luận văn thạc sỹ: Nghiên cứu phương pháp xác định vitamin D (D2, D3) và vitamin K2 trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LCMSMS)

luận văn thạc sỹ: Nghiên cứu phương pháp xác định vitamin D (D2, D3) và vitamin K2 trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LCMSMS). Tổng quan về vitamin D và K, kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần phối khổ (Icmsms); nội dung và phương pháp nghiên cứu; kết quả nghiên cứu và thảo luận.

TRƯỜNG ĐẠ I H C BÁCH KHOA HÀ NỘI Ọ

Gi ả ng viên hư ớ ng dẫn: TS Vũ Hồng Sơn

Vi ệ n: Công ngh Sinh h c và Công nghệ ọ ệ Thực phẩm

HÀ N I, 20 Ộ 22

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độ ậ c l p – T – H ự do ạ nh phúc

B Ả N XÁC NHẬN CHỈNH SỬ A LU Ậ N VĂN THẠC SĨ

H ọ và tên tác giả ận văn : Phạ lu m Th ị Đoan

Đề tài luận văn: Xác định vitamin D (D2, D3) và vitamin K2 trong th c ự

phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC-MS/MS)

Chuyên ngành: Công nghệ ự th c phẩm

Mã số SV: 20202044M

Tác giả, Người hướng d khoa hẫn ọc và Hộ ồi đ ng chấm luận văn xác

nh n ậ tác giả đã sửa chữa, bổ sung luậ văn theo biên bản họp Hội đồng ngàyn 27/04/2022 với các nội dung sau:

1 Giải thích thêm vai trò của vitamin K2 trong quá trình hấp thu canxi

2 B ổ sung phần bàn luận kết quả phân tích

3 B ổ sung kết quả phân tích mẫu thực tế ột số ẫu thực phẩ m m m

4 B ổ sung phụ ục gồm số ệu thô và sắc ký đồ l li chu n, m u phân tích ẩ ẫ

Ngày tháng năm 2022

Ủ Ị CH HỘI ĐỒ

Lời đầu tiên, tôi xin bày t lòng kính trỏ ọng và biết ơn sâu sắ ếc đ n th y giáo ầTS.Vũ Hồng Sơn Trưở- ng b môn Qu n lý chộ ả ất lượng, Vi n Công ngh Sinh h c ệ ệ ọ

và Công nghệ Th c Phẩm, Trường Đạ ọự i h c Bách Khoa Hà Nội, là người hướng

dẫn tôi trong suốt quá trình ọc tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn h

Đặc bi t xin chân thành cệ ảm ơnThS Lê Hồng Dũng vàThS Tr n Quang ầ

Th y cùng ủ các anh chị làm việc tại Khoa Hóa thực phẩm, Vi n ệ dinh dưỡng vì

những chỉ ảo tận tình về c ảchuyên môn và tác phong làm vi c trong su t th b ệ ố ời gian tôi làm việc và nghiên cứu tại khoa

Tôi xin trân tr ng cọ ảm ơn Ban giám hiệu, Bộ ận sau Đạ ph i h c, Phònọ g đào tạo, phòng khảo thí Đại học Bách khoa Hà Nội, đã tạo các điều kiện cho tôi được

học tập và làm khóa luận một cách thuận lợi

Tôi mu n g i lố ử ời cảm ơn chân thành đế ập thể ớp 20BCNTP đã cùng tôi n t l

đi qua những tháng ngày mi t mài hệ ọc tập, cùng chia sẻ những ni m vui n i buề ỗ ồn, động viên tôi đi qua những khó khăn, để tôi vững bước vượt qua những vất vả, quyết tâm hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn gia đình và b n bè ạ đã mang tớ ấ ả ềi t t c ni m tin, định hướng và theo dõi tôi su t chố ặng đường đời Nâng đỡ và đ n bên tôi nh ng ế ữgiây phút khó khăn nhấ ủt c a cu c s ng, tộ ố ạo điểu ki n thu n l i cho tôi trong su t ệ ậ ợ ốquá trình th c hiự ện đềtài và hoàn thành b n luả ận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

và làm việc hết công su t, nhấ ờ ộ m t chế độ ăn u ng cân b ng vố ằ ới đúng loại vitamin

và khoáng chấ ểt đ tăng cường sự hình thành, phát tri n cể ủa xương Trong số đó, vitamin K2, cùng v i Canxi và vitamin D là 3 vi ch t quan tr ng giúp hình thành, ớ ấ ọphát triển và đảm bảo sức khỏe của xương, nhất là trong thờ ỳi k 6-11 tu i Ph n ổ ầ

lớn vitamin D2 và D3 trong chế độ ăn uố đế ừng n t việc tăng cường th c phự ẩm như các sản ph m s a ẩ ữ Vì cầ ản đ m bảo mứ ộc đ b ổsung trong các s n ph m th c phả ẩ ự ẩm

là chính xác, thử nghiệm cần có các phương pháp thân thiệ ới ngườn v i dùng, ít t n ố

thời gian,và chính xác Cũng như nhu cầ ớc tính hàm lượu ư ng vitamin trong khẩu phần ăn hàng ngày Vì vậy chúng tôi l a ch n đề tài nghiên cứu phương pháp “Xác ự ọ

đị nh vitamin D (D2, D3) và vitamin K2 trong th c ph m b ng phương pháp ự ẩ ằ

s ắ c ký lỏng khối phổ 2 lần (LC MS/MS)”

-b) M ục đíc h nghiên c u c ứ ủ a lu n văn, đố ợ ậ i tư ng, ph m vi nghiên c u: ạ ứ

Mục tiêu cụ ể th :

 Khảo sát và chọn lựa quy trình chiết và phân tích s c ký phù hắ ợp để xác

định Vitamin D và Vitamin K2 trong th c ph m ự ẩ

 Thẩm định các thông số ủa quy trình phân tích theo tiêu chu n A c ẩ OAC Đối tượng nghiên c u: ứ

Đố ới v i Vitamin D2 ti n hành nghiên cế ứu trên đối tượng: n m ấ

t l n Viatmin D3: thị ợ

s th t bò Vitamin K2: ữa bột, ị

c) Tóm t ắt cô đọ ng các n ộ i dung và phương pháp nghiên c ứ u:

- T ổng quan về vitamin D2 D3 và vitamin K2, các phương pháp nghiên cứu trước đây

Khảo sát, tối ưu thông số ận hành thiết bị LC MS/MS để phân tích đị v - nh lượng vitamin D2, D3, K2

- T ối ưu quy trình tách chiết các chất cần phân tích trên các nền mẫu đã lựa chọn

- Phương pháp phân tích sau khi đã khảo sát và lựa chọ các điều kiện phù n hợp được thẩm định nhằm xác nhận giá trị s dử ụng theo yêu cầu của tiêu chuẩn AOAC 2012

Tác gi mong muả ốn đểnghiên c u có th hoàn thiứ ể ện hơn nữa, các hướng phát tri n kể ế ế ti p của đềtài được đặt ra như sau:

 Do chưa có đủ điề u ki n v th i gian, v t ch t nên nhóm nghiên cệ ề ờ ậ ấ ứu đang

rất hạn chế ề đối tượng nền mẫu nghiên cứu, chúng tối mong muốn tiế v p tục xây dựng các quy trình phân tích vitamin D, K trên các nền mẫu khác như sản phẩm dinh dưỡng công th c, th c ph m b o v s c kh e ứ ự ẩ ả ệ ứ ỏ

 Ứng d nụ g quy trình đã xây dựng phân tích các lo i thđể ạ ực phẩm và ản s

phẩm có mặt trên thị trường

H Ọ C VIÊN

Ký và ghi rõ họ tên

Ph ạ m Thị Đoan

i

M Ụ C LỤ C

CHƯƠNG 1 TỔ NG QUAN V Ề VITAMIN D VÀ K 1

1.1 Tổng quan về vitmin D2, D3 và K2 1

Nguồn gốc và tính chất của Vitamin D 1

Nguồn gốc về tính chất của vitamin K 3

1.2 Tổng quan các nghiên cứu liên quan 6

Các nghiên cứu liên quan đến vitamin D2 và D3 6

Các nghiên cứu liên quan đến vitamin K 7

1.3 Tổng quan về ỹ k thuật sắc ký ỏng ghép hai lần phối khổl (lc-ms/ms) 8

Nguyên lý chung 8

Các loại đầu dò khối phổ 9

Nguồn ion hóa trong đầu dò khôi phổ 10

1.3.3.3 Ion h a b ng photon t ó ằ ạ i á p su t kh ấ í quyể n (APPI) 12

Một số ỹ k thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ 12

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NG HIÊN C U 14 Ứ 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứ 14u Đối tượng nghiên c u 14ứ Hóa ch t và thi t bấ ế ị 14

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 16

Khảo sát, tối ưu thống số ận hành thiết bị LC-MS/MS v 16

Tối ưu quy trình chiết mẫ 18u 2.3 Thẩm định phương pháp 22

Tính ch n lọ ọc 22

Khoảng tuyến tính và đường chuẩ 22n Giớ ại h n phát hi n (LOD); Gi i hệ ớ ạn định lượng (LOQ) 23

