Trong đó, giống cây có họ Citrus cótiềm năng lớn song chỉ được khai thác, tận dụng, hầu như chỉ mới sử dụng múi, chưa che biến và tận dụng tinh dầu từ vỏ và lá của các loại cây ăn trái h
Tổng quan về tinh dầu họ Citrus
Khái niệm về tinh dầu
Tinh dầu là hợp chất dễ bay hơi có mùi đặc trưng, được tạo ra qua quá trình chuyển hóa thứ cấp của thực vật, chủ yếu là các tecpen và tritecpenonit Trong hệ thực vật, có khoảng 3.000 loài cây chứa tinh dầu, trong đó 150-200 loài có ý nghĩa công nghiệp Thành phần hóa học của tinh dầu chủ yếu gồm các terpenoid và các dẫn xuất chứa oxy như alcohol, aldehyde, ketone, ester, acid, trong đó chỉ một số cấu tử chính mới tạo nên mùi thơm đặc trưng Tinh dầu là hợp chất hữu cơ hòa quyện, có mùi đặc trưng, thường ở dạng lỏng với khối lượng riêng nhỏ hơn 1, không tan trong nước hoặc tan rất ít, nhưng dễ hòa tan trong dung môi hữu cơ như ancol, ete, chất béo Khi đun nóng, tinh dầu bay hơi theo hơi nước, mang vị cay, ngọt, nóng bỏng và có tính sát trùng mạnh, phù hợp trong nhiều ứng dụng công nghiệp và dược phẩm.
Tinh dầu trong thực vật có thành phần không ổn định, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giống, di truyền, đất trồng, phân bón, thời tiết, ánh sáng và thời điểm thu hoạch Hàm lượng tinh dầu cũng khác nhau giữa các bộ phận của cây, vì vậy việc hiểu rõ các yếu tố này là cần thiết để xác định thời điểm thu hái phù hợp nhằm tối ưu hóa hàm lượng và chất lượng tinh dầu Tinh dầu là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất của cây và không được tái sử dụng cho hoạt động sống của cây, do đó, việc thu hoạch đúng thời điểm rất quan trọng để đảm bảo sản phẩm đạt chất lượng cao.
Tính chất vật lý và thành phần hóa học của tinh dầu
2.2.1 Tính chất vật lý ớ nhiệt độ thường, tinh dầu ở the lỏng, trừ một số trường hợp đặc biệt như menthol, camphor là ở the rắn Tinh dầu gần như không tan trong nước và dễ bay hơi, do vậy có thế tách thu tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Tinh dầu rất ít tan trong nước, tan tốt trong cồn và các dung môi hữu cơ, các loại dầu mỡ, có thể tan một phần trong dung dịch kiềm, Đa so tinh dầu không có màu hoặc màu vàng nhạt, một số tinh dầu có màu, như tinh dầu quế có màu nâu sầm, tinh dầu thymus có màu đỏ.
Tinh dầu thường có vị cay và hắc, với tỷ trọng dao động trong khoảng 0,80 - 0,95; một số loại như tinh dầu đinh hương và quế có tỷ trọng nặng hơn nước Tỷ trọng của tinh dầu phụ thuộc vào thành phần hóa học, với các hợp chất chứa oxy hoặc nhân thơm thường có tỷ trọng cao hơn các hydrocarbon tecpenic có tỷ trọng thấp Chỉ số khúc xạ của tinh dầu thường nằm trong khoảng 1,45 - 1,56, và cao hay thấp tùy thuộc vào cấu trúc các chất như no, không no hoặc nhân thơm Khi trong tinh dầu có nhiều liên đôi, chỉ số khúc xạ sẽ cao hơn, và yếu tố nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến chỉ số này, với nhiệt độ tăng khiến chỉ số khúc xạ giảm Góc quay cực (a)D thể hiện khả năng hòa tan của tinh dầu trong các dung môi, với giá trị lớn hơn cho dung môi phân cực và nhỏ hơn cho dung môi không phân cực; nhiệt độ cũng làm tăng hoặc giảm góc quay cực khi đo Vì tinh dầu là hợp chất nên không có nhiệt độ sôi cố định, nhưng điểm sôi của các thành phần như tecpen, sesquiterpen và polyterpen dao động từ khoảng 150°C đến trên 300°C Nhờ đặc điểm này, các thành phần trong tinh dầu có thể được tách ra bằng phương pháp chưng cất phân đoạn Ngoài ra, một số loại tinh dầu như hồi, bạc hà, xá xị có thể kết tinh khi giảm nhiệt độ.
Dưới ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng, không khí, nước và tinh dầu dễ bị oxi hóa và biến đổi thành nhựa hóa một phần Ancol trong tinh dầu bị oxi hóa thành anđehit, sau đó anđehit chuyển thành axit, gây thay đổi cấu trúc hóa học của tinh dầu Các hợp chất chứa nhóm đôi dễ bị oxi hóa hoặc tham gia phản ứng cộng, ảnh hưởng đến tính chất của tinh dầu Các hợp chất như xeton và anđehit dễ bị ancol hóa tạo nhựa trong điều kiện có kiềm, làm thay đổi đặc tính ban đầu của tinh dầu Nhiều thành phần có các nhóm chức khác nhau trong tinh dầu có thể phản ứng hóa học, dẫn đến sự biến đổi tính chất của tinh dầu theo thời gian.
