chuỗi polysaccharid.
(enzyme nội bào) m ngoại bào)
Enzyme khử a-amylase p- amylase nhánh
Hình 1.3 Sơ đồ phân loại enzyme amylase 3.
Chương 1 Tống quan tài liệu
Các ứng dụng của enzyme a - amylase
Amylase đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong ngành y dược để chế tạo thuốc điều trị bệnh và dịch tiêm truyền Trong công nghiệp thực phẩm, enzyme này được sử dụng phổ biến để sản xuất các sản phẩm quen thuộc như bánh mì, glucose, rượu, bia, bánh kẹo và siro Ngoài ra, amylase còn đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp dệt, giúp rũ hồ vải trước khi tẩy trắng hoặc nhuộm, làm vải mềm, dễ tẩy trắng và bắt màu tốt hơn.
1.2.4 Tình hình nghiên cứu ve enzyme a - amylase cố định
1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 2007, Huỳnh Ngọc Oanh và cộng sự đã tiến hành khảo sát quá trình cố định enzyme α-amylase (termamyl) trên chất mang CMC/alginate Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt tính của enzyme cố định trên gel CMC/alginate đạt đỉnh tại nồng độ alginate 0,75% và nồng độ CaCl₂ 6%, mở ra tiềm năng ứng dụng trong các quy trình lên men và công nghiệp enzym.
Năm 2014, Dương Thị Ngọc Hạnh và cộng sự đã nghiên cứu về quá trình thủy phân tinh bột từ gạo huyết rồng bằng enzyme α-amylase Kết quả cho thấy, điều kiện tối ưu để thủy phân tinh bột bằng enzyme α-amylase là ở nhiệt độ 90°C, với thời gian lên men tối ưu khoảng 41,44 phút và nồng độ enzyme α-amylase là 0,18% Các kết quả này góp phần cải thiện hiệu quả thủy phân tinh bột từ gạo huyết rồng, ứng dụng trong lĩnh vực chế biến thực phẩm công nghệ cao.
1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Năm 2012, Sachin và Sandeep đã công bố dự án tối ưu hóa quá trình cố định enzyme alpha-amylase trong gel alginate Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ natri-alginate 3% (w/v), canxi clorua 1 M và thời gian lưu hóa 2 giờ mang lại hiệu suất cố định enzyme đạt 90% Hoạt tính của alpha-amylase cố định bị ảnh hưởng bởi kích thước hạt, trong đó hạt có kích thước 2,4 mm cho hiệu quả thủy phân tinh bột cao nhất Sau 10 chu kỳ sử dụng, enzyme vẫn giữ lại khoảng 35% hoạt tính, thể hiện khả năng tái sử dụng hiệu quả trong các phản ứng thủy phân tinh bột kéo dài 30 phút.
Chương 1 Tống quan tài liệu
Năm 2015, Aliya và cộng sự công bố dự án cố định enzyme alpha-amylase từ chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis AR-1 bằng gel calcium-alginate, giúp enzyme hoạt động ổn định và giảm chi phí sản xuất trong công nghiệp Nghiên cứu cho thấy, sau khi được cố định, thời gian phản ứng giữa enzyme và cơ chất tăng tối đa thêm 5 phút mà không làm thay đổi độ pH so với enzyme tự do Công nghệ cố định enzyme này còn cho phép tái sử dụng tối đa trong bốn chu kỳ lặp lại, nâng cao hiệu quả và tính kinh tế của quá trình sản xuất enzyme.
Năm 2011, Om Prakash và Nivedita Jaiswal đã nghiên cứu về việc cố định a-amylase chiết xuất từ đậu trên hai chất mang là agar và agarose Kết quả nghiên cứu này đã được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp nhờ khả năng tái sử dụng enzyme lên đến 5 chu kỳ với chi phí tách chiết và cố định enzyme thấp Quá trình cố định a-amylase giúp nâng cao hiệu quả tẩy rửa, loại bỏ các vết bẩn từ tinh bột trên quần áo Ngoài ra, enzyme cố định này còn có tiềm năng trong việc ứng dụng như một chất tẩy rửa và phụ gia trong ngành công nghiệp.
Chương 2 Tống quan tài liệu
CHƯƠNG 2 NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1 Noithực hiện Đe tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh hóa - Sinh dược- Ký sinh trùng, thuộcKhoa Côngnghệ Sinh học, TrườngĐại học Nguyền TấtThành.
