SỮA CÔNG THỨC DẠNG BỘT CHO TRẺ SƠ SINH – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG WHEY PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL NATRI DODECYL SULFAT (SDS-CGE)

Tiêu chuẩn này không sử dụng để phân tích protein thủy phân hoặc protein thực vật trong các sản phẩm công thức cho trẻ sơ sinh.. Hệ số hiệu chỉnh khối lượng trên diện tích CF là 1,4 được

TCVN T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A

Dự thảo 2 TCVN ………:2019

Xuất bản lần 1

SỮA CÔNG THỨC DẠNG BỘT CHO TRẺ SƠ SINH –

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG WHEY PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL NATRI

DODECYL SULFAT (SDS-CGE)

Milk-dased infant formula powders – Determination of whey protein content by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis (SDS-CGE) method

HÀ NỘI – 2019

Lời nói đầu

TCVN :2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC

2016.15 Quantification of whey protein content in Milk-based infant

formula powders Sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis

(SDS-CGE) method;

TCVN :2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm

quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường

Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN :2019

Sữa công thức dạng bột cho trẻ sơ sinh –

Xác định hàm lượng whey protein bằng phương pháp

điện di trên gel natri dodecyl sulfat (SDS-CGE)

Milk-dased infant formula powders – Determination of whey protein content

by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis (SDS-CGE) method

CẢNH BÁO  Phải sử dụng đúng các tiêu chuẩn an toàn cá nhân và môi trường khi tiến hành phương pháp Nhân viên phòng thí nghiệm xử lý dung môi, axit và thuốc thử phải hiểu biết về các nguy cơ tiềm ẩn của chúng Tham khảo Bản an toàn vật liệu (MSDS) để biết thông tin về các mối nguy và thực hiện các biện pháp phòng ngừa thích hợp Chuyển dung môi, bao gồm β-mercaptoethanol và axit, bên trong tủ hút và máy chiết hiệu quả Vì tích tụ β-mercaptoethanol, nên thực hiện phân tích trong phòng thông gió tốt Tốt nhất, lắp máy trực tiếp trong tủ hút Đảm bảo tất cả các đồ thủy tinh không bị sứt mẻ và có vết nứt.

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng whey protein trong sữa công thức dạng bột cho trẻ sơ sinh bằng điện di trên gel natri dodecyl sulfat (SDS-CGE)

Tiêu chuẩn này có thể xác định được tỷ lệ giữa whey protein với casein trong khoảng từ 20:80 đến 80:20

Tiêu chuẩn này không sử dụng để phân tích protein thủy phân hoặc protein thực vật trong các sản phẩm công thức cho trẻ sơ sinh

2 Nguyên tắc

Các protein trong mẫu bị biến tính bởi chất hoạt động bề mặt anion SDS và được khử bằng β-mercaptoethanol Các protein liên kết với điện tích SDS di chuyển trong điện trường chứa đầy gel phân

tách và được phát hiện bằng detector UV ở 220 nm Casein và whey protein được tách ra thành hai nhóm khác nhau, không chồng pic, tỷ lệ được tính dựa trên diện tích pic mà không cần đường chuẩn

Hệ số hiệu chỉnh khối lượng trên diện tích (CF) là 1,4 được sử dụng cho whey protein so với casein trong phép tính hàm lượng whey protein

3 Thuốc thử và vật liệu thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác

3.1 Đệm gel natri dodecyl sulfat-khối lượng phân tử (SDS-MW)

3.2 Bộ phân tích nhanh SDS-MW, bao gồm mao mạch trần (bar), cột mao quản silica nung chảy

(đường kính 50 μm, dài 30 cm); Bộ đệm gel SDS-MW (3.1); Đệm mẫu SDS-MW (100 mM tris – HCl,

pH 9,0; với SDS 1 %); dung dịch nội chuẩn protein 10 kDa (3.3); dung dịch rửa axit (HCl 0,1 M); dung dịch rửa kiềm (NaOH 0,1 M ) và SDS-MW cỡ tiêu chuẩn (10 kDa đến 225 kDa, 16 mg/ml)

3.3 Dung dịch nội chuẩn protein, 10 kDa.

3.4 Nước đã loại ion, được lọc qua màng lọc 0,45 μm.

3.5 β-mercaptoetanol.

4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1 Proteome Lab PA 800 Plus hoặc tương đương được trang bị detector UV cài đặt ở bước sóng

220 nm

Diện tích pic có thể được tích phân bằng phần mềm bất kỳ phù hợp

4.2 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,0001 g.