Độ ặ ạ l p l i 23

Độ thu h i 24ồ Tiêu chu n AOACẩ 25

Tính toán k t quế ả 25

CHƯƠNG 3 Ế K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 26 Ả Ứ Ả Ậ 3.1 Điều kiện vận hành thiết bị LC-MS/MS 26

Điều ki n kh i ph 26ệ ố ổ Lựa chọn điều kiện sắc ký 29

ii

3.2 Quy trình chi t mế ẫu 37

Quy trình chi t vitamin D2 và D3ế 37

Quy trình chi t vitamin K2ế 38

3.3 Thẩm định phương pháp 40

Độ ổn định c a thi t b 40ủ ế ị Tính ch n lọ ọc 40

Khoảng tuyến tính và đường chuẩ 45n Giớ ại h n phát hi n LOD và gi i h n đệ ớ ạ ịnh lượng LOQ 46

Độ ặ ại và độ l p l thu h i cồ ủa phương pháp 48

CHƯƠNG 4 KẾ T LU N 61 Ậ TÀI LI U THAM KH Ệ Ả O 62

iii

DANH M C HÌNH V Ụ Ẽ

Hình 1.1 C u t o viatmin D2 và D3ấ ạ 1

Hình 1.2 C u t o vitamin K1 và K2ấ ạ 4

Hình 1.3Sơ đồ ạo ion dương bằ t ng ngu n ESIồ 10

Hình 1.4 Lựa chọn ki u t o ionể ạ 11

Hình 1.5 Thiế ị LC-t b MS/MS Qtrap 5500 Sciex 13

Hình 1.6 Mô hình b phân tích tộ ứ ự c c chập ba 13

Hình 2.1Xác định LOD b ng cách tính S/N 23ằ Hình 3.1 Phổ khảo sát các ion c a vitamin Dủ 2 – Q1 27

Hình 3.2 Phổ khảo sát các ion con của vitamin D2, mảnh 397,4 Da – Q3 27

Hình 3.3 Phổ khảo sát các ion c a vitamin Dủ 3 – Q1 28

Hình 3.4 Phổ khảo sát các ion con c a vitamiủ n D3, mảnh 385,4 Da – Q3 28

Hình 3.5 Phổ khảo sát các ion c a vitamin Kủ 2 – Q1 29

Hình 3.6 Phổ khảo sát các ion con của vitamin K2, mảnh 445,4 Da – Q3 29

Hình 3.7 Chu n mix 200ppb c t ODSẩ ộ 30

Hình 3.8 Chu n mix 200ppb c t XDBẩ ộ 31

Hình 3.9 Mix chuẩn 200ppb Pha động 1 điều kiện đẳng dòng tốc độ 1ml/phút 32

Hình 3.10 Mix chuẩn 50ppb pha động 2 điều kiện đẳng dòng tốc độ 1ml/phút 33

Hình 3.11 Mix chuẩn 200ppb pha động 1 gradient 1 34

Hình 3.12 Mix 200ppb Pha động 2 gradient 1 (AOAC) 35

Hình 3.13 Mix 200ppb pha động 2 gradient 2 36

Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu chu n,dung môi, m u blank, m u n p chu n vitamin ẩ ẫ ẫ ạ ẩ D2 trên n n nề ấm 41

Hình 3.15 Sắc ký đồ ẫ m u chu n, mẩ ẫu blank, mẫ ạu n p chu n vitamin D3 n n thẩ ề ịt l n ợ 42

Hình 3.16 Sắc ký đồ ẫ m u chu n, m u blank, m u n p chu n vitamin K2 trên nẩ ẫ ẫ ạ ẩ ền thịt bò 43

Hình 3.17 Sắc ký đồ ẫ m u chu n, m u blank, m u n p chu n vitamin K2 trên nẩ ẫ ẫ ạ ẩ ền sữa bộ 44t Hình 3.18 Đường chu n vitamin D2 46ẩ Hình 3.19 Đường chu n vitamin D3 46ẩ Hình 3.20 Đường chu n vitamin K2 46ẩ Hình 3.21 Sắc ký đồ chuẩn vitamin D2_2ppb 47

iv

Hình 3.22 Sắc ký đồ chuẩn vitamin D3_2ppb 47Hình 3.23 Sắc ký đồ chuẩn vitamin K2_1ppb 47Hình 3.24 Sắc ký đồ ẫ m u blank và mẫu nạp chuẩn D2 trên nền n m 52ấHình 3.25 Sắc ký đồ ẫ m u blank và mẫu nạp chuẩn D3 trên n n th t lề ị ợn 55Hình 3.26 Sắc ký đồ ẫ m u blank và mẫu nạp chuẩn K2 trên n n sề ữa bột 57Hình 3.27 Sắc ký đồ ẫ m u blank và mẫu nạp chuẩn K2 trên n n th t bòề ị 58

v

DANH M Ụ C B Ả NG BI Ể U

Bảng 1.1 Nhu cầu khuyến nghị ề vitamin D 3 v

Bảng 1.2 Nhu cầu vitamin K khuyến nghị (AI) 6

Bảng 2.1 Dãy chuẩn mix vitamin D2, D3 pha trong dung môi ACN 15

Bảng 2.2 Các thông số cho bộ ận tạo nguồn ion 16 ph Bảng 2.3 Các thông số ủa bộ ận phân tích khối 17 c ph Bảng 2.4 Điều kiện gradient 1 (AOAC) 18

Bảng 2.5 Điều kiện gradient 2 18

Bảng 2.6 Điều kiện đẳng dòng đối với pha động 1, 2 18

Bảng 2.7 Hằng số điện môi của mộ ốt s dung môi hữu cơ 19

Bảng 2.8 Biểu mẫu tính toán độ ặp lạ 24 l i Bảng 2.9 Biểu mẫu tính toán độ thu hồ 24i Bảng 3.1 Các thông số ối ưu hóa điều kiện phân mảnh của mỗi vitamin 26 t Bảng 3.2 Khảo sát số ần chiết bằng n l -hexan 37

B ng ả 3.3 Khảo sát điều kiện xà phòng hóa 38

Bảng 3.4 Khảo sát quá trình thủy phân vitamin K2 39

Bảng 3.5 Khảo sát thể tích dung môi chiế 39t Bảng 3.6 Kết quả ảo sát s kh ự ổn định c a thi t bủ ế ị 40

Bảng 3.7 Sự tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chu n ẩ 45

Bảng 3.8 Mức nạp chuẩn và lượng chuẩn thêm vào với từng chấ t 48 Bảng 3.9 Kết quả độ ặp lại và độ thu hồi vitamin D2 trên nền nấ ở ứ ồ l m m c đ ng độ ấ th p 49

Bảng 3.10 Kết quả độ lặp lại và độ thu hồi vitamin D2 trên nền nấ ở ứ ồm m c đ ng độtrung bình 50

Bảng 3.11Kết quả độ ặp lại và độ thu hồi vitamin D2 trên nền nấ ở ứ ồ l m m c đ ng độ cao 50

Bảng 3.12 Kết quả độ ặ l p lại và độ thu h i vitamin D3 trên n n thồ ề ịt lợn ở ứ m c đồng độ ấ th p 52

B ng ả 3.13 Kết quả độ ặ l p lại và độ thu hồi vitamin D3 trên n n thề ịt lợn ở ứ m c đồng độtrung bình 53

Bảng 3.14 Kết quả độ ặ l p lại và độ thu h i vitamin D3 trên n n thồ ề ịt lợn ở ứ m c đồng độ cao 53

vi

Bảng 3.15 Kết quả độ ặ l p lại và độ thu h i vitamin K2 trên n n sồ ề ữa b t mộ ở ức đồng độ ấ th p 55Bảng 3.16 Kết quả độ ặ l p lại và độ thu h i vitamin K2 trên n n sồ ề ữa bộ ở ứt m c đồng độtrung bình 56Bảng 3.17 Kết quả độ ặ l p lại và độ thu h i vitamin K2 trên n n sồ ề ữa bộ ở ứt m c đồng độcao 56

Bảng 3.18 Kết quả độ ặp lại và độ l thu h i vitamin K2 trên nồ ền thịt bò ở m c ứđồng độ ấ th p 59

Bảng 3.19 Kết quả độ ặp lại và độ l thu h i vitamin K2 trên nồ ền thịt bò ở m c ứđồng độ trung bình 59

Bảng 3.20 Kết quả độ ặp lại và độ l thu h i vitamin K2 trên nồ ền thịt bò ở m c ứđồng độ cao 60

Bảng 3.21 Kết quả phân tích hàm lượng vitamin D2, D3, K2 trên một số ạ lo i

thực phẩ 60m

vii

DANH M C T Ụ Ừ NG VI Ữ Ế T T Ắ T

AOAC Analytical communities Association of Official Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức CAD Collision Gas Pressure Áp suất khí bắn phá

CE Collision Energy Năng lượng bắn phá

CXP Collision cell Exit Potential Th ế đầu ra

DP Declustering Potential Th ế đầu vào

ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử

GS1 Ion Source Gas 1 Áp suất khí 2 bên đầu phunGS2 Ion Source Gas 2 Áp suất của luồng khí nóng (GS2)HPLC Liquidchromatography High performance Sắc ký lỏng hiệ năng cao u

