Nghiên cứu nhân sinh khối hệ sợi nấm đông cô (Lentinula edodes) trên môi trường lỏng và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết sinh khối hệ sợi nấm đông cô.pdf

Khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng mầu nấm Đông Cô ban đầu đến quá trình nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô trên môi trường long - Đánh giá sự khảng khuẩn của dịch chiết hệ sợi nấm Đông Cô 4..

NGUYEN TAT THANH

THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

CÔ {Lentinula edodes) TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG VÀ

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Phương Hoài Bảo

GVHD : TS Đồ Tiến Vinh

ThS Mai Thị Phương Hoa

TP HCM, 2019

NGUYEN TAT THANH

THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

CÔ {Lentinula edodes) TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG VÀ

Sinh viên thực hiện :Nguyễn Phương Hoài Bảo

Mã số sinh viên : 14115530966Chuyên ngành : Công nghệ Sinh họcGiảng viên hướng dẫn : ThS Đồ Tiến Vinh

ThS Mai Thị Phương Hoa

TP HCM, 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYÊN TÁT THÀNH CỘNG HÒA XẢ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

- -

oOo -NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

Họ và tên: Nguyền Phương Hoài Bảo MSSV: 1411530966Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lóp: 14DSH02

1 Đầu đề luận văn:

Nghiên cứu nhân sinh khối hệ sợi nấm Đông Cô (Lentinula edodes) trên môi trường lỏng và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết sinh khối hệ sợi nấm Đông Cô (Lentinula edodes).

2 Mục tiêu

Xác định được thành phần khoáng và nong độ pH của môi trường thích hợp đe nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô (Lentinula edodes) trong môi trường lỏng

3 Nội dung:

- Phân lập và khảo sát ảnh hưởng của một số loại môi trường đến quá trình nuôi cấy

hệ sợi tơ nấm Đông Cô

- Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần khoáng đen quá trình nuôi cấy sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng

- Khảo sát sự ảnh hưởng của pH môi trường đến tốc độ tăng trưởng cùa hệ sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng

Khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng mầu nấm Đông Cô ban đầu đến quá trình nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô trên môi trường long

- Đánh giá sự khảng khuẩn của dịch chiết hệ sợi nấm Đông Cô

4 Thời gian thực hiện: tháng 02/2019 đến tháng 8/2019

5 Người hướng dần chính: TS Đồ Tiến Vinh

Người hướng dần phụ: ThS Mai Thị Phương Hoa

Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn

TP HCM, ngày tháng năm 20

ThS Đồ Tiến Vinh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn trường Đại học Nguyền Tất Thành, trong suốt thời gian học tập tại đây, tôi đã nhận sự quan tâm, sự chỉ bảo tận của đội ngũ giảng viên của Ban Giám Hiệu nhà trường cũng như Quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học, gia đình và tập thể cả bạn sinh viên khoa Công nghệ sinh học Hiên tại, sau khi đã hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp của mình, với sự biết ơn cùng với sự trân trọng tôi xin chân thành cảm ơn đen:

ThS ĐỒ Tiến Vinh và ThS Mai Thị Phương Hoa phòng nuôi cấy mô te bào thực vật Khoa công nghệ sinh học tại trường Đại học Nguyễn Tất Thành, người thầy người cô đã tận tâm dìu dắt, hướng dần, tận tâm chỉ bảo tôi suốt khoảng thời gian học tập và thực hiện đề tài

Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến với gia đinh và bạn bè của tôi, đã luôn ủng

hộ động viên, giúp đờ, và tạo điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, để tôi có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Bên cạnh đó, do phần kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế Nên nội dung bài báo cáo còn nhiều hạn chế và thiếu sót, tôi rất mong nhận được những phê bình, nhận xét của Quý thầy cô và tất cả bạn bè cùng lớp để nâng cao và bổ sung kiến thức cùa bản thân

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn và kính chúc Quý thầy cô, và đặt biệt là ThS Đồ Tiến Vinh và ThS Mai Thị Phương Hoa dồi dào sức khỏe và gặt hái nhiều thành công trong công viêc

Nguyễn Phương Hoài Bảo Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyền Tất Thành

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

TÓM TẮT iv

SUMMARY V DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi

DANH MỤC BẢNG BIẾU vii

DANH MỤC CHỮ VIỂT TẮT viii

ĐẶT VẤN ĐỀ ix

1 Tính cấp thiết của đề tài ix

2 Mục tiêu đề tài X CHƯƠNG 1 TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Giới thiệu về nấm Đông Cô 1

1.1.1 Phân bố sinh thái 1

1.1.2 Đặc điêm thực vật 1

1.1.3 Thành phần hóa học 2

1.2 Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nuớc 3

1.2.1 Công trình nghiên cứu trong nước 3

1.2.2 Công trình nghiên cứu ngoài nước 3

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 6

2.1 Nơi thực hiện 6

2.2 Nội dung nghiên cứu 6

2.3 Phương pháp nghiên cứu 6

2.3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và khảo sát ảnh hưởng cùa một số loại môi trường đen quá trình nuôi cấy hệ sợi tơ nấm 8

ii

2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần khoáng đến quá trình nuôi

cấy sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng 8

2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hường của nồng độ pH môi trường đến tốc độ tăng trưởng của hệ sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng 9

