Đánh giá tác động ở mức độ phiên mã của cao phân đoạn Trâm Bầu Combretum quadrangualre Kurz lên con đường apoptosis ở tế bào ung thư gan HepG2.pdf

Vì vậy, nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá cao chiết Trâm Bầu làm thay đổi biểu hiện gene trong con đường apoptosis của các tế bào ung thư.. Liên quan đến tính châ

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc -

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH

Tên đề tài: Đánh giá tác động ở mức độ phiên mã của cao phân đoạn Trâm Bầu

Combretum quadrangualre Kurz lên con đường apoptosis

ở tế bào ung thư gan HepG2

Số hợp đồng: 2021.01.37

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Phương

Đơn vị công tác: Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT- Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 6 tháng

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng 10 năm 2020

NTTU-NCKH-04

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

-

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2021

Tên đề tài: Đánh giá tác động ở mức độ phiên mã của cao phân đoạn Trâm Bầu

Combretum quadrangualre Kurz lên con đường apoptosis ở tế bào ung thư gan HepG2

Số hợp đồng: 2021.01.37

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Phương

Đơn vị công tác: Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT- Đại học Nguyễn Tất Thành

Thời gian thực hiện: 6 tháng

Các thành viên phối hợp và cộng tác:

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về tình hình ung thư 3

1.2 Giới thiệu về cây Trâm Bầu 6

1.3 Tình hình nghiên cứu về hoạt tính kháng ung thư từ cây Trâm Bầu 7

1.4 Quá trình apoptosis trong ung thư 9

1.5 Survivin 10

2.1 Vật liệu nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Phân đoạn cao chiết từ cây Trâm Bầu 15

2.2.2 Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào ung thư gan HepG2 của các cao phân đoạn 16

2.2.3 Tác động của cao phân đoạn Trâm Bầu lên biểu hiện một số gene liên quan đến quá trình apoptosis ở mức độ phiên mã 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Thu nhận cao phân đoạn 19

3.2 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các cao phân đoạn 19

3.2.1 Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các cao phân đoạn lỏng-lỏng 19

3.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các cao phân đoạn P 20

3.3 Ảnh hưởng của cao phân đoạn P12 lên mức độ biểu hiện mRNA ở tế bào HepG2 22

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên đầy đủ

: Phosphate buffered saline : Độ lệch chuẩn - Standard Deviation : Dodecyl sulfate sodium

: Tổ chức Y tế Thế giới - World Health Organization

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Bản đồ biểu diễn ước tính số lượng ca mắc ung thư mới trên toàn thế giới năm

2012

Hình 1.2 Số lượng người tử vong do ung thư trên thế giới năm 2016

Hình 1.3 Hình chụp lá và quả Trâm Bầu

Hình 1.4 Cấu trúc và chức năng của protein survivin

Hình 3.1 Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của cao chiết (A) ethanol lá, rễ, hạt trâm bầu; (B) phân đoạn Ea, H, H:Ea và BuOH từ lá trâm bầu

Hình 3.2 Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của cao phân đoạn P (A) P1 - P4, (B) P5 – P8, (C) P9 – P11 và (D) P12 – PAX1

Hình 3.3 Tác động của cao phân đoạn P12 lên mức độ biểu hiện gene caspase 3, 8 và 9

của tế bào HepG2

Hình 3.3 Tác động của cao phân đoạn P12 lên mức độ biểu hiện gene survivin của tế bào

HepG2

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Giá trị IC50 của các cao chiết ethanol từ lá, rễ, hạt và cao chiết Ea, H, H:Ea và BuOH trên dòng tế bào HepG2

Bảng 3.2 IC50 và IC90 của các cao phân đoạn P (P1 – PAX1) trên dòng tế bào HepG2

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Thu nhận cao phân đoạn từ lá cây

Trâm Bầu Combretum

quadrangulare

Thu nhận được cao phân đoạn từ lá cây Trâm Bầu

2 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế

bào ung thư gan HepG2 từ các

cao phân đoạn từ lá cây Trâm

Bầu Combretum quadrangulare

IC50 của các cao phân đoạn Trâm Bầu trên dòng tế bào HepG2

3 Ảnh hưởng của cao phân đoạn

Trâm Bầu lên biểu hiện gene liên

quan đến apoptosis

Mức độ biểu hiện tương đối của các gene liên quan đến quá trình apoptosis như caspase 3, 8, 9 và survivin của tế bào ung thư gan HepG2 được xử lý với cao phân đoạn Trâm Bầu

1 01 bài báo đăng trên Tạp chí khoa

học công nghệ đại học Nguyễn

Tất Thành

01 bài báo đăng trên Tạp chí khoa học công nghệ đại học Nguyễn Tất Thành

Thời gian thực hiện: 01/2021 – 06/2021

Thời gian nộp cuốn báo cáo: 10/07/2021

MỞ ĐẦU

Hiện nay, ung thư là một trong những căn bệnh với số ca mắc bệnh và tỷ lệ tử vong cao trên thế giới cũng như ở Việt Nam Trong đó, ung thư gan đứng thứ ba về số lượng các ca mắc mới và tỉ lệ tử vong Ung thư là tên gọi chung các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách vô tổ chức và có khả năng lan truyền sang các mô xung quanh Một trong các cơ chế dẫn đến tạo thành tế bào ung thư là quá trình tích lũy các đột biến và đào thoát khỏi quá trình apoptosis của tế bào

Apoptosis là quá trình chết theo chương trình của tế bào được kiểm soát chặt chẽ Ức chế apoptosis dẫn đến quá trình tạo thành khối u cho phép tích lũy đột biến nhằm kích hoạt quá trình chuyển dạng của tế bào mô bình thường Các nhân tố chính điều hòa quá trình apoptosis là protein thuộc họ Bcl-2 và họ protein ức chế apoptosis (IAP - inhibitors

of apoptosis) trong đó có survivin Survivin được coi là một dấu chỉ tiềm năng cho liệu pháp phân tử trong chẩn đoán và điều trị ung thư Các nghiên cứu trên survivin đã chứng minh rằng nếu tăng biểu hiện vượt mức survivin làm tăng quá trình sinh ung thông qua các gen sinh ung (oncogen) Ngược lại, một số nghiên cứu đã chứng minh ức chế biểu

hiện gene survivin dẫn đến gây chết trên tế bào ung thư

Nghiên cứu về bệnh ung thư hiện đang là vấn đề rất được quan tâm trên toàn thế giới

Có rất nhiều nghiên cứu nhằm đưa ra các phương pháp chẩn đoán và điều trị ung thư Tuy nhiên, ung thư vẫn còn đang là vấn đề nan giải đối với y học và vẫn chưa tìm ra hợp chất hay phương pháp chữa trị hữu hiệu cho tất cả các loại ung thư hiện nay Đã có nhiều

tổ chức cũng như các viện nghiên cứu về ung thư trên thế giới được thành lập với mục đích nghiên cứu chuyên sâu cũng như tìm ra các phương pháp chữa trị đối với bệnh ung thư Trong đó, các nghiên cứu về hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được xem là hướng nghiên cứu có triển vọng