LC-MS/MS tandem mass spectrometry Liquid chromatography Sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổLOD Limit of detection Giới hạn định tính

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

1

CHƯƠNG 1 Ổ T NG QUAN V Ề VITAMIN D VÀ K

1.1 T ổng quan về vitmin D2, D3 và K2

Ngu ồ n gốc và tính chất của Vitamin D

Vitamin D là ch t tinh thấ ể hình kim không màu, không mùi, không tan trong nước, hòa tan trong d u m , tan trong dung môi hầ ỡ ữu cơ như ethanol, cloroform, methanol Tên g i khác c a Vitamin D là calciferol Vitamin D là m t nhóm gọ ủ ộ ồm

t D2 ừ đến D song có hai hoạt tính m nh nh t là Vitamin D7 ạ ấ 2 còn gọi là

Ergocalciferol và Vitamin D còn Cholecalcif3 erol [1]

Hình 1.1 Cấu tạo viatmin D2 và D3

T l ỷ ệ Vitamin D đóng góp từ nguồn thực phẩm là rất nhỏ so với Vitamin D đượ ổc t ng h p dượ ới da khi phơi nắng Trong cơ thể người Vitamin D3được tổng

hợp từ 7 dehydrocholesterol ở dưới da nhờ ánh sáng tử ngo i [1] Nguạ ồn thực

phẩm tự nhiên có nhiều Vitamin D nhất là dầu gan cá, các loại cá mỡ như cá trích, cá mòi, cá ngừ cũng chứa nhiều Vitamin D Lượng nhỏ hơn Vitamin D có

th ểtìm thấy trong gan động vật, trứng và các sản phẩm từ ữa Ngũ cốc, rau, quả skhông có Vitamin D, còn th t, gia cị ầm và cá có ch a mứ ột lượng không đáng kể

Vai trò của viatmin D đố ới cơ thể con người v i:

Vitamin D điều hòa quá trình tạo xương nhờ tác dụng chuyển hóa chất vô cơ chủ yếu là canxi và phosphate ở ruột, tham gia vào quá trình canxi hóa sụn nên

nó rất cần cho sự phát triển xương ở trẻ em Vì vậy, việc xác định nhu cầu Vitamin D khuyến nghị cho cộng đồng rất quan trọng góp phần dự phòng nhiều bệnh liên quan đến vi chất này

Khi thiếu Vitamin D ruột không hấp thu đủ canxi và phospho làm canxi máu giảm gây hậu quả trẻ em chậm lớn, còi xương, chân vòng kiềng, chậm biết đi, chậm kín thóp, người lớn bị loãng xương, xốp xương, xương thưa dễ gãy, phụ nữ

có thai thiếu Vitamin D sinh ra trẻ khuyết tật ở xương [2] Tình trạng thiếu Vitamin D gây giảm quá trình khoáng hóa hoặc khử khoáng calci từ xương, dẫn tới còi xương ở trẻ em [1], [2] Thiếu Vitamin D ở người trưởng thành dẫn tới khiếm khuyết trong quá trình khoáng hóa gây chứng nhuyễn xương, đồng thời gây cường năng tuyến cận giáp Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy thiếu

2

Vitamin D có thể liên quan đến tăng nguy cơ mắc ung thư đại tràng, ung thư vú

và ung thư tuyến tiền liệt

Tiêu thụ quá nhiều Vitamin D thường ít khi xảy ra vì Vitamin D có hàm lượng nhỏ từ thực phẩm Tuy nhiên nếu dùng thuốc bổ sung Vitamin D quá liều

có thể gây ra các triệu chứng như tăng nồng độ calci huyết, tăng canxi niệu, yếu

cơ, đa niệu, đau khớp, đau nhức xương khớp, tạo sỏi thận, tăng huyết áp, mất phương hướng, nếu không xử lý kịp có thể chết người [2]

Theo công trình nghiên cứu khảo sát tác dụng của Vitamin D với bệnh ung thư ở bang Chicago trong 19 năm các tác giả nhận thấy tỉ lệ ung thư kết tràng ở , nam giới giảm 55% nếu hàng ngày được bổ sung Vitamin D là 3,75mcg Theo công trình nghiên cứu của Danson Huges và các cộng sự tiến hành trên đối – tượng phụ nữ được bổ sung Vitamin D 400IU/ ngày và nhóm phụ nữ khác không đượcbổ sung [3] Năm 2011, theo khuyến cáo của Viện Y học Hoa Kỳ (IOM), nhu cầu Vitamin D ở trẻ < 1 tuổi là 400 IU/ngày, ở trẻ em từ 1 tuổi trở lên và người trưởng thành < 50 tuổi là 600 IU/ngày, ở người trưởng thành từ 50 tuổi trở lên và phụ nữ mang thai hoặc đang cho con bú là 800 IU/ ngày[4] Theo nghiên cứu của trường Y Havard được đăng trên tạp chí của Hiệp hội y học Mỹ cho thấy Vitamin D có thể giúp giảm nguy cơ mắc bệnh đa xơ cứng Các nhà nghiên cứu

đã so sánh lượng Vitamin D ở 257 mẫu huyết tương trong số hơn 7 triệu mẫu của nhân viên quân đội Mỹ, họ phát hiện rằng người da trắng nhóm có hàm lượng Vitamin D cao nhất có nguy cơ mắc bệnh đa xơ cứng thấp nhất Bệnh đa xơ cứng

là bệnh mãn tính của hệ thần kinh, bắt đầu với các triệu chứng như mất trí nhớ, suy nhược, mệt mỏi, đau đớn hoặc liệt, chóng mặt, và sau đó ảnh hưởng tới tim mạch

Nhu cầu khuyến nghị vitamin D theo từng độ tuổ cho người Việt Nam theo i khuyến cáo của Bộ Y Tế [2]

3

B ng 1.1 ả Nhu cầu khuy n ngh ế ị ề v vitamin D

Ngu ồ n gốc về tính chất của vitamin K

Vitamin K là tên chung của một nhóm hợp chất có cấu trúc hóa học phổ biến

là 2-metyl-1,4-naphthoquinone, là một loại vitamin tan trong chất béo có tự nhiên trong một số loại thực phẩm và có sẵn dưới dạng thực phẩm chức năng Các hợp chất này bao gồm phylloquinone (vitamin K1) và một loạt menaquinone (vitamin K2) Menaquinon có chuỗi bên isopropen không bão hòa và được ký hiệu là MK-

4 đến MK 13, dựa trên độ dài của chuỗi bên của chúng - MK-4, MK 7 và MK- -9

là những menaquinon được nghiên cứu kỹ lưỡng nhất [5]

Vitamin K không hòa tan trong nước,hòa tan nhẹ trong rượu và hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ không phân cực ví dụ: n- hexan, ete và cloroform[6]

Phylloquinone K1 có mặt chủ yếu trong các loại rau lá xanh và là dạng vitamin K chính trong chế độ ăn uống Menaquinon K2chủ yếu có nguồn gốc vi khuẩn, có mặt với hàm lượng nhỏ trong các loại thực phẩm lên men và có nguồn gốc từ động vật Hầu hết tất cả các menaquinon, đặc biệt là các menaquinon chuỗi dài, cũng được sản xuất bởi vi khuẩn trong ruột người MK-4 làmenaquinon duy nhất được cơ thể sản xuất từ phylloquinone thông qua một quá trình chuyển đổi không liên quan đến hoạt động của vi khuẩn

và 40% đến 50% trong phân qua mật Sự trao đổi chất nhanh chóng này làm cho lượng vitamin K trong máu và dự trữ trong mô tương đối thấp so với các vitamin tan trong chất béo khác [5]

Vitamin K trong cơ thể giúp cho quá trình đông máu hay tạo huyết khối Để quá trình máu đông hiệu quả là rất phức tạp Hàng chục hoặc nhiều hơn các

protein có liên quan, và một phần ba trong số này đòi hỏi một lượng đủ Vitamin

K nếu muốn làm việc đúng cách Như đã đề cập trong phần giới thiệu của bài viết này, sự thiếu hụt nghiêm trọng Vitamin K là hiếm thấy ở người lớn khỏe mạnh (nhưng có thể gây ra một số vấn đề cho người có đường tiêu hóa nhất định hoặc mắc bệnh về gan)

5

Tuy nhiên, sự thiếu hụt Vitamin K nhẹ thực sự có thể gây huyết khối không mong muốn và tương đối phổ biến hơn Cơ thể chúng ta thường ngăn ngừa huyết khối không mong muốn thông qua 1 quá trình liên quan đến GLA Protein Matrix (và một số hệ thống enzym phụ thuộc Vitamin K khác Nếu chế độ ăn của bạn có lượng Vitamin A quá thấp, bạn có thể phải trải nghiệm nhiều hơn các huyết khối không mong muốn có khả năng dẫn đến sự căng thẳng hơn về vấn đề tim mạch.Trong khi rất khó để chứng minh Vitamin K giúp chúng ta tránh các rủi ro của bệnh tim, nhưng rõ ràng có Vitamin K trong chế độ ăn duy trì mạch máu khỏe mạnh và khả năng đông của máu Thực phẩm giàu Vitamin K là các sản phẩm có nguồn gốc thực vật, đặc biệt là giàu K1 – màu xanh lá, giúp duy trì một trái tim khỏe mạnh giữa các lợi ích sức khỏe khác [7] [8] ,