Tinh dầu họ Citrus
Hầu hết các giống cây quýt đều chứa tinh dầu trong vỏ, lá và hoa, trong đó hàm lượng tinh dầu trong vỏ trái thường rất cao Tinh dầu từ vỏ, lá và hoa citrus không chỉ mang lại hương thơm tự nhiên mà còn có lợi ích sức khỏe đáng kể, giúp tăng cường hệ miễn dịch và hỗ trợ điều trị một số bệnh Chính vì vậy, việc khai thác tinh dầu từ các bộ phận này đang được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm.
Tinh dầu họ Citrus là hợp chất phức tạp chứa hydrocarbon và các nhóm oxy như aldehyd, alcohol, ketone, este, và axit hữu cơ, chủ yếu từ nguồn terpenoid và nonterpenoid [5] Thành phần chính của tinh dầu vỏ trái cây họ Citrus bao gồm 85-95% hợp chất nhóm terpen, 2-10% nhóm alcohol, và rất ít sesquiterpen (1-2,5%) Trong tinh dầu cam chanh, các thành phần chính như Decanal, Citral, Limonene và Alcohol octyl chiếm ưu thế Tinh dầu vỏ quả quýt chủ yếu chứa D-Limonene, Pinen, Phelendren, cùng một số lượng nhỏ Linalool và Citronel Các thành phần bay hơi và không bay hơi của tinh dầu họ Citrus thể hiện rõ trong hình 2.1 và 2.2, với thành phần của các CEO thay đổi đáng kể tùy thuộc vào đa dạng, mùa vụ, vùng địa lý và giai đoạn chín của quả.
Tinh dầu trong lá của nhiều loài cây là nguồn nguyên liệu quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm Hàm lượng tinh dầu trong vỏ trái khá cao, dao động từ 2-9%, chủ yếu gồm các hợp chất như citral, limonene và dipenten Ngoài ra, lá chứa khoảng 0,2-0,3% tinh dầu với thành phần chính là Linalol, góp phần tạo nên đặc tính và giá trị ứng dụng của các loại tinh dầu này trong ngành công nghiệp thực phẩm.
Trong tinh dầu của nhiều loài cam, chanh, quýt, ngoài các hợp chất chính thuộc nhóm terpen và sesquiterpen, còn chứa các hợp chất chứa oxygen như alcohol, aldehyde, ester Các hợp chất này dễ tan trong nước và rượu có độ cồn thấp, mang lại vị thơm mát dịu hấp dẫn của hoa tươi Chính nhờ đặc tính này, chúng được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp sản xuất nước hoa, kem đánh răng, xà phòng thơm.
Ngoài tinh dầu chiết xuất từ các cơ quan thực vật riêng lẻ của loài thuộc giống Citrus, còn có loại tinh dầu gọi là "petitrain" Tinh dầu petitgrain được sản xuất từ lá và chanh non, nổi bật với khả năng khử mùi và mùi hương ngọt ngào, thường được sử dụng trong nước hoa và các sản phẩm vệ sinh gia đình Nếu loại bỏ terpen, tinh dầu petitgrain có thể trở thành tiền chất quan trọng để tổng hợp các hợp chất đắt tiền trong tinh dầu neroli, góp phần nâng cao giá trị trong ngành sản xuất tinh dầu.
Tinh dầu họ Citrus là một trong những loại tinh dầu phổ biến nhờ hương ngọt ngào đặc trưng của nó Nhiều nghiên cứu đã điều tra thành phần hóa học của tinh dầu vỏ, lá và hoa của các loài cây có múi, cho thấy tinh dầu họ Citrus có khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm, trị nám và chống ung thư Ngoài ra, tinh dầu họ Citrus còn giàu các hợp chất oxy hoặc nitơ, giúp giảm các bệnh tim mạch, tăng cường hiệu quả giấc ngủ, giảm lo âu và trầm cảm Tuy nhiên, thành phần hóa học của tinh dầu Citrus có sự khác biệt lớn tùy thuộc vào nguồn gốc, di truyền, mùa vụ, khí hậu, độ tuổi cây, giai đoạn chín và phương pháp chiết xuất.
Hình 2.1: cấu trúc hóa học của các thành phầndễbay hơi chính trong tinh dầu Citrus.
Hình 2.2: cấu trúc hóa học cúa các thànhphần không bay hơi chính trong tinh dầu Citrus.
2.3.1 Thành phần hóa học trong tinh dầu vỏ Bưởi
Các nghiên cứu trước đây đã xác định thành phần hóa học của tinh dầu bưởi gồm L-Limonene, p-Myrcene, p-Pinene, Sabinene, Germacrene-D, và nhiều hợp chất khác, trong đó limonene chiếm tỷ lệ lớn từ 62,0 đến 95,4%, là thành phần chủ đạo của dầu vỏ bưởi Sự khác biệt về hàm lượng limonene có thể do điều kiện môi trường, nguồn gốc, phương pháp thu hoạch và nơi thu sữa Tinh dầu bưởi thể hiện hoạt động kháng khuẩn phổ rộng, chống lại các vi khuẩn gây bệnh như E coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Bacillus licheniformis, đồng thời có tiềm năng trong ngành nuôi trồng thủy sản để chống lại nấm mốc nước Saprolegnia parasitica Các thành phần chính của tinh dầu bao gồm citronellal và citronellol, đóng vai trò quan trọng trong hoạt động chống oxy hóa, kháng viêm và ức chế enzyme Tyrosinase Khi kết hợp với dầu hoắc hương, tinh dầu bưởi giúp giảm cảm giác thèm ăn, thúc đẩy quá trình giảm cân lành mạnh và loại bỏ độc tố Ngoài ra, tinh dầu bưởi còn kích hoạt quá trình apoptosis tự nhiên của tế bào ung thư bạch cầu HL60 và có khả năng gây độc tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC-3), mạnh hơn so với ung thư biểu mô tế bào phổi (A549) và ung thư vú (MCF-7).
