Đầu đề khóa luận: Đặc điểm hình thái, phân tử và đặc tính xâm nhiễm, sinh học của tác nhân gây bệnh đốm lá nha đam tại Ninh Thuận.. - Nghiên cứu đặc tính sinh học, con đường xâm nhiễm và
Tình hình sản xuất nha đam trên Thế giới và Việt Nam
Tình hình sản xuất và sử dụng nha đam trên Thế giới
Nha đam, còn gọi là Lô Hội, có tên khoa học là *Aloe vera*, thuộc họ Hành tỏi (Liliaceae) và chi Aloe với khoảng 400 loài khác nhau Trong đó, *Aloe vera* là loại phổ biến nhất nhờ đặc điểm dễ trồng, năng suất cao, lá xanh thẫm, bẹ lá to Cây có thân ngắn, to, thô, lá mọc sát nhau không cuống, dày mẫm, hình tam giác với mép có răng cưa thô cứng, dài từ 30–50 cm Hoa mọc thành cụm dài khoảng 1 mét, ban đầu có màu vàng xanh lục nhạt, mọc thẳng rồi rũ xuống Quả nang hình trứng thuôn, chuyển từ xanh sang nâu khi chín Nha đam có khả năng chịu hạn tốt và có nguồn gốc từ châu Phi.
Nha đam là cây trồng có khả năng thích nghi cao, phát triển tốt trên nhiều loại đất, kể cả đất có độ pH và hàm lượng muối Na+, K+ cao Tuy nhiên, nha đam sinh trưởng nhanh hơn trên đất thịt có độ phì trung bình như đất đen nhiệt đới ở miền Trung Ấn Độ Trên thế giới, nha đam thường được canh tác trên đất mùn pha nước hoặc mùn pha cát có độ tơi xốp vừa phải, không cần cày xới sâu do rễ chỉ ăn sâu khoảng 20–30 cm, nhưng đất phải thoát nước tốt để tránh úng Nha đam sinh sản bằng cách mọc cây con từ đầu mút rễ hoặc thân rễ, phát triển tốt trong điều kiện đất có độ ẩm vừa phải, thường được gieo trồng vào mùa mưa tháng 7–8, và có thể trồng quanh năm nếu đảm bảo tưới tiêu ổn định, trừ mùa đông Loại cây này phản ứng rất tốt với phân hữu cơ như phân chuồng, phân ủ, nên cần bón phân định kỳ 15–20 ngày/lần Sau 18 tháng kể từ khi gieo hạt, nha đam có thể thu hoạch, và ruộng nha đam có thể canh tác liên tục khoảng 5 năm trước khi phải trồng lại Tại Ấn Độ, năng suất nha đam hữu cơ đạt khoảng 12 tấn trọng lượng tươi mỗi hecta.
Nha đam, được biết đến như một loại cây dược liệu quý, đã được con người sử dụng từ khoảng 4000 năm trước với công dụng nhuận tràng Theo thời gian, nha đam ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong y học nhờ vào hàm lượng gel cao trong lá, có khả năng hỗ trợ điều trị hiệu quả các vấn đề như đau và vết thương, ung thư da, bệnh ngoài da, cảm lạnh, ho, táo bón, nhiễm trùng và nấm.
Nha đam là loại cây có khả năng chịu hạn tốt, được trồng phổ biến ở các vùng khí hậu khô nóng như Bắc Mỹ, Caribe, Châu Phi, Nam Á, Đông Nam Á và Australia Từ khoảng 4000 năm trước Công nguyên, người A Rập ở Trung Đông đã biết sử dụng nha đam trong đời sống hàng ngày Sau đó, cây nha đam tiếp tục được du nhập vào nhiều quốc gia như Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia, Mexico và Cuba Hiện nay, Mỹ là quốc gia sản xuất nha đam lớn nhất thế giới với diện tích trồng lên đến 20.000 ha, góp phần quan trọng vào ngành công nghiệp nha đam toàn cầu.
Nha đam, sau khi được chế biến qua quy trình hiện đại tại các nhà máy, trở thành nguyên liệu quý trong ngành thực phẩm và mỹ phẩm Trong đời sống hàng ngày, nha đam mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như giảm đau, kháng viêm, hỗ trợ làm lành vết thương và loại bỏ tế bào chết trên da Ngoài ra, nha đam còn giúp tăng cường chức năng giải độc của gan và thận, ngăn ngừa ung thư và được xem là “thần dược” trong chăm sóc sắc đẹp Một số thành phần trong cây nha đam cũng đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe tổng thể.
