Khảo sát tình hình nhiễm nấm và mức độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm của nấm da tại Bệnh viện Da liễu TP.HCM.pdf

Phương pháp nghiên cứu: Phân lập nấm da từ bệnh phẩm trên môi trường chọn lọc dermatophytes test medium DTM, định danh bàng hình thái học và sinh hoá, xác định tính nhạy cảm với ketocona

CỘNG HÒA XẢ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

Số hợp đồng: 2018.01.44

Đơn vị công tác: Khoa Dược

Thời gian thực hiện: 06/2018 - 02/2019

TP Hồ Chỉ Minh, ngày 26 tháng 04 năm 2019

Đơn vị chù trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

Tên đề tài: Khảo sát tình hình nhiềm nấm và mức độ nhạy cảm với thuốc kháng

nấm của nấm da tại bệnh viện Da liều TPHCM.

Số họp đồng: 2018.01.44

Thời gian thực hiện: 06/2018 - 02/2019

Các thành viên phối họp và cộng tác:

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC sơ ĐÒ viii

MỞ ĐẦU 2

ĐẶT VÁN ĐỀ 3

TÓM TẤT 4

CHƯƠNG 1: TỐNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 TÔNG QUAN VỀ NẤM DA GÂY BỆNH 5

1.2.1 Lịch sữ phát hiện nấm da 5

1.2.2 Tổng quan về nấm da 5

1.2.3 Phân loại nam da 6

1.2.4 Các bệnh nấm da ở người 9

1.2.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước ve nấm da 11

1.2 CÁC KỲ THUẬT TRONG PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM DA 14

1.2.1 Xác định sự có mặt cùa nấm da từ mẫu bệnh phẩm 14

1.2.2 Nuôi cấy và phân lập nấm da 15

1.2.3 Phương pháp định danh nam da 17

1.2.3.1 Đặc điểm hình thái khóm nấm 17

1.2.3.2 Đặc điểm hình thái hiển vi 17

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HIỆU Lực KHÁNG NẤM 18

1.3.1 Phương pháp pha loãng 18

1.3.2 Phương pháp khuếch tán 19

1.3.3 Phương pháp khuếch tán dùng để xác định mức độ nhạy cùa các chất kháng nấm trên nấm da 19

1.4 TỎNG QUAN MỘT só THUỐC KHÁNG NẤM VÀ ĐIỀU TRỊ 20

1.4.1 Thuốc kháng nấm ketoconazole 20

1.4.2 Thuốc kháng nấm terbinaíĩne 22

1.4.3 Một số phác đồ điều trị nấm da 23

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cửu 25

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 25

2.1.4 Hóa chất và thiết bị 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 26

2.2.1 Sàng lọc và định danh nam da 26

2.2.2 Phương pháp thứ độ nhạy cảm của nấm da với thuốc kháng nấm 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 KẾT QUẢ 33

3.1.1 Đặc điểm mầu nghiên cứu 33

3.1.2.1 Tỷ lệ nhiễm nấm da theo độ tuổi 33

3.1.2.2 Tỷ lệ nhiễm nấm da theo giới tính 34

3.1.2.3 Tỳ lệ nhiễm nấm theo vị trí trên cơ the bệnh nhân 35

3.1.2 Sàng lọc và định danh vi nấm 36

3.1.2.1 Soi tươi trực tiếp 36

3.1.2.2 Sàng lọc nấm da bằng môi trường DTM 37

3.1.2.3 Đặc điểm hình thái khóm nấm và đặc điểm hình thái hiển vi 37

3.1.2.4 Định danh bằng các phàn ứng khác 41

3.1.3 Độ nhạy cảm cùa nấm da với thuốc kháng nấm 45

3.2 THẢO LUẬN 51

3.2.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 51

3.2.2 Định danh nấm da 52

3.2.3 Độ nhạy cảm của nấm da với thuốc kháng nấm 52

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 54

4.1 KÉT LUẬN 54

4.2 KIÉN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Tiếng Việt 55

Tiếng Anh 56

PHỤ LỤC PL1

Đường kính vòng kháng nấm

Fragment Length Polymorphism

Phàn ứng khuếch đại gen

và sự đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

Bàng 1.3 Phân bố chi nấm Trichophyton ở người và ở động vật [19], [20], [27] 8

Bảng 1.4 Sinh thái học nấm da 9

Bàng 1.5 Tiêu chuẩn ve mức độ nhạy của nấm da theo Neo-Sensitabs [30] 20

Bàng 1.6 Cấu trúc và tính chất của ketoconazole 21

Bàng 2.1 Đặc điểm khóm nấm [38] 27

Bàng 2.2 Đặc điểm quan sát dưới kính hiến vi cùa nấm da [19], [20], [27] 29

Bàng 2.3 Ket quả thử nghiệm ure ở một số chủng nấm da [14] 30

Bàng 2.4 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ nhạy của vi nam với ketoconazole và terbinafme [30] 32 Bàng 3.1 Tỷ lệ nhiễm nấm phân bố theo độ tuổi 33

Bàng 3.2 Tỷ lệ nhiễm nấm da theo giới tính và nhóm tuổi 34

Bàng 3.3 Tỳ lệ nhiễm nấm phân bố theo vị trí và giới tính 35

Bàng 3.4 Đặc điểm hình thái khóm nấm và đặc điểm hiển vi 38

Bàng 3.5 Hình ảnh khóm nam và hình thái hiển vi 40

Bàng 3.6 Ket quâ định danh các vi nấm phân lập từ bệnh phàm 45

Bàng 3.7 ĐK.VK.N đoi với chùng nấm T rubrum 45

Bàng 3.8 ĐK.VK.N trên T mentagrophytes 46

Bàng 3.9 ĐKVK.N trên T tonsurans, T verrucosum và T violaceum 47

Bàng 3.10 ĐKVK.N trên M canis và M gypseum 48

Bàng 3.11 Mức độ nhạy cảm cùa nấm da với ketoconazole và terbinafine 50

Hình 3.1 Sợi nấm quan sát được khi soi tươi dưới vật kính 40X 37

Hình 3.2 Ket quà trên môi trường DTM 37

Hình 3.3 Mỉcrosporum canis phát triển trên môi trường cháo hoa 38

Hình 3.4 Ket quả thừ nghiệm môi trường ure 42

Hình 3.5 Ket quả thừ nghiệm môi trường BCP-MS-G 42

Hình 3.6 Ket quả thừ nghiệm trên môi trường CMDA 43

Hình 3.7 Thừ độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm terbinafme bằng phương pháp khuếch tán 49

Hình 3.8 ĐKVKN của ketoconazole trên T mentagrophytes 49

Hình 3.9 Phân bo mức độ nhạy cảm của nấm da với ketoconazole theo loài 51

Sơ đo 3.2 Tỳ lệ nhiễm nấm phân bố theo giới tính 35

Sơ đồ 3.3 Tỷ lệ nhiễm nấm phân bố theo vị trí nhiễm bệnh trên cơ the 36

Sơ đồ 3.4 Sơ đồ định danh vi nấm da [38] 44

TÓM TÁT KÉT QUẢ NGHIÊN cứuSản phẩm thực đạt được Sản phẩn đăng ký tại thuyết minh

So liệu về tình hình phân bố các chi/ loài

Chí Minh (Đã duyệt đăng tháng 3/2019)

Kỳ yểu Hội nghị ĐH Nguyễn Tất Thành hoặc 1 tạp chí chuyên ngành trong nướcTham gia đào tạo 2 Dược sĩ Đại học

- Tôn Hoàng Diệu (13DDS07)

- Nguyễn Lê Phương Uyên

(13DDS01)

Tham gia đào tạo 2 Dược sĩ Đại học

Thời gian đăng ký: từ ngày 06/2018 đến ngày 11/2018

Thòi gian nộp báo cáo: ngày 16/11/2018

MỞ ĐẦU

Mở đầu: Bệnh nấm da khá phổ biến tại các vùng khí hậu nóng ẩm như Việt Nam, mặc dù bệnh chỉ khu trú ở da nông nhưng ảnh hưởng nghiêm trọng den chất lượng cuộc song Thời gian điều trị dài tác động lớn đen sự tuân thù trị liệu cùa bệnh nhân, cũng là cơ hội phát sinh

đe kháng với thuốc kháng nấm

Đối tượng: Bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm nấm (da, tóc) điều trị tại bệnh viện Da liều

TP HCM với các tiêu chuẩn chọn mầu:

Bệnh nhân đen khám tại Bệnh viện Da liễu từ 11-12/2017

Bệnh nhân có ket quả soi tươi dương tính với hình ánh “Sợi nam có vách ngăn”

Vị trí nhiễm bệnh có nhiều vảy

Phương pháp nghiên cứu: Phân lập nấm da từ bệnh phẩm trên môi trường chọn lọc dermatophytes test medium (DTM), định danh bàng hình thái học và sinh hoá, xác định tính nhạy cảm với ketoconazole, terbinafme theo hướng dần CLSIM44-A2, thay đổi theo Nweze

và cs (2010)