2.3.2 Thành phần hóa học trong tinh dầu vỏ Chanh
A study by Li-Yun Lin and colleagues (2019) identified over 60 volatile compounds in lemon peel oil using GC-MS, primarily comprising 13 monoterpenes (80.36%), with limonene being the most abundant at 42.35% Other significant compounds include γ-terpinene (15.44%), p-pinene (12.57%), and α-pinene (3.12%) The lemon peel oil also exhibits strong antioxidant activity, with IC50 values of 2.36 mg/mL (DPPH) and 0.26 mg/mL (ABTS) Additionally, it demonstrates potent antimicrobial effects against various bacteria such as Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, and Staphylococcus aureus Furthermore, lemon peel oil has notable mosquitocidal properties, making it an effective natural insect repellent.
Tinh dầu chanh đã được ứng dụng trong việc diệt côn trùng như Aedes aegypti, giúp phòng chống bệnh sốt xuất huyết Ngoài ra, tinh dầu chanh còn có tác dụng giảm các triệu chứng cảm lạnh, cúm, hen suyễn, viêm khớp và viêm phế quản, cũng như kháng viêm hiệu quả Nghiên cứu còn cho thấy tinh dầu chanh giúp giảm trọng lượng cơ thể và mức tiêu thụ thực phẩm ở chuột, nâng cao tác dụng hỗ trợ sức khỏe tự nhiên.
Nó cho thấy các hoạt động gây độc tế bào chống lại Avena fatua L., Echinochloa crus- galli (L.) Beauv, Allium cepa L., and Phalaris minor Retz [18].
2.3.3 Thành phần hóa học trong tinh dầu vỏ Cam
Theo báo cáo của Maísa và cộng sự (2019), tinh dầu Cam chủ yếu chứa các monoterpen như limonene (95,12%), a-pinene (0,35%), sabinene (0,54%) và myrcene (1,07%), cho thấy khả năng tiêu diệt tế bào ung thư mà không gây tổn thương đến tế bào da bình thường Nghiên cứu cũng cho thấy tinh dầu Cam giảm 50% khả năng sống sót của tế bào u khi ở nồng độ 272,6 pg/mL, hứa hẹn trở thành phương pháp điều trị ung thư tiềm năng Ngoài ra, tinh dầu Cam còn được xem là chất bảo quản tự nhiên trong thực phẩm, đồng thời mùi cam ngọt giúp giảm lo âu, cải thiện tâm trạng và làm tăng cảm giác thư giãn sau 90 giây ngửi Một số nghiên cứu còn chứng minh tinh dầu Cam ức chế các thương tổn gan preneoplastic trong quá trình gây ung thư gan bởi N-nitrosodiethylamine (DEN), bên cạnh đó các công thức kết hợp dầu húng quế và tinh dầu Cam đã thể hiện hiệu quả trong điều trị mụn trứng cá Không chỉ vậy, tinh dầu Cam còn có khả năng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn như Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, cũng như chống lại các loại nấm như Aspergillus flavus và A fumigatus.
A niger, A terreus, Altemaria altemata, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Fusarium oxysporum, Helminthosporium oryzae, Penicillium chrysogenum, p.verrucosum, và Trichoderma viride, ấu trùng Anopheles labranchia gây bệnh sốt rét
Tinh dầu cam còn được nghiên cứu như một loại thuốc giảm đau, chống động kinh, co giật và viêm loét dạ dày, mang lại tiềm năng điều trị đa dạng các bệnh lý [24, 30, 31] Một mô hình động vật viêm tai giữa cấp tính (AOM) đã được xây dựng, trong đó chế độ ăn uống chứa viên nang tinh dầu vỏ cam giúp quản lý triệu chứng của bệnh, cho thấy tinh dầu cam có khả năng giảm mức độ MDA, IgA, IgG, IgM trong huyết thanh và cochlea, đồng thời tăng hoạt động của các enzyme chống oxy hóa, mở ra triển vọng sử dụng trong điều trị bệnh lý tai giữa và các vấn đề viêm nhiễm [32].
An toàn của tinh dầu Citrus
Trái cây họ Citrus là cây thương mại quan trọng đã tồn tại hàng ngàn năm và tinh dầu của chúng có giá trị lớn trong ngành công nghiệp nước hoa, thực phẩm và đồ uống, được sử dụng làm hương liệu và dược liệu nhờ mùi thơm mát, dễ chịu và hương thơm phong phú Do tầm quan trọng kinh tế cao, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào thành phần hóa học của tinh dầu vỏ, lá và hoa của các loài cây họ Citrus khác nhau, và nói chung, tinh dầu họ Citrus an toàn, không độc hại, không gây đột biến, ung thư, không ảnh hưởng xấu trong thai kỳ và không thay đổi kết quả sinh sản của mẹ, vì chúng được phân loại là GRAS Tinh dầu cam ngọt không gây kích ứng hay nhạy cảm với nhiều tình nguyện viên khi thử nghiệm ở mức 8% và 100% Tuy nhiên, nó gây nhạy cảm cho 0,13% số bệnh nhân viêm da khi thử nghiệm ở mức 2% Tinh dầu chanh không gây kích ứng hay nhạy cảm trong các thử nghiệm ở mức 15% và 100%, nhưng hàm lượng cao citral trong tinh dầu chanh có thể gây độc, đặc biệt ảnh hưởng đến tủy xương Tinh dầu bưởi cũng không gây kích ứng hay nhạy cảm khi thử nghiệm ở mức 10% và 100% Khi sử dụng dầu essential oils (EO) cho da với liều cao hơn mức an toàn tối đa, cần tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời trong ít nhất 12 giờ để đảm bảo an toàn.
Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Trái cây họ Citrus (bao gồm cam, bưởi, chanh, tắc, quýt) là một trong những loại trái cây phổ biến nhất trên thế giới, với sản lượng ngày càng tăng do nhu cầu tiêu dùng tăng cao Theo số liệu năm 2012, sản lượng hàng năm của các loại trái cây có múi ước tính đạt 115,5 triệu tấn, chiếm khoảng 33% tổng sản lượng trái cây chế biến công nghiệp năm 2007, góp phần tạo ra khoảng 15 triệu tấn chất thải mỗi năm Chất thải từ trái cây họ Citrus có giá trị kinh tế lớn vì chứa nhiều alkaloids, flavonoid, carotenoids, chất xơ, đường, polyphenol, axit ascorbic, tinh dầu và các nguyên tố vi lượng quan trọng cho sức khỏe con người Các hợp chất này có nhiều lợi ích như kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm, giảm nguy cơ ung thư, giảm đái tháo đường, bảo vệ tim mạch và thần kinh Chất thải và phụ phẩm của trái cây họ Citrus chứa các hợp chất có giá trị cao, mở ra nhiều cơ hội trong lĩnh vực công nghệ và sức khỏe, đặc biệt là tinh dầu – thành phần chính trong các bộ phận trái cây, đặc biệt trong vỏ, đã thu hút nhiều sự quan tâm của cộng đồng khoa học nhờ hoạt tính sinh học cao của các hợp chất dễ bay hơi.
Tinh dầu từ cây họ Citrus được sử dụng như một thuốc an thần và thôi miên nhẹ giúp thư giãn, tăng cường giấc ngủ, giảm triệu chứng lo âu, cải thiện tâm trạng, tạo cảm giác hạnh phúc, cũng như tăng khả năng tập trung và trí nhớ Nhờ chứa các hợp chất như terpen, flavonoid, carotenoid và coumarin, các loại tinh dầu này có hoạt động kháng khuẩn mạnh, được ứng dụng làm chất chống vi trùng tự nhiên, thay thế các phụ gia tổng hợp trong công nghiệp thực phẩm để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng Nghiên cứu của Wang và cộng sự năm 2012 cho thấy tinh dầu vỏ tắc (Fortunella crassifolia) có khả năng kháng khuẩn chống lại các chủng vi khuẩn gây bệnh Gram âm và Gram dương, đồng thời có tác dụng chống nấm Candida albicans hiệu quả Ngoài ra, tinh dầu vỏ bưởi cũng thể hiện khả năng chống lại nhiều chủng vi khuẩn như P chrysogenum, B subtilis, S aureus và E coli Tinh dầu Citrus còn có khả năng quét gốc tự do, mang lại hoạt động chống oxy hóa cao nhờ hàm lượng D-limonene cao, như báo cáo của Tundis và cộng sự năm 2012 về tinh dầu chanh (Citrus aurantifolia) với giá trị IC50 là 19,6 mg/ml Thêm vào đó, tinh dầu cam, chanh và bưởi đã được ghi nhận gây độc tế bào đối với các tế bào bạch cầu, tế bào ung thư tuyến tiền liệt, phổi, vú và ung thư gan, góp phần vào hoạt động chống ung thư hiệu quả.
Tinh dầu từ cây họ Citrus là một trong những loại tinh dầu phổ biến nhất, chứa thành phần limonene có hoạt tính hạ đường huyết đáng kể Nghiên cứu cho thấy, tinh dầu này có tiềm năng ứng dụng như thuốc trị đái tháo đường, đặc biệt trong việc giảm đường huyết ở chuột bị tiêu đường do streptozotocin gây ra Ngoài ra, một số nghiên cứu còn chỉ ra rằng các hợp chất trong tinh dầu Citrus có khả năng bảo vệ gan khỏi tác nhân độc hại như aspirin, đồng thời kích hoạt hoạt động thần kinh giao cảm trong mô mỡ trắng (WAT) Quá trình này thúc đẩy lipolysis, giúp giảm cân và ức chế quá trình hình thành mỡ bằng cách ngăn chặn sự tích tụ triglyceride, góp phần kiểm soát cân nặng hiệu quả.
Sự cải thiện tình trạng rối loạn lipid máu đã được ghi nhận rõ rệt ở những con chuột bị tăng đường huyết sau khi điều trị bằng tinh dầu Citrus aurantifolia, với mức giảm đáng kể của cholesterol toàn phần, triglyceride và lipoprotein cholesterol mật độ thấp (LDL), đồng thời tăng cholesterol lipoprotein mật độ cao (HDL) Những kết quả này cho thấy tinh dầu Citrus aurantifolia có khả năng giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch ở chuột bị rối loạn chuyển hóa lipid.
Tình hình nghiên cứu trong nước
Citrus là một trong những loài thực vật phổ biến nhất thế giới, gồm 40 loài phân bố rộng rãi Tại Việt Nam, các loại trái cây họ cam, quýt, chanh, tắc và bưởi được tiêu thụ nhiều nhất Khi nền kinh tế và xã hội phát triển, nhu cầu sử dụng tinh dầu từ các loại quả họ cam, quýt, chanh cũng ngày càng tăng, đặc biệt trong lĩnh vực làm đẹp và thực phẩm Chính vì vậy, tinh dầu họ citrus trở thành sản phẩm được ưa chuộng và phổ biến trong đời sống người tiêu dùng Việt Nam.
