CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Tên đề tài: Nghiên cứu các chất kháng khuẩn và kháng nấm tạo bôi vi nấm nội
Trang 1CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
Tên đề tài: Nghiên cứu các chất kháng khuẩn và kháng nấm tạo bởi vi nấm nội
sinh được phân lập từ các cây thuộc họ Cam (Rutaceae)
Số hợp đồng: 2015.01.09/HĐ-KHCN
Chủ nhiệm đề tài: VÕ THỊ NGỌC MỲ
Đơn vị công tác: Khoa Dược
Thời gian thực hiện: Tháng 01/2015 - Tháng 12/2015
TP Hô Chỉ Minh, ngày tháng năm
Trang 2CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
Tên đề tài: Nghiên cứu các chất kháng khuẩn và kháng nấm tạo bôi vi nấm nội
sinh được phân lập từ các cây thuộc họ Cam (Rutaceae)
Sổ hợp đồng: 2015.01.09/HĐ-KHCN
Chủ nhiệm đề tài: Vỗ Thị Ngọc Mỳ
Đơn vị công tác: Khoa Dược
Thời gian thực hiện: Tháng 01/2015 - Tháng 12/2015
Các thành viên phổi họp và cộng tác:
STT Họ và tên Chuyên ngành Cơ quan công tác Ký tên
Trang 3MỤC LỤC
l TÓNG QUAN 5
2 MỤC TIÊU VÀ CÁC NỘI DUNG NGHIÊN củu 8
3 QUÁ TRÌNH THỤC HIỆN CÁC NỘI DUNG 8
4 KẾT QUẢ VÀ SẢN PHÁM ĐÃ ĐẠT Được 10
5 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 17
TÀI LIỆU THAM KHẢO 18
PHỤ LỤC: (Danh mục bài báo, bài báo khoa học) 21
Trang 4TÓM TẮT (ABSTRACT)
Họ Cam (Rutaceae) có nhiều ứng dụng trong việc điều trị bệnh Thân, cành, lá và vỏ quả củacác câytronghọ chứanhiêutinh dâu, hứa hẹn là nơi cung câp một môi trường sông hữu ích
cho các nhóm vi sinh vật nội sinh khác nhau phát triên Nghiên cứu này đã sàng lọc các chủngvi sinhvật nội sinh từ họ Cam (Rutaceae) và khảo sátđiêu kiệnnuôi cây của chủng vi nâmnội sinh
A.terreus TL3-Q phân lập từ gân lá cây quýt Citrus reticulata Blanco.; xác định hoạt tính kháng khuân, kháng nâm băng phương pháp khuêch tán qua khoanh thạch thừ và kháo sát điêu kiện
nuôi cấy tối ưu Nghiên cứu đã xác định được thành phần môi trường toi ưu và các điều kiện
thích hợp choA terreus TL3-Q sàn sinh hoạt chât biên dưỡng kháng Staphylococcus aureus và
MRSA tôt nhât, trong đó nguôn cacbon thích hợp là môi trường khoai tây 300g/l, glucose 2 % ờ
pH môitrường 7; điêukiện nuôi cây tĩnh; thời gian thu nhận hoạt chât thích họp là 9 ngày
Từ khóa: Rutaceae,Aspergillus terreus, endophyte,vi nấm nội sinh
Trang 51 TÓNG QUAN
1.1 Các nghiên cứu ở nước ngoài
Đã có rấtnhiều nhà khoahọc đi sâu nghiên cứu ve endophyte trong mô cúathực vật Phan lớn
các loài endophyte có hoạt tính sinhhọc, tạo ra chất kháng sinh quan trọng đe ngăn chặn sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh đối với cây chù, trong đó có cây lâm nghiệp và nông nghiệp Vì vậy, việc nghiên cửuvai tròcác chủngendophyte làvấn đe rấtquan trọng và đã được nhiềunước
trên thế giới quan tâm
Năm 1955, trên the giới chì tìm rađược 500 chất kháng sinhthì 20 năm sau, năm 1975 đã tìm
ra được5.000 chất kháng sinh Theo Berdy, năm 1984 trênthe giới đã biết được hơn 13.000chất kháng sinh được sán xuất từ thiên nhiên Theo đó, từ những năm 1990, Taxomyces andreanae