Kết quả: Từ 104 mầu cho kết quà nhiễm "sợi nấm có vách ngăn”, phân lập trên DTM thu được 55 mẫu thuần trong đó: Có 7 loài nấm da.- T rubrutn (36,36%), T mentagrophytes

(32,73%), T tonsurans (14,55%), T verrucosum (3,64%), T violaceum (3,64%), M canis

(5,45%) và M. gypseum (3,64%) Nam mắc bệnh cao hơn nữ (65,38% so với 34,62%) Độ tuổi 16-25 chiếm có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất (41,35%), < 15 tuổi chiêm tỷ lệ thấp nhất (3,85%) về vị trí nhiễm nấm, bẹn là vị trí nhiễm bệnh cao nhất (25,96%) sau đó đen đầu (1,92%) Ve mức độ nhạy căm với thuốc kháng nấm, có 52,7% chùng nhạy cảm với ketoconazole; 21,8% nhạy cảm trung gian và có 25,5% chùng đã bị đề kháng với ketoconazole Tất cả các chùng nấm da ly trích từ bệnh nhân đều nhạy câm với terbinafine (2 pg/ đĩa)

Kết luận: Hau het các chùng nam da thuộc chi Trichophyton, 100% chủng nhạy cảm terbinafme, có 52,73% chủng nhạy cảm với ketoconazole

ĐẶT VẤN ĐÈ

Các bệnh ve da và rối loạn về da ở người thường không đe dọa đen tính mạng nhưng gây cho bệnh nhân cảm giác ngứa ngáy và khó chịu, có thể biến dạng vùng da nhiễm bệnh và đặc biệt là ânh hưởng nghiêm trọng đen chất lượng cuộc sống trong trường hợp các tốn thương lan rộng

Ngày nay, mức sống và kiến thức thường nhật cùa người dân Việt Nam đã được nâng cao nhưng vần còn thiếu sót ve kiến thức điều trị bệnh nói chung cũng như bệnh nấm da nói riêng Điều đó dần đến hậu quả rất đáng lo ngại từ việc sữ dụng thuốc không hợp lý Cụ thể

là, bệnh nhân thường lạm dụng corticoid khiến tình trạng nhiễm nấm nặng và cũng trờ nên khó điều trị hơn Không những the, đối với các bệnh nhân dùng đúng thuốc ngay từ khi phát hiện bệnh thường cũng mắc phải một sai lầm chính là không tuân thủ phát đo điều trị cùa thầy thuốc, tự ý dừng thuốc hoặc không đù kiện nhẫn điều trị làm bệnh diễn tiên mạn tính

và phức tạp Từ những lý do đã nêu, bệnh nhiễm nam da và việc đề kháng với thuốc kháng nấm cùa các vi nấm da ngày càng lan rộng và cũng là một trong những vấn đề được nhiều người quan tâm Các thuốc kháng nấm thường được sữ dụng như ketoconazole, clotrimazol dần bị đe kháng khi xuất hiện càng nhiều bệnh nhân điều trị thất bại Xuất phát từ thực te trên, chúng tôi lựa chọn đe tài “Khâo sát tình hình nhiễm nam và mức độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm cùa nấm da tại bệnh viện Da liều TpHCM” từ tháng 11 - 12/2017, nham thực hiện các mục tiêu sau:

1 Khảo sát tình hình bệnh nhiễm nam da trên đối tượng bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Da liễu Thành Phố Hồ Chí Minh từ tháng 11 - 12/2017

2 Phân lập và định danh các chùng vi nấm ly trích từ bệnh pham bang phương pháp

TÓM TẤT

Đặt vấn đề: Bệnh nấm da khá phổ biển tại các vùng khí hậu nóng ẩm như Việt Nam, mặc

dù bệnh chi khu trú ở da nông nhưng ảnh hưởng nghiêm trọng đen chất lượng cuộc sống Thời gian điều trị dài tác động lớn đen sự tuân thủ trị liệu cùa bệnh nhân, cũng là cơ hội phát sinh đề kháng với thuốc kháng nấm

Mục tiêu: Xác định thành phần loài và tính nhạy câm với ketoconazole, terbinafine cùa các chùng nấm da phân lập từ bệnh phẩm tại Bệnh viện Da liều TP Hồ Chí Minh từ tháng 11/2017- 12/2017

Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Phân lập nấm da từ bệnh phẩm trên môi trường

chọn lọc dermatophytes test medium (DTM), định danh bang hình thái học và sinh hoá, xác định tính nhạy cảm với ketoconazole, terbinafme theo hướng dẫn CLSI M44-A2, thay đoi theo Nweze và cs (2010)

Kết quả: Trong các mầu thu thập từ bệnh phẩm trong tháng 11-12/2017 cùa bệnh nhân biểu hiện lâm sàng nấm da, có 104 mầu da dương tính với xét nghiệm KOH, phân lập trên môi trường chọn lọc thu được 55 chủng, trong đó chi Trichophyton chiếm ưu the (90,91%) so với chi Microsporum (9,09%) và không có chi Epidermophyton về mức độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm, có 52,7% chủng nhạy cám với ketoconazole; 21,8% nhạy cảm trung gian

và có 25,5% chùng đã bị đe kháng với ketoconazole Tat cả các chủng đều nhạy cảm với terbinafme

Kết luận: Hầu hết các chùng nấm da thuộc chi Trichophyton, có 52% chủng nhạy cảm với

ketoconazole và 100% chùng nhạy cảm terbinaíine

Từ khóa: nấm da, ketoconazole, terbinafine, mức độ nhạy cám

CHƯƠNG 1: TỐNG QUAN TÀI LIỆU

- Năm 1841, David Gruby - một bác sĩ người Hungary khi làm việc tại Paris đã mô tà một cách cẩn thận một số loại nhiễm trùng da liều khác nhau Đen năm 1843, ông phát hiện và đặt tên cho chi nấm da Microsporum và mô tà loài Microsporutn audouinii dựa trên sự xuất

hiện của loài nam này trên lâm sàng

- Năm 1845, chi nấm da Trichophyton được phát hiện và mô tả bởi Per Henrik Malmsten, một nhà điều tra viên người Thụy Điển

- Năm 1910, chi Epidermophyton được biết đen nhờ công cúa nhà khoa học Raymond Sabouraud, đây là chi nấm cuối cùng được tìm ra trong tong số 3 chi nấm da [12]

1.2.2 Tổng quan về nấm da

Bệnh nấm da là một bệnh truyền nhiễm pho biên gây ra bởi các vi nấm ưa keratin ký sinh trong các mô cơ thể người như lóp biểu bì, tóc và móng [25] Nấm da thuộc họ Gymnoascaceae và cho đen nay đã có khoảng 40 loài nấm da được biết đen, chúng thuộc 3

chi: Trichophyton, Microsporutn và Epidermophyton [10].

Chu kỳ sinh sản cùa nấm da gom hai giai đoạn, vì vậy một loài được biết với hai tên riêng biệt nhau, một tên để chi giai đoạn sinh sàn vô tính (anaphorm) và một tên để chi giai đoạn sinh sản hữu tính (teleomorph) Tên gọi cho giai đoạn sinh sản hữu tính của Microsporum là

Nannizzia và cùa Trichophyton là Arthroderma sông trong đât.

Bảng 1.1 Giai đoạn sinhsản vô tính và hừu tính của nấm da [ 10]

Tên ở giai đoạn sinh sàn vô tính Tên ở giai đoạn sinh sàn hữu tính

Nannizzia gypsa

Trichophyton mentagrophytes Arthroderma benhamiae

Nấm da chỉ xâm nhập vào tổ chức sừng Tùy vào mức độ xâm nhập của nấm và đáp ứng miền dịch cùa cơ the mà có biểu hiện viêm hạn chế hoặc viêm rõ trên lâm sàng [5], Chúng

có khuynh hướng gây nhiễm ngoài da ở các vị trí khác nhau trên cơ thể, tạo ra một hoa văn giống hình vòng - do đó được gọi với thuật ngữ là “Ringworm” Các bệnh do nấm da gây ra thường được điều trị thành công nhưng sự thành công phụ thuộc vào vị trí nhiễm bệnh và sự tuân thủ điều trị cùa bệnh nhân [23]

Bệnh nấm da rất phồ biển, có ít nhất 10% dân số thể giới bị nhiễm nấm da Bệnh lây nhiễm chữ yếu qua tiếp xúc trực tiếp với các đối tượng đã nhiễm nấm ớ môi trường thích hợp, vi nấm có thế sống ngoài cơ the ký chù ít nhất một năm Do vi nấm có mặt khắp nơi, rất khó xác định được nguồn lây nhiễm Nấm gây bệnh cho người khác nhau tùy thuộc vị trí bệnh trên cơ thể và theo vùng địa lý, tuy nhiên trên phạm vi toàn thế giới có hai loài nấm da thường được ly trích từ bệnh phẩm là Trichophyton rubrum (T rubrum) và Trichophyton mentagrophytes (T mentagrophytes) chiếm 60 - 90% trong tổng số ca bệnh nấm da.

