Chính vì vậy đề tài này được đưa ra nhằm mục đích: - Sơ bộ hóa thực vật lá cây lá Đắng tại Việt Nam - Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa các phân đoạn thu được từ cao cồn tổng - Phân lập t
Trang 1CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
Tên đề tài:
SỔ hợp đồng: 2019.01.58
Chủ nhiệm đề tài: Ths Bùi Hoàng Minh Đơn vị công tác: Khoa Dược
Thời gian thực hiện: 04/2019-12/2019
TP Hồ Chí Minh, ngày thảng năm 20
Trang 2CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
Tên đe tài:
SỔ hợp đồng: 2019.01.58
Chủ nhiệm đề tài: Ths Bùi Hoàng Minh
Đơn vị công tác: Khoa Dược
Thời gian thực hiện: 04/2019-12/2019
Trang 3MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHŨ VIẾT TẮT ỉv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH V
DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU vi •
TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN củu vii
MỞ ĐẦU 1
1 TÓNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1 1 Họ Asteraceae 2
1.1 2 Chi Vernonia 3
1.1 3 Loài Vernonia amygdalina Delile 4
1.2 Tồng quan về thành phần hóa học 6
1.3 Tác dụng dược lý 8
1.3.1 Khả năng chống oxy hóa 8
1.3.2 Điều trị viêm gan 8
1.3.3 Hạ đường huyết 8
1.3.4 Điều trị sốt rét 9
1.3.5 Khả năng kháng khuấn 9
1.3.6 Khả năng kháng nấm 9
1.4 Công dụng trong y học cổ truyền 9
2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 11
2.1 Đối tượng nghiên cứu 11
2.1.1 Nguyên liệu 11
2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị 11
Trang 42.1.3 Dung môi hóa chất 12
2.2 Phương pháp nghiên cứu 12
2.2.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật trong lá Vernonia amygdalina 12
2.2.2 Chiết xuất, phân lập và tinh chế 12
2.2.3 Xác định cấu trúc chất phân lập được 13
2.2.4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 13
3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16
3.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật 16
3.2 Nghiên cửu hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa 16
3.2.1 Chiêtxuất 16
3.2.2 Đánh giá các phân đoạn hướng chống oxy hóa 17
3.2.3 Phân đoạn Eto Ac 17
3.2.4 Phân đoạn 8 21
3.3 Phân lập và kiểm tra độ tinh khiết 22
3.3.1 Phân lập V] từ phân đoạn 9 22
3.3.2 Phân lập v 2 từ phân đoạn 5 23
3.3.3 Phân lập V3 từ phân đoạn 8.2 24
3.4 Xác định cấu trúc các chất phân lập được 24
3.4.1 ChấtVi 24
3.4.2 ChấtV2 28
3.4.3 Chấtv3 30
3.5 Xác định hoạt tính chống oxy hóa các chất phân lập được 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PL.l
Trang 5Dữ liệu phổ 13C-NMR (DMSO-dó) PL.2
Dữ liệu phổ 1H-NMR của VI (DMSO-d6) PL.2
Dữ liệu phổ HSQC của VI PL.3
Dữ liệu phổ HMBC của VI PL.3
Dữ liệu phổ 13C-NMR (DMSO-d6) của V2 PL.4
Dữ liệu phổ 1H-NMR (DMSO-dó) của V2 PL.4
Dữ liệu phổ HSQC của V2 PL.5
Dữ liệu phổ 13C-NMR (DMSO-í/6> của v3 PL.6
Dữ liệu phổ ‘H-NMR (DMSO-dó) của v3 PL.6
Dữ liệu phổ HSQC của v3 PL.7
Dữ liệu phổ HMBC của v3 PL.7
Dữ liệu các thử nghiệm sinh học PL.8
Trang 6DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẤT
Chloroform Collerated Spectroscopy - (phô) tương quan 1H-1H Công thức phân tử
doublet Dimethyl sufoxit 2,2-diphenyl- 1 -picrylhydrazyl Ethyl Acetat
Ethanol Acid Formic Hetemonuclear Multiple Bond Correlation Eletemonuclear Single Bond Correlation Hoạt tính chống oxy hóa
Sac ký lóp mỏng Mass spectrometry - khối phổ Nuclear Magnetic Resonance- Cộng hưởng từ hạt nhân Phân tử khối
Trang 7DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Hình thái loài Vernonia amygdalỉna Del 5
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học một so saponin trong v.amygdaỉina 6