- Xây dựng đường chuẩn tinh bột để đánh giá hoạt tính enzyme.
- Khảo sát ảnh hưởng nong độ agar vàenzyme lên hoạt tính enzyme cố định
- Khảo sát ảnh hưởng nồng độ natri - alginate, CaCb và enzyme lên hoạt tính enzyme cố định.
- Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme co định trên agar và canxi- alginate.
- So sánh hoạttính enzyme cốđịnh trên agar, canxi - alginate và enzyme tựdo.
Enzyme A - amylase do chủng vi khuẩn Aspergillus sp sản xuất có khả năng phân giải tinh bột thành glucose và maltose, giúp quá trình tiêu hóa hiệu quả hơn Đây là một loại endoamylase có khả năng thủy phân nhanh các liên kết α-1,4-glucosid trong tinh bột, giúp tăng hiệu suất giải phóng các dưỡng chất cần thiết Sản phẩm LEAFFAA, do công ty TNHH thương mại nông sản và hóa chất Phương Trâm phân phối, có địa chỉ tại 364/37 Thoại Ngọc Hầu, phường Phú Thạnh, quận Tân Phú, TP HCM.
2.3 Dụng cụ,hóa chất, thiếtbị
Hình 2.1 Khuôn lego tạo hạt
Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Chai nuôicấy mô loại nhỏ
- Máy do OD (ƯV -VIS)
Lò vi sóng Máyđo pH
A Cân phân tích B Máy đo OD
Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu c Be ủ nhiệt D Máy đo pH
Hình 2.2 Một số thiết bị dùng trongphòng thí nghiệm
2.4.1 Phương pháp cố định enzyme bang agar
Chuẩn bị hợp chất agar với nồng độ từ 1% đến 5%, đun nóng đến 100°C để hòa tan hoàn toàn, sau đó để nguội và giữ ở 60°C trong môi trường ủ nhiệt Thêm enzyme α-amylase vào hợp chất theo nồng độ phù hợp, khuấy đều để enzyme phân bố đồng đều Tiến hành dùng micropipette lấy dịch chiết vào khuôn tạo hạt có kích thước 4 mm x 2 mm, đế nguội để hạt đông đặc Rửa hạt nhiều lần bằng dung dịch đệm acetate pH 5,8 và bảo quản trong dung dịch này ở 4°C để sử dụng cho các thí nghiệm đánh giá hoạt tính enzyme.
2.4.2 Phương pháp cố định enzyme bang calcium alginate
Ngày tiến hành pha hỗn hợp natri-alginate 10 ml ở các nồng độ 1%, 2%, 3%, 4%, 5% và khuấy đều để hỗn hợp tan hết Sau đó, bổ sung enzyme amylase theo điều kiện thí nghiệm, khuấy kỹ để enzyme phân bố đều trong hỗn hợp Dùng micropipette hút dịch vào khuôn tạo hạt lego (đường kính 4 mm, cao 2 mm) để hình thành các hạt nhỏ Tiếp theo, bổ sung dung dịch CaCl₂ (theo nồng độ phù hợp) để tự tạo hạt trong vòng 2 giờ Hạt sau đó được thu, rửa sạch và bảo quản trong dung dịch đệm acetate pH 5,8 ở 4°C để chuẩn bị cho các thí nghiệm đánh giá hoạt tính enzyme amylase.
Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase
Amylase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành các loại đường đơn, đường đôi hoặc dextrin có phân tử lượng lớn Phương pháp HeinKel được dùng để định lượng lượng tinh bột đã bị thủy phân, từ đó xác định hoạt độ của enzyme amylase Đơn vị hoạt độ (U) của amylase đo lượng enzyme (pg) có khả năng phân giải 1 mg tinh bột trong 15 phút ở nhiệt độ và pH chuẩn (pH= 5,8).