Cây trâm bầu (Combretum quadrangulare) là một loại cây khá phổ biến ở các vùng

đồng bằng miền nam Việt Nam nhưng lại có rất nhiều công dụng như: khả năng kháng khuẩn, chống lại virus HIV, khả năng gây độc lên tế bào ung thư Nhiều nghiên cứu đã

loạt các loại tế bào ung thư như ung thư ruột kết tràng chuột, ung thư máu dòng lympho và ung thư gan Chính vì vậy, nghiên cứu khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao chiết từ trâm bầu và cơ chế ảnh hưởng của cao chiết này lên tế bào ung thư gan (dựa

trên gen pro-apoptotic caspase 3, 8 và 9 và gene ức chế apoptosis survivin) rất cần thiết

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về tình hình ung thư

Ung thư là tên gọi chung các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách vô

tổ chức và có khả năng lan truyền sang các mô xung quanh Khác với các tế bào bình thường, các tế bào ung thư phát triển vượt khỏi sự kiểm soát và trở nên xâm lấn Trong khi các tế bào bình thường trưởng thành và phát triển thành các tế bào chuyên biệt với chức năng cụ thể còn các tế bào ung thư thì không có chức năng

Hình 1.1 Bản đồ biểu diễn ước tính số lượng ca mắc ung thư mới trên toàn thế

giới năm 2012 [1] Con số trong ngoặc thể hiện số ca ung thư ở các khu vực địa lí

khác nhau

Vào năm 2012, trên toàn thế giới có 14,1 triệu trường hợp mắc ung thư mới, 8,2 triệu ca tử vong, 32,6 triệu người còn sống sau khi được chẩn đoán mắc ung thư (trong phạm vi 5 năm kể từ khi được chẩn đoán mắc bệnh) Trong đó, 57% (8 triệu) trường hợp

triển (Hình 1.1) Theo thống kê của WHO – tổ chức y tế thế giới, có 8,8 triệu ca tử vong

vào năm 2015, trong đó, đứng đầu là ung thư phổi chiếm 1,69 triệu ca, ung thư gan chiếm 0,78 triệu ca xếp thứ 2 và ung thư vú xếp thứ 5 toàn thế giới về số ca tử vong với 0,57 triệu ca

Tại Việt Nam mỗi năm có khoảng 110.000 trường hợp mắc ung thư mới và hơn 73% trong số đó tử vong, là một trong những nước có tỷ lệ tử vong do ung thư cao nhất trên thế giới (theo báo cáo của Bệnh viện Bạch Mai năm 2014) Trong đó các loại ung thư phổ biến với tỷ lệ số ca mắc và tử vong cao bao gồm ung thư phổi (1,59 triệu ca tử vong); Ung thư gan (745.000 ca tử vong); Ung thư dạ dày (723.000 ca tử vong); Ung thư đại trực tràng (694.000 ca tử vong); Ung thư vú (521.000 ca tử vong); Ung thư thực quản (400.000 ca tử vong)

Ung thư gan là bệnh ung thư phổ biến đứng thứ sáu trên toàn thế giới và đứng thứ tư

về nguyên nhân gây tử vong trên thế giới Số liệu năm 2015 cho thấy tỷ lệ tử vong do ung thư gan ngày càng cao, trong đó có 854.000 ca mắc mới và gây ra 810.000 ca tử vong trên thế giới Tỷ lệ mắc bệnh ung thư ở nam cao hơn nhiều so với nữ giới Cụ thể, nam giới có 591.000 ca mắc mới và nữ giới chiếm 264.000 ca Nguyên nhân gây ung thư gan hàng đầu trên thế giới do nhiễm HBV chiếm tỷ lệ 33%, do rượu gây 30%, HCV 21%, các nguyên nhân khác 16% 2 Hình 1.2 ước tính tỷ lệ tử vong của bệnh ung thư trong năm

2016 Ung thư khí quản, phế quản, và phổi gây ra số lượng ca tử vong lớn nhất với 1,7 triệu ca Kế đó là ung thư dạ dày, ung thư đại tràng và ung thư gan đứng thứ tư về khả năng gây tử vong lớn, khoảng 830.000 ca trên thế giới

Hình 1.1 Số lượng người tử vong do ung thư trên thế giới năm 2016

Theo thống kê mới nhất, ước tính trên toàn thế giới có 905.677 trường hợp ung thư gan mới và 830.180 trường hợp tử vong liên quan được ghi nhận vào năm 2020 (Bray và cộng sự, 2018; Sung và cộng sự, 2021) Thống kê năm 2020, Globocan (Chống ung thư toàn cầu) cho thấy Việt Nam được xếp hạng là quốc gia có tỷ lệ ung thư gan cao nhất thế giới (Sung và cộng sự, 2021) với 26.418 ca mắc mới (14,5%) Năm 2020, có 25.272 trường hợp tử vong do ung thư gan

Do tỷ lệ mắc mới và tử vong ngày càng gia tăng nên ung thư gan rất đáng được quan tâm ở Việt Nam cũng như trên thế giới Tuy nhiên, ung thư vẫn còn đang là vấn đề nan giải đối với y học và vẫn chưa tìm ra hợp chất hay phương pháp chữa trị hữu hiệu cho tất cả các loại ung thư hiện nay Nghiên cứu về bệnh ung thư và cách chữa trị ung thư hiện đang là vấn đề được quan tâm trên toàn thế giới Các nghiên cứu về các hợp chất mới, đặc biệt là các hợp chất tự nhiên từ thực vật và nấm đang được coi là triển vọng trong hoàn cảnh hiện nay

1.2 Giới thiệu về cây Trâm Bầu

Cây Trâm Bầu (Combretum quadrangulare Kurz) hay còn gọi là Chưn Bầu, Tim

Bầu, Sang Kê, Song Re, thuộc ngành Magnoliophyta; lớp Magnoliopesida; bộ Myrtales;

họ Combretaceae (họ Bàng); chi Combretum; loài Combretum quadrangulare (C quadrangulare) Cây gỗ nhỏ, cao 5 đến 9 m Lá thường mọc đối nhau có hình trứng

ngược, đầu lá nhọn hoặc có khi tròn, gốc lá thuôn, nhẵn và sần sùi ở mặt trên Hoa nhỏ, màu vàng, mọc thành cụm ở ngọn hoặc nách lá, dài 4 đến 5 cm Quả dài khoảng 2 cm, rộng 8 đến 9 mm, có 4 cánh mỏng màu xanh Hạt có hình thoi, cây Trâm bầu từ lúc nảy mầm đến khoảng 1 năm sau thì có quả, đến năm thứ ba thì quả rộ

Ở Việt Nam, cây Trâm bầu được phân bố rộng khắp các tỉnh miền Nam, đa số cây được trồng, một số cây mọc hoang dại Trâm Bầu được trồng nhiều ở các tỉnh miền Tây Nam Bộ như Long An, Tiền Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ Trâm bầu còn được tìm thấy ở Campuchia, Lào, Thái Lan, Miama, châu Phi [1]

Hình 1.3 Hình chụp lá và quả Trâm Bầu [2]