1.1.2 Thực trạng trồng và chế biến nha đam ờ Việt Nam ở nước ta, nha dam có thể thấy mọc hoang dại ở tỉnh miền Nam Trung Bộ như Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận và các vùng đất cát ven biến Ngoài ra cũng gặp một số cây lô hội trồng ở miền Bắc, Huế, Quảng Trị có lá ngắn hơn, chưa thấyra hoa, chủ yếu trồng làm cảnh Điều kiện thổ nhưỡng thích hợp cho nha dam là vùng đất cát khô hạn ven biển các tỉnh Nam Trung Bộ, cũng có thể mở rộng trồng trên đất cát và đất đồi núi trọc vùng thấp dọc ven biến các tỉnh Bắc Trung Bộ trở vào Đất trồng có độ pH giao động từ 5 đến 7.5 Thành phần cơ giới nhẹ đến trung bình nhưng phải thoát nước tốt, không bị ngập úng Nha dam có thể trồng bằng hạt, nhưng để dễ trồng và có hiệu quả nhất là sử dụng giống sinh dưỡng Cây 1 năm tuổi trở lên sẽ mọc ra nhiều chồi nhánh từ gốc, trung bình mồi cây có 3 - 4 chồi nhánh, dùng dao sắc cắt
Thực trạng trồng và che biến nha đam ở Việt Nam
Nha đam thường được nhân giống bằng cách sử dụng những chồi mọc sát thân cây mẹ Thời điểm trồng thích hợp là đầu mùa mưa khi đất đã đủ độ ẩm, với mật độ từ 6.700 đến 10.000 cây mỗi hecta, khoảng cách giữa các cây là 1,5 x 1,0 m hoặc 1 x 1 m Mỗi hố trồng nên bón lót từ 1,5 đến 2 kg phân chuồng hoai mục, có thể trộn thêm 1–2% đạm ure để tăng hiệu quả dinh dưỡng Việc sử dụng quá nhiều phân hóa học tuy giúp cây phát triển xanh tốt nhưng lại làm giảm chất lượng sản phẩm Hàng năm, cần tiến hành chăm sóc tổng thể từ 1 đến 2 lần, chủ yếu là vun xới đất quanh gốc để giữ độ tơi xốp và dinh dưỡng cho cây.
Thực trạng trồng nha đam tại tinh Ninh Thuận
Tỉnh Ninh Thuận, được mệnh danh là xứ sở của nắng và gió, sở hữu khí hậu bán khô hạn với nhiệt độ trung bình năm từ 26–27°C và tổng lượng nhiệt lên đến 10.000°C, là điều kiện lý tưởng cho sự phát triển của cây nha đam Nha đam đã được trồng từ lâu tại địa phương, trở thành một trong những sản phẩm nông nghiệp đặc thù bên cạnh nho, táo, tỏi, măng tây và mủ trôm Loại cây này dễ trồng, năng suất cao, đặc biệt hiệu quả ở vùng đất ven biển Năm 2015, diện tích trồng nha đam đạt 387 ha, năng suất cao điểm 39 tấn/ha/tháng, sản lượng 181 tấn/ha/năm, tập trung chủ yếu tại thành phố Phan Rang – Tháp Chàm Tuy nhiên, diện tích trồng biến động từ 200–400 ha mỗi năm, và đến năm 2016 đạt 402 ha với sản lượng 59.791 tấn Hiện nay, do quy hoạch đô thị mở rộng và ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, diện tích trồng nha đam đang thu hẹp, người nông dân gặp nhiều khó khăn do thời tiết thất thường, mưa kéo dài gây úng và bệnh hại Để phát triển bền vững, cần có chính sách hỗ trợ, quy hoạch hợp lý và chuẩn hóa quy trình canh tác.
Bệnh hại trên cây nha đam
Vì cây nha dam được sử dụng phổ biến trong y học và mỳ phẩm nên việc cây nhiễm bệnh từ các yếu tố như nấm và vi khuấn là rất nghiêm trọng Một số tác nhân gây bệnh sản xuất độc tố trong các ký chủ Ví dụ, Fusarium sp sản xuất độc tố nấm
Trichothecenes là một loại độc tố có thể gây ra các bệnh nghiêm trọng như ung thư, xuất huyết, phù nề và suy giảm miễn dịch Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), độc tố nấm mốc là mối đe dọa lớn đối với sức khỏe con người và động vật Chính vì vậy, việc kiểm soát bệnh nấm trên cây nha đam là điều cần thiết để đảm bảo an toàn sinh học và chất lượng sản phẩm Một số bệnh phổ biến hiện nay trên cây nha đam cần được nhận diện và xử lý kịp thời nhằm ngăn ngừa sự lây lan và thiệt hại trong sản xuất nông nghiệp.
Bệnh gỉ sắt (rỉ sét) trên nha đam là một loại bệnh nấm nguy hiểm, gây ra các đốm tròn màu đen hoặc nâu trên lá, ảnh hưởng nghiêm trọng đến giá trị thương mại của cây Nguyên nhân chính là do sự oxy hóa hợp chất phenol trong nhựa cây, khiến các vết gỉ sắt không thể biến mất sau khi xuất hiện Dấu hiệu ban đầu là các đốm vàng nhạt trên mặt trên của lá, sau đó lan rộng và hình thành bào tử nấm màu vàng cam ở mặt dưới, phát triển thành bụi màu đỏ cam Vết bệnh thường tập trung ở mép lá – nơi dễ đọng sương hoặc nước mưa – với phần trung tâm khô, nâu và phần rìa tiếp tục lan rộng Bệnh thường bắt đầu từ lá thấp và lây lan lên trên, do nấm Phakopsora pachyrhizi và Phakopsora meibomiae gây ra Bào tử nấm phát tán qua nước mưa hoặc gió, có thể lây nhiễm sang vùng chưa bị bệnh Điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển là môi trường ẩm kéo dài và nhiệt độ khoảng 15°C.
Nhiệt độ trên 30 °C có thể làm chậm sự phát triển của nấm bệnh, trong khi mức nhiệt khoảng 28 °C vẫn tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lây lan Bào tử nấm thường hình thành sau 10 ngày kể từ khi nhiễm bệnh và bắt đầu phát tán mạnh sau khoảng 3 tuần Quá trình phát tán tiếp tục nếu môi trường đủ độ ẩm và nhiệt độ phù hợp, mức độ nhiễm bệnh phụ thuộc vào tình trạng cây trồng và thời gian phơi nhiễm.