2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng cùa hàm lượng mẫu nấm Đông Cô ban đầu đến quá trình nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng 9

2.3.5 Đánh giá sự kháng khuẩn của dịch chiết hệ sợi nấm Đông Cô 10

2.4 Thiết kế và phương pháp thu nhập số liệu 10

2.4.1 Thiết kế thí nghiệm 10

2.4.2 Phương pháp thu nhập số liệu 11

CHUÔNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12

3.1 Ket quả phân lập và sự ảnh hưởng cùa một số loại môi trường thạch đến quá trình nuôi cấy hệ sợi tơ nấm 12

3.2 Ket quả sự ảnh hưởng cùa thành phần khoáng đến quá trình nuôi cấy sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng 16

3.3 Xác định được sự ảnh hưởng của nồng độ pH môi trường đến quá trình nuôi cấy sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng 18

3.4 Xác định được sự ảnh hưởng của lượng mẫu nấm Đông cô ban đầu đến quá trình nuôi cấy sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng 19

3.5 Xác định được sự kháng khuẩn của dịch chiết hệ sợi nấm Đông cô được nuôi trong môi trường lỏng 21

3.4.1 Chiết xuất dịch chiết nấm Đông cô 21

3.4.2 Xác định tính kháng khuẩn từ dịch chiết nấm Đông cô 22

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

PHỤ LỤC 26

TÓM TẤT

Đe tài: “Nghiên cứu nhân sinh khối hệ sọi nấm Đông Cô (Lentinula edodes)

trên môi trường lỏng và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết sinh khối

hệ sọi nấm Đông Cô (Lentìnula edodes)”, được thực hiện từ tháng 01 năm 2019 đến tháng 08 năm 2019 tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thực vật khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Nguyền Tất Thành Mục tiêu của đề tài là xác định được phành phần khoáng, nồng độ pH thích họp nhất đe nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô

(Lentinula edodes) trong môi trường lỏng và hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết nấm

Đông Cô Đe tài gồm có năm nội dung khảo sát: Phân lập và khảo sát môi trường thạch đe nuôi cấy sợi tơ nấm Đông Cô; Ảnh hưởng thành phần khoáng đến quá trình nuôi cấy trên môi trường lỏng; Nồng độ pH môi trường ảnh hưởng đến nuôi cấy sợi nấm; Ảnh hưởng của hàm lượng mẫu nấm Đông Cô ban đầu đến sự phát triển sợi nấm;

Và cuối cùng là hoạt tính kháng khuấn của dịch chiết hệ sợi nấm

Ket quả đạt được trong 6 tháng nghiên cứu:

- Môi trường thạch thích hợp để nuôi hệ sợi nấm Đông Cô là PGA + dịch chiết cà rốt

- Môi trường lỏng thích hợp để nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô là PG + dịch chiết cà rốt

- pH để thích họp nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô là 7

- Lượng mầu ban đầu thích hợp nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô là 2 cm2 thạch chứa sinh khối hệ sợi/40ml môi trường

- Dịch chiết sinh khối hệ sợi nấm Đông Cô có khả năng kháng khuẩn

Streptococcus pyogenes.

iv

Thesis:” Research about doubling Yarn type biomass of Shiitake in liquidated environment and evaluating antibacterial feature from extraction of yarn-type shiitake biomass (Lentinula edodes)”, which conducted from January to August of 2019 in biotechnology and plant Lab, Department of High tech agriculture and biometric, Nguyen Tat Thanh University The purpose of this study is determine the suitable mineral composition and pH concentration to grow yam-type shiitake in liquidated environment and antibacterial extraction from shiitake The topic including

4 surveys which are affection of mineral composition to growing process in liquidated environment, pH concentration affect growing process of shiitake, affection of initial shiitake sample to the growing of shiitake and lastly, antibacterial feature of shiitake extraction

After 6 month conducting the research, the results are listed below:

- The agar medium suitable for growing Lentinula edodes mycelium is PGA + 10% of carrot extract