Citrus ngày càng trở nên phổ biến tại Việt Nam, thu hút sự quan tâm đến việc khai thác và sử dụng rộng rãi các chiết xuất tinh dầu từ vỏ quả và lá cây Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phương pháp chưng cất truyền thống như chưng cất bằng dung môi, nước hoặc chưng cất hơi nước để chiết xuất tinh dầu Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa của tinh dầu vỏ bưởi, như Nguyễn Văn Lợi và cộng sự (2013) đã nhận diện tinh dầu bưởi từ bưởi Đoan Hùng và Yên Thế, thể hiện khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn Ngoài ra, nghiên cứu của họ năm 2014 đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu chiết xuất từ lá cam, chanh, và bưởi, cho thấy hiệu quả vượt trội so với Vitamin C đối với các dòng vi khuẩn như S aureus, E coli, S typhi và B cereus.
Nghiên cứu của Phạm Văn Hùng và cộng sự (2013) cho thấy tinh dầu bưởi có tác dụng ức chế nấm mốc P expansum, mang lại hiệu quả chống nấm hiệu quả Các nghiên cứu của Lan-Phi và Vy (2015) trên ba giống bưởi của Việt Nam (năm roi - Vĩnh Long, da xanh - Đong Tháp và bưởi Đường Cam - Đồng Nai) đã chứng minh hàm lượng cao của các hợp chất như γ-terpinene, α-pinene, và P-phellandrene trong tinh dầu, góp phần vào hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn, đồng thời phụ thuộc vào giống bưởi và vùng trồng Gần đây nhất, nghiên cứu của Nguyễn Trọng Tuân và cộng sự (2019) đã trích ly tinh dầu và pectin từ vỏ bưởi bằng phương pháp một công đoạn, mở ra tiềm năng ứng dụng trong chế biến các sản phẩm tự nhiên Ngoài ra, tinh dầu từ vỏ quả Phật thủ cũng được nghiên cứu để khai thác những hoạt tính sinh học đặc biệt.
Citrus medica var Sarcodactylis' đã được Nguyền Hải Đăng và cộng sự (2016) báo cáo về hoạt động ức chế enzyme α-glucosidase với giá trị IC50 là 412,2 pg/ml, cho thấy tác nhân này có khả năng hạ đường huyết an toàn và hiệu quả, đồng thời xuất phát từ nguồn tự nhiên, tiềm năng ứng dụng trong điều trị tiểu đường.
Các phương pháp trích ly
Khuếch tán đóng vai trò quan trọng đầu tiên trong quá trình chiết xuất tinh dầu họ Citrus Quá trình này là sự chuyển động ngẫu nhiên của các phân tử chất tan từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp trong dung môi lỏng, theo định luật Fick Nguyên nhân chính của khuếch tán là do gradient nồng độ của các phân tử chất tan, khiến các phân tử có xu hướng khuếch tán để đạt được cân bằng nồng độ.
Thẩm thấu là cơ chế thứ hai trong quá trình chiết xuất tinh dầu, đóng vai trò vận chuyển các phân tử tinh dầu lên bề mặt túi tiết Trong quá trình này, các phân tử dung môi di chuyển từ vùng có nồng độ thấp đến cao qua sự chuyến động của phân tử, đòi hỏi năng lượng từ tế bào Sau xử lý nguyên liệu, bên trong tế bào còn ít tinh dầu do tác động vật lý làm vỡ túi tinh dầu, phần tinh dầu dễ dàng thoát ra vào dung môi Nồng độ nước bên ngoài cao hơn bên trong, khiến nước có xu hướng di chuyển vào tế bào đến khi đạt cân bằng, khi đó nồng độ chất tan hai bên màng tế bào cân đối, các phân tử nước di chuyển ra ngoài mang theo tinh dầu ra khỏi tế bào.
Thứ ba là quá trình đun nóng nước, trong đó nhiệt độ của nước tăng lên đến khi đạt đến điểm sôi và áp suất hơi bằng với áp suất không khí Trong giai đoạn này, nhiệt lượng tiếp tục được cung cấp để chuyển nước từ thể lỏng sang thể hơi, gây ra quá trình bay hơi Đồng thời, tinh dầu phân tán trong các phân tử nước thấm vào các túi tiết thông qua quá trình khuếch tán qua màng tế bào, hai cơ chế này xảy ra song song Quá trình này sẽ tiếp tục cho đến khi tất cả các phân tử tinh dầu khuếch tán ra khỏi các túi tiết và bay hơi cùng hơi nước, tạo thành hỗn hợp đồng nhất.
Cơ chế thứ tư là quá trình hóa hơi, khi nước và tinh dầu sả được đun nóng đến nhiệt độ nhất định và áp suất khí quyển, chúng sẽ bay hơi tạo thành một hợp chất đẳng phí Quá trình này đóng vai trò quan trọng trong việc tách tinh dầu sả một cách hiệu quả Việc kiểm soát nhiệt độ và áp suất là yếu tố then chốt để đảm bảo tinh dầu được chiết xuất một cách tối ưu và giữ trọn dưỡng chất tự nhiên.
Cơ chế thứ năm là sự ngưng tụ của sản phẩm chưng cất Hơi nước và tinh dầu sả được làm lạnh bằng cách ngưng tụ.