lần đau tiên được ly trích từ cây Taxus brevifolia, vi nấm này sản xuat paclitaxel - chat ức che
các thoi phân bào trong quátrình phânchiatebào, có phổ khốitương tự như paclitaxel chiết xuất
từ cây Thông đỏ (Taxus). Một số nhà khoa học đãnghiên cứu khu hệ nấm nội sinh củacác cây thuộc chi Thông đó và tìm thấy các hoạt chấtTaxol (một hoạt chất được sừ dụng hiệu quả nhất
trong điều trị bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú) do nam nội sinh tổng hợp Chi Thông dở
(Taxus) luôn là 1 nguồn giàu nam nội sinh
Năm 1995 - 1996, các nhà nghiên cứu đã phân lập được hàng trăm loài nam nội sinh từ các
cây Thông đò ờ Châu Âu, ChâuÁvà BắcMỹ Có the nói cáccây Thông đò là một khobáu chứa nhiều vi sinh vật chưa từng được phát hiện và rất đáng chú ý, chúng tương tác với nhau và với
cây chù Những nấm đã được biết là có tong hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae, Pestolotiopsis microspora Ngoài ra, thông qua những bang chứng miễn dịch học,người ta cũng
đã phát hiện được sự tổnghọp taxol ở nhiều nấm nội sinh khác phân lập từ cây Thông đò Taxus brevifolia, baogôm nhiêu chủngcùaPenicillium sp., Pestalotiopsis sp và Trimcatella sp
Bảng 1 Một số endophyte sản xuất paclitaxel
1 Pestalotiopsis microspora Taxus wallichiana
2 Pestalotiopsis guepini Wollemia nobilis (cây quýhiêm)
Năm 1995, Willson cho răng vi khuân nội sinh là vi khuân tiên nhân sông trong mô cùa thực vật mà không gây bệnh cho cây chủ Vi khuẩn nội sinh tìm thay ở nhiều loài cây và cũng giong
như các loài vi khuẩn song trong đất,nướcnhư: Pseudomonas, Bacillus và Azospirillum.
Năm 1999, Miss Yuparet Puangmali đã phân lập và tuyển chọn một số loài vi khuẩn sống
trong mô của cây cỏ có khả năng sàn xuất ra enzym L-asparaginase Tác giả đã phân lập được
657 loài vi khuẩn từ những cây thân thảo đe sàn xuất ra L-asparaginase Trong đó ông tìm ra được 220 loài vi khuẩn có hiệu lực mạnh đe thừ nghiệm Nhóm vi khuấn này hoạt động đesinh
raenzym L-asparaginaseở 50.24 mU/ml và hoạt độngcó hiệu quả ở 202.58 mU/ml, đãứng dụng
bang cách tiêm chùng vi khuẩn vào cây đe cây xúc tiến sinh trường và kiểm soát bệnh Các thí
nghiệm của ông với 2 cây là cà chua và cây dưa chuột đã đem lại hiệu quà ức che một số loại mầmbệnh và giảm mức độ bị bệnh
Năm 2000, Jinwi Kim tách chất ức che p-lactamase từ vi khuẩn sổng trong mô thực vật Tác
già đã phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sống trong mô cùa 25 loài thực vật khác nhau và phân
lập được 600 chủng vi khuẩn Trong đó đã tìm ra được 10 chùng có hiệu lực cao, đó là các
Trang 6chùng: KJ3, Z3, pọ, RV2, HL2, CL21, PG5, GB5, GB18, AS3, S21 có khà năng chống lại hoạt
độngcũa nấm men Candida albicans, 2chúng vi khuẩn Z3, RV2 có khả năng sinh rachất kháng
sinh p-lactamase Chùng vi khuẩn Z3 được lựa chọn đe sản xuấtvớiquymô lớn Chùng Z3 được phân lập từ thân rễ cùa cây Gừng chong lại nam c.albicans, nhưng không chống lại được nam
Aspergillus và nấm Fusarium.