Theo kinh nghiệm dân gian và các bài thuốc y học cổ truyền, cây Trâm bầu được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc trong dân gian để điều trị bệnh viêm gan, sốt rét, nhiễm trùng đường hô hấp Hạt, lá, vỏ của cây được sử dụng trong y học cổ truyền Việt Nam như một phương thuốc hạ sốt và trị giun sán

Trong hạt có chứa tanin, dầu béo, axit béo, oxalate calcium, axit oxalic tự do Hàm lượng dầu trong hạt là 12%, chất không savon hóa là 4,3% Dầu có màu nâu đỏ, trong thành phần axit béo có axit palmitic (5,91%), axit linoleic (2,31%) Hạt được dùng trị giun sán cho người và gia súc, chất nhầy ở vỏ và cành non, rễ cũng có tác dụng trị giun nhất là đối với giun đũa, giun kim, chữa thương và lá làm thuốc giảm đau, cầm tiêu chảy Nước sắc hạt Trâm bầu có tác dụng trên giun đất và sán lợn Ở Thái Lan, rễ được dùng trị giun và các vết thương, lá chữa đau cơ [3]

1.3 Tình hình nghiên cứu về hoạt tính kháng ung thư từ cây Trâm Bầu

Năm 1999, trong quá trình điều tra về thành phần hóa học của cây thuốc Việt Nam, các nhà khoa học đã cô lập được các hợp chất gây độc tế bào cycloartane của nhóm triterpenes từ dịch chiết methanol của lá cây Trâm bầu và nhận thấy có khả năng gây độc trên dòng tế bào HT-1080 (tế bào ung thư biểu mô liên kết) và 26-L5 (tế bào ung thư ruột

kết chuột) [7] Adnyana cùng các cộng sự đã tìm ra sáu loại Triterpene Glucosides được tách chiết từ chiết xuất methanol của hạt Trâm Bầu [10] Ba hợp chất thuộc nhóm triterpene từ dịch chiết methanol thể hiện hoạt tính bảo vệ gan khi ức chế đến 67,5% tế bào chết được cảm ứng TNF-α [11]

Năm 2011, cùng với việc phân lập và xác định cấu trúc của các triterpenes có trong cây Trâm bầu, các nhà nghiên cứu còn tìm thấy các hợp chất flavonol hiện diện trong đó được thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1/SacI, các hợp chất flavonoid này còn được biết đến với khả năng phòng ngừa và điều trị ung thư vú [12] Cũng trong năm 2011, tác giả Toume và cộng sự đã đưa ra báo cáo về việc các cycloartane triterpene tách chiết từ cây Trâm bầu thu nhận tại Thái Lan có hoạt tính làm tăng biểu hiện của Death-Receptor (DR) trên dòng tế bào ung thư dạ dày (AGS), càng nhấn mạnh thêm về tính gây độc tế bào đồng thời thông qua dấu chỉ DR trên tế bào ung thư Năm 2014, nghiên cứu cho thấy trong lá cây Trâm Bầu thu nhận tại Thái Lan có các hợp chất chống oxi hóa và chống ung thư, nghiên cứu thực hiện trên ba dòng tế bào ung thư KB (tế bào ung thư biểu mô), MCF7 (tế bào ung thư vú) và NCI-H460 (tế bào ung thư phổi) [12] Nghiên cứu năm 2018 của Chuda và cộng sự cũng cho thấy cao chiết từ lá cây Trâm Bầu thu nhận ở Thái Lan có tác dụng gây độc lên tế bào ung thư phổi A549 Theo đó, cao chiết thô từ hạt Trâm Bầu và nano từ cao chiết thô có tác dụng gây độc lên tế bào ung thư theo cơ chế apoptosis Nano cao chiết Trâm Bầu còn có tác dụng làm giảm tính xâm lấn của các tế bào ung thư phổi A549 [13]

Pettit cùng các cộng sự đã chiết xuất được một chất có tên là Combretastatin trong vỏ cây Trâm Bầu Combretastatin có tác dụng ngăn cản lưu lượng máu không cho chuyển oxygen đến các tế bào ung thư làm cho chúng ở trong tình trạng đói oxygen vì thế các tế

bào này không thể phát triển được[50] Khi nghiên cứu về thành phần các hợp chất có

trong hạt, rễ, lá Trâm Bầu, đáng chú ý hơn cả là các nghiên cứu của tác giả Bùi Xuân Hào và Trần Kim Qui Các tác giả đã nghiên cứu tách chiết các hoạt chất từ trâm bầu bao gồm methyl quadrangularate A-L, Acid 23-deoxojessic, acid quadrangularic, 24-epiquadrangularic acid L, norquadrangularic acid A và một số hợp chất mới Một số hợp

chất được chứng minh là có tác dụng ức chế tăng trưởng của tế bào ung thư HepG2 khá mạnh với IC50 từ 29,9 - 60,9 µM [1]

Các nghiên cứu trong nước về cây Trâm Bầu tập trung vào hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn, hoạt tính phân giải của các cao chiết từ các bộ phận lá và hạt của cây, đặc biệt là hoạt tính gây độc tế bào ung thư Đề tài “hoạt tính kháng oxy hóa và gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 của các cao chiết ethanol từ một số dược liệu thu hái tại phía nam Việt Vam” của tác giả Lý Hải Triều đã khảo sát thành phần hóa thực vật, hoạt tính kháng oxy hóa và gây độc tế bào ung thư của một số dược liệu (lá trâm mốc, lá trâm bầu, củ gừng gió và phần trên mặt đất cây mảnh cộng) Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết Trâm Bầu có chứa flavonoid, tannin, triterpenoid và saponin Cao chiết ethanol 96% thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH và tổng lực khử Ngoài ra, cao chiết từ lá Trâm Bầu còn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan HepG2 với giá trị IC50 là 98,51 μg/mL

Tuy nhiên, hiện nay có rất ít các nghiên cứu về cơ chế gây độc tế bào ung thư của các cao chiết cây Trâm Bầu Vì vậy, nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá cao chiết Trâm Bầu làm thay đổi biểu hiện gene trong con đường apoptosis của các tế bào ung thư

1.4 Quá trình apoptosis trong ung thư

Apoptosis là quá trình tế bào chết theo chương trình được lập trình trong gen Apoptosis là một phần của hoạt động sống của tế bào, là một quá trình đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển hài hòa của tế bào Trong quá trình phát triển của cơ thể bình thường, nhờ quá trình apoptosis, nhiều tế bào và cơ quan đã bị tiêu biến [41]

Có hai cơ chế kích hoạt apoptosis của tế bào là kích hoạt các thụ thể chết trên bề mặt tế bào (con đường tín hiệu bên ngoài) thông qua caspase-8 (viết tắt của cysteine-aspartic protease - 8) và con đường tín hiệu ti thể (con đường tín hiệu bên trong) thông qua caspase-9 Con đường tín hiệu ti thể là con đường xảy ra nhanh và mạnh mẽ, sự phá hủy

ti thể làm phóng thích các yếu tố tiền apoptosis như cytochrome c Caspase có vai trò

quan trọng trong quá trình apoptosis bằng cách phá hủy các enzyme nhân đôi và enzyme sửa chữa DNA, hoạt hóa các enzyme phân mảnh DNA, phá vỡ cấu trúc protein nhân Tín