Hiện nay vitamin K2đang được quan tâm do K2 và D3 là hai vitamin có vai trò quan trọng trong việc phát triển của xương Viện Y học Ứng dụng Việt Nam (VIAM) vừa công bố kết quả nghiên cứu hiệu quả phát triển chiều cao đối với trẻ

em từ 8 11 tuổi của sữa chứa bộ ba Vitamin K2, Canxi và Vitamin D3– Theo

đó, sau 3 tháng được bổ sung sữa với Công thức Cao Lớn chứa Vitamin K2, tình trạng dinh dưỡng của trẻ đã được cải thiện một cách rõ rệt, cụ thể trẻ tăng chiều cao nhanh hơn 18.2% và tăng cân nhanh hơn 19.7% so với nhóm trẻ uống sữa không chứa công thức này [9]

Canxi đóng vai trò quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể, điển hình như tham gia vào quá trình co cơ, dẫn truyền thần kinh, giải phóng hormon và nhất là việc tham gia vào cấu trúc của xương và răng Canxi được đưa vào cơ thể

ở dạng thức ăn qua miệng rồi vào ruột non, tại đây có hai trường hợp xảy ra, một canxi bị đào thải qua đường tiêu hoá, hai là được hấp thụ vào cơ thể (đi đến xương và răng chiếm 99%, máu 1%) Tuy nhiên, canxi không thể tự mình “cán đích” mà phải nhờ vào sự trợ giúp của rất nhiều vi chất dinh dưỡng, trong đó

có vitamin K2 Vitamin K2 vận chuyển canxi từ hệ tuần hoàn vào các mô xương bằng cách kích hoạt hai loại protein vận chuyển canxi chính trong máu là matrix Gla protein (vận chuyển canxi từ hệ tuần hoàn vào xương – MGP) và osteocalcin – đóng vai trò chủ đạo trong việc kích hoạt tế bào osteoblast (tạo cốt bào) tạo xương phát triển Nếu cơ thể thiếu “ tác nhân vận chuyển” thì canxi sẽ bị phân tán

và có thiên hướng gắn vào mô mềm, mạch máu hơn là ngắn vào xương Điều này không chỉ hạn chế quá trình tăng trưởng chiều cào mà còn gây ra nguy cơ loãng xương và mắc bệnh tim mạch trong tương lai

Tình trạng thiếu Vitamin K thường xảy ra ở trẻ sơ sinh không phải do dinh dưỡng kém của mẹ trong quá trình mang thai mà do kém vận chuyển chất dinh dưỡng qua nhau thai hoặc do hệ vi khuẩn ruột ở trẻ không tổng hợp được Vitamin K Nếu bị thiếu Vitamin K, trẻ có thể mắc chứng chảy máu nguy hiểm Người trưởng thành hiếm khi thiếu Vitamin K Nguy cơ thiếu vitamin K nghiêm trọng là lớn nhất ở trẻ sơ sinh, vì dự trữ vitamin K thấp, ruột vô trùng của chúng không sản xuất menaquinon và vitamin K hàm lượng trong sữa mẹ

6

thấp Sự thiếu hụt này được gọi là bệnh xuất huyết của được sinh ra, và nó được ngăn ngừa ở nhiều quốc gia bằng cách dự phòng phylloquinone khi sinh [6] Nhu cầu vitamin K khuyến nghị [5] theo Ban Thực phẩm và Dinh dưỡng (FNB)

B ng 1.2 ả Nhu cầu vitamin K khuyến nghị (AI)

1.2 T ổng quan các nghiên cứu liên quan

Các nghiên cứ u liên quan đ ế n itamin D2 và D3 v

Do vai trò quan trọng của Vitamin D đối với sức khỏe, trên thế giới đã phát triển nhiều kỹ thuật phân tích Vitamin D trong thực phẩm và các mẫu sinh hóa Phương pháp phân tích phổ biến hiện nay là sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [10], [11 goài ra các tiêu chuẩn phát triển gần đây đã sử dụng phương ] Npháp sắc ký lỏng khối phổ[12], [13] để định lượng Vitamin D trong thực phẩm M.M Delgado Zamarreno, A Sanchez Perez của trường đại học Salamanca Tây Ban Nha đã nghiên cứu hàm lượng Vitamin hòa tan trong chất béo của mẫu sữa chua bằng phương pháp HPLC với detector PDA và đưa ra các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích Vitamin A, E, D như điều kiện thủy phân, tách các chất trong khi xử lý mẫu, kết quả của nghiên cứu này đưa ra độ thu hồi Vitamin D3là 91 5% với hàm lượng Vitamin D trong mẫu là 0,09 mcg/100g 3 5% [14]

Theo nghiên cứu công bố trên Food Chemistry Vol.57, No.1 95 99, 1996 ở Anh các nhà nghiên cứu đưa ra cách xử lý mẫu, đều phân tích xác định hàm lượng Vitamin D trong thực phẩm, kết quả nghiên cứu này cho thấy hệ số biến thiên sau khi làm lặp lại ba lần đối với Vitamin D3 và D2là <10%, độ thu hồi của phương pháp là 90 110% với D- 2và D3, giới hạn phát hiện là 1,5-2 ng[15] Trong công trình nghiên cứu đăng trên tạp chí Chromatography A của bộ môn thực phẩm, dinh dưỡng Đại học Georgia Athens Mỹ, bộ môn Dinh dưỡng trên người và khoa học thực phẩm trường Bách khoa Virginia ngày 26 tháng 1 năm 1998 đã đưa ra các điều kiện và yếu tố ảnh hưởng quá trình phân tích hàm lượng Vitamin A, E, D trong thức ăn động vật bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu này cho thấy độ thu hồi của phương pháp là 93-107%

Trong bài báo của tạp chí Food composition and analysis 16 (2003) có công trình nghiên cứu hàm lượng Vitamin D3 và 25 hydroxy Vitamin D3 đối với thịt

7

tươi và thịt lợn chín, đã đưa ra kết quả nồng độ Vitamin D đối với thịt tươi là từ 3 0,05 đến 0,21 mcg/100g đối với thịt chín là 0,07-0,14 mcg/100g Sau khi làm 49 thí nghiệm lặp lại họ đã đưa ra hệ số biến thiên là 7,0%, làm 51 thí nghiệm khác

hệ số biến thiên là 7,3%

Ngoài ra còn nhiều công trình nghiên cứu xác định hàm lượng Vitamin D trong máu và huyết thanh, trong thực vật, Một số nghiên cứu đã đưa ra hàm lượng Vitamin D trong cá thu là 15 mcg/100g, trong gan bò 1 mcg/100g, trong trứng gia cầm chứa 37 IU/100g, trong nấm nút màu trắng cung cấp Vitamin D nhiều nhất có thể lên tới 536 IU/100g ,

Theo TCVN 8973:2011 [16] Vitamin D3 và vitamin D có trong mẫu thực 2 phẩm được xà phòng hóa bằng dung dịch kali hydroxit trong ancol và được chiết bằng dung môi thích hợp Việc xác định vitamin D3 hoặc vitamin D2 trong dung dịch chiết mẫu thích hợp được tiến hành bằng HPLC bán điều chế dùng pha thường sau đó được phân tích tiếp bằng HPLC pha đảo Nếu cần xác định vitamin D thì vitamin D3 2 được dùng làm chất nội chuẩn Nếu cần xác định vitamin D thì dùng vitamin D2 3 làm chất nội chuẩn [7] T uy nhiên tiêu chuẩn này không áp dụng để xác định cả hàm lượng D lẫn vitamin D3 2

Các phương pháp tiêu chuẩn theo AOAC và TCVN 7787:2007, TCVN 8973:2011 đều áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng, làm sạch bằng chiết pha rắn hoặc làm sạch bằng một cột sắc ký khác trước khi đưa qua cột phân tích, vì vậy quá trình thực hiện rất phức tạp và tốn nhiều vật tư, hóa chất Các phương pháp gần đây đã áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LCMSMS để định lượng Vitamin D2 và D với độ nhạy và độ chính xác cao, giảm bớt các hóa chất và đơn giản 3 hóa quá trình xử lý mẫu Hiện nay ở Việt nam, chúng tôi nhận thấy việc nghiên cứu Vitamin D trong thực phẩm chưa được làm nhiều, trong bảng thành phần thức ăn Việt Nam chưa đề cập đến hàm lượng Vitamin D Trong danh mục tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) chúng tôi chưa thấy một quy trình chuẩn nào để xác định hàm lượng Vitamin D bằng LCMSMS, vì vậy sau khi tham khảo các tài liệu cùng với điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp xác định hàm lượng Vitamin D trong một số loại thực phẩm bằng LC-MS/MS