Bệnh mốc muội đen trên cây nha đam là một dạng bệnh thứ cấp, phát sinh từ tác hại của các loại côn trùng tiết mật sương, chất nhầy và các chất ngọt bám trên lá Do đặc tính lá nha đam chứa nhiều chất nhầy và có khả năng bài tiết mật sương, cây dễ bị mốc muội đen tấn công và bao phủ bề mặt ở nhiều mức độ khác nhau Mặc dù bệnh không gây hại trực tiếp đến cây nha đam, nhưng lớp mốc đen che phủ lá sẽ cản trở quá trình quang hợp, ảnh hưởng đến sự phát triển của cây.
Hiện tượng vàng lá ở cây trồng thường bắt nguồn từ các yếu tố gây hại trong môi trường, trong đó mốc muội đen là dấu hiệu rõ ràng cho thấy sự xuất hiện của côn trùng gây hại Do đó, khi phát hiện mốc muội đen, cần ưu tiên tập trung vào việc tiêu diệt các loại côn trùng để ngăn chặn sự lây lan và bảo vệ sức khỏe cây trồng.
Một trong những tác nhân gây hại phổ biến trên cây nha đam là các loại nấm gây thối thân rễ, đặc biệt thường xuất hiện ở những vùng đất ẩm ướt hoặc ngập nước Các loại nấm này thường phát triển trên những lá trưởng thành và già, gây đổi màu vàng nâu và làm rụng lá Theo nghiên cứu của Ayodele, các chủng nấm gây bệnh chủ yếu được phân lập gồm Aspergillus verocosa chiếm 28,03%, Fusarium oxysporum chiếm 24,24% và Plectosphaerella cucumerina chiếm 16,67%.
Thối gốc là bệnh phổ biến và khó tránh trên cây nha đam, thường do thời tiết lạnh và ẩm ướt gây ra Khi bị bệnh, gốc nha đam chuyển sang màu nâu đỏ hoặc đen và bắt đầu thối rữa, đặc biệt từ phần lá gần mặt đất nơi tiếp xúc trực tiếp với đất bùn ẩm Mô bị thối nhũn sẽ đổi màu từ đỏ nâu sang đen, lan dần lên phần ngọn và có thể dẫn đến chết cây Hai loại nấm thường liên quan đến bệnh này là Mammeria ehinobotryoidea (15,91%) và Torula herbarium (15,15%).
Bệnh thối mềm do vi khuẩn thuộc giống Erwinia spp (được đổi tên thành
Bệnh thối nhũn do vi khuẩn Pectobacterium spp thường bắt đầu từ vết thương ở cuống lá gần mặt đất, sau đó lan nhanh lên các phần khác của cây Lá bị nhiễm trở nên mọng nước, mềm nhũn, phần mô bên trong bị phân hủy trong khi lớp biểu bì vẫn còn nguyên Lá cây có thể đột ngột mục rữa, xoắn lại và phát ra mùi thối đặc trưng Dấu hiệu ban đầu là sự héo ở chóp lá thấp, tiếp theo là mềm nhũn tại cuống lá, rồi lan rộng ra toàn bộ cây khiến cây chết chỉ trong vòng 2–3 ngày Trong quá trình thối nhũn, khí được tạo ra làm vỏ lá phồng lên, biến lá thành túi chứa chất nhầy dễ bị vỡ.
Bệnh thán thư trên cây nha đam do nấm Collectotrichum gloeosporioides gây ra, thường phát triển mạnh trong môi trường ẩm ướt, bóng râm và khi tưới phun từ trên xuống Triệu chứng ban đầu là các đốm nhỏ hình bầu dục, màu nâu nhạt, ngâm nước xuất hiện trên lá, sau đó lan rộng và liên kết thành mảng màu nâu đỏ hoặc cam ở tâm vết bệnh Bào tử nấm dễ dàng phát tán qua gió, nước mưa và nước tưới, làm tăng nguy cơ lây lan bệnh trên diện rộng.
Bệnh teo ngọn, khô ngọn lá do nấm Stemphylium botryosum w gây ra là một trong những nguyên nhân khiến cây trồng không phát triển, lá bị khô từ đầu ngọn xuống gốc, dẫn đến cây ngày càng nhỏ lại và có thể chết Khi phát hiện dấu hiệu bệnh, cần nhanh chóng cắt bỏ phần lá bị khô và tiêu hủy để ngăn ngừa lây lan Trường hợp bệnh nặng, nên tiến hành nhổ bỏ toàn bộ cây bị nhiễm để bảo vệ vườn cây khỏe mạnh.
Bệnh đốm lá cây nha đam
Bệnh đốm lá trên cây nha đam là một vấn đề phổ biến, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến tính thẩm mỹ, năng suất và chất lượng sản phẩm, từ đó làm giảm giá trị nguyên liệu nha đam Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu là do các loại nấm như Alternaria alternata, Cercospora sp và Helminthosporium sp Bệnh thường phát sinh trong điều kiện môi trường ẩm ướt, đặc biệt khi lá bị tổn thương do tác động cơ giới hoặc côn trùng Triệu chứng điển hình là các đốm tròn hoặc bầu dục lõm xuống phần thịt lá, ban đầu có màu vàng nâu rồi chuyển sang nâu đậm Khi bệnh phát triển nặng, lá nha đam sẽ bị vàng và khô từ chóp lan dần xuống dưới, dẫn đến hiện tượng khô héo toàn bộ lá.