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học một số sesquiterpen lacton trong v.amygdalina 7
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học cùa một so Flavonoid trong v.amygdalina 7
Hình 3.1 Ket quả chiết xuất lá V amygdalina Del 16
Hình 3.2 Ket quả hoạt tính chống OXH trên mô hình DPPH trên các phân đoạn 17
Hình 3.3 Hệ phân tích phân đoạn EtOAc 18
Hình 3.4 Sắc ký đồ các phân đoạn thu đuợc từ sắc ký cột cổ điển phân đoạn EtOAc 20
Hình 3.5 Ket quả đánh giá hoạt tính chống OXH từ các phân đoạn từ cột sắc ký phân đoạn EtOAc 20
Hình 3.6 Sắc ký đồ hệ dung môi phân tích phân đoạn 8 21
Hình 3.7 Sắc ký đồ các phân đoạn thu đuợc từ sắc ký cột co dien phân đoạn 8 22
Hình 3.8 Ket quả kiêm tra độ tinh khiết của V1 trên 3 hệ dung môi khác nhau 23
Hình 3.9 Ket quả kiếm tra độ tinh khiết của V2 trên 3 hệ dung môi khác nhau 23
Hình 3.10 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết cùa V3 trên 3 hệ dung môi khác nhau 24
Hình 3.11 Cấu trúc hóa học và nhũng tuơng tác hóa học trong V1 27
Hình 3.12 Cấu trúc hóa học và những tương tác chính trong pho HMBC cùa V2 29
Hình 3.13 Cấu trúc và một số tương tác trên pho cùa V3 32
Trang 8DANH MỤC CÁC BẢNG BIÉU
Bảng 3.1 Bảng kết quả khảo sát hóa thực vật vỏ thân cây lá Đắng 16
Bảng 3.2 Ket quả đương lượng acid galic của các phân đoạn 17
Bảng 3.3 Ket quả thu được từ sắc ký cột quá tải phân đoạn EtOAc 19
Bảng 3.4 Bảng dữ liệu phổ NMR của V1 25
Bảng 3.5 Bảng so sánh dừ liệu phổ NMR cùa V] và Cynarosid 27
Bảng 3.6 Bảng số liệu phổ NMR của V2 28
Bảng 3.7 Bảng so sánh dừ liệu NMR của V2 và Luteolin 29
Bảng 3.8 Bảng số liệu phổ NMR của V3 30
Bảng 3.9 Ket quả so sánh dừ liệu pho NMR của V3 và Cosmosiin 32
Bảng 3.10 Ket quả hoạt tính chống OXH cùa các hợp chất phân lập được 33
Trang 9TÓM TẤT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu
1 So bộ hóa thực vật lá cây lá Đắng Sơ bộ thành phẩn gồm: nhiều
alkaloid, caroten, saponin; ngoài ra còn có các polyphenol, triterpen và
có thể có flavonoid
2 Chiết xuất và sàng lọc tác dụng
chong oxy hóa
Phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa tốt nhất: EtOAc
3 Phân lập, xác định cấu trúc 3 flavonoid: 300 mg V1 (Cynarosid),
30 mg V2 (Luteolin) và 41,3 mg V3 (Cosmosiin)
4 Xác định giá trị IC50 Cả 3 chất đều có hoạt tính chồng oxy
hóa tốt, đặc biệt V1 và V2 có tác dụng dọn gốc tự do DPPH mạnh hơn cả chứng dương Rutin (ICso= 9,47 pM) với IC50 lần lượt là 5,8 pM và 4,8 pM
1 Phân lập và xác định cấu trúc 3
chất có hoạt tính chống oxy hóa
Phân lập và xác định cấu trúc 2 chất
có hoạt tính chống oxy hóa
2 Bài báo đăng trên tạp chí khoa
học công nghệ NTT
Bài báo đăng trên tạp chí khoa học công nghệ NTT
Thời gian thực hiện: 9 tháng (04/2019 - 12/2019)
Thời gian nộp cuốn báo cáo: 12/2019
Trang 10amygdalina Delile là loài được sử dụng nhiều nhất, với đặc tính dễ thích nghi và phát trien nhanh Một số quốc gia ở Châu Phi sử dụng lá loài cây như một nguyên liệu chế biến thức ăn, dùng rễ làm rượu thuốc Không chỉ dừng lại với công dụng là thực phẩm mà nó còn góp một phần không nhỏ trong việc phòng và chừa bệnh Có rất nhiều công trinh nghiên cứu đã chứng minh được các tác dụng dược lý có giá trị của v.amygdalina như trị sốt rét, giúp hạ đường huyết đặc biệt là chống oxy hóa, bảo vệ gan và độc tế bào Điều đáng mừng là trong thời gian
và được biết đến với tên gọi là cây Lá Đắng - với nhiều tác dụng chừa bệnh và dễ dàng sử dụng bằng cách uống như trà Mặc dù đà có rất nhiều bài nghiên cứu về v.amygdalina trên thế giới nhưng ở Việt Nam hiện nay vần chưa có nhiều nghiên cứu định hướng phân lập thành phần hóa học có khả năng chống oxy hóa của loài cây này Với khả năng thích nghi và phát triển tốt, nếu như được đầu tư, đào sâu nghiên cứu, tin rằng Lá Đắng sè là cây thuốc có ích trong công cuộc chăm sóc sức khỏe cho người dân cũng như tìm ra những cấu trúc mới có hoạt tính Chính vì vậy đề tài này được đưa ra nhằm mục đích:
- Sơ bộ hóa thực vật lá cây lá Đắng tại Việt Nam
- Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa các phân đoạn thu được từ cao cồn tổng
- Phân lập thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính các chất phân lập được
Trang 111 TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan thực vật học
1.1.1 Họ Asteraceae
Dạng sống: cỏ, sống một năm hay nhiều năm Thân gồ, cây bụi hay dây leo hiếm gặp Rễ:
có the phù lên thành củ, nhưng chất dự trữ ở đây không phải là tinh bột mà là inullin (Thược dược) Lá: Hình dạng biến thiên, không có lá kèm, thường mọc đối hoặc tụ thành hình hoa ở gốc, có nhừng loại lá có gai Thông thường phiến là nguyên, xẻ sâu; lá kép hình lông chim hay hình chân vịt hiếm gặp Cụm hoa: đầu, có thể mang rất nhiều hoa hay ít hoa Đầu có thể đứng riêng lẻ hay tụ thành chùm, gié, xim, nhưng thông thường nhất là tụ thành ngừ Có the xem hoa tự đầu như một gié thu ngắn, trong đó các hoa đính theo một đường xoắn ốc liên tục, hoa già ở bìa, hoa non ở giữa Dạng thông thường cùa hoa tự đầu là hình nón, nhưng cũng có thể phăng hoặc có khi lõm hình chén Đầu mang hai loại lá bắc: Lá bắc ngoài bất thụ, tạo thành một tổng bao Các lá bắc này có the dính thành một hàng (Senecio, Tagetes) hoặc đính trên nhiều hàng kết lợp Hình dạng và kích thước của lá bắc ngoài rất biến thiên Lá bắc thật có mang hoa ở nách Chúng là những phiến mỏng hẹp, đôi khi có lông Lá bắc thật có thể phẳng hay cong xung quanh hoa; chúng có thể không có Hoa: lường tính, mầu 5, bầu dưới, không
có lá bắc con Hoa thức theo kiểu:
* ị K(5)C(5)A5G(2)Các hoa trên một đầu có thể giống nhau, có cùng cách cấu tạo, cùng chức năng Kiểu đầu này
đôi khi toàn hoa hình môi Hoa tự đầu có thể gồm hai loại hoa: Hoa đều hình ống ở giữa có nhiệm vụ sinh sản và hoa không đều hình lưỡi nhỏ có ba răng ở bìa, đóng vai trò của tràng đe thu hút côn trùng Kiểu này gọi là dị giao Bao hoa: Lá đài thường giảm vì nhiệm vụ bảo vệ
đã được đảm nhiệm bởi các là bắc của tong bao Đài có thể biến mất, đôi khi chỉ còn một gò nhỏ, nguyên hay có thùy; gờ có thể mang nhừng vấy hay một vòng lông tơ Sau khi thụ tinh, đài có thể phát triển thành một mào lông, có thể láng hay có gai, có nhiệm vụ trong sự phát tán của quả Tràng do cánh hoa dính, có the đều hình ống (trường hợp hoa giữa cùa các đầu dị giao) hoặc không đều có dạng lưỡi nhỏ có 3 răng hay 5 răng hoặc hình môi 2/3 hoặc hình ống dài hơi cong Bộ nhị: 5 nhị bằng nhau, đính trên ống tràng và xen kẽ với cánh hoa Chỉ nhị rời nhau trừ tông Cynareae Bao phấn mở dọc, hướng trong, dính nhau thành một ống bao quanh
Trang 12những phụ bộ choãi ra tạo thành những tai nhỏ, che chở cho mật hoa ở gốc vòi khỏi bị nước mưa Bộ nhụy: 2 lá noãn ở vị trí trước-sau, tạo thành bầu dưới 1 ô, đựng 1 noãn, đính đáy Đìa mật ở trên bầu ớ hoa lưỡng tính và hoa cái, vòi xuyên qua đĩa mật và chia thành 2 nhánh đầu nhụy (vòi không chia nhánh ở hoa bất thụ) Các nhánh đầu nhụy mang ở mặt dưới những lông để quét hạt phấn khi vòi mọc xuyên qua ống cấu tạo bởi các bao phấn Sự thụ phấn nhờ côn trùng Quả: bế, thường mang một mào lông do đài biến đoi, có khi nào lông được mang bởi một cuống dài hay ngắn Đôi khi quả trần hoặc có móc hay có gai Hạt: không có nội nhũ;
lá mầm to, nhiều khi chứa đầy dầu (hạt Hướng dương)
ớ Việt Nam, Asteraceae có khoảng 125 chi và trên 350 loài [4].
