Sàng lọc các chủng Streptomyces từ dược liệu, đất, nước có khả năng E.coli sinh ESBL.pdf

coli sinh ESBL - Phân lập các chủng Streptomyces từ thực vật, đất và nước - Khảo sát tính kháng E.. coli sinh ESBL của chủng Streptomyces đã phân lập - Khảo sát hoạt tính kháng một số vi

KHOA CỒNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

LIỆU, ĐÁT, NƯỚC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG

E.Coli SINH ESBL

Sinh viên thực hiện: Nguyền Thị Thanh Thủy

GVHD : ThS Nguyền Trung Hiếu

TP HCM, 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TÁT THÀNH CỘNG HÒA XÀ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

oOo -NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

Họ và tên : Nguyền Thị Thanh Thủy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

MSSV: 1311523926Lớp : 13DSH02

1 Đầu đề luận văn:

Sàng lọc các chủng streptoniyces từ dược liệu, đất, nước có khả năng kháng

E coli sinh ESBL

2 Mục tiêu

- Sàng lọc các chủng Streptomyces từ dược liệu, đất, nước có khả năng kháng E coli sinh ESBL

3 Nội dung:

- Xác định chủng E coli sinh ESBL

- Phân lập các chủng Streptomyces từ thực vật, đất và nước

- Khảo sát tính kháng E coli sinh ESBL của chủng Streptomyces đã phân lập

- Khảo sát hoạt tính kháng một số vi khuẩn khác của chủng Streptomyces SS435

4 Thời gian thực hiện: tháng 02/2019 đến tháng 8/2019

5 Người hướng dần chính: ThS Nguyền Trung Hiếu

Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn

Trên hết, tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến Thạc Sĩ Nguyễn Trung Hiếu người đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đờ tôi trong suốt thời gian làm đề tài; với tất cả tinh thần tình thương và trách nhiệm thầy đã giúp tôi hoàn thành luận văn, bên cạnh đó tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức quý báu nơi thầy cũng như phương pháp nghiên cứu khoa học.

Tôi chân thành cám ơn thầy cô ở khoa Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành, đã tận tình giúp đờ tôi trong thời gian thực hiện đề tài luận văn đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian làm đề tài

Cảm ơn Thầy Tiến Sĩ Nguyễn Hoàng Chương và bạn bè trong phòng thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu và ứng dụng Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ cho tôi, dạy tôi, làm việc cùng tôi rất mệt rất bận nhưng rất vui và cũng sè là hành trang của tôi trên con đường tương lai tiếp tục nghiên cứu tìm tòi thêm nhiều chủng Streptomyces mới

Tôi xin chân thành cảm ơn!

(Sinh viên ký tên)

Nguyễn Thị Thanh Thủy Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

TÓM TẮT iv

SUMMARY V DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi

DANH MỤC BẢNG BIÊU vii

ĐẶT VÁN ĐÈ ix

CHƯƠNG 1 TÒNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Tong quan về xạ khuẩn 1

1.1.1 Sơ lược về xạ khuẩn 1

1.1.2 Phân loại 1

1.1.3 Đặc điểm hình thái 2

1.1.3.1 Khuẩn lạc 2

1.1.3.2 Khuẩn ty 2

1.1.3.3 Bào tử 2

1.1.4 Khả năng sinh chất kháng sinh cùa xạ khuẩn 3

1.1.4.1 Khái niệm về chất kháng sinh 3

1.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 3

1.1.5 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng xạ khuẩn 4

1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất, ứng dụng xạ khuẩn trên thế giới 4

1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất, ứng dụng xạ khuẩn trong nước 5

1.1.6 Phương pháp phân lập xạ khuẩn 6

1.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E colỉ sinh ESBL 7

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E coỉỉ sinh ESBL trên thế giới 7

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuấn E coli sinh ESBL ở Việt Nam 10

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỬƯ 12

2.1 Nơi thực hiện 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 12

2.2.2.2 Vi sinh vật kiểm định 12

2.3 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị 13

2.3.1 Dụng cụ 13

2.3.2 Hóa chất 13

2.3.3 Thiết bị 13

2.4 Phương pháp nghiên cứu 14

2.4.1 Phân lập xạ khuân 14

2.4.1.1 Phân lập xạ khuẩn từ mầu thực vật 14

2.4.1.2 Phân lập xạ khuân từ mầu đất 15

2.4.1.3 Phân lập xạ khuẩn từ mầu nước 15

2.4.2 Bảo quản chủng xạ khuấn 15

2.4.3 Sàng lọc xạ khuẩn sinh chất kháng khuẩn 16

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 Ket quả sàng lọc các chủng E coli sinh ESBL 17

3.2 Ket quả phân lập xạ khuấn từ đất, nước, cát và dược liệu tự nhiên 18

3.3 Ket quả khảo sát hoạt tính kháng Escherichia coli sinh ESBL của các chủng xạ khuẩn phân lập 19

3.4 Ket quả khảo sát khả năng kháng cùa xạ khuan SS435 với một số chủng vi khuẩn khác 21 KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 24 TÀI LIỆU THAM KHAO