1.2.3 Phân loại nấm da

Có the phân loại nam da dựa vào:

Dựa theo đặc điếm bào tử đính lớn, nấm da được chia thành ba chi chính:

Trichophyton (gây nhiễm trùng trên da, tóc và móng), Epidermophyton (gây nhiễm

trùng da và móng) và Microsporum (gây nhiễm trùng trên da và tóc) [10], [19].

- Dựa trên phương thức lây truyền, một số nấm da nhiễm trên người (được gọi là Anthropophilic) và thường được lây truyền từ người sang người Một so nam da ưa thú (gọi là Zoophilic) lây nhiễm từ động vật sang người và các nấm da ưa đất (được gọi là Geophilic) [10]

- Dựa theo vị trí nhiễm bệnh, nấm da được chia thành nấm da ở vùng đầu, mặt, râu, cơ thể, tay, bẹn, chân và móng Ngoài ra các biển thể trên lâm sàng gặp phải bao gồm nấm Tinea imbricata, Tinea pseudoimbricata và u hạt Majocchi [21]

Microsporum canis Microsporum gypseum Microsporum namtm Microsporum gallinae E floccosum

Người: hiếm Heo: chù yếu

Người: hiếm Gia cầm: chủ yếu

Nhiễm trùng ở người: 1% (bẹn, chân và móng tay) Hiếm thấy ở động

vậtKhóm

khoảng cách gần nhau

Chù yếu là màu vàng nâu-vàng sẫm với viền trắng Sợi nấm phát triền rất nhanh

Khóm nấm dạng bột từ trắng đến vàng sầm (màu vàng-nâu)

Khóm nấm dạng nhung

từ trắng đến hồng

Màu xanh lá cây ô liu đen màu vàng-mù tạt Khóm nam gấp lại và sấn sùi (tạo thành rành)

Mặt sau Vàng chuyển sang nâu theo độ tuổi Màu kem, thuộc da màu đỏ nâu Ban đầu màu cam, sau đó màu đó-nâu Sắc tố màu đò khuếch tán vào môi trường Cam đến nâu

đầu tròn Nhiều, hình bầu dục với ĩẽ

vách mòng, 1 đen 3 vách ngăn (thường là 2)

Nhiều, hỉnh chùy Thường cong, vách mỏng trơn, từ 4-10 vách ngăn

Hình chùy đầu cùn Thành mòng mịn, đính chùm từ 2, từ 2-6 tế bào

T mentagrophtes T tonsurans T rubrum T verrucosum T equinum

Chỉ nhiễm bệnh ớ người:

45% (thường ờ da đầu, cũng có ở da và móng)

Chì nhiễm ở người: 41%

(thường ở da, chân, tay, móng, bẹn) Hiếm gặp ở động vật

Gia súc: thường gặp nhưng ở người, ngựa, cừu: thình thoảng

Người: rất hiếm Ngựa: thường thấy

bột hoặc trang và dạng tơ

Mượt như nhung với nếp gấp bao quanh Màu sắc có thể thay đoi

Trắng đến vàng sẫm, mịn mượt và phù lông tơ

Trắng, đôi khi màu vàng hoặc xám Be ngoài mịn mượt, có the có nếp gấp, khóm nhỏ

Màu kem cho đến màu

da và mượt như nhung

Thành mòng, mịn, hỉnh dạng không đều

Màu đò đậm, rượu vang, đôi khi màu nâu, màu vàng hoặc không màu

2-8 tế bào, các cạnh song song Hiếm gặp

Trẳng, đôi khi vàng

ị í-**

Hiếm, thành dài, mỏng, trơn, chuồi chlamydospore

Vàng đến đó nâu

Hiếm, hình chùy, thành mỏng và mịn

Nhiều, trên sợi nấm và hình quả lê đến hình

tròn

1.2.4 Các bệnh nấm da ờ người

Bệnh nấm da rất phổ biến, có khoảng 10% dân số thế giới bị nhiềm nấm da Bệnh lây nhiềm chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp với người bệnh, thú bệnh hoặc đất; gián tiếp qua thâm, nen nhà, quần áo, giày dép mang vày da hay tóc bệnh [9]

var mentagrophytes Thú (gậm nhấm) Khắp the giới Thường gặp

Châu Á

T schoenleinii Người

DươngChâu Âu, châu Phi Vùng nội dịch

Microsporuni sp.

1.1.3.1 Bệnh nấm tóc

Hiếm

Epidermophyton sp.

Bệnh nấm tóc hay còn gọi là chốc đầu (Tinea Capitis) là bệnh nhiễm trùng liên quan đến da đầu do các chi nam Microsporum và Trichophyton gây ra Sự nhiễm trùng có the chi từ nhẹ với ban đò và một vài chồ bị lốm đom hay những nốt tóc màu xám xin đen các phàn ứng viêm nặng hơn như viêm nang lông, hình thành kerion và sẹo rộng, gây hói, đôi khi kèm theo sốt, mệt mỏi và bệnh bạch huyết khu trú Cả 2 vùng da và tóc đều bị ảnh hưởng Sự nhiễm nấm có the được miêu tà như ectothrix - nhiễm nấm kiểu phát ngọai (bào tử hình thành ở bên ngoài cùa sợi tóc) hoặc endothrix - nhiễm nấm kiểu phát nội (bào tử hình thành bên trong sợi tóc) Nguyên nhân chù yểu gây bệnh là T tonsurans (endothrix) thay vì Microsponưn audouinii (M audouinii) hay Microsporum canis (M canis) (ectothrix) [35]:

- Nhiềm nấm kiểu phát nội (Endothrix): bào từ nấm được hình thành trong thân sợi tóc.Biểu hiện cùa bệnh biến đổi từ các mãng tóc rụng có giới hạn rõ, kèm với nổi ban đỏ và bong vảy da Thường tóc gãy ngang mức vảy da, sự viêm giới hạn, hoặc tóc gãy, da đầu viêm bờ go cao cộng với viêm nang lông trong dạng chốc đầu chấm đen Các dạng tóc nhiễm nấm này rất khó chuẩn đoán

- Nhiễm nấm kiểu phát ngoại (Ectothrix): bào tử nam bao quanh sợi tóc Tóc gãy ở bất kỳ điếm nào nhưng thường cách da đầu vài milimet Da đau thường viêm và cho những vùng rụng tóc giới hạn Da đầu viêm nặng hoặc kerion có the xảy ra ở tóc nhiễm phát nội lần phát ngoại, nhưng thường gặp ở phát ngoại

1.1.3.2 Bệnh ở da nhẵn

- Hắc lào: ton thương hình vòng tròn lan rộng, bờ hơi gồ cao có vày và có mụn rộp, ở giữa

có màu hơi nhạt Một số trường hợp kích thước và hình dạng của ton thương cao the thay đoi tùy vào mức độ viêm Thường viêm mạnh hơn trong trường họp nhiễm trùng do nấm

ưa thú như M canis Khi nhiễm T rubnun phàn ứng viêm ít hơn và vet thương lan rộng,

bờ ít giới hạn

- Vày rồng: nấm bắt đầu mọc ở một điểm rồi lan rộng có khi cà thân mình trừ mặt và đầu,

do bệnh kéo dài lâu năm Da không viêm nhưng tróc vảy tạo thành nhiều vòng đong tâm

1.1.3.3 Bệnh nấm bẹn

Bệnh thường gặp ở vùng khí hậu nóng ẩm, chữ yếu ở nam giới Nấm nhiễm ở vùng háng, quanh hậu môn và đáy chậu và đôi khi xuất hiện ở đùi trên T rubrum và Epidermophyton floccosum (E floccosum) là các nguyên nhân thường gặp nhất Tổn thương hồng ban đó nâu

và phũ vảy khô Chúng thường có hai mặt và đối xứng, kéo dài xuống hai bên của đùi bên trong và có đường viền nổi rõ, thường thấy nồi mụn nhó đối với nhiễm E floccosum Neu nhiềm Trichophyton sp., ton thương thường không đối xứng hai bên bẹn và có khuynh hướng lan lên trên thân mình [38]

1.1.3.4 Bệnh nấm chân

Bàn chân, đặc biệt là lòng bàn chân và các kẽ ngón chân, là những vị trí thường xuyên xuất hiện bệnh lý liên quan đến nấm da Biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất là da bị sần sùi, bong tróc và nứt, chù yếu ở khoảng cách giữa các ngón chân thứ tư và thứ năm Những biểu hiện thường gặp khác là tăng sừng mạn tính dần đen các vảy bạc phũ lên da làm da nhợt nhạt ở lòng bàn chân, gót và cạnh bàn chân Đối với tình trạng viêm cấp tính, đặc trưng bời sự hình thành các mụn ghẻ, mụn mù, và đôi khi là chất nhầy, thường xuyên nhất là do T

mentagrophytes. Các tác nhân khác cũng gây nấm chân là T rubrum, T mentagrophytes var

- Bệnh bắt đầu từ mặt trên cùa móng (nấm móng trang ở mặt trên), vi nấm gây bệnh thường

là T mentagrophytes var interdigỉtale.