1.1.2 Chi Vernonia
Dạng sống: cỏ, cây bụi hay cây gồ đôi khi là dạng dây leo sống một năm hay lâu năm Lá:
Lá mọc cách, hiếm khi mọc đối, có thể có cuống lá hoặc không nhưng thường khó xác định;
lá nguyên hay có răng cưa, gân lá hình lông chim Bao hoa: tổng bao phía trên có hình bát thu hẹp dần thành hình trụ, gồm nhiều lá bắc lợp lại với nhau, gom 6 hàng, lá bắc ở ngoài ngắn, phía trong hay rụng sớm Đe hoa phang hay có gờ nhỏ, thường nhằn hoặc có lông tơ ngắn
Hoa: Cụm hoa tạo thành chùy hay các ngừ ở ngọn hoặc nách lá, hoặc là cụm hoa đơn Hoa có màu hồng, tía, hiếm khi màu trắng; cụm hoa có từ (1 -)3- 100+ hoa đơn, hình ống nhỏ, lá đài thường hình chuông hay hình phễu, có 5 thùy Bao phấn có hình mác Quả: Quả bế hình trụ hay hình nón ngược, thường có 7-10 gờ nổi rõ, ít khi là 4-5, có tuyến, giữa các gờ thường có hoặc không có lông ngắn Mào lông hai lớp, lớp ngoài là những lông ngắn, đôi khi tiêu biến, lớp trong có nhiều lông tơ hình lông chim, có gai, rụng hoặc tồn tại, thường có màu [23].
Các loài trong chi Vernonia phân bố rộng rãi ở nhiều nơi với nhiều loại hình điều kiện sinh thái khác nhau: rừng nhiệt đới, đầm lầy, các khu vực ẩm ướt, hoang mạc hay sa mạc thậm chí
là những khu vực hàn đới ở Bắc Mỳ [22] Tại Việt Nam có khoảng 28 loài, trong đó có một
số loài được sử dụng làm thuốc [3], [5].
- Bạch đầu ông, Bạch đầu tro, Dạ hương ngưu ( Vernonia cinerea (L.) Less.)
- Bạch đầu sát trùng, Ban cưu cúc sát trùng (Vernonia anthelminthica (L.) Willd)
- Bông bạc, bạch đầu đại mộc {Vernonia arborea Buch.-Ham vax.javanica El.)
Trang 13- Dây chè, Rau ráu, đỏ ngọn (Vernonia cumingiana Benth Var andersoni C.B.Clarke)
- Bạch đầu bao gai, Bạch đầu cứng (Vernonia squarrosa (D.Don) Less Var teres Wall.
Ex DC.)
- Bạch đầu lá liều (Vernonia saligna (Wall.) D.C)
- Bạch đầu lông (Vernonia parishiỉ Hook f.)
- Bạch đầu nhám (Vernonia aspera Buch - Ham.)
- Bạch đầu nhỏ, Cúc bạc đầu ( Vernonia patula (Dryand.) Merr.)
- Bạch đầu rau, Ban cưu cúc ( Vernonia esculenta Hemsl.)
- Bạch đầu Spire ( Vernonia spirei Gandog.)
- Dây dọi tên, bạch đầu bầu dục (Vernonia elliptica DC var elaeagnifolia DC.)
- Cúc bung, Bạch đầu to (Vernonia macrachaenia Gag-nep.)
- Cúc lá cà, Cúc hồng leo (Vernonia solanifolia Benth.)
1.1.3 Loài Vernonia amygdalina Delile.
Tên khoa học: Vernonia amygdalin a Delile
Tên đồng nghĩa: Gymnanthemum amygdalinum (Delile) Sch Bip ex Walp [11].
Tên thường gọi: cây Mật gấu, Lá đắng
Tên nước ngoài: African bitter leaf [11], bitter leaf [ 16], [20].