PHỤ LỤC

TÓM TẤT

E coỉi sinh ESBL gây bệnh đang tăng lên một cách nhanh chóng ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là các nước thuộc khu vực châu Á, đặc biệt hơn là ở Việt Nam tỉ

lệ vi khuẩn E colỉ kháng các thuốc kháng sinh thông dụng cũng ngày càng tăng cao

Kháng sinh là nhân to chủ yếu đe kiểm soát dịch bệnh từ E coli sinh ESBL

Streptomyces là một nhóm vi khuấn có lợi Hon 2/3 kháng sinh sử dụng hiện nay có nguồn gốc từ xạ khuẩn - đặc biệt loài thuộc chi Streptomyces Đe tài: “Sàng lọc các

chủng streptomyces từ dược liệu, đất, nước có khả năng kháng E.colì sinh ESBL”

được thực hiện tại Trung Tâm Nghiên Cứu và ứng Dụng Sinh Học từ tháng 2 năm

2019 đến tháng 8 năm 2019 với mục tiêu tìm ra được các chủng Streptomyces phân lập

từ tự nhiên có hoạt tính kháng E coli sinh ESBL gây bệnh và góp phần trong việc phát trien thuốc kháng sinh mới

Đe tài gồm các nội dung chính: Xác định chùng E coli sinh ESBL; Phân lập các chủng Streptomyces từ thực vật, đất và nước; Khảo sát tính kháng E coli sinh ESBL cùa chủng Streptomyces đã phân lập Khảo sát hoạt tỉnh kháng một số vi khuấn

khác của chủng Streptomyces SS435

Những kết quả đạt được sau 6 tháng nghiên cứu:

- Xác định chủng E coli sinh ESBL

- Phân lập được 65 chủng Streptomyces từ thực vật, đất và nước

- Khảo sát tính kháng E coli sinh ESBL của 65 chủng Streptomyces đã phân lập trong đó có 12 chủng kháng E coli sinh ESBL Chủng Streptomyces SS435 cho kết quà vòng kháng lớn nhất với đường kính kháng khuấn 16mm

- Khảo sát hoạt tính kháng một số vi khuẩn khác của chủng Streptomyces

SS435

ESBL-producing E coli pathogens are increasing rapidly in many parts of the

world, especially in Asian countries, especially in Vietnam, the rate of E coli bacteria resistant to resistant drugs popular birth is also increasing Antibiotics are a key factor

in controlling the disease from ESBL-producing E coli Streptomyces is a group of

beneficial bacteria More than two-thirds of the antibiotics used today are derived from

actinomycetes - especially species of the genus Streptomyces Topic: “Screening

strains of streptomyces from medicinal herbs, soil, and water-resistant to ESBL- producing E coir was conducted at the Center for Biological Research and

Application from February 2019 to August 2019 with goals to identify naturally isolated Streptomyces strains that are resistant to pathogenic ESBL-producing E coll and contribute to the development of new antibiotics

The thesis includes the following main contents: Identifying ESBL-producing E coll strains; Isolation of strains of Streptomyces from plants, soil, and water; Survey on

ESBL-producing E coir, the resistance of isolated Streptomyces strain; Survey of

activity against some other bacteria of Streptomyces SS435

The results achieved after 6 months of research:

- Determination of ESBL-producing E coli strain

- Isolation of 65 strains of Streptomyces from plants, soil, and water

- Surveying ESBL-producing E coll resistance of 65 isolated Streptomyces

strains, including 12 ESBL-resistant E coli strains Streptomyces SS435 strain showed the largest resistance round with 16mm antibacterial diameter

- Investigating activity against some other bacteria of Streptomyces SS435 strain

DANH MỤC• CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Tỉ lệ vi khuẩn E coli sinh ESBL (báo cáo WHO 2011 - 2014) 10

Hình 1.2 Tỉ lệ đề kháng các kháng sinh của các trực khuẩn Gram âm 10

Hình 3.1 Kết quả test Escherichia coli bằng môi trường Chromagar 17

Hình 3.2 Ket quả test E coli với 6 loại kháng sinh 18

Hình 3.3 Đường kính kháng khuẩn của 12 chủng xạ khuẩn có biêu hiện kháng E coli sinh ESBL 20

Hình 3.4 Hình thái xạ khuẩn (A) và đường kính kháng khuẩn cùa chủng SS435 với E.coli sinh ESBL (B) 21

Hình 3.5 Khả năng kháng của xạ khuẩn SS435 với 6 chủng vi sinh vật kiểm định 22

Bảng 3.1 Kết quả kháng E coli sinh ESBL của 12 chủng Streptomyces đã phân lập 19Bảng 3.2 Kết quả khảo sát phổ kháng khuẩn của SS435 với 8 chủng vi sinh vật kiểm

định 23

DANH MỤC • CHỮ VIÉT TẮT

ss : Streptomyces đang nghiên cứu tại Sài GònKpl : Klebsiella pneumoniae

Sa3 : Staphylococcus aureus-3

Efal : Enterococcus faecium 1

Vai : Virio alginolyticus

AMC : Amoxicillin/Clavulanic acid

1 Tính cấp thiết của đề tài

Theo thống kê của công ty IMS Health cho thấy tỉ lệ kê đơn thuốc có hoạt chất kháng sinh tại Việt Nam đang đứng mức cao nhất thế giới trên bản đồ sử dụng kháng sinh năm 2015' Lượng kháng sinh sử dụng tại Việt Nam đà tăng vọt trong giai đoạn