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng để xác định hoạtđộ củaenzyme cố định và enzymetự do
2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu
Agar 1 - 5% Alginate 1 - 4% Enzyme tự do Mẩu ĐC
Tinh bột 4%/đệm acetate (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2 Đệm acetate (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3
Enzyme cố định (mL) 5 hạt có khối lượng tương đương 0,17 g
10 hạt cỏ khối lượng tương đương 0,17 g
Lượng enzyme tương đương trong 5 hạt agar hoặc
5 hạt agar hoặc 10 hạt alginate không có enzyme khối lượng tương đương 0,17 g ủ ờ nhiệt độ phòng trong 15 phút sau đó hút ra 0,2 mL sang effendorf mới
Hút 0,1 mL từ các ồng sang efendorf mới
2.4.4.1 Xử lý số liệu bằng công cụ ANOVA trong Excelvà phần men SAS 9.1.
Phương pháp phân tích phương sai ANOVA được dùng để thống kê các giá trị trung bình ODó20 và các sai số củahoạttínhcùa enzyme a- amylase.
Phan mem ANOVA trong SAS 9.1 giúp phân tích thong kê và phân hạng về hoạt độ thúy phân tinh bột của enzymea - amylase.
Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.4.4.2 Định lượnghoạt tính enzyme a- amylase
Tính hiệu số giữa giá trị OD của mầu đối chứng và các mầu enzyme:
AOD()20nm ODđỐi chứng 620nm — ODenzyme 620nm
Giá trị AOD được tính là giá trị OD tương ứng với lượng tinh bột đã bị thủy phân bởi enzyme a-amylase Sử dụng giá trị AOD này trong phương trình đường chuẩn để xác định lượng tinh bột bị tiêu biến sau 15 phút phản ứng tại pH 5,8 Đơn vị hoạt độ của enzyme a-amylase được xác định theo công thức: u (ng/mg) = —-.
Lượng tinh bột bị thủy phân (mg)
2.4.5 Phương pháp xây dựng đường chuẩn tinh bột Đe xác định hoạt độ amylase theo phương pháp HeinKel cần xác định đường chuẩn từ dung dịchtịnhbột 2 % Từ dung dịch này, tiến hành xây dựng đường chuẩn từ các dung dịch chuẩn có chứatinh bột theo nồng độ được trình bày trong Bảng 2.2 Mầu trắng: Cũngchính là mẫu 0, dùng ống 0 để chuẩn máyvề 0.
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng trongcác ống chuẩn xây dựng đường chuẩn ỏng thử nghiệm 0 1 2 3 4 5
Hút0,1 mL từ các ổngsang effendorfmới Đệm acetate (mL) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
Hút0,1 mL từ các ống sang effendorfmới
Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Xây dựng đường chuẩn tinh bột
Hoạt độ của enzyme alpha-amylase cố định và enzyme tự do được xác định thông qua phương trình đường chuẩn tinh bột 2% dạng Y = ax + b Quá trình pha loãng dung dịch tinh bột thành các nồng độ 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8% và 1% dựa trên Bảng 2.1, giúp đánh giá hoạt độ enzyme đồng thời đảm bảo độ chính xác của phản ứng theo bước sóng 620 nm.
2.5.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ agar lên hoạt tính của enzyme cố định
Các hạt agar với nồng độ 1-5% được tạo ra với lượng enzyme cố định ban đầu là 0,5%, nhằm khảo sát hoạt tính enzyme sau khi tạo Quá trình thí nghiệm được lặp lại ba lần để tính toán chỉ số trung bình chính xác Phản ứng thủy phân tinh bột bằng enzyme được thực hiện theo phương pháp mô tả trong Bảng 2.1, đảm bảo độ chính xác và khả năng so sánh kết quả.
Các chỉ tiêu đánh giá:
- Đánhgiá độ cứng, độ bền cơhọc và kết cấucác hạt agarsau khi tạo.
- Khảo sát hoạt tính enzyme a - amylase co định trên các nồng độ từ kết quả đó lựa chọn ra nongđộ agar chohoạt tính enzyme caonhất.
2.5.3 Khảo sát sự ảnh hưởng nồng độ natri - alginate và CaCb lên hoạt tính của enzyme cố định
Chúng tôi tạo các hạt chứa natri-alginate với nồng độ từ 1,0% đến 4,0%, cùng với lượng CaCl₂ trong khoảng 0,5 M đến 2,0 M, nhằm tối ưu hóa quá trình hình thành hạt Lượng enzyme α-amylase được cố định ban đầu là 0,5%, theo các dữ liệu trình bày trong Bảng 2.1 Các yếu tố này ảnh hưởng đến độ ổn định và hiệu quả của quá trình tạo hạt, góp phần nâng cao hiệu suất giải phóng enzyme và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.