Bệnh nhân nhiễm nấm móng thường bị ở những vị trí khác như lòng bàn chân, kẽ chân, ở Việt Nam, vi nấm gây nhiễm thường gặp là T rubrum, T mentagrophytes và

E floccosum [1], [10]

1.2.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về nấm da

1.1.4.1 Ngoài nước

Bệnh nấm da có xu hướng ngày càng gia tăng trong những năm gần đây Tý lệ mắc bệnh nấm da so với các bệnh ngoài da ở Đông Nam Á là 40 - 60%, còn ở Việt Nam là 5 - 15% ở Việt Nam, khí hậu, điều kiện vệ sinh, tập quán còn thấp là điều kiện lý tưởng cho bệnh nấm

da phát triển, kéo dài và phát sinh chùng đe kháng thuốc Trên the giới, đã có các nhà khoa học nghiên cứu về vấn đề này, có thể kể đến như:

- Một nghiên cứu tại bệnh viện trường đại học Bari (Italia) trong khoảng thời gian từ 2005

-2010 đã khảo sát 6133 bệnh nhân với kết quả cho thấy ti lệ cao nhất là bệnh nấm móng với 39,2%, tiếp theo là bệnh nam thân với 22,7%, nam bàn chân với 20,4% Đong thời két quà từ quá trình định danh bằng phương pháp cổ điển cho thấy tỳ lệ nhiễm T rubrum

là 64%, T mentagrophytes là 10%, và M caiìis chiêm 14% [22].

- Maria Elisabete da Silva Barros, Daniel de Assis Santos (2007) thư tính nhạy cảm cùa 4 thuốc kháng nấm (fluconazole, itraconazole, terbinafine và griseofulvin) trên 2 chủng thường gặp là T mentagrophytes và T rubrum Ket quà cho thấy các chúng đều nhạy

cảm với terbinafine, itraconazol, sau đó den ketoconazole, đối với griseofulvin thì mức

độ nhạy cảm không ổn định [17]

- Gadangi Indira (2014) tiến hành nghiên cứu trên 119 bệnh nhân nhiễm nấm da trên đối tượng bệnh nhân tại Ần Độ với ti lệ phân bổ theo loài tập trung chủ yeu ở T rubrum (n=40), T mentagrophytes (n=19), T vỉoỉaceum (n=15), M gypseum (n=12), E flocossum (n=9), còn lại là các loài khác Giá trị MIC của terbinaflne là thấp nhất so với ketoconazole, itraconazole, griseofulvin và fluconazole Như vậy, terbinafine có hiệu quả trị liệu tốt nhất so với các thuốc khác [24],

- Mona Fattouh Mohamed Shalaby và cộng sự (2016) khảo sát bệnh nhiễm nấm da trên

110 bệnh nhân, cho thấy tỉ lệ nhiễm nấm da M canis (52,7%), M.gypseum (20,9%), T mentagrophytes (16,4%), và M audouinii (10%) Ti lệ nhạy cảm với clotrimazole là 95,5% và miconazole là 84,5% [33]

Tình hình nghiên cứu dịch tề ve sự phân bố các loài vi nấm và sữ dụng thuốc kháng nấm trên bệnh nhân từ các công bố quốc te vẫn chưa nhiều Qua các bài báo, có the thấy rang tình hình bệnh nhiễm nam ngày càng tăng, cũng như bat đau có sự xuất hiện tình trạng đề kháng thuốc kháng nấm và tăng dần theo thời gian, cần thêm các nghiên cứu trong lĩnh vực này đe cập nhật kịp thời các thông tin dịch tễ học cũng như thông tin ve hiệu quả sữ dụng thuốc kháng nấm

1.1.4.2 Trong nước

Tính đen nay, chưa có nhiều các đề tài trong nước nghiên cứu ve nấm da ở người và độ nhạy câm của các chững nam này với thuốc kháng nấm đang dùng Dưới đây là các nghiên cứu trong nước ve lĩnh vực này:

- Năm 2012, Lê Chuyển, Lê Thanh Hài, Trần Thanh Tường tiến hành kháo sát 252 người

bị nhiễm nấm với tình hình nhiễm nấm: tỷ lệ nhiễm nấm cao nhất ở độ tuổi 21-40 chiếm 55,95% (141/252); làm nông chiếm tỷ lệ cao nhất 46,04%, lao động phổ thông chiêm 22,61%; cao nhất là nhiễm nam da nhằn 39,28%, tiếp đến là nấm sinh dục 34,88% Ve tình hình sứ dụng thuốc kháng nam.- tỳ lệ dùng thuốc kháng nấm không theo đơn 67,46% so với theo đơn 32,54% [3]

- Cũng trong năm này, Nguyền Vũ Giang Bấc, Huỳnh Thể Hà, Nguyễn Đinh Nga đã khảo sát sự phân bố của nấm da ly trích từ bệnh nhân cho thấy chi Trichophyton vẫn là chi nấm

gây bệnh chiêm ưu thê (95,31%), T rubrum/T tonsurans (76,56%), T mentagrophytes (12,5%), M canis (1,56%), M gypseum (1,56%), M audouinỉi (1,56%) Kốt quả MIC (Minimum Inhibitory Concentration - Nong độ ức che tối thiếu) đánh giá mức độ đáp ứng với ketoconazole gia tăng trong quan the nấm da khảo sát cho thấy cần có những khuyến cáo can thiết trong việc sử dụng ketoconazole hợp lý [6]

- Năm 2013, Tôn Nữ Phương Anh và cộng sự đã nghiên cứu mô tả cắt ngang trên 181 bệnh nhân có kết quà xét nghiệm nấm trực tiếp dương tính với các bệnh phẩm da, tóc, móng

đe khảo sát tình hình phân bố các loài nấm da theo the bệnh Ket quâ cho thấy nấm da (dermatophytes) là 90,64%, bao gom [2]:

+ Chi Trichophyton là 82,91%, trong đó: T rubrum (58,01%),

T mentagrophytes (14,36%), T tonsurans (3,31%), T violaceum (2,76%),

T erinacei (1,66%), T schoenleini (1,10%), T soudanense (0,55%) và T verrucosum (1,10%).

+ Chi Microsporum là 7,18%, trong đó: M gypseum (4,42%), M cams (2,21%) và

M persicolor (0,55%).

+ Chi Epỉdermophyton là 0,55%, trong đó chì có duy nhất loài E floccosum (0,55%).

- Bùi Tố Quyên (2013) đánh giá tình hình sứ dụng thuốc điều trị bệnh nấm da tại bệnh viện

Da liễu Hà Nội, khi điều trị với một so thuốc như ketoconazole, terbinafine, clotrimazol

có tỉ lệ khỏi bệnh chiến 87,6%, tiến triển bệnh khá chiếm 8,8% và xuất hiện tỳ lệ 3,6% bệnh nhân điều trị kém đáp ứng [11].

- Nãm 2016, kết quả nghiên cứu của Nguyền Thái Dũng và cộng sự xác định thành phan nấm da phổ biến nhất là T rubrum (67,2%) tiếp theo là các loài Trichophyton khác và

Microsporum sp.; sử dụng terbinafine dạng kem bôi có tác dụng với nấm da the nhẹ và vừa, còn the nặng cần phối hợp thêm với dạng uống [15]

- Quách Thị Hong Dung (2016) khâo sát tình hình nhiễm nấm ngoại biên, kết quả cho thay tất cà các chủng nấm da ly trích từ bệnh nhân đều nhạy cảm với terbinafine, xuất hiện một số chùng nấm chì ở mức độ nhạy câm trung gian và đã có chúng đe kháng (2/52) với ketoconazole [4]

Như vậy, các nghiên cửu trong nước vẫn còn tập trung nhiều ở dịch tễ phân bố nấm da hay các yeu tố liên quan đen bệnh và hiệu quả điều trị cùa các phát đồ trên lâm sàng Bên cạnh

đó, số liệu từ các đe tài mang tính chất địa phương Nghiên cứu ve đe kháng thuốc kháng nấm vẫn chưa nhiều mặc dù các số liệu ve đề kháng thuốc cùa vi nấm càng lúc càng tăng

Do đó, cần có thêm những nghiên cứu ve mức độ nhạy cám với thuốc kháng nấm của nam

da đe cập nhật thông tin ve tình hình bệnh nhiễm nam da hiện nay

1.2 CÁC KỸ THUẬT TRONG PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NÁM DA

Thực hiện các thử nghiệm nhằm xác định sự có mặt cũa nấm da trong mầu bệnh phẩm, sau