2009 - 2015 với mức tăng gần gấp 3 so với giai đoạn 2005 - 2009 Trong đó, riêng kháng sinh amoxicillin tăng 20% so với năm 2017 với số tiền lên tới gần 623 tỉ; kháng sinh cefoxitin tăng đột biến tới 443%, từ 76,5 tỉ lên gần 416 tỉ2

Các nghiên cứu cho thấy enzyme beta lactamase pho rộng (extended spectrum beta-lactamase, ESBL) là một nhóm enzyme được tạo ra từ vi khuấn có tác dụng giúp

vi khuẩn kháng lại các kháng sinh dòng cephalosporin và một số dòng kháng sinh khác2 Trong thời gian gần đây, tỉ lệ vi khuẩn E coli sinh ESBL gây bệnh đang tăng lên một cách nhanh chóng ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là các nước thuộc khu vực châu Á ơ Việt Nam, thống kê ở 15 bệnh viện cho thấy tỉ lệ vi khuan E coli sinh ESBL khá cao (thay đổi từ 14,7% đến 57%) và tỉ lệ vi khuẩn E coli kháng các thuốc kháng sinh thông dụng cũng ngày càng tăng cao Điều này dẫy lên hồi chuông cảnh báo về mức độ đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn đang ngày càng tăng và có xu hướng không còn kháng sinh để điều trị trong tương lai

Streptomyces đà được công nhận rộng rãi là vi sinh vật công nghiệp quan trọng

do tiềm năng của nó trong việc sản xuất đa dạng các chất chuyến hóa thứ cấp bao gồm: các chất kháng sinh, tác nhân kháng u, chống ký sinh trùng và các enzyme Việc tìm kiếm các chủng Streptomyces từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên (đất , đất mặn, cát, nước ) đã được nhiều tác giả nghiên cứu, tuy nhiên việc tìm kiếm các chủng

Streptomyces nội cộng sinh từ các nguồn dược liệu tự nhiên có tính kháng khuẩn đang

là xu hướng mới chưa có nhiều nghiên cứu Chính vì lý do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Sàng lọc các chủng streptomyces từ dược liệu, đất, nước có khả năng kháng E

coỉi sinh ESBL ’’

2. Mục tiêu của đề tài

Phân lập và tuyển chọn các chủng xả khuân có khả năng kháng Escherichia coll sinh ESBL

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về xạ khuẩn

1.1.1 Sơ lược về xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm vsv rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm Tên xạ khuẩn - actinomycete - bắt nguồn

từ Hy Lạp “actys ” (tia) và “mykes ” (nấm) và có cấu trúc giống nấm Nhánh của chúng

có sự sắp xếp của các tế bào hình sợi thành một mạng lưới gọi là sợi nấm Chúng có thể chuyển hóa các hợp chất khác nhau bao gồm: đường, rượu, acid amin, và các hợp chất thơm bằng cách sản xuất các enzyme thủy phân ngoại bào3

Xạ khuân là vi khuân Gram dương có tỉ lệ G + c cao (>55%) trong DNA đa

số xạ khuấn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rài trong đất, nước và thực vật Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 30 °C và pH trung tính là các điều kiện tối ưu cho xạ khuẩn phát triển

Hiện nay, hơn 2/3 thuốc kháng sinh cho người và động vật có nguồn gốc từ xạ khuẩn Xạ khuẩn được công nhận rộng rãi là các vi sinh vật quan trọng trong công nghiệp vì có khả năng sinh các loại chất chuyển hóa thứ cấp mới Các hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm, chống ký sinh trùng và ức chế miền dịch và đặc biệt là kháng sinh

đã được xác định là sản phẩm chất chuyển hóa thứ cấp từ xạ khuẩn4

1.1.2 Phân loại

về mặt phân loại, lớp xạ khuân có 5 phân lóp, 6 bộ trong đó bộ được nhắc đến nhiều nhất (có giá trị trong y học và kinh tế) là bộ Actinomycetales Bộ

Actinomycetaỉes có 13 dưới bộ, 42 họ và khoảng 200 chi

Xạ khuấn thường được chia thành hai loại: Streptomyces và không phải

Streptomyces. Chi xạ khuẩn được biết nhiều nhất là Streptomyces, với khoảng 500 loài, tất cả đều có GC cao (69% - 73%) trong DNA

Chương 1 Tổng quan tài liệu

1.1.3 Đặc điểm hình thái

1.1.3.1 Khuẩn lạc

Trên môi trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh Khuẩn lạc thường có dạng thô ráp, có các nếp tỏa ra theo hình phòng xạ Bề mặt khuẩn lạc của xạ khuẩn xù

xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh5

Đường kính mồi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 - 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1 cm hoặc lớn hơn Khuẩn lạc có 3 lóp, lóp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tô ong6

1.1.3.2 Khuẩn ty

Trên môi trường đặc, khuấn ty có 2 dạng:

Mọc dưới khuẩn lạc và cắm sâu vào trong môi trường: Khuẩn ty cơ chất (đường kính từ 0,2 pm - 0,3 pm): không có vách ngăn và không bị đứt đoạn, có chức năng hút chất dinh dường để cung cấp cho toàn bộ cơ thế