đột biến gây hại cho tế bào và toàn bộ cơ thể Tuy nhiên, trong tế bào ung thư, quá trình apoptosis bị ngăn chặn dẫn đến việc bất tử của tế bào ung thư, đồng thời kéo theo việc duy trì các đột biến trong cơ thể

Apoptosis là chu trình chết của tế bào được kiểm soát chặt chẽ, quá trình này rất quan trọng đối với cân bằng nội môi Ức chế apoptosis dẫn đến quá trình tạo thành khối u cho phép tích lũy đột biến nhằm kích hoạt quá trình chuyển dạng của tế bào mô bình thường [63] Các nhân tố chính điều hòa quá trình apoptosis là protein thuộc họ bcl-2 và họ protein ức chế apoptosis (IAP - inhibitors of apoptosis) [30] Các tế bào ung thư có thể tránh được quá trình apoptosis bằng cách: làm mất cân bằng của các protein pro-apoptotic và anti-apoptotic; giảm chức năng của enzyme caspase; suy giảm tín hiệu thụ thể gây chết

Khác với quá trình hoại tử (necrosis) tế bào thường bị phá hủy gây ra phản ứng viêm, trong apoptosis, màng bào tương nguyên vẹn của các thể apoptotic hầu như sẽ bị thực bào mà không khởi phát tiến trình viêm Do đó, các chiến lược nhằm kích hoạt quá trình apoptosis ở tế bào ung thư rất có ý nghĩa và được coi trọng

1.5 Survivin

Sơ lược về survivin

Survivin hay còn gọi là BIRC5 (baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing

5) là protein thuộc họ protein ức chế quá trình apoptosis (inhibitor of apoptosis - IAP)

Survivin lần đầu tiên được mô tả bởi Ambrosini và cộng sự năm 1997 trong nghiên cứu sàng lọc thư viện bộ gene người [5]

Gene survivin có chiều dài 15 kb, nằm ở vị trí nhiễm sắc thể 17q25 Gene survivin có

cấu trúc gồm 426 nucleotide mã hóa cho protein gồm 142 amino acid có trọng lượng phân tử 16,3 kDa [33] Là một thành viên nhỏ nhất của họ IAP, survivin chỉ chứa một domain chức năng BIR (Baculovirus IAP Repeats) ở đầu tận cùng N có chức năng quan trọng đối với quá trình apoptosis và một miền α-helix ở đầu tận cùng C có thể tương tác

với cấu trúc tubulin (Hình 1.2) [5]

Survivin biểu hiện trong giai đoạn phôi thai, giảm dần biểu hiện trong cơ thể trưởng thành và biểu hiện mạnh trong các trường hợp ung thư [42], [25] Đối với cơ thể trưởng

thành, survivin ban đầu chỉ được phát hiện trong tuyến ức trưởng thành và nhau thai [5],

tuy nhiên các nghiên cứu tiếp theo sử dụng phương pháp hiện đại hơn đã cho thấy nhiều

mô đã biệt hóa khác cũng biểu hiện survivin mặc dù ở mức độ thấp hơn so với các tế bào

ung thư [18], [49]

Hình 1.4 Cấu trúc và chức năng của protein survivin [27]

Chức năng sinh học của survivin trong Apoptosis

Survivin đóng vai trò quan trọng ngăn chặn quá trình apoptosis của tế bào bằng cách trực tiếp hoặc gián tiếp ức chế sự hoạt hóa các caspase thông qua domain BIR Biểu hiện quá mức của survivin làm rối loạn các kiểm soát sự chết theo chương trình của tế bào và cho phép sự tiến triển bất thường của tế bào qua quá trình nguyên phân Survivin gắn đặc hiệu vào đầu tận cùng của các caspase-3 và caspase-7, dẫn đến tăng biểu hiện các caspase này và ức chế quá trình chuyển đổi các zymogen thành các caspase hoạt động [59] Ngoài

ra, survivin còn có thể trực tiếp liên kết với caspase-9 và ức chế hoạt động của protease

có vai trò trong apoptosis [10]

Có nhiều bằng chứng chứng tỏ survivin ngăn chặn quá trình apoptosis gián tiếp thông

qua con đường cytochrome c của ti thể Survivin liên kết với protein nội bào HBXIP

(hepatitis B X-interacting protein), phức hợp này sau đó gắn với pro-caspase-9 làm ức

chế apoptosis của tế bào thông qua con đường cytochrome c của ti thể [40] Thêm vào đó, ở tế bào gan của chuột được knockout gen survivin thể hiện mức độ rất thấp caspase-

8, procaspase-3 và procaspase-9 được hoạt hóa, làm tăng độ nhạy đối với apoptosis được cảm ứng bởi thụ thể chết Fas [9] Survivin còn có thể ức chế hoạt động của caspase thông qua việc gắn và cô lập phức hợp Smac/DIABLO do đó ngăn cản phức hợp này gắn vào các IAP khác dẫn đến việc ngăn chặn quá trình apoptosis [14], [60]

Vai trò của survivin trong ung thư

Survivin được biểu hiện trong khoảng 60 dòng khối u của con người, với mức độ biểu hiện cao nhất trong ung thư vú và ung thư phổi [31], [59] Sự biểu hiện quá mức của survivin luôn gắn liền với sự tồn tại của các loại khối u ác tính

Liên quan đến tính chất ức chế quá trình apoptosis của tế bào, survivin được coi là một dấu chỉ tiềm năng cho liệu pháp phân tử trong chẩn đoán và điều trị ung thư [55] Các nghiên cứu trên survivin đã chứng minh rằng nếu tăng biểu hiện vượt mức Survivin làm tăng quá trình sinh ung thông qua các gen sinh ung trên tế bào Ngược lại, một số

nghiên cứu đã chứng minh ức chế biểu hiện gen survivin dẫn đến gây chết trên tế bào ung

thư [10], [9], [33], [37]

Trong các nghiên cứu về mối tương quan giữa survivin và sự phát triển của tế bào ung thư thì ung thư gan (hepatocellular carcinoma - HCC) được quan tâm hơn cả Mức độ biểu hiện của survivin ở mô ung thư gan (hepatocellular carcinoma - HCC) cao hơn ở

mô gan bình thường và mức độ biểu hiện của survivin có liên quan đến quá trình apoptosis của tế bào [23] Hơn thế nữa, survivin được tìm thấy biểu hiện sớm ở các tế bào ung thư gan và xung quanh mô gan [39], ở giai đoạn sớm của ung thư phổi không tế bào nhỏ (non-small lung cancer) [17] nghiên cứu này đánh dấu một bước quan trọng trong chẩn đoán sớm ung thư gan thông qua biểu hiện survivin Thêm vào đó, mối quan hệ giữa survivin và giai đoạn bệnh ở bệnh nhân ung thư gan được khẳng định khi kết quả cho thấy bệnh nhân có biểu hiện survivin càng cao thì bệnh nhân càng ở giai đoạn sau của bệnh [24]