Trang 14và kích thước đa dạng, lá hình mũi mác hay hình trứng có kích thước khoảng 3-17 X 1,3-7 cm, đỉnh lá nhọn, mép lá có hình răng cưa, mặt trên nhẵn, mặt dưới nhạt màu hơn và có gân lá nổi rõ; có cuống hoặc không có, cuống lá dài 1-4 cm Hoa: Cụm hoa dạng ngù ở đầu cành, cuống ngắn, có nhiều lá bắc con dài 0,1-0,2 cm, có mùi thơm [2], [11] Mồi cụm hoa có 11-35 hoa, hình chuông rộng 0.2-0.5 cm, cuống dài 0.2-0.5 cm, màu trắng kem Tổng bao mang 25-30 lá bắc, xếp thành 4-5 hàng, hình trứng hay hình chừ nhật, dài 0,4-0,6 cm, màu xanh đậm ở đỉnh, vòng trong dài hơn vòng ngoài Tràng hoa màu trắng, thu hẹp dần ve phía dưới Bộ nhị: dài 4,5-5cm, gồm 5 chỉ nhị, dài 1 l-14,5mm; bao phấn dính nhau thành ống dài 3-4mm, hình trứng, kích thước 2-2,5 X 0,5-0,9mm Bộ nhụy: Vòi nhụy dài 8-9 5mm, mang 2 đầu nhụy Quả: Quả
bế hình trứng thuôn dài 3-4 X 0,5-1 mm, có 10 gân, túm lông với những sợi lông cứng mọc loe
ở đầu [2] Quả và hoa ra vào tháng 12 và tháng 3 năm sau [11].
Hình 1.1 Hình thái loài Vernonia aniygdalinaDel.
1.1.3.3 Sinh thải và phân bổ
Vernonia amygdaỉina Delile có nguồn gốc từ Châu Phi, được trồng pho biến ở một số nước như Yemen, Ethiopia, Nam Uganda, Kenya và Tanxania, Brazil; một số nơi ở Châu Á: phía đông Án Độ, Trung Quốc, Malaysia, [11], [24] V amygdalina Del di thực vào Việt Nam trong vài năm gần đây, với khả năng thích nghi tốt trong nhiều điều kiện khí hậu khác nhau đã được trồng phổ biến trên nước ta, đặc biệt là các tỉnh miền Nam [2].
Thường là lá, được thu hái và sử dụng quanh năm bằng cách dùng tươi hay phơi khô hãm như trà Bên cạnh đó còn được dùng làm thức ăn cũng như được sử dụng trong việc làm thuốc
Trang 15[14], [22] Rễ cây được dùng làm que ngậm giúp làm sạch răng miệng, làm thức uống như rượu, có tác dụng trên các bệnh về dạ dày ruột [8].
1.2 Tổng quan về thành phần hóa học
R amygdalina là loài được nghiên cứu nhiều nhất trong chi Vernonia, các nhà nghiên cứu đã phân lập được trong V amygdalỉna có chứa các nhóm họp chất chính có tác dụng dược lý như: Saponin, Sesquiterpen lacton, Flavonoid Ngoài ra trong cây còn chứa một lượng đáng kể các yếu tố vi lượng, khoáng chất cũng như các acid amin cần thiết cho cơ thể [16], [22].
Các Saponin trong Vernonia amygdalina Del thuộc nhóm Stigmastan như: Vemoniosid Al, A2, A3, A4, B2, B3, c, D, E Trong đó các Vemoniosid A và aglycon của nó làm cho cây có
Vernoniosid D
Oglc Ogle Oglc Oglc Oglc
Vernoniosid A|
Vemoniosid A2 Vemoniosid A3 Vemoniosid B|
Vernoniosid B3
H H H
OH H
B-OH, H a-OH, H
o
H, H a-OAc H
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học một số saponin trong v.amygdalina
Trang 16Hầu hết loài trong chi Vernonia nói chung và trong Venonia amygdalia Del nói riêng đều chứa một luợng lớn các Sesquiterpen lacton; những họp chất này đã được chứng minh có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn, trị côn trùng, chống lại độc tế bào [13], [11]; các nhà khoa học đã phân lập ra một số chất: Vemolid, vemodalol, vernolepin, vemodalin và hydroxyvemolid [13], [16].
Vemodalin Hydroxyvernolid
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học một số sesquiterpen lacton trong v.amygdalina
Bên cạnh đó, còn có sự hiện diện của các flavonoid nhóm flavon như Luteolin và các dần xuất glycosid của nó: luteolin 7-0- (3 - glucoronisid, luteolin 7-0- p - glucoside; trong đó luteolin 7-0- p - glucoronisid chiếm nhiều nhất [16], [15].