Phát triển trên bề mặt thạch: khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bên ngoài không khí, trên bề mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn, có chức năng chủ yếu là sinh sản7

1.1.3.3 Bào tử

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuấn ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn Một số

xạ khuấn có sinh nang bào tử, nên trong có chứa nhiều bào tử nang Be mặt của bào tử

có thề nhằn (smooth), gai (spiny), tóc (hairy), xù xì (warty), nhăn (rugose), tùy thuộc vào loài xạ khuẩn Quá trình sinh bào tử được tạo bởi 2 cách sau:

Ket đoạn: Lúc đầu các hạt cromatin trong tế bào được phân bố khắp cuống sinh bào tử Sau đó các tế bào chất co lại bao lấy hạt cromatin tạo thành một khối gọi là tiền bào tử Các tiền bào tử được bao bọc bởi một lóp màng hình thành bào tử8

Cắt khúc: Cuống sinh bào tử hình thành các vách ngăn ngang Các nhân được phân chia hình thành các hạt cromatin phân bố khắp cuống sinh bào tử Tiếp đó các tế bào chất bao quanh các hạt này hình thành bào tử, sau đó là cuống bào tử.

Tùy theo từng loài mà cuống sinh bào tử có thể thắng hay uốn cong, xoắn lò xo hay xoắn ốc, chúng có the mọc đơn, mọc đối, mọc vòng, mọc thành chùm, số vòng xoắn của cuốn sinh bào tử có thể từ 5 - 10 vòng, đường kính có the thay đổi từ 5 - 7

mm, hình dạng thường có hình cầu, ovan, que, Be mặt bào tử có các dạng như: nhằn,

xù xì, có gai, Các đặc diêm hình thái cuống sinh bào tử và bào tử rất quan trọng khi tiến hành phân loại xạ khuẩn

1.1.4 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn

1.1.4.1 Khái niệm về chất kháng sinh

Năm 1942, Tiến sĩ Selman A.Waksman đưa ra định nghĩa đầu tiên về kháng sinh: “Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với vi sinh vật khác”9

về sau, sự phát triển của khoa học kỳ thuật, người ta có thể tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tổng họp nhân tạo các chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế bào ung thư (actinomycin)10

Vì thế định nghĩa kháng sinh được thay đổi: “Kháng sinh là tất cả các họp chất

có nguồn gốc tự nhiên hoặc tống họp với nong độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hàm sự phát triển hoặc tiêu diệt đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động vật và thực vật bằng con đường cung cấp chung” Các vi sinh vật mần cảm với chất kháng sinh ở những mức độ khác nhau,

đa số các vi khuẩn Gram dương mần cảm với chất kháng sinh hơn các vi khuẩn Gram âm4

1.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng họp chất kháng sinh

Độ thông khí: yếu tố thông khí ảnh hưởng quyết định đến sinh tong hợp chất kháng sinh Các xạ khuấn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nên độ thông khí đạt hiệu

Chương 1 Tổng quan tài liệu

suất cực đại đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đế khả năng sinh kháng sinh, lượng thông khí cung cấp vào môi trường nuôi cấy là lưu lượng thổi khí 1 thế tích môi trường /1 phút

Nhiệt độ: có những loài xạ khuấn ưa nhiệt hay sống tốt trong môi trường có nhiệt độ cao nhưng đa số xạ khuẩn thường phát triển tốt ở nhiệt độ 28°c - 30°C (nhiệt

độ phòng thí nghiệm) Nhiệt độ tối ưu cho sinh tông hợp chất kháng sinh thường nằm trong khoảng 18°c - 28°c

pH: sinh tong hợp chất kháng sinh phụ thuộc đáng kể vào độ pH của môi trường Độ pH thích hợp để sinh tổng hợp chất kháng sinh là pH trung tính, ở pH acid

và kiềm sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh

Chất lượng giong: Chất lượng bào tử và tế bào sinh dường là rất quan trọng, tuoi và khả năng đồng đều về mặt di truyền và hoạt tính trao đối chất của giống phản ánh điều kiện nuôi cấy Điều kiện môi trường nhân giống cũng như thời gian nhân giống cũng khác nhau tùy từng chủng và tuổi của bào tử giống

Thành phần môi trường nuôi cấy: Thành phần môi trường khác nhau sẽ dần đến khả năng sinh các chất khác nhau Tùy từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon (Glucose, Manitole, tinh bột, ) và nguồn nitơ (hữu cơ và vô cơ) thích họp

1.1.5 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng xạ khuẩn

1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất, ứng dụng xạ khuẩn trên thế giói

Chất kháng sinh đã được phát hiện và ứng dụng để chữa bệnh cho con người Nhờ kháng sinh mà chúng ta đà đấy lùi được nhiều bệnh và dịch bệnh nguy hiếm như:

tả, đậu mùa, thương hàn Phần lớn các chất kháng sinh được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn Trong số 8.000 chất kháng sinh đã được biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn sinh ra

Năm 1999, một kháng sinh được phát hiện có tác dụng ngăn chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đe kháng đối với các chất độc cùa chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Đó là kháng sinh loposomal HA - 92, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL - 312

Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng loạt các chất kháng sinh mới Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuan Streptomyces sp TP - A0356 bằng phương pháp sắc kí cột Chất

kháng sinh này có khả năng kìm hãm sự phát trien của nấm Aspergillus fumigalus và