đó tiến hành nuôi cấy, phân lập ở các bước tiếp theo Đe định danh các chi nấm da thường dựa trên đặc điểm khóm nấm nuôi cấy trên thạch và đặc điếm hình thái quan sát dưới kính hiển vi Đe định danh đen mức loài thường can nuôi cấy trên các môi trường chuyên biệt hoặc một số phân ứng sinh hóa như phản ứng ure, phân ứng BCP,

1.2.1 Xác định sự có mặt ciía nấm da từ mẫu bệnh phẩm

Sử dụng phương pháp soi bệnh phẩm trực tiếp với dung dịch KOH 10 - 20% Các bệnh phẩm

là sợi tóc, mẫu vụn móng tay, vãy da được đặt lên lam kính có sẵn 1 - 2 giọt dung dịch KOH

10 20%, hơ nhẹ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn, dưới tác dụng của kiềm và nhiệt độ sẽ làm các te bào tách rời nhau ra và lớp keratin trong suốt, đe dề dàng quan sát hình ảnh vi nam trong các vảy da dưới kính hiển vi Đối với bệnh phẩm có nhiễm nấm sẽ dề dàng quan sát thấy những sợi nấm và những bào tử đốt dề phân biệt với te bào động vật Tuy nhiên phải lưu ý phân biệt giữa những hạt dạng sợi, dạng mỡ, những te bào sừng với te bào nấm can

nấm phân nhánh, có vách ngăn, đôi khi sợi tơ nấm đứt khúc thành chuồi bào tử đốt Trường hợp tóc: dựa vào vị trí nhiễm nấm ở sợi tóc có thể quan sát được hai kiểu tóc nhiễm phát nội

và tóc nhiễm phát ngoại [26]

1.2.2.1 Môi trường cơ bản Sabouraud 4%

1.2.2.2 Phương pháp xét nghiệm trực tiếp (soi bệnh phấm dưới kính hiển vi)

chỉ cho biết có nấm da trong mầu bệnh phẩm hay không nhưng không thế biết

vi nấm. Môi trường hay dùng nhất là môi trường Sabouraud, thường nuôi cấy

ở nhiệt độ phòng, sau 1 - 2 tuần quan sát sự phát triến của vi nấm có the giúpxác định chi/loài. Trên thực tế tỷ lệ giữa triệu chứng lâm sàng, kết quả soi trực

tiếp và nuôi cấy là 3 : 2 : 1 (3 trường hợp có triệu chứng lâm sàng thì có 2

trường họp vi nấm mọc trên môi trường) Môi trường Sabouraud có kháng

sinh

Khi phân lập nấm da thường có các vi khuấn và nấm mốc hoại sinh phát triển do vậy có thể

sữ dụng môi trường Sabouraud có chứa kháng sinh thích họp để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và các nấm mốc khác, chì cho nấm da phát triển Môi trường Sabouraud bổ sung penicilin, streptomycin và cycloheximide: tiệt trùng môi trường trong nồi hấp ở nhiệt độ 120°C, 1 atm trong 10-15 phút, để nguội khi nhiệt độ còn khoảng 50°C bổ sung vào 250.000 đơn vị penicilin, 250 mg streptomycin và 500 mg cycloheximide vào khuấy đều, đo vào ống nghiệm hoặc đĩa petri Môi trường này được dùng để phân lập, quan sát hình thái khóm nấm da

1.2.2.3 Môi trường DTM

Môi trường DTM (Dermatophyte Test Medium) dùng đe sàng lọc cơ bản, giúp xác định sự

có mặt cùa nấm da trong mầu bệnh phẩm Khi nuôi cấy nấm da trong môi trường này ở nhiệt

độ phòng trong 2 tuần, nấm da (nếu có) sẽ phát triển và chuyển màu môi trường từ vàng sang

đỏ [37], Môi trường DTM được phát triển trên nền môi trường Sabouraud có bổ sung cycloheximid và kháng sinh chloramphenicol ức chế sự tăng trưởng cùa nấm mốc hoại sinh

và vi khuẩn, cùng với chi thị đỏ phenol Nấm da phát triển trên môi trường DTM sẽ sứ dụng hợp chất nitơ tạo ra kiềm đổi màu chỉ thị dở phenol từ vàng sang đỏ (khi pH > 7).

1.2.2.4 Phương pháp nuôi cấy trên lam kính

Ballagi đã đưa ra phương pháp nuôi cấy nấm trên lam kính đế nghiên cứu cơ quan sinh sản

vô tính cũng như các thành phần khác cùa vi nam nói chung Khi nuôi cay, vi nấm phát triển trên lam nên hình thái vi nam rõ ràng, đầy đủ và không bị dập nát Phương pháp này được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu phân loại xác định các loài nam da Hệ thong bao gom: đìa petri chứa que chữ u và lam đã hấp tiệt trùng 121°c trong 15 phút ở 1 atm, sau đó dùng dao mũi mác cắt thạch thành hình vuông đặt lên lam Tien hành cấy vi nấm lên bốn cạnh thạch, đặt lamell đã tiệt trùng lên mặt thạch, đe ở nhiệt độ phòng Sau 7-10 ngày, vi nấm sẽ phát triển, lan ra xung quanh và phát triển trên lam Nhấc nhẹ nhàng khối thạch ra khỏi lam, nhó thuốc nhuộm nấm lên lam, đậy lamell và roi đem soi dưới kính hiển vi

1.2.3 Phương pháp định danh nấm da

1.2.3.1 Đặc điểm hình thái khóm nấm

Các đặc điểm khóm cần quan sát bao gồm: Màu sắc của khóm nấm ở mặt trên và mặt dưới, tính chất bề mặt khóm (dạng bột, dạng nhung, dạng bông hay nhằn, độ cao khóm, kiếu mọc của sợi, hình dạng rìa khóm v.v.) và tốc độ mọc [26]

1.2.3.2 Đặc điểm hình thái hiển vi

Tiêu báu nấm trong nước cất: Trong một số trường hợp có thể soi hình dạng nấm trong giọt

nước Lợi ích cùa phương pháp này là chi so khúc xạ cùa ánh sáng đi qua tiêu bản và chỉ số khúc xạ của nước khác nhau ít nên hình ánh của nấm được nhìn rõ Mặt khác do sự chênh lệch ve nong độ giữa trong và ngoài te bào nam nên nước khuếch tán vào trong te bào, làm

te bào nấm tăng kích thước, dề dàng quan sát Trường hợp cần đo kích thước thì không ứng dụng được phương pháp này

Tiêu bán nấm trong dung dịch glycerin: Nhược diem cùa tiêu bàn trong nước là không giữ tiêu bản được lâu vì nước dề bay hơi, làm khô tiêu bán Tiêu bân trong glycerin giữ được lâu hơn vì glycerin hạn che sự bay hơi và hình ảnh quan sát vẫn rõ

Tiêu bán nhuộm: Đe nhận biết và phân biệt các cơ quan hay các bộ phận cùa nấm như bào

tữ đính lớn, bào tứ đính nhỏ, thành te bào, bề mặt cũa bào tử hay vách ngăn cùa nấm người

ta thường nhuộm nấm với thuốc nhuộm Lactophenol coton blue (LPCB)

1.2.3.3 Định danh bằng môi trường CMDA

Môi trường CMDA (Cornmeal Dextrose Agar) là môi trường nuôi cấy nấm da và nghiên cứu các loài Candida sản xuất chlamydospore Việc bổ sung dextrose làm tăng khả năng tạo sắc tố của một số loài Trichophyton [24] CMDA được dùng để phân biệt các chủng T mentagrophytes với T rubrum dựa trên sự tạo thành sắc tố Các chùng T rubrum sẽ cho sac

tố đỏ rượu đậm ở mặt trái của khóm trong khi

T mentagrophytes sẽ cho nhiều màu sac khác nhau từ không màu cho đen nâu đỏ [16], [32]

1.2.3.4. Định danh bằng môi trường BCP-MS-G

Môi trường BCP-MS-G (Bromocresol Purple - Milk Solid - Glucose) hay còn gọi là môi trường thạch sữa ran được tìm thấy bởi Fischer và Kane (1971) đe xác định nấm da mà không cần ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm men T mentagrophytes khi tăng trưởng sẽ làm thay đổi pH kiềm sau 7 ngày trên môi trường BCP-MS-G, trong khi đó T rubrum tăng trưởng hạn chế và không làm thay đồi pH cùa môi trường ở cùng một khoảng thời gian Năm 1988,

Summerbell cùng cộng sự đánh giá độ tin cậy của BCP-MS-G agar và mòi trường này cho thấy hiệu quà cao trong việc phân biệt T rubrum và T mentagrophytes Khi được sừ dụng chung với môi trường khác (như thạch ure, agar bột ngô ) BCP-MS-G có thể được dùng

đe xác định các chững nấm da lâm sàng trong vòng 7-10 ngày [29]

1.2.3.5 Định danh bằng phản ứng ure

Phàn ứng này giúp phân biệt các chững nấm trong chi Trichophyton, không có tác dụng định danh một chững nấm cụ thể Phàn ứng dương tính với T mentagrophytes và T tonsurans,

âm tính với T rubrum Dấu hiệu nhận biết phản ứng dương tính là môi trường ure chuyển

từ màu cam sang màu hong tím sau khi cấy khoảng 2-4 ngày [34],

1.2.3.6 Các phương pháp định danh khác

Kỳ thuật định danh nam bang PCR-RFLP với moi ITS1-ITS4, phân cắt giới hạn bang enzyme Mval và Haein

- Kỳ thuậtđịnh danh vi nấm bằng phương pháp giải trình tự.