Luteolin Luteolin 1-0- p-glucosid Luteolin7-ơ-P-glucoronisid
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học ciia một số Flavonoid trong v.amygdalina
Trang 171.3 Tác dụng dược lý
Chi Vernonia có rất nhiều loài được dùng làm thuốc đặc biệt là ở các quốc gia Châu Phi, trong
đó loài Vernonia amygdalina là một trong năm loài hay được sử dụng nhất [22]; theo thống
kê của N.J.Toyang và R.Verpoorte đăng trên tạp chí Joural of Ethnopharmacology và các nghiên cứu khác, Vernonia amygdalina Del được dùng trong điều trị một số bệnh: sốt rét, tiêu chảy, viêm gan, bệnh trì, đái tháo đường, kháng khuẩn, kháng nấm [16], [22], [11].
1.3.1 Khả năng chống oxy hóa
Trong một thử nghiệm so sánh về khả năng chống oxy hóa của dịch chiết ethanol và nước từ
rằng, dịch chiết ethanol có phần trăm chống hoạt tính oxy hóa cao hon BHA 90,23% và 88,23%
ở nồng đồ 0,8mg/ml Trong khi dịch chiết nước và BHT đạt %HTCO tối đa là 73,93% và 68,66% ở nồng độ 2,0mg/ml Từ kết quả nghiên cứu cho thấy rằng dịch chiết ethanol và nước
từ lá của loài v.amygdalina có tiềm năng thay thế cho những chất chống oxy hóa như BHT, BHA, nhưng chất gây độc tính hoặc ung thư trên người [18].
Một nghiên cứu khác bằng dịch chiết nước nóng và lạnh của lá V amygdalina Del đã sử dụng phương pháp đánh bắt gốc tự do với thuốc thử là DPPH và đo độ hấp thu của mầu ở bước song
517 nm Ket quả nghiên cứu cho thấy rằng dịch chiết nước nóng và lạnh của lá v.amygdalina
ở nồng độ 0,2 mg/ml có phần trăm hoạt tính chống oxy hóa lần lượt là 26,4% và 36,2% [12]
1.3.2 Điều trị viêm gan
Một trong những vấn đề phổ biến nhất trên thế giới là các bệnh về gan, hầu như các thuốc được dùng trong điều trị đôi khi sè gây những tác dụng phụ nghiêm trọng Vì vậy cần tìm ra những thuốc thay khác phục vụ cho việc điều trị Trong một thử nghiệm về khả năng bảo vệ gan của V amygdalina từ Arhoghro, E M và các cộng sự vào năm 2009 cho thấy rằng dịch chiết nước từ lá loài cây này cho hiệu quả phục hồi đáng kể các chỉ số của gan Các nhà nghiên cứu đã thử nghiệm đồng thời trên 6 nhóm chuột, trong đó có 3 nhóm được gây bệnh viêm gan cấp bằng CCh và được điều trị bằng 5%, 10%, 15% dịch chiết nước V amygdaỉina', sau khoảng thời gian 7, 14, 21 ngày, sau đó đo các chỉ so ALT, AST, ALP nhận thấy những chỉ số này giảm đáng kể khi phụ thuộc vào liều và thời gian [9].
1.3.3 Hạ đường huyết
Thử nghiệm của Atangwho và cộng sự vào năm 2007 với mô hình thử nghiệm trên in vivo
Trang 18nghiệm được chữa trị bằng dịch chiết EtOH từ lá V amygdalina với nồng độ 400 mg/kg, cuộc thử nghiệm diễn ra trong 14 ngày Ket quả cho thấy rằng các nhóm sinh lý, bệnh lý, nhóm thử nghiệm có giá trị glucose trong máu lần lượt: 73,51 + 18,98 mg/dL; 247,25+4,83 mg/dL; 144,14+25,83mg/dL Từ kết quả thử nghiệm có thể chỉ ra rằng dịch chiết từ lá của loài này cũng cho tác dụng hạ đường huyết trên chuột [10], [16].
1.3.4 Điều trị sốt rét
Sot rét - một trong những căn bệnh khiến nhiều người tử vong nhất trên thế giới đặc biệt là trẻ
em, thêm vào đó nhừng loại thuốc được sử dụng để chừa trị đang dần bị đề kháng [12] Nhằm tìm một thuốc thay thế, các nhà nghiên cứu đã dùng dịch chiết EtOH và nước từ lá của loài V
amygdalina trên các thử nhiệm in vivo cũng như invitro đối với loài Plasmodium berghei Ket quả thử nghiệm trên in vivo cho thấy rằng: dịch chiết nước có khả năng diệt giao bào cái đến
50%; trên in vitro, dịch EtOH còn ức chế gần như hoàn toàn (>90%) quá trình tạo thoa trùng trong in vitro với nồng độ 50 pg/ml [7].
1.3.5 Khả năng kháng khuẩn
Hai sesquiterpen lacton: vemolid, vemodalol được phân lập từ loài v.amygdalina có khả năng chống lại các vi khuẩn gram dương, đặc biệt là Micrococcus kristinae với giá trị MIC 0,25 mg/ml; cả hai hoạt chất trên đều không tác động lên các vi khuẩn gram âm ngoại trừ Salmonella pooni với MIC 0,5 mg/ml [13], [16].