Candida albicans. Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư với giá trị MIC là 0,01 - 0,3 mg/ml11

Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuấn Streptomyces sp C684 sinh chất kháng sinh laidlomycin, chất này có the tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin12

1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất, ứng dụng xạ khuẩn trong nước

ớ Việt Nam, chúng ta cũng đằ có nhiều cố gắng trong việc tìm kiếm và sản xuất chất kháng sinh Năm 1950, GS Đặng Văn Ngừ đã nuôi cấy Penicillum và dùng dịch nuôi cấy để chừa bệnh cho các thương binh trong thời kháng chiến chống Pháp13

Năm 1970, Đơn vị nghiên cứu chuyên đề kháng sinh do GS Trương Công Quyền làm chủ nhiệm ra đời, giáo sư và cộng sự đã có nhiều công trình nghiên cứu về kháng sinh: phân lập được một tập hợp khá lớn các chủng vi sinh vật, trong đó đặc biệt

là xạ khuẩn sinh kháng sinh có nguồn gốc từ đất Việt Nam ông đã tiến hành nghiên cứu sinh lý sinh hóa của các chùng vi sinh vật sinh kháng sinh và tách chiết, định loại được một số kháng sinh14-

Từ năm 1985 đến năm 1990, Bộ Y tế đà nghiên cứu và sản xuất thành công kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin10

Năm 2000, tổng công ty dược Việt Nam chủ trì thực hiện đề tài “Nghiên cứu công nghệ điều chế 6-APA, 7-ADCH và cephalexin từ penicillin G” và đề tài “Nghiên cứu áp dụng công nghệ sản xuất các chất kháng sinh mới, hiệu quả bằng nguyên liệu trong nước”15

Năm 2016, nghiên cứu cùa Nguyễn Văn Hiếu và cộng sự đã phân lập được xạ

khuấn Streptomyces parvulus nội cộng sinh trên cây bưởi Diễn ở Hà Nội và xác định tiềm năng sinh tổng họp chất kháng khuẩn của loài xạ khuẩn này Xạ khuẩn9

Chương 1 Tổng quan tài liệu

Streptomyces parvulus có khả năng đối kháng mạnh với Bacillus subtỉlis và

Staphylococcus aureus.

Gần đây, vào năm 2017, Viện Công nghệ sinh học đã công bố kết quả nghiên cứu các họp chất sinh học thu được từ xạ khuấn nội cộng sinh trên cây Que và cây Màng tang Ket quả thu được 2 họp chất: 1-monolinolein và baíĩlomycin D có khả năng kháng ung thư và kháng vi sinh vật kiềm định kháng kháng sinh MRSA và MRSE Cũng trên cây Quế, có rất nhiều công bố về việc xạ khuấn nội cộng sinh có khả năng kháng các căn bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm5,16'

1.1.6 Phưong pháp phân lập xạ khuẩn

Phần lớn xạ khuẩn được phân lập từ đất, nước, Đen ngày nay, nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới công bố về tương tác giữa thực vật và vi sinh vật nội cộng sinh trong thực vật, trong đó vi sinh vật đóng vai trò như tác nhân ức chế sinh vật gây bệnh, tong hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật, phân giải phospho khó hoà tan, cố định nitơ tự do, tăng độ phì nhiêu cho đất4-17

Đối với mẫu đất và nước, dùng phương pháp cấy trực tiếp Riêng mầu đất mang lắc đều với dung dịch nước muối sinh lí 0.9% và trải đều trên mặt thạch

Đối với các mẫu thực vật, nhìn chung mật độ xạ khuẩn nội cộng sinh trong cây thấp hơn so với mầu đất và nước, và mật độ đó còn phụ thuộc vào các vùng mô khác nhau trên thực vật Theo các công trình công bố, quá trình phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh cần xử lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt Do đó, phải khử trùng bề mặt mầu và cắt mầu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử trùng trước khi phân lập Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng đe khử trùng bề mặt Mầu thực vật được ngâm trong ethanol 70 - 99% từ 1 - 5 phút và 1 - 5% NaOCl trong khoảng 3-20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vô trùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl còn dư Ngoài ra, hydro peroxide và clorua thủy ngân cũng được sử dụng như chất khử trùng bề mặt hiệu quả Năm 1992, Sardi và cộng sự công bố sử dụng hơi của propylen oxit để khử trùng bề mặt thay vì hóa chất khử trùng dạng lỏng Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý bề mặt chỉ với ethanol không hiệu quả với quá trình phân lập vsv nội cộng sinh Neu

chất khử trùng khác thì không phân lập được xạ khuẩn nội sinh Hiệu quả khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt như Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của chất khử trùng với bề mặt thực vật Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích họp, nuôi cấy ở nhiệt độ thích họp từ 25 - 30 °C Trong quá trình phân lập, các nhà nghiên cứu thường gặp phải

là vsv phát triến mạnh trong hai tuần đầu tiên là vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật Đe ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuấn và nấm không mong muốn cũng như tìm kiếm loài xạ khuấn mới, một số môi trường chọn lọc đã được sử dụng như: môi trường thạch humic acid-vitamin, môi trường thạch casein tinh bột, môi trường SFM18’19