Bệnh đốm lá trên cây nha đam là một vấn đề nghiêm trọng được ghi nhận tại nhiều quốc gia Năm 2008, Kamalakannan xác định nấm Alternaria alternata là tác nhân gây bệnh với triệu chứng đặc trưng là các đốm nhỏ tròn hoặc oval, màu nâu tối, đường kính khoảng 1,0 mm xuất hiện trên lá, bắt đầu từ đầu lá và lan xuống dưới, làm giảm diện tích quang hợp và ảnh hưởng đến sinh trưởng cũng như năng suất cây nha đam Tại Ấn Độ, nha đam bị nhiễm bệnh đốm lá nghiêm trọng do nấm Cladosporium sphaerospermum và Curvularia lanata gây ra Trong khi đó, nghiên cứu của Alam và cộng sự (2017) tại Pakistan cho thấy nấm Nigrospora oryzae là nguyên nhân gây bệnh đốm lá trên cây nha đam tại khu vực này.
Xác định tác nhân gây bệnh thông qua đặc điếm hình thái
Theo nghiên cứu tại Ấn Độ, lá nha đam khi xuất hiện triệu chứng bất thường thường có các đốm màu nâu sẫm trên mặt lá, đường kính khoảng 1,0 mm, với bào tử màu đen nằm ở trung tâm vết bệnh Mẫu bệnh được thu thập và phân lập trên môi trường thạch khoai tây (PDA), sau 4–5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 2 °C với chu kỳ sáng 12 giờ, nấm phát triển tạo khuẩn ty màu xám có rìa xanh oliu Cuống bào tử có nhánh, thẳng, màu nâu vàng, dài 15 mm và dày từ 2–6 mm Bào tử cũng có màu nâu vàng, chuồi phân nhánh rõ ràng, kích thước dao động từ 22,75 đến 63,7 mm Khuẩn ty có từ 2–3 vách ngăn ngang và một vài vách ngăn dọc, đặc điểm này giúp nhận diện chính xác loại nấm gây bệnh trên nha đam.
Chương 1 Tổng quan tài liệu
Xác định tác nhân gây bệnh thông qua đặc điểm phân tử
Phản ứng PCR
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại giúp khuếch đại nhanh chóng nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần tạo dòng Được Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và hoàn thiện bởi Saiki năm 1988, PCR đã trở thành công cụ thiết yếu trong nghiên cứu di truyền Quá trình thực hiện PCR diễn ra hoàn toàn trong các ống eppendorf và chỉ trong thời gian ngắn, có thể thu nhận số lượng lớn bản sao DNA, đáp ứng hiệu quả cho các ứng dụng trong y học, xét nghiệm và phân tích gen.
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật sinh học phân tử cực kỳ nhạy và quan trọng, được sử dụng rộng rãi để phát hiện các tác nhân gây bệnh thực vật Phương pháp này cho phép khuếch đại hàng triệu bản sao của các trình tự DNA đặc hiệu thông qua hỗn hợp gồm oligonucleotides đặc hiệu, deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) và enzyme DNA polymerase chịu nhiệt trong môi trường đệm phù hợp Các đoạn DNA sau khi khuếch đại có thể được phát hiện bằng phương pháp điện di trên gel agarose nhuộm màu với EtBr, SYBR Green hoặc các phân tử an toàn khác có khả năng xen kẽ vào DNA sợi kép, hoặc thông qua các kỹ thuật đo màu và huỳnh quang.
Việc phát hiện băng ADN đặc hiệu có kích thước phù hợp với dự kiến là dấu hiệu rõ ràng cho thấy sự tồn tại của tác nhân gây bệnh mục tiêu trong mẫu xét nghiệm Nhờ những tiến bộ vượt bậc trong công nghệ PCR, quá trình phân tích này có thể được thực hiện nhanh chóng, chính xác và định lượng hiệu quả thông qua hệ thống tự động, giúp nâng cao độ tin cậy và hiệu suất trong chẩn đoán bệnh.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước 13:
Trong bước biến tính của quy trình PCR, hỗn hợp phản ứng được đun nóng ở nhiệt độ từ 94 đến 95°C trong khoảng 30 giây đến 1 phút, nhằm tách DNA mạch kép thành hai mạch đơn Hai mạch đơn này sẽ đóng vai trò làm khuôn mẫu để tổng hợp các mạch bổ sung mới, đảm bảo quá trình nhân bản DNA diễn ra chính xác và hiệu quả.
Bước 2 của quy trình PCR là giai đoạn bắt cặp, diễn ra ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, thường dao động từ 55 đến 65°C Tại đây, các primer sẽ gắn vào mạch khuôn DNA, tạo điều kiện cho quá trình nhân bản diễn ra chính xác Thời gian bắt cặp phụ thuộc vào Tm của từng loại primer, thường kéo dài từ 30 đến 60 giây để đảm bảo hiệu quả tối ưu.
Ở bước kéo dài trong quy trình PCR, nhiệt độ được nâng lên 72°C nhằm tối ưu hóa hoạt động của enzyme DNA polymerase Tại nhiệt độ này, các nucleotide sẽ được gắn vào đoạn mồi (primer) theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn ban đầu, giúp tổng hợp nên chuỗi DNA mới Thời gian thực hiện bước này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường dao động từ 30 giây đến vài phút.