Năm 2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò cùavi nam nội sinh Streptomyces sp
chủng NRRL 30562 được ly trích từ cây Kennedia nigriscans, sàn xuất kháng sinh phổ rộng munumbicins, kháng vi khuẩn Gram (+) như Bacillus anthracis, M tuberculosis đa kháng vàmột
so vi khuẩn kháng thuốc khác Steptomyces sp chùng NRRL 30562 phát triển trong lá cây
Grevilea pteridifolia phát triển ở úc, sản xuất kháng sinh kakadumicinsvà echinomycin đều cho
tác động khángp falciparum với LD50=7-10ng/ml
Năm 2001, Tan và Zou chứng minh rằng vi nấm nội sinh cũng được công nhận là nguồn phong phú của chấtchuyển hóacho hoạt tính sinh học
Năm 2002, L Araujo và cộng sự đã tiếnhành biện pháp phòngtrừ sinh học bằng việc sữ dụng sảnphẩm trao đối chất cũa vi khuẩn Bacillus sp., được phân lập từ mô thực vật òng vàcộng sự
đã đi sâu vào nghiên cứu các loài vi khuẩn sống trong mô củathực vậtđe tìm ra các chất kháng
sinh có khá năng kiềm che các nguồn gây bệnh ở cây trong bằng phương pháp sinh học nhằm
làm giảm bớt tác độngđến môi trường, bởi hiện nay con người đang sử dụng rất nhiều chất hoá học đe phòng trừ bệnh cây và côn trùnggây hại trên các cánh đong Vớiphương pháp nàynhóm
cùa ông đã phân lập và tuyển chọn một so chúng vi khuẩn nội sinh được lựa chọn trong các giongcam, quýtnghiên cứu đe tìm ra các chất kháng sinh mới có hiệu lực cao trongviệc phòng
trừ nấmbệnh
Năm 2003, Strobel và cộng sự đã nghiên cửu về chùng vi nấm nội sinh Cryptospriopsis quercina được ly trích từ cây Tripterigeum wilfordii, vi nấm nàycó the sản xuấtcryptocandinvà
cryptocin Trong đó, cryptocandin kháng một số vi nấm gây bệnh cho người như Candida albicans, Trichophyton spp và chống một so nấm gây bệnh thực vật như Sclerotinia sclerotiorum và Botrytis cinerea. Cryptocin có tác dụng kháng Pryriaria oryzae và một số vi
nấm gây bệnh thực vật Cùng nãm 2003, T Taechowisan và s.lumyong đã nghiên cứu về endophyte cóhoạt tính kháng nấm từ rề câyZingiber officinale và Alpinia galanga.
Năm 2006, N.S.H.Raviraja và cs khả năng kháng nấm cùa các vi nấm nội sinh từ các cây dược liệu mien Tây ÂnĐộ
Năm 2012, Agnes JosephAswathy và cộng sự đã nghiên cứu ve endophyte trong cây Nghệ
(Curcuma longa) Các chất dinh dưỡng trong thân rễ cứacây Nghệ là môi trường sống đa dạng
cho các nhóm vi khuẩn khác nhau Một số vi khuẩn nội sinh liên quan có the thúc đẩy tăng trưởng Trong nghiên cứu này, hai endophytePaenibacillus sp được phân lập từ thânrễ cù Nghệ
và câ hai chùng đã được tìm thấy có khảnăng đesàn xuất IAA quaphân tích HPLC
1.2 Các nghiên cứu trong nước
Từnăm 1994, các nhà nghiên cứu đã phân lập được 6 chủng nấm nội sinh từ vỏ cây Thông đò; đã định được tên cùa6 chững nấm này Đây là loài thực vậtđặc hữucó ở Việt Nam, từ lâuđã
được nhân dân ta sữ dụng như một vị thuốc Chúng thường được phân bố ờ Pà Cò, Mai Châu,
Hòa Bình, NghệAn, Hà Tĩnh, Phú Yên, Khánh Hòa, và chủ yếu là ở Lâm Đồng Trong đó đáng chú ý làchùng nam Pestalotiopsis maculans (corda) NagRai có mặt ở tất cả các mầu vỏ của cây