- Suitable liquid medium for culturing Lentinula edodes mushroom mycelium

is PG + carrot extract

- pH to suit the culture of Lentinula edodes mushroom mycelium is 7

- The amount of initial sample suitable for growing Lentinula edodes

mycelium is 2 cm2 of fibrous biomass/40ml of medium

- Lentinula edodes mushroom mycelium extract has antibacterial Streptococcus pyogenes

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Nấm Đông Cô 1Hình 2.1 Sơ đồ tổng quan nghiên cứu 7Hình 3.1 Phân lập nấm Đông Cô trên môi trường PGA: Mầu ban đầu (A); Mầu sau 4 ngày (B); Mầu sau 8 ngày (C); Mầu sau 12 ngày (D) 12Hình 3.2 Nấm Đông Cô sau 4 ngày nuôi cấy trên các môi trường: Môi Trường PGA (A); Môi trường PGA + 10% Nước dừa (B); Môi trường PGA + 100 g/L dịch chiết Cà rốt (C); Môi trường PGA + 3 g/L Pepton (D) 13Hình 3.3 Nấm Đông Cô sau 6 ngày nuôi cấy trên các môi trường A (Môi Trường PGA); B (Môi trường PGA + 10% Nước dừa); c (Môi trường PGA + 100 g/L dịch chiết Cà rốt); D (Môi trường PGA + 3 g/L Pepton) 14Hình 3.4 Hệ sinh khối sợi nấm Đông cô trên môi trường lỏng trên các môi trường Môi Trường PG (A); Môi trường PG + 10% Nước dừa (B); Môi trường PG + 100 g/L dịch chiết Cà rốt (C); Môi trường PG + 3g/L Pepton (D) 17Hình 3.5 Hệ sợi nấm Đông cô trên môi trường lỏng PG + dịch chiết cà rốt với nồng độ

pH = 7 19Hình 3.6 Lọc thu sinh khối hệ sợi nấm Đông cô trên môi trường lỏng PG + dịch chiết

cà rốt với nồng độ pH = 7 21Hình 3.7 Chiết xuất dịch chiết nấm Đông cô từ hệ sợi nấm Đông cô A (hệ tơ nấm Đông cô được ngâm dầm trong môi trường enthanol); B (cao thô nấm Đông cô sau khi cô quay); c (dịch chiết Đông cô pha loãng) 22Hình 3.8 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết nấm Đông Cô: A và B ( Đĩa đối chứng với: A là đìa môi trường vi khuan; B là môi trường vi khuấn có enthanol); c ( Môi trường vi khuẩn đã có dịch chiết nấm Đông Cô) 23

VI

DANH MỤC BẢNG BIÉU•

Bảng 2.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của lượng mẫu nấm Đông Cô ban đầu 10Bảng 3.1 Ket quả xử lý xác định được môi trường thích hợp nuôi cấy nấm Đông Cô 15Bảng 3.2 Kết quả xác định môi trường lỏng thích họp để nuôi cấy hệ sợi nấm ĐC 16Bảng 3.3 Ket quả xác định được nong độ pH tốt nhất ảnh hưởng đến tốc độ sinhtrưởng và phát triển của hệ sợi nấm Đông cô trên môi trường lỏng 18Bảng 3.4 Ket quả xác định sự ảnh hưởng của lượng nấm Đông cô ban đầu 20

DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT

PBMCs: Te bào đơn phân máu ngoại vi

XO : Xanthine oxyase

DSRNA: Can thiệp RNA ( Small interfering RNA)

LeV : virut Lenitmiỉa edodesmycừus

AFM : Kính hiển vi lực nguyên tử

PGA : Môi truờng nuôi cấy có khoai tây, đường và agar (Potato glucose agar)CRD : Bo trí thí nghiệm hoàn toàn ngầu nhiên (Completely randomized design)

PG : Môi trường nuôi cấy có đường và khoai tây (Potato glucose)

viii

ĐẶT VẤN ĐÈ

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nấm là loại thực phẩm gần gũi và rất phổ biến với con người, được xem như là một loại thực phẩm hoàn hảo bởi nó không chỉ mang hương vị độc đáo mà còn về hàm lượng dinh dưỡng mà chúng mang lại Nấm có giá trị như thực phẩm chức năng có nhiều công trình khoa học đã chứng minh nấm là thực phẩm có tác dụng hồ trợ (phục hồi, duy trì hoặc tăng cường) chức năng của các bộ phận trong cơ thể, sử dụng nấm ăn

và nấm dược liệu tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng, phòng chống bệnh tật và tăng cường sức khỏe nhờ các chất chống oxy hóa (beta-caroten, lycopen, vitamin c, vitamin E ), chất xơ và một số thành phần khác Trong đó nấm Đông Cô