Mồi - Primer
Để tiến hành nhân bản đoạn DNA bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction), việc sử dụng một cặp mồi đặc hiệu là yếu tố bắt buộc Cặp mồi này bao gồm mồi xuôi (Toward primer) và mồi ngược (Revert primer), giúp định vị chính xác vị trí bắt đầu và kết thúc của đoạn DNA cần khuếch đại, đảm bảo hiệu quả và độ chính xác cao trong quá trình phản ứng PCR.
Vùng trình tự ITS
Vùng spacer được phiên mã nội bộ (ITS) của ribosome RNA là khu vực phổ biến nhất được sử dụng trong thiết kế xét nghiệm chẩn đoán PCR và phân tích phát sinh gen nhờ vào sự bảo tồn cao và biến thể trình tự phù hợp Vùng rRNA bao gồm nhiều bản sao (tối đa 200 bản trên bộ gen đơn bội), được sắp xếp lặp lại với các tiểu đơn vị 18S, 5.8S và 28S, phân tách bởi các vùng ITS1 và ITS2 Các vùng này có đặc điểm bảo tồn cao giúp thiết kế mồi đặc hiệu cho các loài đồng nhất, đồng thời chứa các vùng biến đổi cao cho phép phân biệt ở nhiều mức độ phân loại Vùng ITS hiện diện rộng rãi trong tự nhiên và có mặt ở tất cả sinh vật nhân chuẩn Đặc biệt, số lượng bản sao cao của gen rRNA trong hệ gen nấm giúp tăng độ nhạy của phản ứng PCR, cùng với kho dữ liệu trình tự ribosome phong phú được công bố công khai, hỗ trợ xác nhận và nâng cao độ tin cậy của các thí nghiệm phát hiện.
Phân tích phân tử nấm gây bệnh thực vật truyền thống thường sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng ITS, sau đó tiến hành giải trình tự và tìm kiếm BLAST trên GenBank hoặc các cơ sở dữ liệu khác Tuy nhiên, phương pháp này gặp nhiều thách thức do sự tương đồng cao giữa chuỗi ITS của một số loài, dẫn đến khó khăn trong việc phân biệt ranh giới loài, như trường hợp p Fragariae var Fragariae và p Fragariae var rubi có trình tự ITS giống hệt nhau Dù vậy, phân tích vùng ITS vẫn đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các loài mới, như nghiên cứu của Abad và cộng sự (2008) đã chứng minh vùng ITS của Phytophthora spp có thể được liên kết theo thứ bậc rõ ràng.
Chương 1 Tổng quan tài liệu với bệnh thối gốc từ các quốc gia khác nhau và và tổ chức với các chuỗi trình tự trên ngân hàng gen từ các loài Phytophthora khác và mục đích phân lập loài mới
Phytophthora bỉsheria sp 18 Cũng như Burgess và cs (2009) cũng có một đánh dấu mới và đơn vị phân loại củaPhytophthora từ hệ sinhthái tựnhiên.
I LJ 18SrRNA> - — - r 5.8S rRNA ITS2 Ị 28S rRNA
Hình 1.1 Vùngtrình tự ITS rRNA 19
Điện di
Phương pháp điện di là kỹ thuật thí nghiệm phổ biến trong nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm sinh học của các phân tử mang điện tích như DNA, protein và enzyme DNA là đại phân tử mang điện tích âm, khi đặt trong môi trường có điện trường, các phân tử DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương với tốc độ khác nhau tùy theo kích thước Điện di trên gel agarose là phương pháp kiểm tra DNA bằng cách sử dụng gel agarose với nồng độ từ 0,3% đến 2%, tùy thuộc vào kích thước DNA Với DNA có kích thước nhỏ hơn 1 kb, nồng độ agarose thường dùng là khoảng 1% đến 2%, trong đó các phòng thí nghiệm thường sử dụng nồng độ khoảng 0,7% đến 0,8% để đạt hiệu quả tối ưu.
1.6 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quy luật phát sinh, phát triển của bệnh hại
Trên cây nha dam, nấmAlternaria alternata các triệu chứng bệnh thường xuất hiện vào tháng 2 đen tháng5 khi nhiệt độ giaođộng từ 29-36 °C với độ ẩm tương đối
Tại Pakistan, nấm Alternaria alternata gây bệnh trên cây cà chua bằng cách xâm nhập qua lỗ khí khổng, vết thương hoặc trực tiếp qua biểu bì Bào tử của nấm nảy mầm trong giọt nước sau 1–2 giờ ở nhiệt độ từ 16–34 °C, với nhiệt độ lý tưởng để nấm phát triển là 26–28 °C Ngay từ 13 °C, nấm đã có thể xâm nhập và gây bệnh, và khi nhiệt độ tăng cao, quá trình này diễn ra dễ dàng hơn Trong điều kiện thuận lợi như độ ẩm cao và nhiệt độ phù hợp, thời kỳ tiềm dục của bệnh kéo dài từ 3–4 ngày, sau đó nấm có thể sinh bào tử mới trong vòng 3–4 ngày tiếp theo; thông thường, thời kỳ tiềm dục kéo dài từ 8–10 ngày.
Chương 2 Nội dung và phương phápnghiên cứu
CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Nguyền Tất Thành.
- Nội dung 1: Xác định đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy của tác nhân gây bệnh đốm lá nha dam tại Ninh Thuận.
- Nội dung 2: Xác định con đường xâm nhiễm, lan truyền của tác nhân gây bệnh đốm láthông qua lây nhiễm nhân tạo.
- Nội dung3: Định danh phântử tác nhân gây bệnh.
- Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng lên sự sinh trưởng và phát triển củatác nhân gâybệnh.
+ Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng cùa nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của tác nhângây bệnh.
4 - Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng lên sự sinh trưởng và phát trien cùa tác nhân gây bệnh.
2.3.1 Xác định đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy của tác nhân gây bệnh đốm lá nha dam tại Ninh Thuận
Vật liệu: Mầu bệnh hại có triệu chứng dien hình của bệnh đốm lá thu thập tại 03 phường: Văn Hải, MỹHảivà Mỳ Bình- Tp Phan Rang Tháp Chàm.
2.3.1.1 Mô tả triệu chứng gây bệnh
Trong quá trình khảo sát đồng ruộng tại ba phường Mỹ Bình, Mỹ Hải và Văn Hải, nhóm nghiên cứu đã ghi nhận các triệu chứng điển hình của bệnh do nấm Alternaria alternata gây ra trên cây nha đam Các biểu hiện bao gồm những đốm nhỏ hình tròn hoặc oval, màu nâu tối xuất hiện trên lá, với đường kính trung bình khoảng 1,0 mm Sau khi xác định nghi ngờ cây bị nhiễm bệnh, các mẫu nha đam mang triệu chứng tương tự đã được thu thập tại cả ba phường để phục vụ cho công tác phân tích và kiểm tra bệnh lý.
2.3.1.2 Phương pháp phân lập làm thuần tác nhân gây bệnh
Quá trình phân lập mẫu bệnh bắt đầu bằng việc thu thập và xác định mẫu có dấu hiệu nhiễm bệnh Mẫu sau đó được xử lý bằng cách lau với cồn 70°C để khử trùng, rồi cắt thành các mảnh nhỏ khoảng 1 cm Các mảnh này được đặt vào đĩa petri chứa môi trường WA và ủ trong vòng 7 ngày nhằm thúc đẩy sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh để phục vụ cho các bước phân tích tiếp theo.
Sau 7 ngày nuôi cấy, tiến hành kiểm tra mẫu đà phân lập khi tơ nấm bắt đầu xuất hiện Sau đó, thực hiện cấy chuyền sang môi trường PDA bằng cách dùng dao cắt một phần thạch khoảng 1 cm và đặt lên môi trường PDA mới, ủ trong vòng 4 ngày ở nhiệt độ khoảng 25 °C để đảm bảo quá trình làm thuần đạt hiệu quả cao.
- Dùng dao cắt mầu nha dam thành các mảnh nhỏ (~1 cm) cho vào đìa petri có chứa môi trường Mồi đĩa cấy 1 điếm.
- Saukhi cấyxong đểcác đĩa trong phòng ở nhiệt độ khoảng 25 -30 °C.
- Khi tàn nấm mọc có kích thước khoảng 1 - 2 cm thì tiến hình cấy chuyền sang môi trường PDA.
Môi trường thạch khoaitây (PDA)
Sau khi gọt vỏ và thái nhỏ khoai tây theo lượng cần thiết, tiến hành đun sôi đến khi khoai mềm để thu được dịch chiết Tiếp theo, pha 1000 ml dịch nước khoai tây với 20 đơn vị nguyên liệu theo công thức, đảm bảo quy trình chiết xuất đạt hiệu quả tối ưu.
Chương 2 Nội dung và phương phápnghiên cứu g đường(pH 5.8) và 20 g agar vào Môi trường được đế vào các bình tam giác, lắc đều rồi đem hấp vô trùng trong nồi hấp ở 121 °C, 1.5 atm trong 30 phút, đe môi trường nguội sau đó đem rót vào đìa petri đã được vô trùng.
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi các chỉ tiêu như hình thái học, cấu trúc, bào tử và màu sắc tản nấm và sợi nấm.
2.3.1.3 Quan sát mẫu dưới kính hiển vi
Tác nhân gây bệnh được xác định thông qua các phương pháp cơ bản dựa trên hướng dẫn của Barron (1968) và Domsch (1972), tập trung vào các tiêu chí như đặc điểm hình thái học, cấu trúc vi sinh vật, loại bào tử và màu sắc Việc phân tích các yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện chính xác mầm bệnh, góp phần nâng cao hiệu quả trong công tác phòng ngừa và điều trị.
Hóa chất: Thuốc nhuộm lacto phenol
Vật liệu: Mầu nấm, môi trường PDA.
Dụng cụ: Lam kính, lamen, đĩa petri, giấy thấm, que thủy tinh cố định, dụng cụ saukhi chuẩnbị đemhấp vô trùng.
Tiến hành nuôi cấy mầu nấmtrên lam kính:
Bước 1: Cho giấy thấm vào đìa petri, đặt que thủy tinh cố định lên giấy thấm Bước 2: Nhỏ vài giọt nước cấtvào giấy thấm đề tạo độ ẩm
Bước 3: Đặt lam kính lên que thủy tinh đã cố định, cắt một mầu nhỏ môi trường PDA đặt lên lam kính Sauđó, đậy lamen lại.
Bước 4: cấybào tử nấm lên 4 gốc của môi trường PDA và đậy nấm đìa petri lại, để ở nhiệt độ phòngtrong4 ngày.
Sau 4 ngày bào tử phát triến đều trên lam kính, tiến hành nhuộm bang lacto phenol.
Bước 1: Nhỏ một vài giọtlactophenol vào lamen chứabào tử nấm
Bước 2: Đặt lamenvào lamkính và quan sát dưới kínhhiển vi.