Trang 7Thông đỏ được lấy mẫu Chúng phù hợp nhất với hình thái chúng nấm Pestalotiopsis sp được tìm thấy trong vỏ cây Thông đở ở Mỳvà được các nhà khoa học tiến hành lên men, nuôi cấy,
chiết rút,chạy sắckí bân móngcùng vớichấttaxol chuẩn
Năm 2002, Phạm Quang Thu sừ dụng endophyte có khả năng ức che sự phát triển cùa nấm
gây bệnh cây rừng, tác già đã đi sâu vào nghiên cứu khả năng tương tác cùa các vi sinh vật có
khả năng ức che sinh vật gây bệnh với các loài sinh vật đặc thù khác nhau như vi sinh vật phân giài lân, vi sinh vật kích thích sinh trưởng, vi sinh vật cố định đạm hội sinh và cộng sinh, vi sinh
vật đối kháng với nấm gây bệnh đe tạo ra che phẩm hỗn họp được gọi là “phân vi sinh chức năng” Phân vi sinh chức năng này đã được nghiên cứu và sản xuất thử cho từng đối tượng cây
trong như: cây Bông, cây Đậu, cây Cà chua, cây Điều và một số cây khác như cây Keo, cây
Thông nhựa,Thông mãvĩ
Năm 2005, Lê Mai Hương và cộng sự đã phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn cùa 45 mẫu cây lấy ở vùngYên Tữ, Hà Nội và vườn thuốc Mê Linh thu được 89 chùng vi
nấm nội sinhtrong đó có 32 chùng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 36%); trong đó 20 chủng có
hoạt tínhkháng nấm và kháng khuẩn (chiếm22,5% tong số), 26 chùng có hoạt tính kháng khuẩn (chiếm 29,2 % tong số), 27 chúng có hoạt tính kháng nấm (chiếm 30,33% tong so chùng phân lập) Từ 32 chùng có hoạt tính, bàng phương pháp lên men tách chiết sơ bộ đã chọn được 9
chúng có hoạt tính mạnh, hoạt phổrộng, đặc biệt chúng có kí hiệu N2 phân lập từ cây họ Chòm
có hoạt tính cao nhất, khángBacillus subtilis (ATCC25922) và Fusarium oxyporum.
Năm 2006, Nguyền HoàngNghĩa, Phạm Quang Thu tìm hiểu ve vai trò cùa vi khuẩn nội sinh
trong cơ che kháng bệnh loét thân, cành do nam Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc gây bệnh hại đối với keo lai
Năm 2009, Trần Thị Như Hằng và cộng sự nghiên cứu về vi nấm nội sinh trên cây Kho sâm
(Croton tonkinensis Gapnep.) và Bùm bụp (Mallotus paella Lour.) thu được chùng nam
Trỉchoderma konỉlangbra KS14 sán sinh chat ergosterol, ergosterol peroxide, sorbicillin cho hoạt tính kháng vsv, độcte bào, chống oxyhóa và hoạt tính enzyme ngoại bào; sorbicillin cho hoạt tính khángs aureus với MIC=25mg/ml Chat ergosterol peroxide bieu hiện hoạt tính độc te
bào mạnh với cả 3 dòngtế bào thứ làungthưgan, ungthư màng tứ cung và ungthư màng tim Năm 2010,Nguyền Đinh Nga và cộng sựsàng lọc các chùng vi nấm nội sinh thực vậttrên cây
Ngũ sac (Lanata camara L.) thu được chùng Pseudeurotium NS-T1 kháng c.albicans, trên cây
Mã de(Plantago major L.) thuđượcchủng Fusarium MĐ-TR1 và MĐ-TR3 cho hoạt tính kháng
c albicans và MRSA, Tía tô (Perilla ocymoides L.) thu được chủng Trichoderma TT-L1 kháng
c albicans và MRSA, Trầu (Piper betle L.) thu được chùng Fusarium TR-T1 kháng
c.albicans