Quá trình cuối cùng trong cơ chế này là sự phân tách nước và tinh dầu Khi chất lỏng ngưng tụ, nó rơi xuống nhờ trọng lực và tách thành hai lớp riêng biệt: lớp dầu phía trên và lớp nước phía dưới, giúp tách hoàn toàn các thành phần này để đạt hiệu quả tối ưu trong quá trình chiết xuất.
Một số phương pháp trích ly tinh dầu:
• Phương pháp trích ly bằng dung môi.
• Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
• Phương pháp chưng cất hồ trợ vi sóng.
Giói thiệu sơ lược về các chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài
Staphylococcus aureus lần đầu được phát hiện bởi tiến sỳ Alexander Ogston vào năm
Staphylococcus aureus là một chủng vi khuẩn gram dương, hình cầu, có xu hướng kết tụ thành cụm và thường có màu vàng Đây là tác nhân gây nhiễm trùng phổ biến trên toàn thế giới kể từ năm 1880, với khả năng gây ra các dạng nhiễm trùng từ nhẹ trên da đến nặng và có thể gây tử vong khi xâm lấn sâu vào các mô bên trong S.aureus sinh lý phát triển tốt trong môi trường nhiệt độ từ 7.0 đến 48.5°C, lý tưởng nhất là từ 30 đến 37°C, và pH từ 4.2 đến 9.3, tối ưu nhất từ 7.0 đến 7.5 Loài vi khuẩn này có khả năng sống trong môi trường khô, thậm chí rất khô, thường thấy trên da người, trên quần áo và trong một số loại thực phẩm.
E.coli là trực khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae, hình que, di chuyển bằng roi, sinh sống hội sinh trong ruột người và các động vật khác, sinh trưởng trong điều kiện yếm khí hoặc kỵ khí tùy nghi được Buchner tìm ra năm 1885 E.coli phân bố rộng rãi trong môi trường đất, nước và tồn tại nhiều trong đường ruột của sinh vật máu nóng Đa số các E.coli là vô hại tuy nhiên cũng có một số dòng có thể gây ra ngộ độc thực phẩm E.coli là nguyên nhân cùa các bệnh về đường ruột, tiêu chảy, một vài khiểu hình kháng nguyên có thể gây bệnh viêm màng não, phim phối trên người [57], Ngoài ra,
E.coli là một trong nhừng vi khuẩn chỉ thị sự ô nhiễm của nước công nhận Hiện nay những nghiên cứu trên vi khuân này tương đối nhiều từ ứng dụng của nó trong tạo các protein tái tổ hợp đến những biện pháp ức chế nó, mà điển hình là sử dụng các hợp chất tự nhiên Trong những thập kỉ qua, đây là một trong những mô hình vi sinh vật được nghiên cứu nhiều nhất.
2.8.3 Salmonella enterica s.enterica là chủng vi khuấn que, gram âm, kỵ khí tùy nghi, di chuyến bằng roi [58], không tạo bào tử Khoảng nhiệt độ vi khuẩn s.enterica có thể sinh trưởng và phát trển là 6 - 42°c, điều kiện tối ưu cho sự phát triển là ở khoảng nhiệt độ từ 35 - 37°c, pH từ 6-9 s.enterica là một trong những chủng vi khuẩn gây ngộ thực phẩm phổ biến, ngoài ra, đây còn là nguyên nhân chính dẫn đến bệnh thương hàn [59] Cùng với E.coli, các chùng Salmonella nói chung và s.enterica nói riêng là một trong những đối tượng pho biến nhất được nghiên cứu trên toàn thế giới [60] s.enterica là một trong những đối tượng chính gây ra các triệu chứng nhiễm trùng salmonella (salmonellosis) bao gom tiêu chảy, sốt, đau bụng, nôn mửa s.enterica có thể xâm nhập vào người thông qua việc sử dụng nguồn nước ô nhiềm hay gia cầm bị nhiễm bệnh bao gồm cả trứng chưa được chế biến kỳ Nhiễm trùng salmonella là nguyên nhân vi sinh phổ biến thứ hai trong việc gây ra viêm dạ dày và hệ thống ruột Người ta ước tính rằng có khoảng 1,2 triệu ca nhiễm trùng salmonella mồi năm ở Hoa Kỳ và có tới 450 ca tử vong [61].
Bacillus cereus là vi khuẩn hình que, hiếu khí, gram dương, sinh bào tử và phân bố rộng trong môi trường Đây được xem là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm do hoạt động tiết enzyme ngoại bào gây phá hủy mô, dẫn đến các triệu chứng nôn mửa và tiêu chảy Các độc tố của B cereus bao gồm hemolysin, phospholipase, protease và các chất gây nôn khác, có khả năng phá hủy hồng cầu và tổn thương mô Ngoài ngộ độc thực phẩm, Bacillus cereus còn liên quan đến các bệnh nguy hiểm như bệnh than, nhiễm trùng huyết và viêm hệ thần kinh trung ương, đe dọa đến sức khỏe người tiêu dùng.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
Chiết xuất tinh dầu được thực hiện bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn bằng hơi nước, đảm bảo giữ nguyên các thành phần hoạt tính của tinh dầu tự nhiên Các thành phần hóa học trong tinh dầu được phân tích chính xác nhờ phương pháp sắc ký khí ghép phối với máy đo GC-MS, giúp xác định rõ các hợp chất chính có trong tinh dầu Đồng thời, hoạt tính kháng khuẩn của các loại tinh dầu được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, cung cấp thông tin đáng tin cậy về khả năng tiêu diệt vi khuẩn của từng loại tinh dầu tự nhiên.
Nội dung 3: Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu bằng các phương pháp: DPPH và ATBS.