Quan sát hình dạng cấu trúc sợi nấm (màu sắc, có vách ngăn haykhông) và tiến hành đo kíchthước sợi nấm.
2.3.2 Xác định con đường xâm nhiễm, lan truyền tác nhân gây bệnh đốm lá thông qua lây nhiễm nhân tạo
Phương pháp lây bệnh trênlá, các bước lâynhiễm như sau:
1 Phun dịch bào tửlên lá cây được lây bệnh
2 Phun nước vô trùng lên lá cây dùng làmđối chứng
3 Che chậu bằng túi ni lông đặt trongnhà lưới, tránh ánh nắng trực tiếp
4 Sau 7 ngày theo dõi kiểm tra và so sánh những cây được lây bệnh với những câyđối chứng Quan sát và ghi nhận triệu chứng và so sánh những triệu chứng này với các triệuchứng đã quan sát được trên đồng ruộng.
Thí nghiệm bao gồm 06 nghiệm thức theo, được bố trí theo phương pháp CRD với một cây/chậu và 3 lần nhắc lại,theo quy tắc Koch24:
Nghiệm thức 1: Không gây vết thương (đối chứng) +phun nước vô trùng
Nghiệm thức 2: Gây vết thương(đối chứng) +phun nước vô trùng
Nghiệm thức 3: Không gây vết thương trên lá +phun dịch bào tử nấm lên lá
Nghiệm thức 4: Không gây vết thương trên lá + tưới dịch bào tử nấm vào gốc Nghiệm thức 5: Gây vết thương +phun dịch bàotửnấm lên lá
Nghiệm thức 6: Gây vết thương 4- tưới dịch bào tử nấm vào gốc
Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi:
T, 1A /oz\ _ sô cây nhiễm bệnh „ ! nn
Tống sõ cây điêu tra
Tiến hành tái phân lập tác nhân gây bệnh theo quy trình chuẩn, sau đó quan sát và so sánh các đặc điểm hình thái như hình dạng, màu sắc tản nấm, bào tử và sợi nấm của mẫu nấm bệnh đã phân lập với mẫu nấm thuần ban đầu, nhằm xác định chính xác chủng nấm gây bệnh.
Chương 2 Nội dung và phương phápnghiên cứu
Những cây con sử dụng trong thí nghiệm được tuyển chọn từ Trung Tâm Giống Cây Trồng Ninh Thuận, đảm bảo chất lượng đầu vào Sau khi mua về, cây được trồng trong đất sạch và đặt trong nhà kính nhằm ngăn chặn sự xâm nhập của mầm bệnh và côn trùng gây hại, tạo điều kiện lý tưởng cho quá trình nghiên cứu và phát triển.
2.3.3 Xác định tác nhân gây bệnh bằng phương pháp định danh phân tử
Vật liệu: Hệ sợi nấm nuôi cấy ở nội dung 1.
2.3.2.1 Tách chiết DNA tổng số 25
Tách chiết DNA tổng số theo nguyêntắc bộ Kit: HI™ DNAPlant Kit
Sử dụng 30 - 100 mg mẫu mô thực vật vào tube 1.5 ml Nghiền mầu bằng cối chày và thêm nito lỏng.
Cho 400 pl dung dịch PLS 1 vào tube 1.5 mL (đã chứa sẵn mầu cần tách chiết) Vortex đều.
Chotiếp 10 pl RNase A vào, vortex nhẹ và ủ ở 65 °C trong30 phút hoặc đến khi tếbào lygiải hoàn toàn.
Lưu ý: Vortex thường xuyên trongquátrình ủ (khoảng 5 - 10 phút một lần)
Cho tiếp 130 pl PLS 2 vào, trộn đều và ủ 5 phút trên đá hoặc tủ4 °C.
Sau khi ủ, ly tâm ở tốc độ tối đa (> 15000 vòng/phút) trong 5 phút và hút toàn bộ dịch nổi (khoảng 450 pl) vào tube mới (tránhhút phần cặn dưới đấy tube)
Bước 3: Gan DNA lêncột silica
Cho PBB gấp 1.5 lầnthể tích dịch nổi hút ở bước 2 vào (dịch nổi hút ở bước2 là
450 pl thì cho 675 pl PBB vào), đảo đều và đế ở nhiệt độ phòng 1 -2 phút
Chuyến 600 pl dịch nổi vào silica
Ly tâm 11000 vòng trong 2 phút Đố bỏ dịch lọc qua, tái sử dụng ống chứa dung dịch (phía dưới cột silica)và giữ lại cộtsilica
Tiếp tục với ly tâm lầnnừa với lượng hồn hợp còn lại.
Lưuý: DNA lúc này sẽ gắn vào silica bên trong cột
Cho 500 pl PWB vào cột silica
Ly tâm ở 11000 xg trong 1 phút Đổ bỏ dịch lọc qua, tái sử dụng ống chứa dung dịch (phía dưới cột silica) và giữ lại cộtsilica
Cho 500 pl PWB vào cột silica
Ly tâm ở 11000 xg trong 1 phút Đo bỏ dịch lọc qua, tái sử dụng ống chứa dung dịch (phía dưới cột silica)và giữ lại cộtsilica
Bước 6: Làm khô cột silica
Ly tâm ở 11000 xg trong 2 phút
Bỏ ống chứa dung dịch(phía dưới cột silica) và giữ lại cột silica
Chuyển cột silica vàotube 1.5 mL
Cho 100 pl dung dịch EB (đãủ ở 70 °C) vào cột silica
Ly tâm ở 11000 xg trong 5 phút
Giữ tube 1.5 mL và bảo quảnở - 20 °C nếu chưa được sử dụng
Dung dịch trong ống tube 1.5 mL chứa DNA đã được tách chiết, có thể điều chỉnh thể tích dung dịch EB để thay đổi nồng độ DNA thu được Việc chia dung dịch EB để thu hai lần cũng là một cách hiệu quả giúp tăng hiệu suất thu hồi DNA.