4.3 Nồi cách thủy được kiểm soát nhiệt độ, 100 °C ± 5 °C

4.4 Máy ly tâm, dùng cho lọ nhỏ dung tích 1,5 ml.

4.5 Máy trộn vortex.

4.6 Pipet có thể điều chỉnh, có các dung tích thích hợp.

4.7 Lọ ly tâm, có nắp đậy kín, dung tích 2,0 ml.

4.8 Ống ly tâm, đáy tròn, dung tích 10 ml.

5 Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên thoả thuận với nhau về vấn đề này

6 Cách tiến hành

6.1 Chuẩn bị các dung dịch đệm và dung dịch mẫu

6.1.1 Nạp các thuốc thử vào đầu vào (trái) và đầu ra (phải) của hệ thống khay đệm bằng 6 6 khay đệm được sắp xếp theo cấu hình được nêu trong Phụ lục A (cấu hình khay đệm) Nếu sử dụng hệ thống tương đương thì làm theo hướng dẫn đối với hệ thống đó

6.1.2 Dùng cân (4.2) cân khoảng 135 mg 5 mg sữa bột đã tách chất béo (hàm lượng protein

khoảng 37 %) hoặc 500 mg ± 20 mg bột thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh (hàm lượng protein khoảng

11 %) vào ống ly tâm 10 ml (4.8)

6.1.3 Pha loãng mẫu đến 5 ml cuối cùng bằng nước đã loại ion Trộn từng ống trên máy trộn vortex

(4.5) cho đến khi dung dịch đồng nhất Mỗi dung dịch cuối cùng chứa từ 10 mg/ml đến 15 mg/ml protein

6.1.4 Chuẩn bị mẫu rửa giải sơ bộ bằng cách trộn 1 % dung dịch natri dodecyl sulfat (SDS) với dung dịch nội chuẩn peptit 10 kDa tỷ lệ 84:1 Tổng thể tích dung dịch rửa giải sơ bộ dựa trên tổng số mẫu được phân tích trong mẫu (90 μl/mẫu)

6.1.5 Dùng pipet (4.6) lấy 10 μl của mỗi dung dịch mẫu vào các lọ ly tâm (4.7) riêng biệt.

6.1.6 Lần lượt thêm 85 μl mẫu rửa giải sơ bộ và 5 μl β-mercaptoetanol (3.5) vào từng lọ của máy ly

tâm (4.4) Trộn kỹ trước khi đun nóng các lọ trong nồi cách thủy (4.3) ở 100 °C ± 5 °C trong

10 min Để nguội đến nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm ở nhiệt độ phòng 1 min ở khoảng 7 000 r/min

6.1.7 Trộn trên máy trộn vortex (4.5) trước khi chuyển từng mẫu vào lọ bơm mẫu tương ứng.

6.2 Tiến hành phân tích

6.2.1 Thiết lập phương pháp tách tối ưu để phân tích mẫu, bao gồm một mẫu trắng dung dịch đệm

(10 μl nước), MW kích thước chuẩn và mẫu sữa bột đã tách chất béo

6.2.2 Đối với mỗi chu trình tách (45 min), trước tiên hoạt hóa mao quản bằng dung dịch rửa cơ bản

trong 3 min, tiếp theo là dung dịch rửa axit trong 1 min, nước trong 1 min và dung dịch đệm gel SDS trong 10 min Thiết lập chương trình tách trong 30 min

6.2.3 Điện di mẫu ở điện thế –5 kV trong 20 s.

6.2.4 Thực hiện điện di ở điện thế không đổi với cường độ điện trường -497 V/cm và mao quản được

giữ nhiệt ở 25°C bằng dịch làm mát tuần hoàn

6.2.5 Dòng điện được tạo ra phải xấp xỉ 27 μA.

6.2.6 Thông thường một vial thuốc thử chỉ thực hiện cho 8 lần phân tích, nên cần tăng lượng vial

thuốc thử khi có nhiều mẫu phân tích

6.2.7 Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống thử nghiệm bằng cách sử dụng bộ đánh dấu MW Tiêu chí

chấp nhận đối với sự phù hợp của hệ thống như sau:

a) Thời gian di chuyển của dung dịch chuẩn nội là 12,3 min ± 0,5 min khi sử dụng thiết bị và mao quản Nếu sử dụng mao quản hoặc thiết bị tương đương thì xác định thời gian di chuyển của dung dịch nội chuẩn tương ứng Mô hình di chuyển và thời gian di chuyển của bảy bộ đánh dấu MW (10, 20, 35, 50,