(Lentinula edode) hay còn gọi nấm Hương là một loại nấm ăn rất pho biến có nguồn gốc ở Đông Á Tuy nhiên, hiện nay loài này phân bố rộng khắp ở Châu Á và trên thế giới

về dinh dưỡng, trong thành phần nấm Đông Cô có khoảng 30 loại enzym và tất

cả các acid amin cần thiết cho cơ thể và một số hợp chất có tính kháng khuẩn cao Trong đó, Lentinan và Lentinula Edodes mycelium (LEM) là 2 chất chính tạo nên tác dụng dược lý của nấm Nấm Đông Cô là loại thực phẩm rất cần thiết cho những người

bị thiếu máu do thiếu sắt, cao huyết áp, tiêu đường, trẻ em suy dinh dưỡng Trong Đông y nấm Đông Cô được sử dụng trong các bài thuốc bổ tỳ, ích khí, dưỡng huyết, hòa huyết, tiêu đờm ớ Việt Nam nấm Đông Cô mọc hoang nhiều trên thân gổ lớn ở các vùng rừng núi như ở Tuyên Quang, Hòa Bình, Thái Nguyên, Cao Bằng trên các loại cây Dẻ đá, Dẻ đỏ, Soi bộp, Re đỏ Tuy nhiên, do việc khai thác quá mức dần đến nguồn cung nấm Đông Cô tự nhiên cạn kiệt đã làm cho giá thành loại nấm này ngày càng tăng cao (Nấm Đông Cô rời có giá 350.000 đồng/kg, nấm Đông Cô xâu lạt có giá 450.000 đồng/kg) Hiện nay, Nấm Đông Cô đã được nghiên cứu nuôi trồng thành công nhưng để sản xuất loại nấm này đòi hỏi diện tích lớn cần nhiều lao động, thời gian từ khi trồng đế khi thu hoạch dài, phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nhiệt độ độ ẩm nên chỉ có thể trồng ở một số khu vực nhất định dần đến nguồn cung vẫn không được đảm bảo Vì vậy, việc nghiên cứu nhân nhanh sinh khối hệ sợi nấm Đông cô là vô cùng cần thiết Nhân sinh khối hệ sợi nấm Đông Cô trong môi trường lỏng sẽ giúp hệ sợi nấm

phát triển nhanh hơn, sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi trường tránh làng phí các chất dinh dưỡng còn sót lại như trong môi trường chất rắn Với mong muốn rút ngắn được thời gian, giảm chi phí đầu tư mà vẫn đạt hiệu quả sản suất nên việc tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân sinh khối hệ sọi nấm Đông Cô (Lentinula

edodes) trên môi trường lỏng và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết sinh khối hệ sợi nấm Đông Cô (Lentìnula edodes)”.

Chương 1 Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Giới thiệu về nấm Đông Cô

Pỉeiưotaceae Lentinula

Hình 1.1 NấmĐông CôLoài: Lentinula edodes

1.1.1 Phân bố sinh thái

Loài nấm này mọc hoang nhiều ở Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Thái Lan ớ Mỳ, nông dân trồng nấm Đông Cô tại các trang trại Mồi khúc gồ

có the cho nấm ký sinh 3-7 năm Ớ Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc nấm Đông

Cô được khai thác để làm thức ăn và dược liệu từ trước Công nguyên và đã biết trồng nấm hương hơn 1.000 năm trước Văn bản ghi chép về nấm hương đầu tiên ở Nhật Bản khoảng 199 năm trước Công nguyên và văn bản mô tả kỳ thuật trồng nấm hương

đe làm rau và dược liệu ở Trung Quốc do Wu Sang Kwuang dưới triều đại nhà Minh (1368 - 1644) cho biết loài nấm này dùng để trị các bệnh đường hô hấp trên, lưu thông máu kém, yếu gan, kiệt sức và yếu ớt, và để tăng cường sinh lực, ngăn chặn lão hóa sớm ở Việt Nam nấm Đông Cô mọc hoang nhiều trên thân gổ 1cm ở các vùng rừng núi như ở Tuyên Quang, Hòa Bình, Thái Nguyên, Cao Bằng trên các loại cây Dẻ đá,

Dẻ đỏ, Sồi bộp, Re đỏ, máu chó (https://sites.google.com/site/raurungvietnam/nam- an-dhuoc/nam-huong)

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Nấm Đông Cô có dạng như cái ô, đường kính 4-10 cm, màu nâu nhạt, khi chín chuyển thành nâu sậm Nấm hương có một chân đính vào giữa tai nấm Mặt trên tai nấm màu nâu, mặt dưới có nhiều bản mỏng xếp lại Trên mặt nấm có những vảy