Chương 2 Nội dung và phương phápnghiên cứu
23.2.2 PCR vùng trình tự ITS rRNA
Trình tự cặp mồi sử dụng cho PCR:
Thành phần phản ứng PCR
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (pl)
Dụng cụ chuẩn bị: 1 ống PCR Dùng pipet hút lần lượt cho các thành phần đã chuẩn bị vào ống PCR, vortex đều.
Bước 1: Lấy 10 pl Mytaq Mix.
Bước 2: Lấy 1 pl mồi xuôi.
Bước 3: Lấy 1 pl mồi ngược.
Bước 4: Lấy3 pl DNA khuôn mầu.
Chohồn hợp trên vào máy PCR và chu trình nhiệt như Bảng 2.2
Bảng 2.2 Chutrình nhiệt phản ứng PCR
Số chu kỳ Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian
1 Biến tính ban đầu 95 °C 5 phút
Sản pham PCR được phát hiện bằng phương pháp điện di trên gel agarose với nồng độ 1 %.
Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1 %
- Cho 0,5 g bột agarosevào Erlen bo sung 50 ml TBE, lắc cho tan đều.
- Cho vào lò vi sóng đun 1 -2 phút.
- Đe nguội khoảng50 °C sauđó đo vào khuôn đã cài sẵn lượt.
- Đê yên 15-20 phút cho gel đông lại.
Bước 2: Bơm mẫuvào giếng gel và chạy điện di
- Cho miếng gel đã chuẩn bị vào bể điện di có chứa dung dịch TBE, phần giếng của miếng gel quay về hướng cực âm.
- Hút2 pl thuốc nhuộm gelredbổ sung 3 pl mẫutrộn đều.
- Bơmtoàn bộ 5 |11 hồn hợp vào giếng gel.
- Bơm thang DNA vào giếng kế tiếp.
- Đậy nắp bề điện di và cắm nguồn điện. Điện di được thực hiệntrong 25 phút ở 90mA.
Bước 3: Kiểm tra kết quảđiện di
Chương 2 Nội dung và phương phápnghiên cứu
Sau khi điện di, đặt gel vào máy soi gel.
Quansát và chụp hình kết quả.
2.3.2.4 Phân tích trình tự và xác định tên loài gây bệnh đốm lá nha đam
Mầu sau khi được khuếch đại bằng kỳ thuật PCR được gửi giải trình tự tại công ty TNHH Phát triển Công nghệ ứng dụng Việt Nam (VNDAT).
Dựa trên các trình tự DNA thu được, nghiên cứu tiến hành tìm kiếm các mẫu tương đồng trong cơ sở dữ liệu GenBank bằng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ Sinh học) Các trình tự nấm được phân tích và so sánh với dữ liệu tham chiếu, từ đó xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 7.0 nhằm xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài nấm.
2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng lên sự sinh trưởng và phát triển của tác nhân gây bệnh
2.4.1 Khảo sát sự ảnh hưởng ciia nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của tác nhân gây bệnh
Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng cùa nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của nấm Thí nghiệm được bố trí 5 nghiệm thức:
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tốc độ phát triển của nấm ở các ngàythứ 2, 4, 6 sau khi cấy bằng cách đo đường kính tản nấm.
2.4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng cua ánh sáng lên sự sinh trưởng và phát triển ciia tác nhân gây bệnh
Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng khác nhau đến sinh trưởng phát triểncủanấm Thí nghiệm được bốtrí 5 nghiệm thức:
Nghiệm thức 3:12 giờ sáng xen kẽ 12 giờtối
Nghiệm thức4: 16 giờ sáng xen kẽ 8 giờ tối
Nghiệm thức 5:16 giờtối xen kẽ 8 giờ sáng
Sử dụng ánh sáng củađèn led vớicường độ ánh sáng 1500 lux.
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tốc độ phát triển của nấm ở các ngàythứ 2, 4, 6 sau khi cấy bằng cách đo đường kínhtản nấm.
Chương 3 Kết quả và thảo luận
CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Xác định đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy của tác nhân gây bệnh đốm lá nha đam tại Ninh Thuận
Chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh đóng vai trò then chốt trong hiệu quả của các biện pháp phòng trừ dịch hại Tuy nhiên, do nhiều bệnh có triệu chứng tương đồng, việc chẩn đoán tại hiện trường thường gặp khó khăn và đôi khi không thể thực hiện Vì vậy, chẩn đoán trong phòng thí nghiệm trở thành yếu tố không thể thiếu trong hệ thống bảo vệ thực vật hiện đại, giúp nâng cao độ chính xác và hiệu quả kiểm soát dịch bệnh.
Việc giám định tác nhân nấm gây bệnh bắt đầu bằng việc dựa vào các đặc tính hình thái, như bào tử và các cấu trúc tạo bào tử Nhìn chung, cần quan sát dưới kính hiển vi để có thể nhận ra tác nhân gây bệnh và chẩn đoán bệnh Việc giám định hình thái được trợ giúp nhờcác khóa phân loại, tài liệu hướng dẫn và hình ảnh minh họa.