Ngoài ra, bổ sung các họp chất kháng sinh như acid nalidixic và trimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide để ức chế vi khuẩn, nấm nội cộng sinh và nâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn

và nấm bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm20’21

1.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E coli sinh ESBL

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E coli sinh ESBL trên thế giói

Hiện nay, những nguy cơ ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng của vi khuẩn E

coỉi sinh enzyme beta-lactamase pho rộng ESBL đang được quan tâm nghiên cứu trên người2 Ket quả nghiên cứu của tác giả Ben-Ami et al (2009) trên những báo cáo về bệnh nhân ngoại mắc bệnh tiêu hóa cho thấy có tới 339 ca (chiếm 34,5%) nhiễm chùng E coli sinh ESBL trong tổng số 983 ca mắc, trong đó chủng vi khuấn mang gen CTX-M chiếm 65% Tại Bắc Mỹ, báo cáo đầu tiên về ESBL tại Mỹ vào năm 1988, là

K pneumoniae với enzyme TEM-10, tiếp ngay sau đó là các báo cáo về TEM-12 và TEM-26 Một nghiên cứu dịch tễ cùa Doi et al.(2013)15 thực hiện tại Mỳ cho thấy có tới 81,5% các bệnh nhân nhiễm trùng đường tiêu hóa bị nhiễm E coli sinh ESBL18

Nghiên cứu này và một vài nghiên cứu khác cũng chỉ ra E coli sinh ESBL đã lây lan rộng trong cộng đồng dân cư, tuy chưa có biểu hiện lâm sàng Tại châuẦu, các genTEM-l,TEM-2, và SHV-1 được phát hiện ngay từ những năm 198022 Hiện nay,

do truyền lây qua plasmid, sự phân tán của các gen beta-lactame đang tiếp tục làm tăng khả năng kháng thuốc của vi khuẩn sinh ESBL, trong đó có thể kể đến các gen:

Chương 1 Tổng quan tài liệu

TEM-4, TEM-24, TEM-52, SHV12,CTX-M-9,CTX-M-14,CTX-M-3,CTX-M-15, và CTX-M-3220’23- Theo số liệu của EARSS, tỉ lệ E coỉi kháng lại C3G có sự biến đổi lớn,

từ 3% ở Thụy Điển đen 36% ở đảo Syp, và cũng chỉ rõ một grandient Bắc tới Nam với

tỉ lệ cao nhất châu Âu tại các nước Nam Âu và thấp nhất ở các nước Bắc Âu Từ năm

2008 tới 2011, tỉ lệ E coli kháng Cephalosporin thế hệ 3 tăng ở 18 trên 28 nước và không có một nước nào có tỉ lệ giảm trong giai đoạn này Tại Trung Đông, các nghiên cứu đã chỉ ra 1 tỉ lệ ESBL cao hơn hãn các vùng khác trên thế giới21 Tại Nam và Trung Mỹ, SHV-2 và SHV-5 được báo cáo lần đầu tiên ở K pneumoniae vào khoảng năm 1989 tại Chile và Argentina Tỉ lệ E coli sinh ESBL ở khu vực châu Mỹ Latin tăng so với các năm trước23, về số lượng cụ thể, 26% E coli tại châu Mỹ Latin có sinh ESBL vào năm 2008, trong khi đó tỉ lệ này chỉ là 10% vào năm 2003 và 2OO4.Tại châu

Á, lần đầu tiên phân lập được K pneumoniae mang SHV-2 được báo cáo ở Trung

Quốc vào năm 1988" Các nghiên cứu ở châu Á đà chỉ ra một tỉ lệ cao các vi sinh vật mang ESBL trong lâm sàng Các nghiên cứu với các vi sinh vật được phân lập trong giai đoạn 1998- 1999 đã chỉ ra rằng có 30,7% K pneumoniae và 24,5% E.coli sinh ESBL24 Hawkey trong nghiên cứu của mình đã chỉ ra rằng có 25% vi khuân họ

Enterobacteriaceae ở Thái Lan dương tính với ESBL16 Ước tính tỉ lệ E coli dương tính với ESBL phân lập được ở Hàn Quốc, Nhật Bản, Malaysia và Singapore là từ 5% đến 8%; còn ở Thái Lan, Đài Loan, Philippin và Indonesia là từ 12 đến 24%17’25- Trong khi đó ở những nước châu Á khác, nằm trong khoảng 20 đến 50% Tại Ấn Độ, trên các

vi sinh vật có kiểu hình ESBL phân lập được từ lâm sàng, kiểu gen ESBL được tìm thấy ở 63,6% tổng số chủng E coli và 66,7% tổng số chủng K pneumoniae18- Trong