Chương 1 Tổng quan tài liệu

nhỏ màu trắng Thịt nấm màu trắng, cuống hỉnh trụ Nấm mọc ký sinh trên những cây

có lá to và thay lá mồi mùa như dẻ, sồi, phong Nấm quả the trưởng thành có hình tán

dù Màu sắc bên ngoài khác nhau tùy loại: Loài L.edodes có màu nâu nhạt nhũ bong,

loài L tigrinus có màu xám, những vết nứt như da hổ Sợi nấm Đông Cô lúc đầu có

đường kính nhỏ khoảng 0,5 - 1,0 mm, về sau lớn dần lên đến kích thước 1 - 2 mm, sau khi các quá trình tiếp hợp và hình thành nấm quả thế ta có mũ nấm có đường kính

từ 3 - 10 cm Lúc đầu mũ có dạng hình nón nhọn ở giừa, sau trài rộng ra và bằng phang, viền mũ thường cuộc vào trong Be ngang của phiến tương đối rộng và có khuynh hướng bám vào cuống nấm Nấm hương không có vòng co và vòng bao gốc, cuống thon đều hoặc hơi tóp ở gốc Cuống nấm có đường kính 0,5 - 1,2 cm, dài khoảng 2,5 - 8 cm (https://sites.google.com/site/raưrungvietnam/nam-an-dhưoc/nam- huong)

1.1.3 Thành phần hóa học

Nấm hương có giá trị dinh dưỡng cao, sử dụng nấm hương làm rau như một thực phẩm cung cap vitamin, chất khoáng cho cơ thế Trong 100 g nấm hương khô (phần ăn được) có chứa 13 g nước; 19 % protein; 1,8 g lipid; 54 g hydratcacbon; 7,8 g chất xơ; 4,9 g chất khoáng, trong thành phần chất khoáng có 124 mg Ca; 415 mg P; 25,3 mg Fe; Vitamin có trong nấm hương 0,07 mg vitamin Bl; 1,13 mg vitamin B2; 2,4 mg vitamin PP; 18,9 mg acid nicotinic; provitamin D Các chất tạo nên hương thơm: Xeton, sulíít, ankan, acid béo

Theo Mizuno yếu tố tạo nên hương thơm, vị ngon của nấm là monosodium glutamate, nucleotit, amino axit tự do, chuồi peptide, acid hữu cơ (axit malic, axit fumalic, axit glutaric, axit oxalic, axit lactic, ) và đường Hơn nữa trong nấm hương

và hệ sợi nấm hương có tới 40 loại enzyme, đáng chú ý nhất là enzyme p (1-3) glucosidaza, kitinaza, esteraza, lipoidaza, ligninaza, almondaza, pepsin, loxintinaza, tannaza, pectinaza, saccaraza, transferaza, maltaza, xenlulaza ,hemixenlulaza, amylotransferaza, inulaza, melibiaza, glycozidaza, ureaza, insulinaza, asparaginaza, peroxydaza, lactaza, cacboxylpeptidaza, tyrozin oxydaza, zymaza, lichen amylaza, chymosin, metalloproteaza (https://sites.google.com/site/raưrungvietnam/nam-an- dhưoc/nam-huong)

2

Chương 1 Tổng quan tài liệu

1.2 Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Công trình nghiên cứu trong nước

Trần Thị Hồng Hà, và các cộng sự của mình đã nghiên cứu;” đánh giá hoạt tính sinh học của polysaccharide và các hợp chất tách chiết từ nấm Đông cô”, cho thấy rằng cặn chiết ethanol của nấm Đông cô có chứa polysaccharie có khả năng ức chế rất tốt với virut ung thư gan Hep-G2 2

Phạm Nữ Kim Hoàng, và cộng sự ở Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Lâm Đồng đã chung tay thực hiện thành công một số đặc điểm sinh học của chuẩn nấm Đông Cô lai

từ núi Langbiang và chủng thương mại Nhật Bản Sau đó, các điều kiện cần thiết cùng phương pháp lai bắt cặp giữa dòng đơn nhân và đa nhân đã loại bỏ các đột biến có hại của bố mẹ, tạo nên con lai có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn hay bằng chủng bố mẹ Con lai có tốc độ phát triển cao nhất trong thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ và glucose (lần lượt là 202,47 và 204,31 pm/giờ); phát trien tương tự chủng thương mại trong các thí nghiệm về pH (191 pm/giờ), pepton (203 pm/giờ) và cao nấm men (196 - 198 pm/giờ) Trong khi đó chủng hoang dã phát triển với tốc độ thấp nhất ở tất

cả các thí nghiệm 3

1.2.2 Công trình nghiên cứu ngoài nước

M Shimizu; I Anzai, 2001, đã nghiên cứu đề tài “phân tích nong độ phóng xạ cesium trong nấm Đông Cô khô (Lentinuỉa edodes) sản xuất tại Nhật Bản”, được đăng tải “Journal of oral science”, bài viết đánh giá việc sử dụng nấm như một chỉ số đo ô nhiễm phóng xạ cho thấy rằng mức độ 137 Cs bị ảnh hưởng chủ yếu bởi các yếu tố môi trường này 4