Năm 2010, các nhà nghiên cứu thuộc phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Họp
chất Thiên nhiên đã đưa ra biểu đồ ve quy luật phân bố cùa các chùng nấm nội sinh trên các bộ phận cùa câyThôngđỏ (Taxus wallichiana). Sàng lọc sơbộ hoạt tính kháng sinh của các chủng phân lập được, từ 157 chủng nam nội sinh đã sàng lọc được 68 chững có hoạt tính kháng vi sinh
vật kiểm định(VSVKĐ) tương đối cao Thứ hoạttính sinh học cùa dịch chiet 68 chùng nấm nội
sinh, đáng chú ý hơn cả là có 17 mẫu (25%) có hoạt tính gây độc với cả 3 dòng te bào ung thư
như mẫu chiết của các chủng SHT4, SHT6, SHT9 Với các kết quà đạt được, dự án đã góp
phần tích cực vào công tác bào ton và phục hoi hữuhiệu các loài Thông quýhiếm đang bị đe dọa
Trang 8tuyệt chủng ở Việt Nam, đồng thời giúp các nhà quân lý hiểu biết tốt hơn về vai trò cùanấm nội
ký sinh vàsản phẩmcùa chúng trong việc hồ trợ điềutrị bệnh ung thư
Các nhà khoa học đã tìm thấy rất nhiều chất có hoạt tính sinh học được tạo ra bởi các
endophyte trong quá trình chúng ton tại và phát triển, một số chùng endophyte có hoạt tính sinh
học cao, tạo ra chất kháng sinh quan trọng đe ngăn chặn sự xâm nhập cùa sinh vật gây bệnh gây
ra đoivới cây chủ, trong đó có câythuộc lâm nghiệp, nông nghiệp và cây ăn quả Hiện nay trên the giới có khá nhiều nghiên cứu về vai trò và ứng dụng cùa endophyte trong việc phòng trừ bệnh cây và côn trùng gây hại, sản xuất kháng sinh ức che khối u và sàn xuất các chất có hoạt tính sinh học khác Tìm kiểm vàkhám phá những hoạt chất đó chính là đích ngắm mà các nhà
nghiên cứu sinh dược học không ngừng vươntới
2 MỤC TIÊU VÀ CÁC NỘI DUNG NGHIÊN cúu
Theo thống kê của Tổ chức Y te The giới (WHO) có khoảng 80% dân so thế giới, chù yếu từ
các nước phát triển dựavào các loại thuốc truyền thống(nguồn gốc từ thực vật) đe chăm sóc sức
khỏe Trong 119 loại hợp chất hóa học, ít nhất 90 loại có nguồn gốc từthực vật, đây là các loại
thuốc đang được sữ dụng ngày càng nhiều ở nhiều quốcgia (theo Balick và cộng sự, 1996) Hiện
có rất nhiều chất chiết xuất từ cây có tác dụng chữa bệnh, vấn đe đặt ra là các chấtcó hoạt tính
sinh học trong cây là do chính cây sinh ra hay là kết quả cúa mối liên hệ tương sinh với các vi
nấm nội sinhcó íchtrongmô thực vật
Nhiều nghiên cứu cho thay khi cộng sinh trong mô thực vật, vi nấm nội sinh đã sàn sinh ra
nhiều chất có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn và kháng nam Ớ quy mô rộng, vi nấm nội
sinh có tác động quan trọng trongnông nghiệp,rừng và đang được quan tâm nghiên cứu và tiềm
năng cùa chúngcó ý nghĩa rất lớn trong các lĩnh vực yhọc, nông nghiệp và công nghiệp
Nhiều côngtrình nghiên cứu trên thực vậtcũng như trên người cho thấy tinh dầu cùa vỏ quả
các cây họ Cam (Rutaceae) có tác dụnganthan, chữa cảm cúm Từ những đặc tính trên cho thấy,
tiềm năng cùa nhữnghọ chứa hệ endophyte phongphú, tiếtnhiều chất biếndưỡng và có ỷ nghĩa trong việc điều trị bệnh Tuy vậy, cho đen nay, ở Việt Nam nói riêng và trên the giới nói chung