đó, 57% vi khuấn chứa đồng thời 2 gen ESBL trở lên CTX-M là kiểu gen pho biến nhất (85,4%) được phát hiện, sau đó làTEM (54,9%) và SHV (32,9%) dưới dạng đơn hoặc kết hợp9 Nghiên cứu về ô nhiễm vi khuẩn E coli sinh men ESBL có nguồn gốc động vật và sản phẩm động vật cũng đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới thực hiện Trong đó CTX-M là loại enzyme được phát hiện phô biến nhất ở châu Âu và đây cũng là loại enzyme được xác định lần đầu tiên ở lợn tại Đan Mạch năm 2OO53.Gen CTX-M cũng đà được phát hiện trong sản phẩm chăn nuôi tại Pháp, Tây Ban Nha và tại Phần Lan Một nghiên cứu của Dierik c et al., tại 26 trang trại ở Hà Lan đã chỉ ra rằng tất cả các trang trại đều dương tính với E coli mang đồng thời ESBL và AmpC,

trong đó 22/26 trang trại có tì lệ trên 80% Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của Veldman

et al tại Hà Lan, được công bố vào năm 2014, đã chỉ ra tinh trạng các sản phẩm dược thảo có mang theo E coli sinh ESBL được nhập khẩu từ các nước Thái Lan, Malaysia, Việt Nam và sự cảnh báo về nguy cơ lây nhiễm vi khuẩn này ảnh hưởng tới cộng đồng6 Hiện tượng tương đong kiểu hình và kiểu gen đa kháng thuốc của E coli phân lập từ thú cảnh, từ người, và từ bề mặt các thiết bị gia dụng trong cùng một gia đình đã được khẳng định trong nghiên cứu của Martins et al (2013)26 Việc sừ dụng kháng sinh nhóm Cephalosporin trong thú y là yếu tố nguy cơ ảnh hưởng tới mức độ nhiễm vi khuan E coỉi sản sinh enzyme ESBL ở vật nuôi và lây lan sang người và sản phẩm thủy sản Theo các tác giả, môi trường ao nuôi cá cũng là nguồn lưu E coli sinh ESBL với 17% số chùng E coli phân lập được từ ruột cá có khả năng sản sinh ESBL27.Việc

sử dụng các kháng sinh Cephalosporin thế hệ mới như Ceftiofur và Cefquinome được cho là nguyên nhân quan trọng cho hiện trạng lây nhiễm vi khuẩn sinh ESBL trong thức ăn gia súc và sản phẩm chăn nuôi8 Chính vì vậy, tại Đan Mạch, các trang trại chăn nuôi lợn đã ngừng sử dụng kháng sinh nhóm Cephalosporin điều trị bệnh cho lợn

từ năm 2010 Ò nhiễm vi khuẩn sản sinh ESBL trong sản phẩm động vật sè tác động mạnh đến sức khỏe cộng đồng , bởi vì những yếu tố quyết định tính kháng thuốc có the được truyền từ động vật sang người thông qua chuồi thức ăn hoặc truyền trực tiếp cho người chăn nuôi qua tiếp xúc với vật nuôi, sản phẩm, và chất thải chăn nuôi Bên cạnh đó, những ton thất nặng nề về kinh tế từ việc điều trị bệnh đường ruột do vi khuấn E.coli sản sinh enzyme ESBL kém hiệu quả đang là vấn đề toàn cầu22-24

Chương 1 Tổng quan tài liệu

0-9 Ị _ I »0-19 [23 20-39 HH 40 59 m 60*79 m 80-100 No ƠMJ»

FIGURE I 2 Percentage of extended-spectrum beta-lactamase producing Ííchtrtchiacoti* by country

(most recent year 2011-2014)

Source CDDEP 2015 WHO 2014 and PAHO forthcoming

Hình 1.1 Tỉ lệ vi khuẩn E coli sinh ESBL (báo cáo WHO 2011 -2014)

(Nguồn: https://tudu.com vn)

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E coli sinh ESBL ờ Việt Nam

ơ nước ta, các nghiên cứu về vi khuẩn đường ruột sản sinh ESBL mới chủ yếu được thực hiện tại các cơ sở chăm sóc y tế và hầu hết các bệnh viện lớn đều có chương trình khảo sát tỉ lệ vi khuan gram âm sản sinh ESBL

• p aeruginosa

• Acinetobacter

■ Klebsiella

■ E coll

(Hợp tác toàn cầu vồ kháng kháng sinh GARP-Vĩột Nam tại 15 bõnh viện ỞVN nam 2008)

Hình 1.2 Tỉ lệ đề kháng các kháng sinh của các trực khuấn Gram âm

(Nguồn: https://www.google.com)

Bệnh viện Trung ương Huế, tỉ lệ bệnh nhân nhiễm vi khuẩn sinh ESBL là 30,4% Theo tác giả Nguyền Đắc Trung (2013) tại bệnh viện Thái Nguyên và bệnh viện

trường ĐH Thái Nguyên, 39,53% chủng E coli và 33,33% K pneumoniae sinh ESBL

Báo cáo kết quả nghiên cứu ở 19 bệnh viện ở Hà Nội, TPHCM và Hải Phòng trong 2 năm 2009 - 2010 về tình trạng kháng thuốc kháng sinh chỉ cứu từ những năm 1996-

1997 trên 96 chủng vi khuẩn kháng thuốc đã cho thấy có 100% số chủng kháng ba loại kháng sinh trở lên, 52,9% số chủng kháng sáu loại kháng sinh trở lên số liệu báo cáo của dự án GARP Việt Nam cho biết năm 2009 có tới gần 70% các vi khuẩn gram âm kháng với các kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 và 4 Tỉ lệ kháng kháng sinh của 4 loại vi khuẩn gram âm thường gặp tại các bệnh viện được trình bày trong6-8 hình 1.4