1.3.6 Khả năng kháng nấm
Các Sesquiterpen lactons được chứng minh có khả năng kháng nấm mạnh, trong nghiên cứu của p Erasto và cộng sự đã cho thấy Vemolid có ức chế mạnh Peniciỉlium notation và
Aspergillus flavus với giá trị LCso 0,2 và 0,3mg/ml hay Aspergillus niger và Mucor hỉemalis
là 0,4 mg/ml; vemonalol có tính kháng nấm kém hơn so với vemolid, tuy nhiên cũng có tác dụng đáng kê trên Aspergillus flavus, Penicillỉum notation và Aspergillus niger với giá trị LC50 lần lượt 0,3; 0,4 và 0,5 mg/ml [13], [16].
1.4 Công dụng trong y học cổ truyền
ở Nigeria, lá của loài K amygdalina được sử dụng như một loại rau xanh hoặc được dung như một gia vị trong các món ăn, đặc biệt là món soup Lá đắng Sau khi thu hoạch, có thể loại bỏ
vị đắng bằng cách ngâm dầm với nước nóng hay lạnh, dịch chiết nước có the dùng làm thuốc
Trang 19bổ tiêu hóa và giúp ngăn ngừa một số bệnh tật Một bộ phận phụ nữ người Hausas dùng lá loài cây này đế giúp tăng thêm sự quyến rũ.
Ớ Ethiopia được sử dụng để ủ bia Bộ phận lá được sử dụng pho biến trong điều trị sốt; loài cây này còn được biết đến như một chất thay thế Quinin ở Nigeria và một so nước châu Phi khác Lá non được sử dụng trong y học dân gian như thuốc chống trầm cảm, thuốc chống sốt rét, thuốc nhuận tràng, thuốc xổ, thuốc long đờm, thuốc làm tăng co thắt tử cung và tăng khả năng thụ thai ở phụ nữ vô sinh.
Nhiều bác sĩ đông y đã đề nghị sử dụng dịch chiết nước cùa loại cây này cho bệnh nhân để điều trị các chứng bệnh: mệt mỏi, buồn nôn, tiểu đường, ăn mất ngon do ăn kiêng, kiết lị và các vấn đề đường tiêu hóa khác [14].
Trang 202 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu •
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu
Lá cây Lá Đắng được thu hái tại thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 01/2019.
Mầu lá tươi được thu hái tự nhiên, sau đó loại bỏ các lá hư hại, rửa sạch và sấy ở nhiệt độ 60°C Mầu sau sấy được xay nhở thành bột có kích cỡ phù hợp với từng thí nghiệm.
2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị
- Các dụng cụ thường quy trong phòng thí nghiệm
- Bep cách thủy Memmert (Đức)
- Đèn uv Spectroline Model CM-10A (Mỹ)
- Cân phân tích Sartorius (Đức)
- Cân kỳ thuật Electronic Scale G&G
- Tủ sấy Memmert (Đức)
- Máy quang phố tử ngoại UV- Vis 1800 Shimadzu (Nhật)
- Máy siêu âm Hwashin Technology Power sonic 410 (Hàn Quốc)
- Máy xác định hàm ẩm Ohaus Model MB45 (Mỹ)
- Máy cô quay Heidolph Hei-VAP Advantage (Đức)
- Kính hien vi Primo star Zeiss (Đức), Olympus CX221ed( Nhật)
- Silicagel Trung Quốc, cỡ hạt trung bình (40-63 pm) và silicagel Merck, cờ hạt mịn (15-40 pm).
- Sắc ký lớp mỏng pha thuận dùng bản silicagel F254 tráng sẵn trên đế nhôm (Merck).
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters 2695-2996, Detecter PDA Waters 2996.
- Máy đông khô
Trang 212.1.3 Dung môi hóa chất
- Dung môi: Ethanol, Chroloform, Ether, Methanol (Merck),
- Các loại thuốc thử: Fehling, Mayer, Hager, Dragendorff, Bouchardat, Bertrand, DPPH (2,2-diphenyl-1 -picrylhydrazyl)
- Hóa chất: NH4OH, HC1, H2SO4, KOH, Mg, CaSO4 khan, Na 2SO4,
- DMSO PROLABO ( Pháp)
- Folin-Ciocalteu (Sigma), acid gallic (Sigma)
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật trong lá Vernonia amygdalina
Bằng các dụng cụ thường quy và các phản ứng định tính đơn giản để sơ bộ xác định sự có mặt của nhóm hợp chất có trong dược liệu ở các phân đoạn có độ phân cực tăng dần bằng phương pháp của Ciulei đã được cải tiến bởi Đại học Y Dược Tp.HCM [6].