Các nghiên cứ u liên quan đ ế n vitamin K

Cùng với sự phát triển của nền khoa học kỹ thuật tiên tiến, hàng loạt các hệ thống thiết bị phân tích hóa học đã được cải tiến nhằm xác định được nhiều loại chất khác nhau đồng thời nâng cao độ nhạy của phép phân tích cũng như độ lặp lại của kết quả kiểm nghiệm Do vai trò quan trọng của Vitamin K1 đối với sức khỏe, trên thế giới đã phát triển nhiều kỹ thuật phân tích Vitamin K1 trong thực phẩm và các mẫu sinh hóa Phương pháp phân tích phổ biến hiện nay là sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Các phương pháp này chỉ có khả năng xác định Vitamin K1 ở mức nồng độ từ 40 ppb trở lên[17][18]

8

Các phương pháp tiêu chuẩn theo AOAC 2015.09 và TCVN 8974:2011 [19] đều áp dụng kỹ thuật dẫn xuất sau cột và phát hiện bằng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang Kỹ thuật này dù có độ nhạy tốt nhưng đòi hỏi hệ thống sắc

ký phải có bộ phận sau cột và sử dụng khá nhiều hóa chất trong quá trình tạo dẫn xuất Trong đó TCVN 8974:2011chỉ mới đưa ra quy trình phân tích cho vitamin K1

Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LCMSMS để xác định Vitamin K1, K2 trong sữa và các sản phẩm

từ sữa Đây là kỹ thuật có độ nhạy, độ chọn lọc cao, có khả năng phát hiện ở nồng độ 1 ppb [20] [21][22] Vì vậy chúng tôi muốn đưa ra một quy trình phân tích vitamin K2 ứng dụng cho nhiều loại thực phẩm hơn cũng như có độ chính xác cao hơn để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp

1.3 T ổng quan về ỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lầ phối khổ k n

(LC-MS (LC-MS / ll)

Nguyên lý chung

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó

Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm ( ) Kiểu quét ion dương thường cho nhiều -thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ thuật hiện nay cũng đã cho phép tích hợp hai kiểu quét này thành một nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu, tuy nhiên thường

độ nhạy không cao bằng từng kiểu quét riêng lẻ Trong r t nhiấ ều năm, các nhà nghiên c u kứ ỹ thuật sắc k ỏng gh p khối phổ ải đối mặt với rất nhiều khý l é ph ó khăn trong việc tìm c ch gi i quyá ả ết được s ự tương thích gi a h th ng s c ký ữ ệ ố ắ

lỏng v đầu dà ò khối phổ Nguyên nhân l do quà á trình phân t ch với đầu d MS í ò

đòi h i m c đ chân không cao, nhiỏ ứ ộ ệt độcao, c c ch t kh o s t phá ấ ả á ả ở ại tr ng thái khí, vận tốc d ng chảy nhỏ; trong khi hò ệ thống LC lại ho t đ ng áp suạ ộ ở ất cao

với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, c c chất phân átích thở ể l ng ỏ Để khắc phục những kh khăn trên, cầó n ph i có m t k thu t ả ộ ỹ ậtrung gian gọi là giao di n R t nhi u k thu t giao di n (interface technology) ệ ấ ề ỹ ậ ệnhư chùm tia h t (FB), bạ ắn phá nguyên tửnhanh d ng liên t c (CFò ụ -FAB),… đã được nghiên c u và ng dứ ứ ụng, nhưng m i cho đếã n cu i th p nhiên 80, mới có s ố ậ ự

đột phá th t s v i k thu t ion hóa t i áp su t khí quy n (Atmospheric Pressure ậ ự ớ ỹ ậ ạ ấ ểIonization – API)

Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích.

Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:

• Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI)

• Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization – APCI)

• Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photoionization – APPI)

Trong đ , hai kỹ thuật APCI và ESI, đặó c bi t là ệ ESI được sử dụng nhiều hơncả

Cá c loại đầu dò khối phổ

Hiện nay, có bốn kiểu đầu dò khối phổ chính đang được sử dụng bao gồm:

• Đầu dò khối ph ổ bẫy ion (Ion Trap, IT)

• Đầu dò khối ph ổ cộng hưởng cyclotron sử ụ d ng phép biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry, FTICR hay FT-MS)

• Đầu dò khối ph ổ thời gian bay (Time-of-Flight, TOF)

kỹ thuật trên bằng sự phát triển các bẫy ion “tuyến tính” hoặc “hai chiều” khi những ion được tập hợp trong một thể tích hình ống lớn hơn bẫy ion ba chiều truyền thống, cho phép làm tăng độ nhạy, độ phân giải và độ chính xác FT-MS bản chất cũng là một loại khối phổ bẫy ion, cho phép bắt những ion dưới

độ chân không sâu trong một từ trường cao Do được cải tiến và kết hợp cả hai loại máy nên FT MS có độ nhạy, độ chính xác và phân giải cao Tuy nhiên, do -vận hành phức tạp và giá thành quá cao nên chúng ít được sử dụng trong phân

10

tích dư lượng Đối với đầu dò khối phổ ời gian lưu, tất cả c ion đơn điện t th cá ích

nào chịu một biệt về ế năng V sẽ đạt một năng lượng chuyển h a eV (electron th óvolt) như nhau Vì v y, nh ng ion có khậ ữ ối lượng lớn hơn sẽ có v n t c nh hơn ậ ố ỏnên m t nhi u thấ ề ời gian hơn để bay qua cùng một quãng đường d i trong mà ột

ống không có từ trường (field free flight tube) C- ác ion, sau khi được tăng tốc, bay ngang qua vùng không trường, nơi đây chúng s ẽ được tách riêng nhau ra tùy theo giá tr ịm/z của chúng, và được tập trung t i bạ ộ phận thu nh n t n hi u Do ậ í ệ

thời gian đến đích của c c ion chỉ ch nhau rất ngắn, 10 7 giây, nên m y cần cá cá - á ó

h thệ ống điện tử ực nhạy để c có th ểphân biệt được c c ion.á

Đầu dò t c c (m t ho c ba t c c) có nhứ ự ộ ặ ứ ự độ ạy cao trong phân t ch địí nh lượng m t ch t đã bi t, t o đư c nhi u phân m nh trong ch ộ ấ ế ạ ợ ề ả ế độ MS/MS, có th ểlàm được kiểu đo mất phân tử trung h a (neutral loss), thò ích hợp cho phân t ch vi ílượng các chất đã biết trước c u trúấ c Tuy nhiên, đầu dò t c c khó gi i thích cơ ứ ự ảchế phân m nh MS/MS ả Tùy theo mục đích, các nhà nghiên cứu sẽ chọn các kỹ thuật ứng với các máy khối phổ thích hợp Ngo i ra, đểà phát huy những ưu điểm

cũng như khắc phục c c hạn chế cá ủa từng loạ ầi đ u d , người ta c n gh p nối kếò ò é t

hợp c c kỹá thuật với nhau, v ụ như hệ ống kết hợp giữa bẫy ion v ứ ực API í d th à t cQTRAP4000 hay QTRAP5500 của hãng Appliedbiosystems, trong đó, t c c th ứ ự ứ

ba của hệ ba tứ ực đượ c c thay b ng b y ion.ằ ẫ

Ngu ồn ion hóa trong đầ u dò khôi phổ

1.3.3.1 Ion ha tia điện (ESI)

ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn ESI có khả năng tạo thành những ion

đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thu c vào áp cộ ực điện thế), được xem là kỹ thuật ion h a êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học ónhư protein, peptide, nucleotide… hoặc các polyme công nghiệp như polyethylen glycol

Trong ESI, các ion được hình thành như sau:

Hình 1.3 Sơ đồ ạo ion dương bằ t ng nguồn ESI

11

Được b t ngu n t h th ng s c ký l ng, t i đ u ng d n mao quắ ồ ừ ệ ố ắ ỏ ạ ầ ố ẫ ản, dướ ải nh hưởng của điện th ếcao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang tích điện tại bề mặt Kh ởí xung quanh c c gi t n y tá ọ à ạo nhi t ệnăng l m bay hơi dung môi ra khỏà i giọt sương, khi đ , mật độ điện tích tại bề ómặt hạt sương gia tăng Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh) để từ đó hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi sau đó đi vào

1.3.3.2 Ion hóa h a học ở p suấ kh ó á t í quy ể n (APCI)

APCI là k thuỹ ật ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất

có độ phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi Trong APCI, ion đươc hình thành như sau: mẫu h p ch t c n phân tíợ ấ ầ ch, hòa tan trong pha động, sau khi ra khỏi cộ ắc ký, được cho đi ngang qua ốt s ng mao quản đốt nóng Khi ra

kh i ỏ ống, nhờ khí N2, dung dịch được phun th nh dà ạng sương từ đầu ra của nguồn APCI Các giọt sương nhỏ được m t dòộ ng khí dẫn đến m t ng th ch anh ộ ố ạđun nóng, g i là bu ng dung môi hóọ ồ a kh H p chí ợ ất đi theo luồng khí nóng ra

kh i ỏ ống để đến một v ng c p suất khù ó á í quyển, nơi đây sẽ ả x y ra sự ion h a h a ó ó

học nhờ o que ph ng điện corona, tại đây c ự trao đổi proton để ến th và ó ó s bi ành ion dương (M + H)+ v trao đổà i electron hoặc proton để ế bi n th nh ion âm (M à – H)- Sau đó á, c c ion sẽ được đưa v o bộ phân tíà ch khối