Ngai PH, Ng TB, 2003 với nghiên cứu “Lentin, một loại protein kháng nấm mới

và mạnh từ nấm Đông Cô có tác dụng ức chế hoạt động của virus - 1 sao chép suy giảm miền dịch ở người và sự tăng sinh của các tế bào ung thư bạch cầu” Từ quả thể của nấm Đông Cô, một loại protein mới được chỉ định là lentin có hoạt tính mạnh đã được phân lập Lentin không được hấp thụ trên DEAE - cellulose và được hấp phụ trên gel màu xanh da trời Affí-gel và Mono s Trinh tự N-terminal của lentin biểu hiện

Chương 1 Tổng quan tài liệu

tương tự như endoglucanase Lentin, có khối lượng phân tử 27,5 kDa, đã ức chế sự tăng trưởng sợi nấm ở một loạt các loài nấm bao gồm Physalospora piricola, Botrytis

cinerea và Mycosphaerella arachidicola Lentin cũng có tác dụng ức chế men sao chép ngược HIV - 1 và tăng sinh tế bào ung thư bạch cầu 5

Kuppusamy ƯR, 2009, cùng với cộng sự cùa mình đã nghiên cứu đề tài: “Chiết xuất nấm Lentỉnula edodes bảo vệ chống độc tế bào gây ra bởi hydrogen peroxide trong các tế bào đơn nhân máu ngoại vi Trong nghiên cứu hiện tại, chiết xuất methanolic của quả the của L edodes đã được nghiên cứu về tác dụng bảo vệ tế bào chống lại tế bào gây độc bởi H2O2 trong các tế bào đơn nhân máu ngoại biên của con người (PBMCs) bằng cách đo hoạt động của xanthine oxyase (XO) và glutathione peroxid H2O2 ở nồng độ 5 microM gây ức chế 50% khả năng tồn tại cùa PBMC Chiết xuất đã cải thiện khả năng tồn tại của PBMC và có tác dụng bảo vệ phụ thuộc vào liều chống lại độc tế bào do H2O2 gây ra6

Julita Regula; Zbigniew Krejpcio; Halina Staniek, 2010 với bài viết “khả năng sử dụng cùa sắt từ các sản phẩm ngũ cốc làm giàu với nấm Đông cô khô (Lentinula

edodes) được xác định bằng phương pháp hiệu quả tái sinh sắt ở chuột cái” Nấm

Đông cô (Lentinula edodes) là nguồn sắt phong phú, ngoài giá trị dinh dưỡng tương

đối cao của chúng còn được đặc trưng bởi hàm lượng cao của các thành phần hoạt tính sinh học Tuy nhiên, khuyến nghị về các sản phẩm được điều chế trên cơ sở nấm shiitake khô và được đưa vào chế độ ăn uống vì nguồn sắt đòi hỏi phải xác định chính xác khả dụng sinh học của nguyên tố này Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá khả dụng sinh học của sắt từ các sản phẩm ngũ cốc với việc bo sung nấm shiitake khô bằng phương pháp hiệu quả tái sinh sắt ở chuột cái thiếu Fe Cho ăn các sản phấm có

bổ sung 10% và 20% Đông cô khô cho chuột cái bị thiếu Fe đã gợi lên trước đó dẫn đến sự phục hồi dần dần các chỉ số Fe hạ thấp, bao gồm sự gia tăng nồng độ hemoglobin trong máu và nong độ Fe trong huyết thanh và gan đến các giá trị tương đương với các nhóm đối chứng Sinh khả dụng của sắt từ các sản phấm ngũ cốc làm giàu với nấm shiitake khô tương đương với gluconate Fe (II)7

Tsivileva OM; 2012, và các công sự đã nghiên cứu đề tài của mình “ Phân hủy hợp chất organoselenium thành selen bởi nấm Đông Cô” được đăng tải trên tạp chí

4

Chương 1 Tổng quan tài liệu

“Biological trace element research” Với nội dung chuyển đôi hợp chất selen hừu cơ thành selenium đỏ (Se), gây ra sắc tố đỏ mạnh mẽ của hệ sợi nấm Đông cô.Sự biến đổi sinh học của 1,5 - diphenyl-3-selenopentanedione - 1,5 (diacetophenonyl selenide, DAPS-25) đă được nghiên cứu trong môi trường nuôi cấy pha lòng và pha rắn của nấm Đông cô Trong môi trường nuôi cấy lỏng, màu đỏ phát triển trong sợi nấm ở nồng độ DAPS-25 ban đầu bằng hoặc cao hơn 0,1 mol/1 Cường độ và thời gian bắt đầu cùa màu là phụ thuộc nồng độ Se Dừ liệu bán định lượng thu được bằng phương pháp hóa lý trên phạm vi sản xuất Se và acetophenone cho thấy L.edodes có the hấp thụ và hoặc phá hủy xenobiotic hừu cơ này 8