3.2 Thời gian và địa điểm
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Viện Kì thuât công nghệ cao - trường đại học Nguyễn Tất Thành.
Thời gian thực hiện nghiên cứu 6 tháng: từ tháng 1 năm 2020 đến tháng 6 năm 2020.
Các hóa chất sử dụng trong đề tài được liệt kê theo bảng dưới dây:
2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic axit) (ABTS)
6 Vitamin c 2.1' mục hóa chất sử dụng
Dụng cụ thí nghiệm được sử dụng trong đề tài này theo bảng sau đây:
Bảng 2.2: Danh mục dụng cụ thí nghiệm
STT Tên dụngcụ Loại Nhà sản xuất
1 Bình cầu đáy tròn 1000 ml, 029-32 Đức
2 Thiết bị sinh hàn 029-32 Đức
5 Ỏng đong thủy tinh 10 ml Án Độ
6 Giá đỡ 25 X 16 cm Trung Quốc
7 Kẹp sắt 17 cm Trung Quốc
8 Nút cao su 029-32 Trung Quốc
9 Dây dần nhựa Việt Nam
11 Đĩa petri thủy tinh 0 90 mm
12 ỏng ly tâm 5 ml, 50 ml
Giá đế eppendorf, giá đê ống nghiệm, bông gòn thấm và không thấm, đèn cồn, bật lửa,
Bảng 2.3: Danh mục các thiết bị thỉ nghiệm
STT Tên thiết bị Hãng Hình ảnh
Công ty cổ phần công nghệ Vinastar ±f
Tú an toàn sinh học cấp 2 Topair systems
(agilent technologies cary 60 uv-vis)
3.4 Phương pháp và bố trí thí nghiệm
3.4.1 Trích ly tinh dầu và phân tích thành phần hóa học tinh dầu
3.4.1.1 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Trong quá trình nghiên cứu, phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước được lựa chọn nhờ tính hiệu quả và độ chính xác cao trong việc tách tinh dầu từ nguyên liệu thô Phương pháp này dựa trên nguyên lý trích ly hệ rắn-lỏng, sử dụng pha lỏng để tách các thành phần cấu tử của pha rắn, chủ yếu là tinh dầu Quá trình bao gồm 3 bước chính: hòa tan nước trong nguyên liệu để giải phóng tinh dầu, hơi nước đi qua các mô, túi tinh dầu để hòa tan tinh dầu; hơi nước và tinh dầu sau đó ngưng tụ thành hai pha lỏng riêng biệt; cuối cùng, tinh dầu được chiết tách ra và bảo quản, có thể qua các bước tinh chế tùy theo yêu cầu sử dụng Phương pháp này mang lại hiệu quả cao trong việc thu hoạch tinh dầu nguyên chất.
Hình 2.3 mô tả hệ thống chiết tách tinh dầu bằng phương pháp chưng cất trực tiếp với nước gia nhiệt, giúp tối ưu quá trình thu hoạch tinh dầu hiệu quả Quy trình chiết tách tinh dầu Citrus sử dụng phương pháp gia nhiệt bếp lưới và vi sóng theo sơ đồ hình mang lại hiệu suất cao, giảm thời gian thực hiện và giữ nguyên chất lượng tinh dầu tự nhiên Phương pháp này phù hợp để nâng cao năng suất sản phẩm, đồng thời đảm bảo sự an toàn và tiết kiệm năng lượng trong quá trình sản xuất.
Hình 2.3: Quy trình tách chiêt tinh dâu Thuyết minh quy trình:
Quy trình chưng cất tinh dầu vỏ Bưởi, Cam Chanh bắt đầu bằng việc xử lý sơ bộ vỏ quả sau thu hoạch, loại bỏ bụi bẩn và nguyên liệu hỏng Tiếp theo, vỏ quả được xay nhuyễn với lượng phù hợp (100 g) rồi cho vào bình cầu Sau đó, thêm nước theo tỷ lệ phù hợp với từng thí nghiệm và tiến hành chưng cất tinh dầu qua hệ thống chuyên dụng.
Thiết bị chưng cất được gia nhiệt bằng bếp lưới và thời gian chưng cất bắt đầu tính từ khi xuất hiện giọt chất lỏng đầu tiên Sau quá trình tách chiết tinh dầu, hợp chất gồm nước và tinh dầu được thu gom qua thiết bị ngưng tụ Clevenger để tiến hành thu hồi tinh dầu Tinh dầu sau khi thu nhận thường chứa một ít nước, nên được làm khô bằng muối Na2SO4 để loại bỏ độ ẩm Cuối cùng, quá trình loại bỏ nước giúp thu được tinh dầu tinh khiết, đảm bảo chất lượng sản phẩm.
3.4.1.2 Phươngpháp sắc kí khí ghép phối phổ GC-MS
Sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) là phương pháp phân tích hiện đại có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và phân tích hợp chất Thiết bị GC/MS gồm hai phần chính: phần sắc ký khí (GC) để phân tích hỗn hợp các chất và xác định chất cần phân tích, cùng phần khối phổ (MS) để mô tả các hợp phần riêng lẻ dựa trên số khối của chúng Sự kết hợp giữa hai kỹ thuật này cho phép đánh giá, phân tích định tính và định lượng các thành phần hoá chất một cách chính xác, đồng thời giải quyết các vấn đề liên quan đến nhiều loại hóa chất Tại Viện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng, sau khi tinh dầu chưng cất ở điều kiện tối ưu, thành phần hoá học được phân tích bằng máy sắc ký ghép khối phổ GC-MS nhằm cung cấp dữ liệu chính xác và chi tiết về thành phần hoá học của tinh dầu.