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HIỆU Lực KHÁNG NẤM

Phương pháp pha loãng và phương pháp khuếch tán là hai phương pháp chính dùng đe xác định tác dụng kháng nấm cùa các chất hay che phẩm Các phương pháp chuẩn của CLSI có thể được biến đổi để phù họp với các đặc điểm phát triển riêng biệt cho từng chùng vi nấm khác nhau hay các dạng bào chế của các chế phẩm khác nhau của chất thừ nghiệm, hoặc thuận tiện hơn, kinh te hơn, dễ thực hiện và nhanh hơn với điều kiện phương pháp biển đổi cho kết quà phù họp với phương pháp chuẩn, có sự liên thông kết quả giữa các phòng thí nghiệm, được nhiều phòng thí nghiệm sừ dụng [9]

1.3.1 Phương pháp pha loãng

Nguyên tắc: Chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ theo cấp số nhân trong

hoặc bằng quang phổ kế, thường được dùng làm điểmdừngkhi đọckếtquả ở những nồng độ chất thử cótác dụng ức chế vi nấm, các ống thử sè trong; khi chất thử không

có tác dụng ức chế vi nấm thì vi nấm vẫnphát triển bình thường làm môi trường trở

nên đục [9].

Ket quả xác định được bằng phương pháp pha loãngmang ý nghía định lượng Mức

phát triến vi nấm của chất thử (MIC). Trị số MIC càng thấp, chất thử (chế phẩm)

- Phương pháp pha loãng (macrodilution) và phương pháp vi pha loãng (microdilution) theo CLSI M27-A2 (2008) dùng cho nấm men

- Phương pháp pha loãng cho nấm sợi (nam mốc, nấm da) theo CLSI M38-A2 (2008) [9],

1.3.2 Phương pháp khuếch tán

Nguyên tắc: Tác dụng kháng nấm của một chất thử (che phấm) được xác định dựa trên khả

năng ức chế vi nấm của chất thử khuếch tán từ một đĩa giấy đặt trên mặt thạch, một lồ cắt từ thạch hay một ống trụ đặt trên mặt thạch đã cấy nấm, thể hiện qua vòng kháng nấm Đường kính vòng kháng nấm dùng để đánh giá hoạt lực kháng nấm So với phương pháp pha loãng, phương pháp khuếch tán đơn giãn dề thực hiện, giúp phát hiện vi sinh vật kháng thuốc dề dàng và giá thành rẻ hơn [9], [36]

Các phương pháp khuếch tán hiện đang được sữ dụng:

- Phương pháp khuếch tán dành cho nấm men theo CLSI M44-A2 (2009)

- Phương pháp khuếch tán dành cho nấm sợi (nấm mốc, nấm da) theo CLSIM51 -A (2010) [9]

1.3.3 Phương pháp khuếch tán dùng để xác định mức độ nhạy của các chất kháng nấm trên nấm da

Vào thập niên 90, NCCLS (hiện nay là CSLI - Clinical and Laboratory Standards Institute)

đã công bố các phương pháp để đánh giá mức độ nhạy của các thuốc kháng nấm cho nấm men (NCCLS M27-A; M44-A) và nấm mốc (M38-P; M38-A) Tuy nhiên, các phương pháp thừ này không bao gồm nấm da cũng như vẫn chưa có một hướng dẫn chính thức nào đe đánh giá mức độ nhạy câm cùa nấm da với thuốc kháng nam

CLSI M38-A2 (2008) đã công bố một phương pháp thừ mức độ nhạy cũa nam sợi bao gom các nấm mốc gây bệnh nhiễm nam xâm nhập và nấm da (Trichophyton sp., Microsporum

sp và Epidermophyton sp.) đối với các thuốc kháng nấm Tuy nhiên, các phương pháp pha loãng và vi pha loãng của CLSI khó áp dụng như các phương pháp thường qui ở các phòng thí nghiệm Từ 2002, Neo-Sensitabs đã đưa ra thị trường và hướng dẫn sữ dụng phương pháp khuếch tán đe xác định mức độ nhạy cảm của nấm da với các thuốc kháng nấm, được phát

triển bởi Rosco® (Taastrup, Đan Mạch) Năm 2005, A Esteban và cộng sự đã SŨ dụng sản phẩm cùa Neo-Sensitabs®, áp dụng phương pháp khuếch tán để thử độ nhạy cùa nấm da đối với clotrimazol, itraconazol và terbinafine, sử dụng môi trường PDA và SDA Dựa vào sự tương đong giữa giữa giá trị MIC cùa phương pháp pha loãng (theo CLSI M38 - A2) và đường kính vòng kháng nấm khảo sát được của 59 mẫu nấm da lâm sàng, nhóm nghiên cứu

đã đề nghị chững nấm da được cho là nhạy càm khi đường kính vòng kháng nấm ít nhất là

20 mm với clotrimazol và terbinaíine và 15 mm với itraconazol [13],

Keyvan Pakshir và cộng sự (2009) cũng đã dùng phương pháp khuếch tán theo hướng dẫn

và tiêu chuẩn cùa Neo - Sensitabs đe đánh giá mức độ nhạy cảm của 39 chúng lâm sàng và đánh giá phương pháp này đơn giàn, thuận tiện, không đất tiền và dễ thực hiện hơn M38 - A2, có thể áp dụng cho nấm da [30]

Bàng 1.5 Tiêu chuẩn về mức độ nhạy cùa nấm da theo Neo-Sensitabs [30],

Thuốc

kháng nấm

Nông độ (pg/đĩa giấy)

Bảng 1.6 Cấu trúc và tính chất của ketoconazole

Tên khoa học l-acetyl-4-[4-[[(2ÃS,4SÃ)-2-(2,4-diclorophenyl)-2-

(1 //-imidazol-1 -ylmethyl)-1,3-dioxolan-4- yl] methoxy] phenyl] piperazin

Công thức cấu tạo

nước, dề tan trong dicloromethan, tan trong methanol, hơi tan trong ethanol 96%

- Điểm chảy 148 - 152°c

- Sắc kí lóp mỏng

- Phản ứng hóa họcKetoconazole là một dẫn chât imidazole dioxolane tông hợp, có khâ năng ức chê sinh tông hợp ergosterol ờ nấm và làm thay đoi cấu trúc các thành phan lipid khác trong màng Ketoconazole thường tác dụng rất nhanh trên triệu chứng ngứa, là triệu chứng thường thấy

ở các nhiễm nấm ngoài da và nấm men Ketoconazole có hoạt tính kháng nấm mạnh đoi với các vi nấm ngoài da như Trichophyton sp., E floccosum và Microsporum sp và đối với các

nấm men, bao gom Malassezia sp và Candida sp Đặc biệt hiệu quả trên Malassezia sp rất

rõ rệt, giảm triệu chứng được ghi nhận trước khi thấy các dấu hiệu lành bệnh đầu tiên.Chỉ định: ức che P450 ít chọn lọc hơn các triazol mới nên độc tính cao hơn và tương tác thuốc nhiều hơn nên ngày nay ít dùng đe điều trị nhiễm nam nội tạng, thường dùng trị nấm da

- Dạng tại chỗ: Kem trị nhiễm nấm ngoài da và nhiễm Candida Thuốc gội đau trị viêm da do tiết bâ nhờn

- Dạng uống: Trị nhiễm nấm biểu bì, Microsporuni và loài Trichophyton Trị lang ben đáp ứng tốt với lieu duy nhất trong ngày và trong thời gian ngan.