Yumi Magae, 2012, với bài viết đặt tính phân tử của một loại mycirut mới được phát hiện trong nấm Đông cô Trong nghiên cứu này, bộ gen DSRNA cùa một loại virus mycirus gần đây được tìm thấy trong một chủng thương mại shiitake đã được giải trình tự và cấu trúc phân tử của nó được đặc trưng Một thư viện cDNA đã được xây dựng từ một DSRNA được tinh che từ cơ thể đậu quả của L edodes Virus được

đặt tên là L edodesmycừus HKB (LeV) Dựa trên trình tự RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp), phân tích phát sinh gen cùa LeV đã được tiến hành Do không có hạt virion nào liên quan đến DSRNA được quan sát bằng kính hiển vi điện tử, quan sát kính hiên vi lực nguyên tử (AFM) đã được chọn để đạt được hình ảnh phân tử của virus

Ariel Drori; Yehudit Shabat; 2016, cùng với các cộng sự cho thấy chiết xuất nấm

“Đông cô có hàm lượng vitamin D cao phát huy đặt tính chống viêm gan” Bài viết được đăng trên “Journal of medicinal food” Được biet vitamin D có đặc tính chống

viêm, Chiết xuất có nguồn gốc từ nấm Đông cô (Lentỉnula edode) có tác dụng chống viêm Các chất chiết xuất này có chứa hàm lượng ergosterol cao, chuyến thành ergocalciferol (vitamin D2) sau khi tiếp xúc với tia cực tím, sau đó hấp thụ và hydroxyl hóa thành dạng hoạt động 25 - hydroxyv vitamin D[25(OH)D] '°

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1 Noi thực hiện

Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 01 năm 2019 đến tháng 08 năm 2019

Địa điềm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật khoa Công Nghệ SinhHọc, Trường Đại học Nguyền Tất Thành

Vật liệu: thí nghiệm được tiến hành trên nấm Đông Cô do Công ty TNHH Thương mại - Xuất nhập khẩu Cao Nguyên Xanh cung cấp

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và khảo sát ảnh hưởng của một số loại môi trường đến quá trình nuôi cấy hệ sợi tơ nấm Đông Cô

- Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần khoáng đến quá trình nuôi cấy sợi nấmĐông Cô trên môi trường lỏng

- Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ pH môi trường đến tốc độ tăng trưởng của

hệ sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng

- Khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng mầu nấm Đông Cô ban đầu đến quá trình nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng

- Đánh giá sự kháng khuẩn của dịch chiết hệ sợi nấm Đông Cô

2.3 Phương pháp nghiên cứu

6

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ tống quan nghiên cứu

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và khảo sát ảnh hưởng của một số loại môi trường đến quá trình nuôi cấy hệ sợi tơ nấm

Phân lập nấm Đông Cô: Ta chọn nấm Đông Cô to khỏe, màu nâu, mủ nấm không nứt nẻ, không sâu bệnh và sau đó đem đi sát khuẩn bằng cồn 70°, nấm Đông Cô đã được sát khuẩn sẽ tiến hành lấy mẫu, dùng dao phẩu thuật cắt lấy mầu Mầu nấm được lấy ở phần tiếp giáp giữa mủ nấm và cuốn nấm sau đó cho vào các ống nghiệm chứa môi trường PGA

Mục tiêu: Xác định được thành phần trên môi trường thạch nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô

Vật liệu: Hệ sợi nấm Đông Cô phân lập tốt nhất

Môi trường nuôi cấy: PGA; PGA + dịch chiết cà rốt (100 g/L); PGA + 10% nước dừa; PGA + Pepton (3 g/L)

Nội dung: Nuôi cấy tơ nấm và xác định điều kiện môi trường thạch đế hệ sợi nấm phát trien tốt nhất

Tiến hành: Chọn hệ tơ tốt nhất trong ống nghiệp đã phân lập, tiếp theo cấy mẫu nấm Đông Cô đã phân lập vào từng loại môi trường: PGA; PGA + dịch chiết cà rốt (100g/L); PGA + 10% nước dừa; PGA + Pepton (3 g/L) Mầu sau khi cấy được nuôi trong điều kiện tối và theo dõi

Chỉ tiêu khảo sát: bán kính tơ lan (cm), đặc điểm hệ sợi

2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần khoáng đến quá trình nuôi cấy sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng

Mục tiêu: Xác định được thành phần khoáng trong môi trường tốt nhất ở thí nghiệm 1 ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy hệ sợi nấm trên môi lỏng