Mặc dù Việt Nam là một nước nông nghiệp và nằm trong khu vực có nguy cơ lây lan rộng khắp của enzyme ESBL nhưng số liệu về các nghiên cứu về vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh men ESBL có nguồn gốc từ vật nuôi và sản phẩm chăn nuôi (thịt, trứng, sữa), và chất thải chăn nuôi, còn rất hạn chế Đặc biệt là thiếu những công trình nghiên cứu về mức độ tương đồng kiểu gen kháng thuốc của vi khuẩn lây lan giữa người và vật nuôi Vi vậy, cần thiết tiến hành các nghiên cứu có tính hệ thống để

có những số liệu khoa học về sự năng động của lan truyền plasmid mang gen kháng thuốc giữa người và vật nuôi, làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng chiến lược sử dụng kháng sinh an toàn và hiệu quả, ngăn chặn nguy cơ kháng thuốc của vi khuẩn, bảo vệ sức khỏe cùa người và vật nuôi'5-16

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1 Noi thực hiện

Thời gian từ tháng 02 năm 2019 đến tháng 08 năm 2019

Địa điếm: Phòng thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu và úng dụng Sinh học tại địa chỉ 74, đường số 2, Khu dân cư Bình Hưng, huyện Bình Chánh, thành phố Ho Chí Minh

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

- Xác định các chùng E coli sinh ESBL

- Phân lập các chủng Streptomyces từ thực vật, đất và nước

- Khảo sát tính kháng E coll sinh ESBL của chủng Streptomyces đã phân lập

- Khảo sát hoạt tính kháng một số vi khuấn khác của chủng Streptomyces SS435

2.2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.2.1 Nguyên liệu phân lập Streptomyces

Mầu: Cây dược liệu, đất, cát, nước tại nhiều nơi khác nhau trải dài khắp các tỉnh

từ miền trung đến miền tây

Địa điểm thu mầu: nơi ít bị xáo trộn, không bị canh tác hay chịu tác động cùa con người

2.2.2.2 Vi sinh vật kiểm định

Các chủng vsv kiểm định do Trung tâm Nghiên cứu và ứng dụng Sinh học

cung cấp gồm 8 chủng bao gồm vi khuẩn và vi nấm: Kpl: Klebsiella pneumoniae ;

Sa3: Staphylococcus aureus-3; Efal: Enterococcus faecium ỉ; Abi: Acinetobacter baumaniv, Pa2: Psedomonas aruginosa 2; Ecll: Enterococcus spp 1; EC5: Escheria

coll 5; Pa: Psedomonas aruginosa', Vai: Virio alginolyticus

Các chủng này được nuôi trong môi trường thích hợp để sử dụng cho sàng lọc các chủng Streptomyces cỏ hoạt tính kháng khuấn Vi khuấn được nuôi trên môi trường NA, vi nấm nuôi trên môi trường PDA

- Acid nalidixic (Sigma)

- Thuốc Nystatin (Mekongphar)

- Cycloheximide (Sigma)

Hóa chất khử trùng bề mặt thực vật

- Tween 20 (Sigma)

- Ethanol (Việt Nam)

- NaOCl (Trung Quốc)

- Na2S2Ơ3 (Trung Quốc)

- NaHCCb (Trung Quốc)

Máy ly tâm (Eppendorf AG) Bàn đèn uv (Bioinstrument ATTO)

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.4 Phưong pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân lập xạ khuẩn

2.4.1.1 Phân lập xạ khuẩn từ mẫu thực vật

Thu mẫu cây bao gồm cả thân, lá, rễ cho vào túi nilon sạch, đem về phòng thí nghiệm và bảo quản ở 4°c cho đến khi tiến hành phân lập xạ khuấn Phân lập xạ khuẩn được tiến hành trong vòng 24 giờ sau khi thu hái

Đe đảm bảo khi phân lập chỉ thu nhận được xạ khuấn sống nội cộng sinh cần tiến hành loại bỏ các vsv sống ngoại sinh bằng cách khử trùng bề mặt Quy trình khử trùng cần được tiến hành trong môi trường vô trùng

Quy trình khử trùng mầu:

- Thu mầu (rễ, thân, lá) cho vào fancol

- Rửa sạch bùn đất bằng nước máy

- Rữa nước vô trùng trong 4’

- Rữa với Tween 20 0,1% trong vài giây -> rửa nước vô trùng trong 2’

- Rừa NaOCl 0,4% trong 2’

- Rửa Na2S?O3 2,5% trong 4’

- Rửa ethanol 70% trong 2’ -ỳ rửa nước vô trùng trong 2’

- Rửa NaHCCh10% trong 4’

- Kiềm tra hiệu quả khử trùng bằng cách: Trải dịch rửa NaHCƠ3 10% lên đìa chứng chứa kháng sinh (acid Nalidixic (50 pg/mL), cycloheximide (60 pg/mL) và nystatin (60 pg/mL), ủ 28°c

Phân lập Streptomyces'

- Dùng kẹp, dao tách riêng rề, thân, lá ra từng eppendorf khác nhau

- Cho nước vô trùng -> nghiền

- Trải dịch chiết lên môi trường phân lập chứa kháng sinh, ủ nhiệt độ phòng

- Kiểm tra và quan sát kết quả:

- Sau 4 ngày, quan sát các đĩa đã cấy