Hình 1.4 Lựa chọn kiểu tạo ion

12

1.3.3.3 Ion hó a bằng photon tạ p suất kh i á í quy ể n (APPI)

Thông thường, h p ch t phân tíợ ấ ch thường ion hóa b ng ngu n ESI ho c ằ ồ ặAPCI, tuy nhiên, có một số chất không được ion hóa tốt bằng hai kỹ thuật n y, và í

d ụ như polyaromatic hydrocarbons (PAHs), người ta sẽ ử ụng nguồn APPI s d

Kết hợp ưu điểm của giữa d ng kh phun thẳng g c với d ng ion, đ n krypton ò í ó ò ètrong ngu n sồ ẽ phát ra c c photon cá ó năng lượng cao đủ để ion h a nhi u hó ề ợp chất hóa học kh c nhau.á Ngoài ba ngu n ion hóồ a trên, c n cò ó nguồn ion hóa đa phương thức (MMI, Multimode ionization) có th v n h nh, thao tể ậ à ác hai ch ở ế độion h a ESI vó à APCI

Mt số ỹ k thu t ghi ph ậ ổ trong đầ u dò kh i ph ố ổ

1.3.4.4 Scan

Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ to n ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường àdùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đố ới v i

đầu dò kh i ph ba t c c, ch ố ổ ứ ự ế độ SCAN thường đượ ực l a chọn để kh o sát ion ả

m ẹ

1.3.4.5 Selected Ion Monitoring (SIM)

Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn Đối với đầu dò kh i ph ba t c c, ch ố ổ ứ ự ế độ SIM thường đượ ực l a chọn để ả kh o sát năng lượng phân mảnh khi đã bi t ion m ế ẹ

1.3.4.6 SRM (Selected Reaction Monitoring) v à MRM (Multiple

Re action Monitoring)

Đố ới v i kh i ph ba t c c, là máy đo kh i ph hai l n liên ti p (MS MS), 2 ố ổ ứ ự ố ổ ầ ế

-k thuỹ ật ghi phổ có nhđộ ạy cao thường được sử ụng l SRM v d à à MRM

SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.MRM: trên thực tế, do yêu cầ ề ặu v m t kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên c c ion con cá ần quan tâm thường t 2 tr lên, do v y kừ ở ậ ỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ ở ứ ự) t c c thứ ấ nh t, phân m nh ion cô lả ập đ ạó t ứ ựi t c c th 2 (thứ ực chấ à buồt l ng va chạm) thu được các ion con, cô l p 2 (ho c nhi u) ion con cậ ặ ề ần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa

vào đầu d đểò phát hiệ n

13

Hình 1.5 Thi ế t bị LC MS/MS Qtrap 5500 Sciex

-Trong nghiên cứu này bộ phân tích khối là bộ phân tích tứ cực chập ba,

Bộ phận phân tích tứ cực chập ba (triple Quadrupole Analyser) gồm ba tứ cực ghép nối với nhau

mẹ bị phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions)

Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion con mà nó chấp nhận tất cả các ion do Q1

chuyển đến Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3

• Q3: Bộ tứ cực thứ ba làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới detector

14

CHƯƠNG 2 Ộ DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ N I U

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứ u

Đối tượ ng nghiên c u ứ

Theo các nghiên cứu trước đây cho thấy nấm là thực ph m giàu vitamin Dẩ t ựnhiên có nguồn gốc thực vật nhất Cũng giống như con người, nấm có khả năng

tổng hợp vitamin D khi ếp xúc vớ ti i ánh sáng m t tr i N m không t ng hợp ra ặ ờ ấ ổvitamin D3 mà chỉ ả s n xu t ra vitamin D2 và có thấ ể ch a tớ ầứ i g n 2300 IU vitamin D2 trong m i 100 gram Còn các lo i n m công nghiỗ ạ ấ ệp thường được nuôi tr ng trong bóng t i thì chồ ố ứa rất ít vitamin D2

Ngược l i vitamin D3 l i có nhi u trong th c ph m có ngu n gạ ạ ề ự ẩ ồ ốc động vật như các loại cá béo, tr ng và s a ứ ữ

Vitamin K1 là d ng vitamin K phạ ổ ế bi n nhất, chủ ếu đượ y c tìm th y trong các ấloại thực phẩm có ngu n gồ ốc thực vậ ặt, đ c biệt là các lo i rau có lá màu xaạ nh

s m Mẫ ặt khác, vitamin K2 chỉ được tìm thấy trong thực phẩm có nguồn gốc

động v t và th c ph m th c v t lên men, chẳng hạn như natto ậ ự ẩ ự ậ

Do đó lựa ch n xây d ng quy trình phân tích vitamin D2 trên n n m u n m, ọ ự ề ẫ ấD3 trên n n th t l n và tr ng, K2 trên n n sề ị ợ ứ ề ữa bột, th t bò.ị

Chất chuẩn gồm chuẩn đơn của 3 chất:

- Vitamin D2, Sigma (Cat No 47763, độ tinh khiết 99,9%)

- Vitamin D3, Sigma (Cat No 47768, độ tinh khi t 99,0%)ế

- Vitamin K2 (MK (Lot 38337 01, độ tinh khiết 99,0%)-4)

-Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

 Dung dịch chu n g c vitamin Dẩ ố 2 và D3: cân chính xác kho ng 10,0 mg ảmỗi chất chuẩn, hòa tan bằng Ethanol và định mức trong bình định mức 10,00 ml được dung d ch chuẩ ốị n g c nồng độ 1000 ppm Bảo quả ởn nhi t ệ

độ -18 oC tránh ánh sáng Hạn sử ụ d ng 2 tháng

 Dung dịch chu n trung gian D2, D3 10ppm : hút 0,1ml dung dịch chuẩn ẩ

gốc mỗi chuẩn thổi khô và định mức bằng 10ml ACN

 Dung dịch chu n g c vitamin K2: cân chính xác kho ng 10,0 mg chẩ ố ả ất chuẩn, hòa tan bằng Acetonitrile và định mức trong bình định mức 10,00

ml được dung d ch chu n g c nị ẩ ố ồng độ 1000 ppm B o qu n nhiả ả ở ệt độ -18

oC tránh ánh sáng H n sạ ử ụ d ng 6 tháng

 Dung dịch chu n trung gian K2 10ppm : hút 0,1ml dung dịch chuẩn gốc ẩ

và định m c b ng 10ml CAN ứ ằ

15

 Dung dịch chu n h n h p D2, D3, K2 1ppm: 100µl dung d ch chu n m i ẩ ỗ ợ ị ẩ ỗchất, thêm 700µl ACN

T duừ ng dịch chuẩn hỗn hợp 3 chất, pha thành dãy chuẩn có nồng độ vitamin D

t khoừ ảng 1ppb đến 500ppb bằng dung môi ACN theo bảng sau:

B ng 2.1 ả Dãy chuẩn mix vitamin D2, D3 pha trong dung môi ACN

(µl)

Mix D2,D3,K2 500ppb 50µl D2 10ppm

50µl D3 10ppm 50µl K2 10ppm

- Kali hydroxide (KOH)

- Kali dihydro phosphate (KH2PO4)

16

- Bình định m c 10ml; 100ml; 1 lít ứ

- Pipet man các loại và Pipet Pasteur

- Các dụng c c n thi t khác c a phòng thí nghiệm ụ ầ ế ủ

2.2 N  i dung và phương pháp nghiên c ứ u

Khảo sát, tối ưu thố ng s v n hành thi t b LC- ố ậ ế ị MS/MS

2.2.1.1 L ựa chọn và tối ưu điều kiện khối phổ MS

- Kh ả o sát ion mẹ và ion con

Qua tham kh o các tài liả ệu phương pháp tiêu chuẩn AOAC, chúng tôi ti n ếhành khảo sát xác định vitamin D2, D3và K2 b ng kằ ỹ thuật ion hóa hóa học ở áp

suất thường (APCI) với chế độ ắn phá ion dương b

Tiến hành pha dung dịch chuẩn đơn vitamin D2, D3và K2 trong ACN với

nồng độ 200ppb Tiêm từng chuẩn trực tiếp vào detector khối phổ MS, chọn chế

độ Q1 MS (Q1), ch ế độquét (+) Positive, khoảng quét t ừ 300 Da đến 500 Da đểxác định ion mẹ, thường cho tín hi u l n nh t, có s kh i lệ ớ ấ ố ố ớn hơn khối lượng phân tử 1 đợn vị (m/z= M+1) khi ion ở ạ d ng phân tử [M-H]+

Sau khi lựa chọn được ion m , chuy n sang chẹ ể ế độ ch y Product ion (MS2) ạ

để khảo sát các điều ki n b n phá ion m tệ ắ ẹ để ạo ion con Ion con có cường độ tín hiệu lớn hơn, ổn định hơn đượ ực l a chọn làm ion định lượng, ion còn lại được dùng cho mục đích định tính Các thông số th ếđầu ra (CXP) và năng lượng bắn phá (CE) đượ ối ưu tự độc t ng b ng ph n m m v i m i ion con ằ ầ ề ớ ỗ