vẫn chưa cỏ nhiều nghiên cứu ve endophyte trên các loài cây thuộc họ Rutaceae Do đó, việc
nghiên cứu tìm kiếm các chủng vi nấm nội sinh có khânăng tạo ra các chất biếndưỡng có lợi và
có khà năngsản sinh các chất có hoạt tính sinh học với hy vọng dùng đe điềutrị bệnh chongười
là một công việc hết sức thú vị và được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Từ đó chúng tôi thực
hiện đe tài: “Nghiên cúu các chất kháng khuẩn và kháng nấm tạo bởi vi nấm nội sinh được phân lập từ các cây thuộc họ Cam (Rutaceae)” với mục tiêu chính là tìm được các chùng vi
nấm nội sinhcó hoạt tínhkháng khuẩnvà kháng nấmcaotrên họ thực vật này
3 QUÁ TRÌNH THỤC HIỆN CÁC NỘI DUNG
3.1 Lấy mẫu dược liệu:
a Đổi tirợng thu mầu: Thực vật nghiên cứu có 1 trong đặc diem sau hoặc két hợp nhiều
đặc điểm:
• Những cây đã được tài liệu nghiên cửucó tác dụngkhángkhuẩn, kháng nấm
• Những cây thuốc theo kinh nghiệm dân gian sữ dụng đe rửa, chữa trị vet thương lở loét
hoặc bệnhnấmngoàida
Trang 9b Xác định tên khoa học của thực vật: dựa theo những tên gọi dân gian, những mô tá về
hình tháicùa thực vật, các đặc điểm hoa, quà, hạt(nếu có) và các bộ phận khác, đe từ đó cócơ sở đem so sánh với khóa phân loại hoặccác tài liệu tham khảo chuyên biệt đêxác định tên khoa học
thực vật
c Nguyên tắc chọn mẫu:
• Chọn những cây khỏe mạnh, không còi cọc, không bị sâu hại hay các biểu hiện bệnh như đốm lá, úng lá
• Thu tất cà các bộ phận của cây như rễ, thân, cành, lá, hoa cùa các cây trong họ thực vật nghiên cứu
Mầu sau khi thu hái được rừa sạch dưới vòi nước, đe ráo nơi khô mát sau đó được xừ lý ngay
hoặc phải được giữ ở nhiệt độ thấp (khoảng4°C) trong vòng 24 giờ nếukịp xữ lý
3.2 Phưomg pháp xử lý mẫu:
Mầu đượcxứ lý tại PTN, trong điều kiện vô trùng của tù cấy
Chủ ỷ: Kích thước và vị trí cắt đe đưa mẫu vào ly trích vi nấm nội sinh:
• Rễ: cắt thành từng đoạn dài lem
• Lá: cắt thành những mảnh vuôngdiện tích 1x1 cm, ở các vị trí dọc gân lá, 2 bên thịt lá ở
các vị trí đầu, giữa, cuối vàcuống lá
• Thân hoặc cành: cắt bỏ vỏ ngoài bằng dao vô trùng, chẻ nhò dọc theo thân, cắt thành từng đoạn dài 1 cm
3.3 Ly trích vi nấm nội sinh:
Giai đoạn 1:
Mầu cây sau khi được xứ lý sẽ được đặt trên môi trường thạch, không chứa các chất dinh
dưỡng khác Các vi nấm nộisinh sẽpháttriển bang chính các chất dinh dưỡnglấytừ mầu cây
Đĩa thạch đã đặt mẫu cây được ũ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển cùa vi nấm nội sinhtrong khoáng từ 1-2 tuần
Vi nam nội sinh được phân biệt với các vi nấm ngoại nhiễm dựa vào nơi xuất phát của khóm nấm và khómvi khuẩn
Sau đó cấy chuyền vi nấm nội sinh sang môi trường dinh dưỡng thích hợp mới Từ đó phân
biệtcác chùnggiong khác nhau, ký hiệu chùng
Giai đoạn 2:
Cấy chuyền vi nấm nội sinh sang môi trường dinh dưỡng thích họp Dựa vào đặc điểm ve
hình thái hoặc mô tả vi học đe gộp chung những chủng giống nhau, phân biệt các chủng khác
nhau và ký hiệu chúng