Tại Việt Nam, vấn đề chẩn đoán ung vú dựa trên dấu chỉ phân tử survivin đang được quan tâm nghiên cứu Nghiên cứu của Nguyễn Minh Hiền năm 2014 cho thấy tỷ lệ phát

hiện sự sao chép survivin mRNA ở mô ung thư vú không liên quan đến tuổi, kích thước

u, tình trạng hạch, giai đoạn bệnh, tình trạng di căn xa, các thể mô bệnh học Tuy nhiên,

nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tỷ lệ phát hiện sự sao chép survivin mRNA ở máu liên quan

đến kích thước u, giai đoạn bệnh [2]

Mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của survivin và mức độ biểu hiện xâm lấn của khối u được chứng minh trong một loạt các nghiên cứu về ung thư mô liên kết [61], ung thư đại trực tràng [21], ung thư vú [54], ung thư phổi không tế bào nhỏ [11], u thần kinh đệm (glioma) [65], ung thư máu tế bào T [45], ung thư tuyến tiền liệt [32] Ngoài ra, nghiên cứu về ung thư biểu mô vòm họng (nasopharyngeal carcinoma) cho thấy mức độ biểu hiện của survivin có liên quan đến quá trình phát triển của mô ung thư biểu mô vòm họng, qua đó cho thấy survivin đóng một vai trò trong nghiên cứu chẩn đoán bệnh ung thư này [8]

Survivin biểu hiện ở mức cao có liên quan đến sự kháng hóa trị liệu, tăng tái phát khối u và giảm thời gian sống của bệnh nhân [19], [48], [64] Survivin có thể tham gia vào quá trình tăng sinh tế bào ung thư và gây ra tình trạng kháng thuốc điều trị [12], [66], [67]

Như vậy, mức độ biểu hiện của survivin có liên quan mật thiết đến quá trình apoptosis của tế bào, dẫn đến mối liên hệ tới quá trình phát triển của các tế bào ung thư Những nghiên cứu về survivin trên tế bào ung thư cho thấy tiềm năng sử dụng survivin như một dấu chỉ sinh học trong chẩn đoán và đặc biệt là chẩn đoán sớm ung thư Hơn thế nữa, sự tương quan giữa survivin và kháng hóa trị liệu cho phép nhìn nhận survivin như một mục tiêu tiềm năng trong nghiên cứu chữa trị bệnh ung thư

Hiện nay phương pháp điều trị được coi là có hiệu quả nhất là phương pháp phẫu thuật cắt bỏ đối với các mô ung thư Tuy nhiên, không phải lúc nào phương pháp phẫu thuật cũng tỏ ra hiệu quả với các bệnh nhân, trong khi đó, phương pháp hóa trị lại xảy ra tình trạng kháng thuốc ở bệnh nhân ung thư, làm giảm hiệu quả điều trị của các phương pháp này [22], [51] Việc phát triển một hợp chất điều trị mới là việc cần thiết và các nghiên cứu trên hợp chất có hoạt tính sinh học tách chiết từ thực vật rất được quan tâm hiện nay

Theo nghiên cứu của Boykin và cộng sự (2011), 1 loại triterpenoid kích hoạt quá trình apoptosis trong tế bào ung thư thông qua điều hòa biểu hiện gene PARP thông qua

ức chế gene survivin trong con đường downstream của JAK2/STAT3 Mà theo nghiên

cứu của Roy và cộng sự (2014), trong số 97 hợp chất đã tách chiết từ cây Trâm Bầu thì có đến 75 hợp chất thuộc nhóm Triterpenoid và 15 hợp chất thuộc nhóm Flavonoid Ngoài ra, survivin được chứng minh biểu hiện nhiều khi cơ thể ở giai đoạn sơ sinh và giảm dần trong quá trình trưởng thành của cơ thể Tuy nhiên, biểu hiện của Survivin lại tăng đột ngột trong trường hợp ung thư, đặc biệt là các tế bào ung thư gan Vì vậy, chúng tôi kì vọng cao phân đoạn từ Trâm Bầu có hoạt tính gây độc tế bào ung thư thông qua ức

chế gene survivin vốn được biểu hiện mạnh của tế bào ung thư gan HepG2

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

Cao chiết Ethanol từ lá cấy Trâm Bầu Combretum quadrangulare Kurz được thu

nhận từ đề tài cấp cơ sở mã số 2020.01.005 Dòng tế bào ung thư gan HepG2 được sử dụng trong nghiên cứu được tặng từ TS Phạm Văn Phúc (Viện Tế Bào Gốc – ĐH Khoa học tự nhiên – ĐH Quốc gia TP HCM) với mục đích nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân đoạn cao chiết từ cây Trâm Bầu

Cao chiết ethanol có hoạt tính gây độc tế bào HepG2 tốt nhất (cao chiết ethanol lá) được hòa tan trở lại với hệ dung môi ethanol:acetone:H2O tỉ lệ 4:1:1 (thể tích/thể tích) để thực hiện phương pháp chiết lỏng – lỏng Cao chiết ethanol trong hệ dung môi ethanol:acetone:H2O (4:1:1) được chiết tách bằng phương pháp lỏng-lỏng (phiễu chiết 2 lít) với dung môi hexan (H), thu nhận dịch chiết hexan Phần không tan trong hexan sau đó được tách chiết với dung môi hexan:ethyl acetate (H:Ea, 1:1), thu nhận dịch chiết H:Ea Tương tự, phần không tan được tiếp tục chiết với dung môi ethyl acetate (Ea), butanol (Bu) và thu nhận các dịch chiết này Các dịch chiết hexan, H:Ea, Ea, Bu được loại dung môi bằng phương pháp cô quay giảm áp, làm khô ở nhiệt độ phòng, thu nhận cao chiết hexan, H:Ea (1:1), Ea, Bu

Cao chiết có hoạt tính gây độc tế bào HepG2 tốt nhất (cao chiết H:Ea) được phân tách ra các phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột silica gel trong hệ dung môi hexan:ethyl acetate:acetone tỷ lệ 5:1:1 Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng Những lọ cho kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn Thu nhận được 15 phân đoạn gồm P1 – P14

và PAX1

2.2.2 Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào ung thư gan HepG2 của các cao phân đoạn từ Trâm Bầu

Dòng tế bào ung thư gan HepG2 được nuôi cấy với mật độ ban đầu là 2×104 tế bào/ml trong môi trường nuôi cấy gồm high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco) bổ sung 10% huyết thanh thai bò (FBS, Gibco), kháng sinh penicillin (100 IU/ml) và streptomycin (100 µg/ml) Tế bào sau đó được ủ ở 37ºC và 5%

CO2 trong 24 giờ

Các cao phân đoạn và đối chứng dương (Doxorubicin) được pha loãng ra các nồng độ 100; 50; 25 và 12,5 µg/ml trong môi trường nuôi cấy, với nồng độ DMSO tương ứng: 1%; 0,5%; 0,25% và 0,125% Đồng thời, đối chứng trắng chính là các nồng độ của đối chứng dương được đặt vào giếng không có tế bào được sử dụng để làm nền cho các giếng trong phương pháp MTT Đối chứng âm (DMSO) được pha loãng ra các nồng độ 1%; 0,5%; 0,25% và 0,125% trong môi trường nuôi cấy Tế bào sau đó được xử lý với 100 μl các cao chiết và đối chứng âm, đối chứng dương ở các nồng độ khác nhau trong môi trường nuôi cấy