- Lieu dùng: 200 mg 1 - 2 lần/ngày, thời gian 2-3 tuần ở vùng da nhẵn hoặc 4-6 tuần ở gan bàn tay, lòng bàn chân

- Độc tính: Buồn nôn, ngứa (3%) Vú to đàn ông, viêm gan (1/10.000) lieu > 800 mg/ngày giảm testosterone huyết và cortisol huyet

1.4.2 Thuốc kháng nấm terbinaíìne

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của terbinafine

So với các thuốc nhóm azol, terbinafine ít được sừ dụng phổ biến hơn, nhưng đây là nhóm thuốc khá nhạy càm với nấm da lâm sàng Với cấu trúc nhân allylamine, terbinafine có tác dụng diệt nấm phổ rộng đối với nấm da, nam móng và nấm lưỡng hình Tác dụng diệt hay

là kháng nấm phụ thuộc vào từng loại nấm

về cơ ché tác dụng, terbinafine ảnh hường đến khả năng tổng hợp các sterol cũa vi nấm Sterol là thành phan quan trọng cùa màng tế bào nấm và liên kết chúng với nhau, sự ảnh hường này làm suy yếu màng tế bào Terbinafine can thiệp chọn lọc vào giai đoạn đầu cùa quá trình sinh tổng họp ergosterol, dẫn đen sự thiếu hụt ergosterol và làm tăng sự tích tụ nong độ squalene trong nội bào và làm chết te bào nấm Ngoài ra, terbinaíĩne còn có tác dụng ức che squalene epoxidase trong màng te bào nấm Đặc biệt hơn, terbinafine không gây ảnh hưởng tới sự chuyển hóa của các hormon hay các thuốc các

Chi định: terbinaíĩne thường được chì định trong nhiễm nấm da gây ra bởi Trichophyton sp

(T rubrum, T mentagrophytes, T verrucosunì), M canis và E floccosum.

Lieu dùng: Người lớn 250 mg/ngày, thời gian điều trị: nam da chân 2-6 tuần, nấm da thân

và đùi 2 - 4 tuần, bệnh Candida da 2 - 4 tuần Nam da đầu 4 tuần, nấm móng 6-12 tuần.Tương tác thuốc: Rifampicin làm giảm nong độ terbinaíine trong máu, làm giâm đáng ke tác dụng của terbinafine Cimetidine làm tăng nong độ terbinafme trong máu

1.4.3 Một số phác đồ điều trị nấm da

Theo Quyết định so 75 cùa Bộ Y tế ban hành ngày 13 tháng 1 năm 2015 đã quyết định ve việc ban hành tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị các bệnh da liễu” như sau [ 1 ]:

- về nguyên tắc điều trị cần (i) Xác định và loại bó các yếu tố thuận lọi cho nấm phát triển

và (ii) Sử dụng thuốc bôi tại chỗ hoặc toàn thân

- về điêu trị cụ the cần thực hiện :

• Vệ sinh cá nhân, tránh mặc quần áo ẩm ướt

• Là quần áo thường xuyên hoặc phoi quàn áo dưới ánh nang mặt trời, nhất là quần áo lót

• Tránh tiếp xúc với các nguồn lây như chó, mèo

• Không dùng chung quần áo, chăn màn với người mắc bệnh

• Tránh tam xà phòng

• Dùng các thuốc chống nấm bôi tại chồ đơn thuần hoặc kết họp thuốc bôi với thuốc uống đường toàn thân tùy thuộc vào mức độ thương tổn

- về tiến triển và biến chứng:

Bệnh tiến triển lành tính, khỏi hoàn toàn nếu áp dụng các biện pháp điều trị đúng cách Các trường họp tái phát thường do điều trị không triệt để Trong một số trường hợp, tổn thương

có thể lan rộng toàn thân do sử dụng các thuốc corticoid tại chồ hoặc toàn thân hoặc ở những người bệnh suy giảm miễn dịch Bien chứng chù yếu cùa nam da là bội nhiễm và chàm hoá

do người bệnh gãi nhiều và vệ sinh không tốt

Bôi ngày 1 - 2 lần, thời gian bôi thuốc ít nhất từ 3 - 4 tuần

* Thuốc kháng nấm toàn thân

- Khi thương tổn lan rộng hoặc dai dẳng bôi lâu không khỏi

- Nên kiểm tra chức năng gan trước và trong quá trình điều trị

- Liều lượng và thời gian uống thuốc tùy thuộc từng bệnh.

- Các thuốc kháng nam toàn thân thông dụng:

+ Griseofulvin viên 500 mg: trẻ em dùng lieu 10-20 mg/kg/ngày Người lớn 1 - 2 viên/ngày, thời gian điều trị 4 - 6 tuần

+ Hoặc terbinafme 250 mg/viên/ngày X 10 -14 ngày, uống trước bữa ăn Chống chỉ định với phụ nữ có thai hoặc cho con bú, trẻ dưới 16 tháng, bệnh nhân suy gan, suy thận nặng.+ Hoặc itraconazol 100 mg/viên X 2 viên/ngày X 3 - 4 tuần, uống sau bữa ãn

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm nấm (da, tóc hoặc móng) điều trị tại bệnh viện Da liễu TpHCM trong thời gian từ tháng 11 - 12/2017 với các tiêu chuẩn chọn mầu như sau:

- Bệnh nhân đen khám tại Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Da Liều TpHCM

- Bệnh nhân có kết quà soi tươi dương tính với hình ânh “Sợi nấm có vách ngăn”

- Vày nấm da ở vị trí bệnh nhiều (loại trừ các trường họp trẻ em có chồ da bệnh mỏng và rất ít vảy)

2.1.2 Thiết kế nghiên cứu

Thực hiện nghiên cứu cắt ngang mô tả trên mầu bệnh phẩm được thu thập từ tháng 11 - 12/2017 tại bệnh viện Da liều TpHCM Nghiên cứu cat ngang (Cross sectional study) là nghiên cứu được thực hiện tại một thời điểm hay trong khoảng một thời gian ngắn, mồi đối tượng chỉ thu thập thông tin một lần và không theo dõi suốt theo thời gian như trong nghiên cứu đoàn hệ tương lai Các yếu tố phơi nhiễm và ket quả đều ghi nhận vào cùng một thời điểm vì vậy khó xác định được mối liên hệ nhân quà (bệnh và phơi nhiễm cái nào xảy ra trước) Tuy vậy, loại nghiên cứu này khá hữu dụng vì thực hiện nhanh, ít ton kém

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Đe tài được thực hiện tại:

- Bộ môn Vi - ký sinh, khoa Dược, trường Đại học Nguyền Tất Thành

- Khoa xét nghiệm Kỷ sinh trùng, Bệnh viện Da Liễu Tp HCM

Hóa chat: Ketoconazole, Terbinafme, D-glucose, môi trường PDA, môi trường DTM, môi trường BCP- Milk Solids - Glucose Medium, môi trường SDA, glycerol, tween 80, NaCl, thuốc nhuộm LPCB, KOH 10%, Cycloheximide, Chloramphenicol

Trang thiết bị: Nồi hấp tiệt trùng Hirayama HVA-110, tù cấy Memmert UNB-500, máy đo quang Genequant, tủ đông Alaska, máy vortex Labnet S0200 Model VX-200, tú ấm Memmert INB-500, tù sấy Memmert UN110, kính hiển vi 2 mắt OPTIKA - Ý B-192.Dụng cụ: Micropipet, que cay, ống nghiệm, đĩa petri, binh erlen, pipet, que gỗ, cốc có mỏ, dao mũi mác, thanh chữ u, eppendorff, duran

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ

Sơ đồ 2.1 Quy trình thực hiện nghiên cứu

2.2.1 Sàng lọc và định danh nấm da

Đe lấy được mầu bệnh phẩm cần có các dụng cụ đã tiệt trùng đế tránh ngoại nhiễm như lười dao cạo phẫu thuật một lần, cán dao, nhíp vô trùng, hù đựng sang thương đã tiệt trùng, Mầu lấy cần đủ đe tiến hành soi tươi và nuôi cay trên các môi trường thích họp

Tien hành lấy mầu tại vị trí da bệnh, dùng dao phầu thuật một lần đã gắn chặt vào cán cạo phần bờ vet thương đe lấy các mành da bệnh chứa nam, nên lấy phần bờ vì đặc tính nấm da mọc lan rộng sẽ giúp quan sát rõ hơn các sợi nấm khi soi trực tiếp và cũng là vị trí vi nấm phát triển mạnh nhất Với trường họp sang thương ở da đầu và tóc, dùng nhíp đã vô trùng để nhổ lấy tóc và cho mẫu và hù đựng sang thương đã tiệt trùng [12]

2.2.1.2 Phương pháp soi tươi trực tiếp

Tiến hành soi trực tiếp mầu bệnh phẩm để đánh giá sơ bộ trên bệnh phẩm có phải nấm da hay không Cho một ít mầu bệnh phẩm lên lam, thêm vài giọt KOH 10% để làm trong té bào, đậy lam lại sau đó hơ nóng trên ngọn lừa đèn cồn và đe một phút ở nhiệt độ phòng Đối với mầu bệnh phẩm là tóc cũng thực hiện tương tự, đặt mầu tóc lên lam, cho vài giọt K.OH 10%, đậy lam lại nhưng đối với tóc tránh hơ nóng quá lâu sẽ làm hư cấu trúc tóc sẽ khó quan sát hơn trên kính hiến vi hoặc có the không gia nhiệt

Nhận định kết quả bang quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi vật kính 10X, 40X Dưới kính hiển vi có the quan sát được những mành sợi nấm không màu, có vách ngăn, phân nhánh hay đứt khúc tạo thành chuỗi bào từ đốt

Sau khi soi tươi trực tiếp các mẫu bệnh phẩm cho kết quả “Sợi nấm không màu, có vách ngăn”, sẽ tiên hành cấy và ũ với môi trường DTM

Bệnh phẩm được cay vào chai mẫu chứa môi trường DTM, ũ ờ nhiệt độ phòng từ 10-20 ngày Môi trường chuyển từ vàng sang đỏ thì nấm gây bệnh là nấm da Nhuộm khóm nấm với thuốc nhuộm LBCP và quan sát ở kính hiển vi Những khóm nấm cho đặc điểm vi học của nấm da (đặc điếm của sợi nam, bào tử đính lớn, bào tứ đính nhỏ) được thuần khiết

và định danh tiếp theo

Các loài nâm da Hình thái khóm nâm

táng trường (Mặt phải - Mặt trái)Mặt trước trung tâm khóm

Mặt trái màu vàng nâu đến màu nâu đỏ.