- T ối ưu các điề u kiện MS/MS

Để ối ưu hóa điề t u ki n MS/MS, tiệ ến hành bơm trực ti p t ng dung dịch chất ế ừchuẩn đơn có nồng độ 200ppb vào nguồn MS/MS mà không qua bộ HPLC Chọn chế độ ả kh o sát tự động đối v i tớ ừng ion con định lượng và định tính c a t ng ủ ừ

chất để ọn được các thông s thích hch ố ợp cho bộ ậ ph n t o ngu n ion ACPI và bạ ồ ộ

GS2 (Ion Source Gas 2) Tạo áp suất của luồng khí nóng, hỗ ợ tr quá trình

làm bay hơi dung môiTEM (temperature) Nhiệt độ ủ c a ngu n khí nóng th i vào (GS2)ồ ổ

CUR (Curtain Gas) Luồng khí N2 thổi vào khe giữa 2 màn chắn của

b ộion hóa và bộ phân tích kh i phố ổ

EP (Entrance Potential) Th ếáp vào ngu n ion mồ ẹ Q0

CE (Collision Energy) Năng lượng va chạm, năng lượng để phân mảnh m ẹ

Pha động trong LC MS/MS không ch có vai trò phân tách các ch t mà còn - ỉ ấ

có tác động đến quá trình ion hóa ảnh hưởng đến tín hiệu của các chất phân tích

Với kỹ thuật khối phổ ử ụ s d ng nguồn ion hóa ESI (+) và APCI (+) thì sự ion tăng lên khi trong thành phần pha động có thêm các ch t cung cấ ấp proton như acid formic (HCOOH)

Thay đổi và tối ưu thành phần pha động v i m u chu n bớ ẫ ẩ ằng cách thay đổi thành ph n và tầ ỷ ệ pha độ l ng Chúng tôi lựa chọn, nghiên cứu 2 pha động dưới đây sau khi tham kh o tài li u ả ệ [22], [23]

• Pha động 1:

Kênh A: H2O 2,5 mM Amonium formate 0,01 % axit fomic

Kênh B: Methanol 2.5 mM Amonium formate 0,01,% axit fomic

• Pha động 2:

Kênh A: H2O 0,1 % axit fomic

Kênh B: MeOH 0,1% axit fomic

Pha động được ch n phọ ải đảm b o peak c n phân tích trong sả ầ ắc kí đồ không

b ịchập với peak nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, peak không b doãng, th i ị ờgian lưu không được quá dài Đối với mỗi pha động tôi nghiên cứu đã tiến hành

18

nghiên c u kèm theo các gradientứ , riêng pha động th 2 ta sứ ử ụng 2 gradient để d

khảo sát Thông số ụ th ểđược trình bày tại các bảng 2.4; 2.5; 2.6 c

B ng 2.4 ả Điề u kiện gradient 1 (AOAC)

Th ờ i gian

ố c đ dòng (µl/phút) T l % A ỷ ệ kênh T l % B ỷ ệ kênh

T ố i ưu quy trình chi ế t mẫ u

2.2.2.3 Quy trình chiết vitamin D

- Tối ưu quá trình xà phòng ha:

T l ỷ ệ chất béo trong các th c ph m chự ẩ ứa vitamin tan trong d u chầ ủ ế y u gồm các triglycerid, một lượng rất ít các sterol, carotenoid, phospholipid và

một lượng nhỏ các thành phần gần giống mỡ Tất cả các chất này c ch kh ứ ế ảnăng hòa tan của các lo i vitamin tan trong d u M t ph n các vitamin nàyạ ầ ộ ầliên k t v i phế ớ ức hợp lipoprotein do đó cần phải phá v liên kỡ ết để giải phóngvitamin ra khỏi các phức hợp Như vậy cần có phương pháp chiết tách phù

hợp để chiết các vitamin ra khỏi nền mẫu trước khi tiến hành định lượng

Có m t sộ ố phương pháp chiết vitamin tan trong d u ra khầ ỏi nền m u thẫ ực

để ả gi i phóng các liên k t ho c phá v d ng ester c a vitamin A, D, E ế ặ ỡ ạ ủ

Trong quá trình phân tích vitamin D trong thực ph m, mẩ ẫu cần được xà phòng hóa b ng dung dằ ịch KOH Các điều kiện xà phòng hóa thường được sử ụ d ng là

xà phòng hóa b ng nhiằ ệt và xà phòng hóa qua đêm ở nhiệt độ phòng Trong bài nghiên c u này chúng tôi lứ ựa chọn 2 điều kiện xà phòng hóa để khảo sát là 75 o C-

30 phút và 90 o C-15 phút

- Kh ả o sát dung môi chiế t:

Sau khi lựa chọn được điều ki n xà phòng hóa, ti n hành soệ ế sánh để ự l a chọn dung môi chi t và sế ố ầ l n chiế ẫu t m

Các chất phân c c tan trong dung môi phân c c, không tan trong dung môi ự ựkhông phân cực và ngược lạ ới, v i ch t không phân cấ ực chỉ tan trong dung môi không phân cực Hằng sốđiện môi bi u th m c đ phân c c c a m t dung môi, ể ị ứ ộ ự ủ ộdung môi phân cực mạnh có h ng sằ ố điện môi l n, dung môi càng kém phân cớ ực

có h ng sằ ố điện môi càng nhỏ

B ng 2.7 H ả ằng số điện môi của một số dung môi hữu cơ

Dung môi Công th c hóa h ứ ọ c Điể m sôi H ằ ng số

điệ n môi T tr g/ml ỷ ọ ng

Pentane CH3-CH2-CH2-CH2-CH3 36oC 1.84 0.626 Hexan CHCH3-CH2-CH2-CH2-

Dietyl ether CH3-CH2-O-CH2-CH3 35oC 4.3 0.713 Ethyl acetate CH3-C(=O)-O-CH2-CH3 77oC 6.02 0.894

Dựa vào TCVN 8973:2011 và các nghiên cứu trước đây n-hexan là dung môi

hữu cơ được sử ụng phổ ến trong quy trình chi t tách vitamin D N hexan là d bi ế chấ ỏt l ng trong su t không màu, dung môi không phân cố ực, dễ bay hơi và có mùi đặc trưng Sở hữu cho mình một mức giá cả hợp lý, n hexan có độc tính thấp,

-phần lớn trơ với các chất khác nên được sử ụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau d

Vì th chúng tôi lế ựa chọn dung môi chi t là nế -hexan và chỉ ảo sát số l kh ần chiết

mẫu với 2 lựa chọn:

A, Chi t 1 lế ần bằng 20ml n-hexan

B, Chi t 2 lế ần bằng 20ml n-hexan

- Quy trình chiế ẫ ử ụng để ả t m u s d kh o sát:

20

Cân 3 5g m u vào ng falcon 50ml- ẫ ố

Thêm 6ml EtOH 2% pyrogallic, 4ml KOH 50%, vortex

Thủy phân ở 7590oC,oC, 30phút15 phút

Làm nguội đến nhiệt độ phòng Thêm 5ml ACN, 0.1g NaCl, vortex

Chi tế󰇥1 l n2 l n󰉚󰉚 bằng 20ml n hexan (12.5mg BHT, vitamin C), vortex

-Ly tâm, chuy n lể ớp n-hexan vào bình gạn

Rửa 2 lần bằng 20ml nước cất

Lọc qua giấy lọc có bổ sung Na2SO4vào bình cô quay

Cô quay đến c n ạHòa c n b ng 2ml MeOH 1%FAặ ằ

Bơm mẫu vào h th ng LC-MS/MS ệ ố

2.2.2.4 Quy trình chiết vitamin K2

Vitamin K không tan trong nước ch tan trong chỉ ất béo và các dung môi như ete, rượu, benzen, axeton B phân hị ủy nhanh dưới tác d ng c a tia t ngo i do ụ ủ ử ạ

cấu trúc quinon bị ến đổi, ngoài ra nó cũng bị bi phân h y nhanh chóng khi ủ đun nóng trong môi trường ki m ề

- Thủ y phân b ng enzyme ho c axit: ằ ặ

Đố ới v i th nghi m HCl, 1ử ệ -2g sữa được thêm vào 5mL nước siêu tinh khi t và ế5mL HCl 1N và đun nóng trong 30 phút 100°C ở Đối với thử nghiệm lipase, 1,0

g lipase mẫu sữa và ủ trong 2 ờ ở gi 37°C[24]

- T ối ưu quá trình thủ y phân

Sau khi lựa chọn phương pháp thủy phân, để xem xét ảnh hưởng c a th i gian ủ ờ

ủ và nhiệt độ ủ

 30 phút ở 100oC đối vớ ủi th y phân b ng axit ằ

 37oC-2h đối với lipase

21

- Lựa ch n dung môi chi ọ ế t

Sau khi tiền xử lý với axit hoặc lipase, vitamin K2 được chiết xuất bằng dung môi n-hexan