Tế bào tiếp theo được ủ ở 37ºC và 5% CO2 trong 72 giờ Sau 72 giờ nuôi cấy, 10 µl MTT (5mg/ml) được thêm vào giếng và tế bào sau đó được ủ ở 37ºC và 5% CO2 trong bốn giờ Loại bỏ môi trường trong giếng, thêm DMSO để hòa tan tinh thể Độ hấp thụ quang học của mẫu ở bước sóng 570 nm được ghi nhận bằng máy đọc ELSIA (BioTek)

Tỷ lệ tế bào chết được tính theo công thức:

I (%) = 100

Trong đó:

I (%): phần trăm tế bào chết

A: giá trị mật độ quang ở bước sóng 570 nm của tế bào đã được thử nghiệm với cao chiết

B: giá trị mật độ quang ở bước sóng 570 nm của đối chứng trắng

C: giá trị mật độ quang ở bước sóng 570 nm của tế bào đã được thử nghiệm với DMSO ở nồng độ tương ứng

Phần mềm GraphPad Prism được sử dụng để vẽ đồ thị thể hiện hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết Với giá trị trung bình là giá trị trung bình cộng (Mean) của 3 lần lặp lại

thí nghiệm và sử dụng độ lệch chuẩn (SD) để thể hiện sự biến thiên của dữ liệu Giá trị

IC50 được tính bằng phương pháp đồ thị, giá trị được thể hiện là giá trị trung bình kèm theo độ lệch chuẩn

2.2.3 Tác động của cao phân đoạn Trâm Bầu lên biểu hiện một số gene liên quan đến quá trình apoptosis ở mức độ phiên mã

Thu nhận tế bào đã thử nghiệm với các phân đoạn tiềm năng

- 105 tế bào HepG2 được nuôi trong mỗi giếng của đĩa 24 giếng, ủ ở 37ºC, 5% CO2

trong 48 giờ

- Loại bỏ môi trường nuôi cấy trong các giếng đối với dòng tế bào ung thư HepG2

- Thêm môi trường có chứa hoạt chất cao phân đoạn tiềm năng và đối chứng âm DMSO ở các nồng độ pha loãng tại IC50 µg/ml vào mỗi giếng

- Ủ ở nhiệt độ 37ºC và 5% CO2 trong 12 giờ

Tách chiết RNA tổng số

Tế bào sau khi ủ với môi trường chứa cao phân đoạn và DMSO được tách chiết RNA tổng số bằng hóa chất TriSure (Bioline) theo hướng dẫn của nhà sản xuất RNA tổng số sau tách chiết được định lượng bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng

260 nm và 280 nm bằng máy đo quang phổ Genway Sau đó, các RNA tổng số được pha loãng trong nước được xử lý DEPC đến nồng độ 200 ng/µl

Đánh giá mức độ biểu hiện mRNA

Phiên mã ngược tạo cDNA (RT-PCR) cDNA được tổng hợp từ khuôn RNA tổng từ tế

bào HepG2 sử dụng LunaScript cDNA Synthesis Kit (NEB) theo hướng dẫn của nhà sản

xuất

Định lượng tương đối mRNA bằng qPCR Phản ứng realtime PCR được thực hiện với

các cặp mồi cho các gen tương ứng survivin, caspase 3, 8, 9 và gen giữ nhà GAPDH (đối

chứng nội – internal control) Các cặp mồi này được tổng hợp hóa học tại Công ty TNHH

MTV Sinh hóa Phù Sa

Kết quả của phản ứng realtime PCR được xử lý bằng phần mềm Pro (Prime) Qua đó, mức độ biểu hiện của mRNA gene mục tiêu của tế bào sau khi xử lý với cao phân đoạn

so với DMSO được thể hiện Mức độ biểu hiện mRNA gene mục tiêu được tính toán theo công thức [38] dựa trên chu kỳ ngưỡng (Ct) của phản ứng realtime PCR:

(lần)

Với,

∆Ct 1 = Ct 1 (gene mục tiêu) – Ct 1 (GAPDH)

∆Ct 2 = Ct 2 (gene mục tiêu) – Ct 2 (GAPDH)

∆∆Ct = ∆Ct 1 - ∆Ct 2

Trong đó:

Ct 1: Chu kỳ ngưỡng của phản ứng đối với tế bào được xử lý với cao phân đoạn

Ct 2: Chu kỳ ngưỡng của phản ứng đối với tế bào được xử lý với DMSO

∆∆Ct: Hiệu số chu kỳ ngưỡng của phản ứng đối với tế bào được xử lý với cao phân đoạn so với DMSO

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu nhận cao phân đoạn

Phần cao chiết ethanol lá Trâm Bầu được hòa tan vào hệ dung môi ethanol : acetone :

H2O tỉ lệ 4:1:1 để thực hiện phương pháp phân đoạn lỏng-lỏng Thực hiện phương pháp chiết lỏng lỏng trên phần cao chiết ethanol (840 g) lần lượt với hexane (H), Hexan: Ethyl Acetate (H:EA, 1:1), Ethyl Acetate (EA) và Butanol (BuOH) thu được cao phân đoạn tương ứng là cao H, H:EA (230 g), EA và BuOH Trong đó, hiệu quả tách chiết phân đoạn H:EA từ cao chiết Ethanol lá Trâm Bầu là 27,38%

Cao phân đoạn H:EA (200 g) được thực hiện sắc kí cột với hệ dung môi H:EA:Acetone 5:1:1 thu được 15 phân đoạn được đánh số P1-P14 và phần cuối được gọi là PAX1 Trong đó, hiệu quả tách chiết phân đoạn P12 (34 g) từ phân đoạn H:EA là 17%

3.2 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các cao phân đoạn

3.2.1 Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các cao phân đoạn lỏng-lỏng

Kết quả Hình 3.1B cho thấy cao phân đoạn H và H:EA thể hiện hoạt tính gây độc tế

bào mạnh hơn phân đoạn EA và BuOH Phân đoạn H và H:EA bắt đầu thể hiện hoạt tính gây độc lên tế bào HepG2 với nồng độ khoảng 12,5 µg/ml Từ nồng độ 50 µg/ml đến 100 µg/ml thì tác dụng gây độc lên tế bào của cao phân đoạn H và H:EA không có sự khác biệt đáng kể (Hình 3.1A thể hiện kết quả của nghiên cứu trước)

Hình 3.1 Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của cao chiết (A) ethanol lá, rễ, hạt trâm

Bên cạnh đó, Bảng 3.1 cho thấy giá trị IC50 của phân đoạn H:Ea (1:1) có là 21,7 ± 1,2

µg/ml, thấp hơn so với các cao phân đoạn còn lại, nói cách khác, phân đoạn H:Ea (1:1) có tác dụng gây độc trên tế bào HepG2 cao hơn các phân đoạn lỏng-lỏng khác Ngoài ra,

Hình 3.1B còn cho thấy cao chiết H:Ea lá bắt đầu thể hiện tác dụng gây độc tế bào