Vật liệu: Hệ sợi nấm Đông Cô nuôi cấy trên môi trường PG

Môi trường nuôi cay: PG; PG + dịch chiết cà rốt (100 g/L); PG + 10% nước dừa;

PG + Pepton (3 g/L)

Tiến hành: Các môi trường thí nghiệm sau khi pha sẽ rót vào các chai thủy tinh có thể tích 250 mL, 40 mL môi trường/chai Mang đi hấp vô trùng, để nguội sau đó lấy hệ sợi nấm tốt nhất cùa môi trường thí nghiệm 1 cấy vào mồi chai và theo dõi

8

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chỉ tiêu theo dõi: sinh khối tươi (g) sinh khối khô (g)

Thời gian theo dõi: 24 ngày

2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ pH môi trường đến tốc

độ tăng trưởng ciia hệ sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng

Mục tiêu: Xác định được nồng độ pH tốt nhất của môi trường trong quá trình nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng

Vật liệu: Hệ sợi nấm Đông Cô nuôi cấy trên môi trường PGA

Môi trường nuôi cấy: Loại môi trường tốt nhất ở thí nghiệm 1

Tiến hành: Môi trường sau khi pha được điều chỉnh pH các mức thí nghiệm (4-5-6 -7-8-9) sau khi rót vào các chai thủy tinh có thể tích 250 mL, 40 mL môi trường/chai Sau đó mang đi hấp vô trùng, để nguội kế tiếp lấy hệ sợi nấm tốt nhất của môi trường thí nghiệm 1 cấy vào mồi chai và theo dõi

Chỉ tiêu theo dõi: sinh khối tươi (g) sinh khối khô (g)

Thời gian theo dõi: 24 ngày

2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng mẫu nấm Đông Cô ban đầu đến quá trình nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng

Mục tiêu: Xác định được sự ảnh hưởng của hàm lượng mầu nấm Đông Cô ban đầu đen quá trình nuôi cấy hệ sợi nấm Đông Cô trên môi trường lỏng

Vật liệu: Hệ sợi nấm Đông Cô nuôi cấy trên môi trường PGA

Môi trường nuôi cấy: Chọn môi trường có nồng độ pH tốt nhất ở thí nghiệm 2

Tiến hành: Pha môi trường lỏng có nồng độ pH tốt nhất đã được xác định ở thí nghiệm 3, rót vào chai thủy tinh có thế tích 250 mL, 40 mL môi trường/chai Sau đó mang đi hấp vô trùng, đe nguội Dùng que cấy móc cắt mầu thạch có chứa sinh khối

hệ sợi Nấm Đông Cô với kích thước 1x1 cm Sau đó, cấy các mầu sinh khối hệ sợi vào các chai môi trường tốt nhất của môi trường thí nghiệm 1 cấy vào mồi chai (lượng mẫu cho vào theo bảng 2.1) và theo dõi Sau 24 ngày, tiến hành thu sinh khối hệ sợi nấm Đông Cô

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chỉ tiêu theo dõi: Sinh khối tươi (g) và sinh khối khô (g)

Thời gian theo dõi: 24 ngày

Bảng 2.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của lượng mầu nấm Đông Cô ban đầu

2.3.5 Đánh giá sự kháng khuẩn của dịch chiết hệ sợi nấm Đông Cô

Nghiệm thức Môi trường Lượng mẫu nấm

1234

pH tốt nhất ở thí nghiệm 4

Mục đích: Xác định được tính kháng khuẩn cùa dịch chiết hệ sợi nấm Đông CôVật liệu: Hệ sợi nấm Đông Cô

Tiến Hành: Sinh khối sau khi thu sè được sấy khô và tiến hành tách chiết dược chất Nồng độ ức chế tối thiểu của cao ethanol đối với vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch Dịch chiết được trích và pha loãng với ethanol nên sử dụng ethanol làm đối chứng âm Thí nghiệm lặp lại 3 lần Ket quả kháng khuẩn của dịch chiết được xử lý thống kê bằng phương pháp ANOVA

Chỉ tiêu theo dõi: Vòng kháng khuẩn

Thời gian theo dõi: 2 ngày

2.4 Thiết kế và phương pháp thu nhập số liệu

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.4.2 Phương pháp thu nhập số liệu

Số liệu thu nhập bằng cách đo bán kính tơ lan, khoảng cách từ tâm điếm đến khoảng cách xa nhất cùa hệ sợi theo đường kẻ ban đầu

Sử lý số liệu thống kê bằng phần men excel Tốc độ sinh trưởng trung bình của

hệ sợi nấm trên các môi trường:

X=(X,+X2+X3+ +Xn)/Yn

Với:

X: Tốc độ sinh trưởng trên các môi trường

Yn: Số quan sát