7-10 ngày

Trichophyton

rubrum

Mặt trước, khóm nấm biển đổi từ dạng lông mịn trắng đên dạng bột màu hông, thường có nêp gâp

Mặt trái màu vàng khi khóm nhóm còn trẻ, thường chuyên

đỏ rượu vang/ đỏ theo độ tuổi

Mặt sau màu vàng đên màu

da đên màu đỏ ri sét

7-14 ngày

Trichophyton

violaceum

Màu rượu đỏ đên mà tím đậm, có the có nếp gấp hoặc phăng với bê mặt mịn nhăn không có lông, sắc tố có thế nhạt dân. _

2;3 tuân

Trichophyton

verrucosum

Khóm nấm màu trắng nhẵn không lông đen mịn như nhung, hiêm khi có khóm nấm màu vàng nâu, nhiều nếp gâp với khuynh hướng ăn sâu vào bê mặt thạch

2-3 tuần

b Đặc điểm hình thái hiển vi

Làm tiêu bán nấm da đà nuôi cay từ 7 - 14 ngày, nhuộm một vài mành nhỏ nam với thuốc nhuộm LPCB Quan sát đặc điểm và cấu trúc hình thể cùa sợi tơ nấm, bào từ đính lớn, bào

từ đính nhỏ [7],

Khác với M gypseum, M canis thường tạo rât ít bào từ đính lớn hình thoi, 6-8 vách ngăn trên môi trường SDA Trong trường hợp nếu nghi ngờ là M canis, cấy vi nấm lên môi trường

cháo hoa để kích thích tạo bào từ đính lớn rồi quan sát lại hình thái trên kính hiển vi và lưu chững

Bàng 2.2 Đặc điếm quan sát dưới kính hiền vi của nấm da [19], [20], [27]

Các loài nấm da Mô tà hình thái quan sát dưới kính Hình ành

nhiêu Hình tròn đên quậ lê Thường - ịỊỈỈL

có sợi xoắn hoặc xoắn ốc "

Trichophyton

rubrum

Bào từ đính lớn: 2-8 te bào, các cạnh 4 v

sợi nấm nhò, hình quả lê \ !*

Trichophyton

tonsurans

Bào tữ đính lớn: Thành mỏng, mịn, hình dạng không đều Không chan ,

Bào tữ đính nhỏ: Hiêm, hình quả lê đến hình chùy Không có chuẩn đoán.

Bào tử đính lớn: phân nhánh, chuồi ngoằn ngoèo, sợi nam hẹp, sap xếp thành các chuồi chlamydoconidia [38]

c Định danh bảng các phán ứng khác

Phán ứng thủy phân ure

Vi nấm được cấy lên canh ure có bổ sung glucose Canh thang ure cho kết quà thừ tương tự thạch ure nhưng nhanh hơn, đọc kết quả sau 2-4 ngày thử bằng cách quan sát sự thay đổi màu của môi trường

Phản ứng này giúp phân biệt các chững nam trong chi Trichophyton, không có tác dụng định danh một chùng nấm cụ the Dấu hiệu nhận biết phàn ứng dương tính là môi trường ure chuyển từ màu cam sang màu hồng tím sau khi cấy khoáng 2-4 ngày

Bâng 2.3 Ket quà thữ nghiệm ure ở một số chững nấm da [14]

Trichophyton mentagrophytes dương tính

Cấy trên môi trường BCP-MS-G

Môi trường thạch sữa rắn là môi trường hữu hiệu đe phân biệt giữa T rubrum và T

mentagrophytes hay T mentagrophytes và M persicolor Theo đó, T rubrum mọc hạn chê

và không tạo phàn ứng kiềm trên môi trường thạch này, trong khi đó T mentagrophytes mọc tốt và cho phàn ứng kiem M persicolor mọc tốt nhưng không cho phân ứng kiềm [16], [18], [39]

Cơ che tạo màu cùa môi trường BCP-MS-G: Một số loài nấm da làm tãng độ pH cùa môi trường bằng cách phá vỡ các protein để tạo ra các họp chất kiềm, ở một số loài, hoạt động phân giái protein này trong casein sữa bị ức che khi môi trường cũng chứa glucose như một nguồn cung cấp cacbon Quá trình phân giải kiềm cùa T rubrum và hầu het các Microsporum

sp bị ức che mạnh trên BCP-MS-G Mặt khác, T mentagrophytes và một so loài khác như

E.floccosum, T tonsurans nhanh chóng làm thay đổi màu sang màu tím xanh đậm

Cay trên môi trường thạch CMDA

Thạch bột ngô thường được sừ dụng nuôi cấy và nghiên cứu các loài Candida sàn xuất chlamydospore Thạch bột ngô bổ sung glucose thường được sử dụng cho việc nuôi cấy các chững nấm gây bệnh Việc bố sung glucose làm tăng khả năng tạo sắc tố cùa một số loài

Trichophyton [31]

Môi trường CMDA được dùng đe phân biệt các chùng T mentagrophytes với T rubrum dựa

trên sự tạo thành sắc tố Các chủng T rubrum sẽ cho sac to đỏ rượu đậm ở mặt trái của khóm trong khi T mentagrophytes sẽ cho nhiều màu sắc khác nhau từ không màu cho đen nâu đỏ

2.2.2 Phương pháp thử độ nhạy cảm của nấm da vói thuốc kháng nấm

Thực hiện thừ độ nhạy càm của nam da với thuốc kháng nam terbinafine bang phương pháp khuếch tán theo hướng dẫn và tiêu chuẩn của Neo - Sensitabs đe đánh giá mức độ nhạy cảm cùa các chủng vi nấm lâm sàng [13]

Chuẩn bị:

- Hoạt hóa nấm da: cấy hoạt hóa nấm da trên ống thạch nghiêng SDA đã hấp tiệt trùng,

để ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày

- Chuẩn bị nước muối sinh lý: Cho nước muối sinh lý có chứa 0,05% Tween 80 và hấp tiệt trùng ở 121°c, 1 atm trong 15 phút

- Chuẩn bị đìa giấy thẩm kháng sinh

o Terbinafine: Pha dung dịch thuốc kháng nấm terbinafine với nồng độ 200 pg/ml

và lọc qua màng lọc millipore 0,45 pm Hút 10 pl dung dịch kháng sinh tẩm vào các đĩa giấy kháng sinh đã hấp tiệt trùng, nong độ kháng sinh mồi đĩa là 2 pg/ đĩa

o Ketoconazole: Cân 30 mg ketoconazole pha trong 20 ml con ta được dung dịch

có nong độ 1,5 mg/ml, lọc qua màng lọc millipore 0,45 pm Dùng pipet nhó 5 pl ketoconazole đã pha vào đĩa giấy đã được vô trùng, đợi đĩa giấy khô roi lặp lại lan 2 Ta thu được nong độ kháng sinh là 15 pg/đĩa

- Cách thực hiện: Cho dung dịch nước muối sinh lý vào ong nghiệm SDA sao cho ngập khóm nấm trong ống, cà nhẹ bề mặt để lấy bào từ, cho dịch treo vi nấm vào các eppendorf

vô trùng và vortex, đe lắng từ 3 - 5 phút roi hút lấy phần dịch phía trên Tien hành đo độ truyền qua cùa dịch treo vi nam tại bước sóng 530 nm và điều chinh ve khoảng giá trị từ

65 - 82% độ truyên qua

- Trãi dịch nấm lên mật thạch: dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch treo vi nấm đã đạt yêu cầu, ép que trên thành ống nghiệm cho ráo rồi trải đều trên mặt thạch Lặp lại 3 lần, mồi lần xoay đĩa petri 60° Đối với nấm da, thử nhạy cảm với thuốc kháng nam thực hiện trên môi trường SDA được ú ở nhiệt độ phòng trong 4-5 ngày

Bàng 2.4 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ nhạy cùa vi nấm với ketoconazole và terbinafine

[30]

Thuốc kháng

nấm

Nông độ (pg/ đĩa giấy)

Đường kính vòng kháng nấm (mm)