HepG2 từ nồng độ thấp, khoảng 12,5 µg/ml Do đó, cao chiết H:Ea (1:1) được chiết theo phương pháp lỏng – lỏng từ cao chiết EtOH lá trâm bầu được chọn để tiếp tục tách chiết phân đoạn, nhằm tìm ra phân đoạn (được ký hiệu P gồm P1 – PAX1) có tác dụng gây độc tốt nhất trên dòng tế bào ung thư HepG2

Bảng 3.1 Giá trị IC50 của các cao chiết ethanol từ lá, rễ, hạt và cao chiết Ea, H, H:Ea và

BuOH trên dòng tế bào HepG2

Cao phân

IC50 ± SD (µg/ml) > 100 39,4 ±3,5 21,7 ±1,2 > 100

3.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các cao phân đoạn P

Trong 15 phân đoạn P thu được từ cao chiết H:Ea, các cao phân đoạn P1 – P3 ít có

tác dụng gây độc trên tế bào HepG2 với hầu hết các giá trị IC50 lớn hơn 100 µg/ml (Bảng

3.2) Phân đoạn P4 – P8 bắt đầu có tác dụng gây độc tế bào được xác định ở nồng độ thấp

(6,25 – 12,5 µg/ml), tuy nhiên, tại nồng độ khảo sát cao nhất của cao chiết (100 µg/ml), đường cong biểu diễn tỷ lệ gây độc trên tế bào HepG2 của các cao phân đoạn này không

vượt qua ngưỡng gây chết 90% (Hình 3.2) Do đó, các cao phân đoạn P1 – P8 không

phải là phân đoạn tiềm năng để tách chiết các hợp chất có tác dụng gây độc mạnh trên tế bào ung thư HepG2

Hình 3.2 Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của cao phân đoạn P (A) P1 - P4, (B)

P5 – P8, (C) P9 – P11 và (D) P12 – PAX1 Giá trị trung bình (mean) của 3 lần lặp

lại với độ lệch chuẩn (± SD) được thể hiện

Hình 2C và D cho thấy các cao phân đoạn P9 – PAX1 có tác dụng gây độc mạnh

trên dòng tế bào HepG2 Bảng 3.2 còn thể hiện giá trị IC50 của cao phân đoạn P9, P10, P13 và P14 ở mức thấp (15,5 – 20,2 µg/ml), tuy nhiên giá trị IC90 của các cao phân đoạn này lại ở mức cao (88,4 và 92,0 µg/ml), chứng tỏ tuy hoạt tính gây độc 50% tế bào ung thư rất tốt nhưng hoạt tính của các cao chiết này chưa đủ mạnh để giết được 90% tế bào ở nồng độ thấp Trong khi đó, cao phân đoạn P12 có giá trị IC50 và IC90 đều ở mức thấp (25,0 và 49,6 µg/ml) Do đó, cao chiết P12 được ưu tiên lựa chọn để tiếp tục tách chiết phân đoạn, nhằm tìm ra phân đoạn T có tác dụng gây độc tế bào tốt nhất trên dòng tế bào ung thư gan HepG2

Kết quả cũng cho thấy, khi dùng phương pháp tách chiết cột silicagel với dung môi độ phân cực tăng dâng, chúng tôi đã thu được phân đoạn cao chiết có hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh hơn cao chiết ban đầu Điều này chứng tỏ rằng, việc phân đoạn tỏ ra có

hiệu quả nhằm khu trú lại các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư, làm tăng hiệu quả tiêu diệt tế bào ung thư so với cao chiết tổng

Bảng 3.2 IC50 và IC90 của các cao phân đoạn P (P1 – PAX1) trên dòng tế bào HepG2

Cao chiết IC50 ±SD

(µg/mL)

IC90 ±SD (µg/mL) Cao chiết

IC50 ±SD (µg/mL)

IC90 ±SD (µg/mL)

Theo Hình 3.3, ảnh hưởng của cao phân đoạn P12 làm tăng biểu hiện các gene tiền

apoptosis như caspase 3, 8 và 9 Đặc biệt, tế bào thử nghiệm cao phân đoạn P12 có biểu

hiện tăng mạnh mức độ mRNA caspase-8, một đại diện của gene tiền apoptosis có liên

quan đến con đường apoptosis ngoại sinh, so với tế bào được xử lý với DMSO (đối chứng âm) Kết quả tương tự được thấy ở mRNA caspase-9, gene tiền apoptosis liên quan đến con đường apoptosis nội sinh Như vậy, có thể kết luận rằng P12 gây chết tế bào ung thư gan HepG2 thông qua cả hai con đường apoptosis nội sinh và ngoại sinh

Hình 3.3 Mức độ biểu hiện tương đối của các mRNA caspase 3, 8 và 9 ở tế bào

HepG2 xử lý với phân đoạn P12 so với đối chứng âm DMSO Giá trị thể hiện trên biểu đồ là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại ± độ lệch chuẩn Giá trị được

coi là có ý nghĩa p ˂ 0,05 với kiểm định t-test

Ngoài ra, cao phân đoạn P12 cho thấy tác động lên mRNA survivin khi ảnh hưởng làm giảm biểu hiện mRNA survivin so với tế bào thử nghiệm DMSO Như vậy, cao phân

đoạn P12 tác động lên tế bào và gây chết có liên quan đến điều hòa làm giảm biểu hiện

mRNA survivin trong tế bào HepG2

Theo Boykin và cộng sự (2011), một triterpenoid gây ra apoptosis trong tế bào ung thư bằng cách điều chỉnh mức độ biểu hiện PARP thông qua ức chế mức độ biểu hiện của

survivin của con đường JAK2/STAT3 Mặt khác, một nghiên cứu đã được thực hiện để

báo cáo hai triterpenoid có hoạt tính sinh học được phân lập từ phân đoạn P12 (Nguyen et al., 2021) Theo đó, nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên về cơ chế điều hòa giảm mức

độ biểu hiện của survivin do ảnh hưởng của phân đoạn P12 từ cây Trâm Bầu Vì vậy,

chúng tôi dự đoán phân đoạn P12 làm điều hòa giảm mức độ biểu hiện của survivin là do thành phần triterpenoid có trong cao phân đoạn P12

Các cao chiết có thể gây ra quá trình apoptosis của tế bào ung thư theo nhiều cách liên quan đến mức độ biểu hiện của Survivin Về cơ bản, cao chiết có thể ức chế trực tiếp Survivin, dẫn đến điều chỉnh mức độ biểu hiện của các protein caspase-3, -8, -9 và Bid (Conway và cộng sự, 2002; Chandele và cộng sự, 2004) Mặc dù không thể thăm dò hết các yếu tố ảnh hưởng đến con đường apoptosis ở tế bào ung thư HepG2, kết quả vẫn cho thấy phần nào mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của survivin so với các gene caspase đại điện cho con đường tín hiệu apoptosis nội sinh và ngoại sinh (caspase-3, -8, -9) Do vậy, chúng tôi kỳ vọng phân đoạn P12 cùng với các triterpenoid có trong phân đoạn này có tác dụng gây ra apoptosis thông qua con đường tín hiệu apoptosis với những ảnh

hưởng nhất định lên biểu hiện gene survivin

Hình 3.4 Tác động của cao phân đoạn P12 lên mức độ biểu

hiện gene survivin của tế bào HepG2 so với DMSO Giá trị thể

hiện trên biểu đồ là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại ± độ lệch chuẩn Giá trị được coi là có ý nghĩa p ˂ 0,05 với kiểm định t-test