100, 150 và 225 kDa) phải hoàn toàn tách biệt trong vòng 30 min bằng phương pháp này hoặc khi sử dụng thiết bị tương đương (xem phụ lục B)

b) Tiêu chí chấp nhận cho quy trình tách

Thời gian di chuyển của dung dịch chuẩn nội phải là 12,3 min ± 0,5 min (nếu sử dụng thiết bị tương đương thì thời gian di chuyển phải được xác định trước) Chênh lệch chiều cao của đỉnh pic nội chuẩn đến điểm uốn giữa pic của chuỗi miễn dịch globulin nặng (Ig H) và pic của albumin huyết thanh bò (BSA) không được vượt quá 25 % chiều cao của dung dịch nội chuẩn trong mẫu

6.2.8 Tích hợp các electropherogram (eGram):

Tich hợp eGram của cả sữa bột đã tách chất béo (Phụ lục C) và sản phẩm công thức cho trẻ sơ sinh (Phụ lục D) bằng cách thiết lập đường nền từ 0,4 min trước pic nội chuẩn đến điểm uốn giữa đầu pic κ-casein và pic của Ig H và BSA (không có pic âm nào được tạo ra bởi sự tích hợp); thực hiện tích hợp thủ công từ pic của Ig H và BSA đến pic cuối cùng trong eGram (tích hợp tất cả các pic sau pic Ig H và BSA)

Tham khảo Phụ lục B đối với việc tách protein kích thước chuẩn MW

6.2.9 Xác định vùng của casein

Đối với sữa bột đã tách chất béo, cài đặt thời gian bắt đầu tích hợp casein ngay trước pic β-casein (khoảng 3,1 min sau pic của nội chuẩn 10 kDa) Đối với sản phẩm công thức cho trẻ sơ sinh, xác định pic của β-casein theo eGram của sữa bột đã tách chất béo và cài đặt thời gian bắt đầu tích hợp casein ngay trước pic này Đối với tất cả các mẫu, cài đặt thời gian kết thúc giữa điểm uốn cuối của pic

κ-casein, pic Ig H và BSA (khoảng 7,0 min sau dung dịch nội chuẩn 10 kDa)

7 Tính kết quả

Tách tổng các pic ở ba vùng: hai vùng ở mỗi đầu của eGram (các protein whey MW thấp hơn và MW

cao hơn) và một vùng giữa Vùng giữa tương ứng với các protein casein (Acn), và hai vùng còn lại

được gộp lại để thu được các protein whey (Aw)

Hàm lượng whey protein, W, tính bằng phần trăm, tính được bằng công thức (1):

Trong đó

A w là tổng diện tích của các protein thành phần;

A cn là diện tích của các casein thành phần;

A w.c là diện tích của các protein thành phần, tính được bằng Công thức (2);

Trong đó: 1,4 là hệ số chuyển đổi sự khác nhau giữa tỉ lệ khối lượng của whey protein và casein

CHÚ THÍCH Các pic trong eGram có thể dịch chuyển dần dần từ đầu đến cuối quá trình chạy Pic nội chuẩn được sử dụng

để điều chỉnh thời gian di chuyển cho tất cả các đỉnh trong eGram.

8 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với

mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được;

f) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được

Phụ lục A

(Tham khảo)

Cấu hình khay đệm (đối với thiết bị Beckman)

Đầu vào

Đầu ra

Phụ lục B

(Tham khảo)

Hình B1  Tách protein kích thước chuẩn MW

Phụ lục C

(Tham khảo)

whey MW thấp Casein whey MW cao

Hình C.1  eGram của sữa bột đã tách chất béo

Phụ lục D

(Tham khảo)

Ví dụ về sắc ký đồ

Hình D.1  eGram của bột sữa công thức cho trẻ sơ sinh

Phụ lục E

(Tham khảo)

Kết quả thử liên phòng thử nghiệm

Kết quả liên phòng thử nghiệm đối với hàm lượng whey protein

trong mẫu bột sữa công thức cho trẻ sơ sinh

(whey

%)

Số phòng thí nghiệm

Trung bình (whey %)

Độ thu hồi, %

RSD r , % RSD R , % HorRat

CGMP – Casein glycoMacro peptit.

EDW – Electrodialysis demineralized whey.

_