Các môi trường thường sừ dụngnhư thạch khoai tây đường (PDA), thạchCzapeck-Dox,thạch
Sabouraud (SDA) ủ ở nhiệtđộ phòng và theo dõi sự phát triển cùa vi nấm nội sinh từ 1-2 tuần hoặc lâu hơntùytheotốc độ phát triển củavi nấm nội sinh
3.4 Khảo sát hoạt tính sinh học của các chủng vi nấm nội sinh
Vi nấm nội sinh sẽ phóng thích chất biến dường có hoạt tính sinh học vào môi trường nuôi cay trong quá trình phát triển Các tác động này được phát hiện và đánh giá bang phươngpháp
khuếch tántrênđĩathạch
3.5 Định danh những chủng vi nấm có hoạt tính ớ mức Chi
Trang 10Tên khoa học cùacác chúng vi nấm nội sinh cho chất biến dưỡng ra môi trường có tác động
khángkhuẩn, kháng nam, chống oxi hóa sẽ được xác địnhđến mức chi dựa trên các đặc diem
của vi nấm
❖ Các qui tắc chính trong định danh
- Chững nấm tuyệt đối thuần khiết (không lẫn nam mốcvà vsv khác)
- Sừ dụng môitrường nuôi cấy có thành phần phù hợp
- Quan sát và ghi lại các đặc diem phân loại cùa chùng vi nam can định danh (đặc diem
khuẩn lạc, mặt phải, mặt trái, tốc độ phát triển, đặc điểm vi học )
- Dùng chuyên luận các nhómphân loại đe định loại nấm đen mức chi
- Kiểm tra chùngvi nam đã định danh với chùng nam cótrong bộ sưu tammầu
- Viet tên các nhóm phân loại đúngvới danh pháp quốc te
- Định danh sơ bộ dưới kính hiển vi sau khi nhuộm với Lacto phenol cotton blue de sơ bộ phân loại nam
- Cấy nam vào các môi trườngchuyên biệt
- Dựa vào hình thái khuẩn lạc (đường kính, màu sắc, hình dạng ) và các sắc tố vi nấm tiết
ra môi trường để định danh Các vi nam nội sinhsẽ được định danh theo khóa phân loại của Guy
St Germain, năm 1995
3.6 Các phưong pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu đế các chủng vi nấm nội sinh sản xuất tối đa hoạt chất sinh học
- Khảosát trên các loại môi trường cơbàn: PDA, SDA,CDA
- Nguôn Cacbon
- Nguồn Nitơ
■
4 KẾT QUẢ VÀ SẢN PHÁM ĐÃ ĐẠT ĐƯỢC
4.1 Kết quả sàng lọc
Họ Cam (Rutaceae) ởnước tahiện có 30 chi với 110 loài manglại nhiều giá trị dược liệu quý giá điển hình là khâ năng kháng khuẩn, kháng nấm.Vì vậy, nham hiểu rõ và sứ dụng tốt nguồn dược liệu này, chúng tôi tiếnhành nghiên cứu khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cùa các vi sinh
vậtnội sinh với đối tượng chính là vi nam nội sinh trên cáccây họ Cam (Rutaceae)
Sauthời gian nghiên cứu thu được một số chúng endophhyte từcam, chanh, tắc, bưởi, nguyệt
que, quýt thuộc họ Cam (Rutaceae) Trong đỏ, phân lập tất cả 65 chủng, có 59/65 chúng không cho tác động kháng khuẩn, kháng nấm mong muốn và 1/10 chùng từ cây bười ở LongAn, 1/12
chùng từ cây tắc ở Long An, 1/13 chùng từ cây bưởi ở Bình Dương, 1/12 chùng từ cây quýt ở Lái Thiêu-Bình Dương, 2/4 chúng từ cây bưởi ờ Vũng Tàu cho tác động kháng khuẩn trong đó
có 5/6 chúng cho tác động khángkhuẩnvừa và 1/6 chùng cho tác động yếu, không có chùng nào cho tác độngkhángnấm
Bảng 4.1 Ketquà sàng lọc chủng vi nấm nội sinh từ họCam (Rutaceae)
STT Thực vật Noi lấy mẫu Chủng thu được Chủng kháng khuẩn,
kháng nấm