Mục đích: Xác định thành phần hóa học của sản phẩm tinh dầu vỏ Bưởi, Cam, Chanh bằng phương pháp sắc kí khí khoi pho GC-MS.
Kết quả phân tích cho thấy thời gian lưu của các hợp chất trên GC phù hợp với thời gian lưu của các chất đã biết trong thư viện NIST Việc so sánh thời gian lưu này giúp xác định chính xác thành phần các cấu tử có trong tinh dầu Đồng thời, đối chiếu khối lượng thu được với dữ liệu trong thư viện NIST là bước quan trọng để định danh các hợp chất chính xác hơn Nhờ đó, quá trình phân tích và xác định các thành phần trong tinh dầu trở nên nhanh chóng và chính xác hơn.
3.4.2 Xác định tiềm năng kháng khuẩn của các loại tinh dầu
3.4.2.1 Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn được sử dụng bao gồm:
Escherichia coli ATCC 8739 Bacillus cercus 46
Salmonella enterica ATCC14028 Staphylococcus aureus ATCC 6538
- Các chủng vi khuẩn thường được tìm thấy ở người trong hệ tiêu hóa, hệ hô hấp, da,
Các chủng vi khuẩn là nguyên nhân chính gây ra các bệnh về đường ruột, ngộ độc thực phẩm, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng da và nhiễm trùng bệnh viện Một số chủng vi khuẩn kháng thuốc còn có khả năng gây ra các bệnh nặng như viêm màng não và viêm phổi ở người.
- Nguy cơ lây nhiễm cao thông qua nguồn nước, thực phấm, mỹ phẩm,
- Có khả năng phát triển thành các dạng kháng kháng sinh.
3.4.2.2 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch
Phương pháp khuếch tán đĩa thạch là kỹ thuật phổ biến dùng trong các thí nghiệm nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết dược liệu Phương pháp này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1990 bởi Perez, đã trở thành tiêu chuẩn trong các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết thảo dược.
Phương pháp dựa trên việc bơm màu thí nghiệm ở một nồng độ xác định vào giếng trên đĩa môi trường đã trải sẵn vi sinh vật để quan sát sự khuếch tán của dược liệu Trong quá trình ủ, vi sinh vật phát triển và dược liệu lan tỏa xung quanh giếng, tạo thành vòng kháng khuẩn nếu màu thí nghiệm có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật Phương pháp này giúp đánh giá khả năng kháng khuẩn của dược liệu một cách chính xác và hiệu quả.
Trong quá trình khảo sát, kích thước vòng kháng khuẩn chịu ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độ, thời gian và môi trường Để đảm bảo kết quả chính xác và khách quan, các yếu tố này cần được cố định, trong đó môi trường Mueller là yếu tố quan trọng cần kiểm soát chặt chẽ.
Hinton Agar (MHA), thời gian ủ 16-18h ở nhiệt độ 35 ± 2 °C, mật độ vi khuẩn 108
Mục đích của nghiên cứu là khảo sát khả năng kháng khuẩn của các loại tinh dầu chiết xuất từ vỏ bưởi, cam và chanh trồng tại đồng bằng sông Cửu Long Nghiên cứu nhằm làm cơ sở cho việc thu nhận, đánh giá và ứng dụng các loại tinh dầu này trong thực tế để tăng cường các giải pháp vệ sinh, kháng khuẩn tự nhiên Đây là bước quan trọng để phát triển các sản phẩm từ tinh dầu tự nhiên phù hợp với thị trường và nâng cao giá trị kinh tế của vùng đồng bằng sông Cửu Long.
Kết quả quan trọng được ghi nhận là đường kính vòng kháng khuẩn và vòng kháng khuẩn xuất hiện khi thử nghiệm với các nồng độ khác nhau, thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của chủng vi sinh vật thử nghiệm Đây là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá hiệu quả của tác nhân kiểm nghiệm trong quá trình thử nghiệm Kết quả này phản ánh rõ mức độ kháng cự của vi sinh vật đối với các nồng độ thử nghiệm khác nhau, giúp xác định khả năng kháng thuốc hoặc tác nhân tiêu diệt vi sinh vật của sản phẩm.
- Tất cả dụng cụ thí nghiệm và môi trường nuôi cấy được chuẩn bị và được hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 phút.
- Hoạt hóa dịch khuấn: Các chủng thử nghiệm được nuôi cấy lắc trong 5ml môi trường Mueller Hinton Broth (MHB) trong khoảng thời gian từ 18 - 20 giờ ở nhiệt độ 35 ±
2 °C Sau đó được hiệu chỉnh đến giá trị Me Farland 0.5 tương đương 1 - 2.108 bằng nước muối sinh lý NaCl 0.9%,
- Trãi đìa: 100 pl dịch canh khuẩn nồng độ 108 CFƯ/ml được bơm vào đĩa thạch MHA sau đó trãi khuấn đều lên bề mặt đĩa nuôi.
- Trong thí nghiệm này đường kính giếng được sử dụng là 6mm, ứng với 50 pl mẫu tinh dầu.
- Tinh dầu được sử dụng ở nồng độ 100%.
- Tetracylin nồng độ 0.25 mg/ml được sử dụng làm chứng dương.
- Mức độ hoạt động được ghi nhận trong bốn cấp độ theo đường kính trong (D (mm)) của vùng ức che, kết hợp đường kính của đĩa (6 mm):
> +2 (hoạt động vừa phải, 10 mm < D +2 (hoạt động vừa phải, 10 mm < D