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Chúng tôi đã phân đoạn thành công và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các cao

chiết từ cây trâm bầu Combretum quadrangulare Trong đó:

- Cao chiết H:Ea (1:1) có tác dụng gây độc tế bào HepG2 tốt nhất so với các cao chiết với dung môi hexan, ethyl acetate, butanol

- Tương tự cao phân đoạn P12 là cao phân đoạn có tác dụng gây độc tế bào HepG2 mạnh nhất so với các cao phân đoạn P còn lại

Cao phân đoạn P12 này sau đó được sử dụng nhằm đánh giá ảnh hưởng lên mức độ biểu hiện mRNA của tế bào ung thư gan HepG2 Kết quả cho thấy, cao phân đoạn P12 làm tăng mức độ biểu hiện mRNA các gene pro-apoptotic như caspase 3, 8, và 9 Ngoài

ra, cao phân đoạn P12 làm giảm mức độ biểu hiện mRNA survivin trên tế bào HepG2

Như vậy, cao phân đoạn P12 có tác dụng gây độc tế bào HepG2 theo con đường

apoptosis và có liên quan đến biểu hiện giảm của gen survivin

Chủ nhiệm đề tài

Nguyễn Thị Phương

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bùi Xuân Hào, T.K.Q., Nghiên cứu thành phần hóa học cây trâm bầu Combretum

Quadrangulare Kỷ yếu Hội nghị - Hội thảo (LIC), Đại học Quốc gia Hà Nội , 2011: p 317-320.

2 Hiền, N.n.M., Đánh giá mức độ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA từ tế bào ung thư vú, in

Tóm tắt luận văn tiến sĩ y học 2014: Đại học Y Hà Nội Hà Nội

3 Adnyana, I.K., et al., Three new triterpenes from the seeds of Combretum quadrangulare and

their hepatoprotective activity Journal of natural products, 2001 64(3): p 360-363

4 Adnyana, I.K., et al., Quadranosides I− V, New Triterpene Glucosides from the Seeds of

Combretum quadrangulare Journal of natural products, 2000 63(4): p 496-500

5 Ambrosini, G., C Adida, and D.C Altieri, A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in

cancer and lymphoma Nature medicine, 1997 3(8): p 917-921

6 Banskota, A.H., et al., Cytotoxic cycloartane-type triterpenes from Combretum quadrangulare

Bioorganic & medicinal chemistry letters, 1998 8(24): p 3519-3524

7 Banskota, A.H., et al., Thirteen novel cycloartane-type triterpenes from Combretum

quadrangulare Journal of natural products, 2000 63(1): p 57-64

8 Cai, J.-H., et al., Survivin gene functions and relationships between expression and prognosis in

patients with nasopharyngeal carcinoma Asian Pac J Cancer Prev, 2015 16(6): p 2341-5

9 Conway, E.M., et al., Deficiency of survivin in transgenic mice exacerbates Fas-induced

apoptosis via mitochondrial pathways Gastroenterology, 2002 123(2): p 619-631

10 Chandele, A., et al., Upregulation of survivin in G2/M cells and inhibition of caspase 9 activity

enhances resistance in staurosporine-induced apoptosis Neoplasia, 2004 6(1): p 29-40

11 Dai, J., et al., Prognostic significance of survivin polymorphisms on non-small cell lung cancer

survival Journal of Thoracic Oncology, 2010 5(11): p 1748-1754

12 de Moraes, G.N., et al., Doxorubicin induces cell death in breast cancer cells regardless of

Survivin and XIAP expression levels European journal of cell biology, 2013 92(8): p 247-256

13 Deutsch, H.F., Chemistry and biology of α-fetoprotein Advances in cancer research, 1991 56: p

253-312

14 Du, C., et al., Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c–dependent caspase

activation by eliminating IAP inhibition Cell, 2000 102(1): p 33-42

17 Falleni, M., et al., Survivin gene expression in early‐stage non‐small cell lung cancer The

Journal of pathology, 2003 200(5): p 620-626

18 Fukuda, S and L.M Pelus, Survivin, a cancer target with an emerging role in normal adult

tissues Molecular cancer therapeutics, 2006 5(5): p 1087-1098

19 Garg, H., et al., Survivin: a unique target for tumor therapy Cancer cell international, 2016

16(1): p 49

20 Giannini, E.G., et al., Surveillance for early diagnosis of hepatocellular carcinoma: how best to

do it? World Journal of Gastroenterology: WJG, 2013 19(47): p 8808

21 Hernandez, J.M., et al., Expression of the antiapoptotic protein survivin in colon cancer Clinical

colorectal cancer, 2011 10(3): p 188-193

22 Housman, G., et al., Drug resistance in cancer: an overview Cancers, 2014 6(3): p 1769-1792

23 Hui, W., et al., Expression of Survivin, p53 and its relationship with apoptosis, proliferation in

hepatocellular carcinoma (HCC) Journal of Nanjing Medical University, 2008 22(4): p

255-259

24 Ikeguchi, M., Y Hirooka, and N Kaibara, Quantitative analysis of apoptosis‐related gene

expression in hepatocellular carcinoma Cancer, 2002 95(9): p 1938-1945

25 Islam, A., et al., High expression of Survivin, mapped to 17q25, is significantly associated with

poor prognostic factors and promotes cell survival in human neuroblastoma Oncogene, 2000

19(5): p 617-623

26 Ito, T., et al., Survivin promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma

Hepatology, 2000 31(5): p 1080-1085

27 Jaiswal, P.K., A Goel, and R Mittal, Survivin: A molecular biomarker in cancer The Indian

journal of medical research, 2015 141(4): p 389

28 Jeyaprakash, A.A., et al., Structure of a Survivin–Borealin–INCENP core complex reveals how

chromosomal passengers travel together Cell, 2007 131(2): p 271-285

29 Kamiyama, T., et al., AFP mRNA detected in bone marrow by real-time quantitative RT-PCR

analysis predicts survival and recurrence after curative hepatectomy for hepatocellular

carcinoma Annals of surgery, 2006 244(3): p 451

30 Kang, M.H and C.P Reynolds, Bcl-2 Inhibitors: Targeting Mitochondrial Apoptotic Pathways in

Cancer Therapy Clinical cancer research : an official journal of the American Association for

Cancer Research, 2009 15(4): p 1126-1132

31 Kennedy, S., et al., Prognostic importance of survivin in breast cancer British journal of cancer,

2003 88(7): p 1077-1083

32 Khan, S., et al., Plasma-derived exosomal survivin, a plausible biomarker for early detection of

prostate cancer PloS one, 2012 7(10): p e46737

33 Li, F., et al., Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin Nature, 1998

396(6711): p 580-584

34 Li, M., et al., Effects of alpha fetoprotein on escape of Bel 7402 cells from attack of lymphocytes

BMC cancer, 2005 5(1): p 96

35 Li, M.S., et al., The intracellular mechanism of alpha-fetoprotein promoting the proliferation of

NIH 3T3 cells Cell research, 2002 12(2): p 151-156