- Tối ưu lượng mẫu thử và thể tích dung môi chiế t

Sau khi thủy phân các bước tiếp theo d a trên tham kh o tài li u AOAC [24] ự ả ệ

T l giỷ ệ ữa lượng mẫu cân ban đầu và dung môi chi t có ế ảnh hưởng khá nhiều đến

hiệu quả ủa quá trình chi c ết mẫu Các tỷ ệ /10 và 1/20(g/ml) đượ l 1 c đưa và nghiên cứu để lựa chọn điều kiện thích hợp nhất Hiệu suất chiết tăng khi tăng

th ểtích dung môi rửa

- Quy trình chiế ẫ ử ụng để ả t m u s d kh o sát :

Cân 1g m u r n/ 10ml m u lẫ ắ ẫ ỏng

↓Thêm 15ml (m u r n)/ 5ml (m u lẫ ắ ẫ ỏng) nước ấm 40oC

5ml đệm phosphate pH 8, vortex cho tan đều

↓

Thêm Thêm 1g lipase5ml HCl 1N 󰉻 37 󰉻 100oC – 2 oC – gi󰉶30 phút

lắc sau mỗi 20’, làm nguội

↓Thêm 10ml h n h p EtOH:MeOH (95:5), vortexỗ ợ

↓

B ổsung 1g K2CO3, vortex

↓Thêm󰇥10ml 20ml hexan, lắc 10 phút

↓

Ly tâm 1500v/10ph

↓Hút 1ml l p trên, th i khôớ ổ

↓Hòa c n b ng 1ml MeOHặ ằ

↓Bơm mẫu vào h th ng LC-MS/MS ệ ố

22

2.3 Thẩ m đ nh phương pháp ị

Phương pháp phân tích sau khi đã khảo sát và l a chọn các điềự u ki n phù h p ệ ợđược thẩm định nh m xác nh n giá tr s dằ ậ ị ử ụng theo yêu cầu của tiêu chuẩn AOAC 2012 đố ới v i các thông s sau: ố

Tính chọ ọ n l c

- Chuẩn bị các mẫu sau:

Mẫu chuẩn mix hỗn hợp vitamin D2, D3, K2: 50ppb

Mẫu trắng hoặc dung môi coi như mẫu trắng, mẫu trắng nạp chuẩn

- Tiến hành chạy sắc ký 3 mẫu trên, so sánh các peak trên các sắc ký đồ thu được

- Yêu cầu: trên sắc ký đồ ủ c a m u trẫ ắng thu được, t i thời điểạ m xu t hi n peak ấ ệcủa vitamin D2, D3 và K2 không được xu t hiấ ện peak Đối v i m u n p ớ ẫ ạchuẩn phải xuất hiện peak vitamin D2, D3 và K2 trùng với thời gian lưu tương ứng c a chu n ủ ẩ

Khoả ng tuy n tính và đư ng chu n ế ờ ẩ

- Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở

đó có sự ph thu c tuy n tính gi a đ i lưụ ộ ế ữ ạ ợng đo được và nồng độ ch t phân tích ấViệc xác định khoảng tuyến tính thường được kh o sát b t đ u t giớ ạn địả ắ ầ ừ i h nh lượng (điểm th p nh t) và k t thúc là gi i h n tuyấ ấ ế ớ ạ ến tính (điểm cao nh t) Th c ấ ự

hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự ụ ph thuộc của tín

hiệu vào nồng độ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, quan sát s ph thuự ụ ộc cho đến khi không còn tuyến tính Khoảng tuyến tính dài hay

ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó quan trọng nhất là bản chất của chất phân tích và kỹ thu ử ụật s d ng

-Xây dựng đường chuẩn:

Sau khi xác định được kho ng tuy n tính c n xây dả ế ầ ụng đường chu n và xác ẩ

định h s xác đ nh (Rệ ố ị 2) Trong phân tích thực tế, có th xây dể ựng các đường chuẩn ngắn, trùm lên vùng nồng độtrong m u, không nh t thiẫ ấ ết phải lập đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính Nồng độ trong mẫu không được vượt ra giới

h n ạ cao nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tốt nhất phải nằ ở vùng giữa của m đường chu n ẩ

Có nhi u loề ại đường chu n khác nhau tùy thuẩ ộc vào các phương pháp và kỹthuật khác nhau Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết:

Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn Xác định các tín hiệu y đo được tương ứng với

nồng độ x Nếu sự ụ ph thuộc tuyến tính, ta sẽ có khoảng khảo sát đường biểu

diễn là một phương trình :

y = ax +b

Trong đó: a là giá trị slope (độ ố d c)

b là giá trị intercept (hệ ố chặ s n)

23

Giớ ại h n ch p nhấ ận đường chu n: Ch tiêu c a một đườẩ ỉ ủ ng chuẩn đạt yêu c u ầ

là hệ ố s xác đ nh nằị m trong khoảng : 0,99 ≤ R2≤1

Giới hạn phát hiện (LOD); Giới hạ ị n đ nh lượ ng (LOQ)

- LOD là nồng độ nh nhỏ ất của chất phân tích mà thi t bế ịcòn có thể phát

S là chi u cao tín hiề ệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền

Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận hai bên của peak, bề ộng mỗi bên tối thiêu gấp 10 lần chiều rộ r ng

của peak ại nửa chiều cao t

LOD được ch p nh n t i nấ ậ ạ ồng độ mà tại đó tín hiệ ớu l n g p 2 3 lấ - ần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N =3

Hình 2.1Xác định LOD bằng cách tính S/N

Đ ặ ạ l p l i

Độ ặ l p lại đặc trưng cho mức độ ầ g n nhau gi a giá tr riêng l xi ti n hành ữ ị ẻ ếtrên các mẫu th gi ng h t nhau, b ng cùng mử ố ệ ằ ột phương pháp phân tích, trong cùng điều ki n thí nghiệ ệm (cùng người phân tích, cùng trang thi t b , phòng thí ế ịnghiệm, trong các khoảng thời gian ngắn) Do vậy còn gọi là độ chính xác trong phòng thí nghiệm.Các đại lượng đặc trưng cho độ ặ l p lại:

Độ ệ l ch chu n ẩ (SD): Độ ệ l ch chu n c a m t t p s li u k t qu nghiên c u ẩ ủ ộ ậ ố ệ ế ả ứđặc trưng cho độ phân tán các s li u trong t p h p so v i giá tr ố ệ ậ ợ ớ ịtrung bình

Độ ệ l ch chuẩn tương đối (RSD): Đại lượng này được dùng để đánh giá độchính xác tương đố ủa phép phân tích và đượi c c xác đ nh theo công th c: ị ứ

 = ( )

  1

2 h

H N

S =

Tiến hành 7 lần thí nghiệm trên cùng một mẫu Mẫu phân tích là mẫu trắng

có thêm chuẩ ởn ồng độ 3 n khác nhau Ti n hành chi t mế ế ẫu theo quy trình đã tối ưu

S mố ẫu xác định độ ặ l p lại: 7 mẫu x 3 mức nồng độ = 21 m u ẫ

B ng 2.8 ả Biểu mẫu tính toán độ ặp lạ l i

TT M soát ẫ u thực/ mẫu kiểm K l

ế t quả ặp

l i ạ (ppm)

K ế t quả tái lặp (ppm) Ngày/ngườ i phân tích:

B ng 2.9 ả Biểu mẫu tính toán độ thu hồ i

TT Msoát ẫu thực/ mẫu kiểm H s ệ ốthu hồi (%) = (Cf – Cu) × 100/Ca

N p chuạ ẩn thấp Nạp chuẩn TB Nạp chuẩn cao

suất thường (APCI) với chế độ ắn phá ion dương b

Tiến hành pha dung dịch chuẩn đơn vitamin D2, D3 và K2trong methanol ới v

nồng độ khoảng 200ppb Tiêm từng chuẩn trự ếc ti p vào detector kh i ph MS, ố ổ

tốc đ tiêm 7,00 μL/phút chạ ởộ y chế độ Q1 MS (Q1), chế độ quét (+) Positive,

khoảng quét từ 300 Da đến 500 Da để xác định ion mẹ, thường cho tín hi u lệ ớn

nhất, có số ối lớn hơn khối lượng phân tử 1 đợn vị (m/z= M+1) khi ion ở ạ kh d ng phân tử [M-H]+

Sau khi lựa chọn được ion m , chuy n sang chẹ ể ế độ ch y Product ion (MS2) ạ

để khảo sát các điều ki n b n phá ion m tệ ắ ẹ để ạo ion con Ion con có cường độ tín hiệu lớn hơn, ổn định hơn đượ ực l a chọn làm ion định lượng, ion còn lại được dùng cho mục đích định tính Các thông số th ếđầu ra (CXP) và năng lượng bắn phá (CE) đượ ối ưu tự độc t ng b ng ph n m m v i m i ion con ằ ầ ề ớ ỗ

Điều ki n hoệ ạt động c a ngu n ion hóa APCI ủ ồ

Khí va chạm (CAD) Bình thường

Nhiệt độmao quản (TEM) 400oC