2.2.2 Chiết xuất, phân lập và tinh chế
Sử dụng phương pháp ngấm kiệt với cồn 96% sau đó cô thu hoi dưới áp suất giảm thu được cao cồn Cao con được phân tán trong nước sau đó lắc phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần (PE, CHCI3, EtOAc), cô thu hồi dung môi thu được các phân đoạn có độ phân cực khác nhau
Chất phân lập được sắc ký trên 3 bản mỏng với 3 hệ dung môi khác nhau Chất cần xác định
độ tinh khiết được phát hiện trên ƯV 254 nm, uv 365 nm và hiện màu với thuốc thử thích hợp Chất được xem là tinh khiết khi chỉ cho 1 vết gọn với Rf trong khoảng từ 0,25 - 0,75.
Trang 222.2.3 Xác định cấu trúc chất phân lập được
Các chất phân lập được xác định cấu trúc dựa trên các dừ liệu phổ ƯV, MS và NMR, kết hợp với các dừ liệu trong tài liệu tham khảo Trong đó:
- Phổ MS được dùng để xác định PTK.
- Phổ NMR được đo với các kỳ thuật 1-D, 2-D (1H-, 13C-, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY) Mầu được hòa tan trong dung môi thích hợp như CDCỈ3, MeOD, DMSO-í/ó với chất chuẩn nội là TMS (tetramethylsilan); thực hiện trên máy ADVANCE 500 (Broker) tại phòng cấu trúc, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội Độ dời hóa học tính theo thang ô (ppni) với Ôtms = 0,00.
2.2.4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
Dựa trên sự khử của tungstat/molybdat trong thuốc thử Folin - Ciocalteu bởi hợp chat phenol trong môi trường kiềm tạo ra sản phàm có màu xanh dương, đo độ hấp thu ở bước sóng cực đại cùa sản phẩm thu được Cường độ của màu tỷ lệ với nồng độ polyphenol bị oxy hóa, từ đó xác định được hàm lượng polyphenol có trong mẫu
Cách tiến hành
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg acid gallic chuẩn vào bình định mức 100 ml, thêm cồn 70% để hòa tan và vừa đủ đến vạch Hút chính xác 5ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm cồn 70% vừa đủ, lắc đều (dung dịch chuẩn có nồng độ pyrogallol 0,05 mg/ml).
Xây dựng đường chuẩn: Hút chính xác lần lượt 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5ml dung dịch chuẩn vào các bình định mức 25 ml riêng biệt, thêm lần lượt 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1 ml, 0 ml con 70% vào mồi bình tương ứng Sau đó thêm vào mồi bình 1 ml thuốc thử Folin - Ciocalteu và 7ml nước Thêm dung dịch Na2CƠ3 29% đến vạch, lắc đều Ly tâm 5 phút, tốc độ 5000 rpm để lắng các tinh thề Na2CƠ3 29% Hút 2 ml dịch trong các dung dịch vào cốc đo quang Đo độ hấp thu của các dung dịch ở 760 nm Chuẩn bị song song 1 mầu trắng.
Dung dịch thử: Cân 5 mg cao, hòa tan bằng cồn 70% và chuyển vào bình định mức 50 ml, thêm cồn 70% vừa đủ Hút chính xác 5 ml dịch thử vào bình định mức 25 ml, 1 ml thuốc thử,
7 ml nước, và thêm dung dịch Na2CƠ3 29% đến vạch, lắc đều Ly tâm 5 phút, tốc độ 5000 rpm
để lắng các tinh thế Na2CƠ3 29% Hút 2 ml dịch trong vào cốc đo quang Đo độ hấp thu của các dung dịch ở 760 nm Thực hiện đo mẫu 3 lần.
Trang 23Nồng độ polyphenol được tính toán dựa theo đường chuẩn pyrogallol thu được Kết quả được thể hiện bởi đơn vị mg acid gallic/g cao.
2.2.4.2 Phương pháp DPPH
Được tiến hành trên bản mỏng và sử dụng phương pháp đo quang đế xây dựng đường tuyến tính, từ đó xác định IC50.
DPPH là gốc tự do có màu tím, có cực đại hấp thu 517 nm, khi gặp tác nhân chống oxy hóa sẽ
bị khử chuyến từ màu tím sang vàng và giảm độ hấp thu ở bước sóng 517 nm.
Thuốc thử DPPH pha trong MeOH với nồng độ 1 mg/ml.
Mầu thử được pha trong MeOH đe có dung dịch mẹ với nồng độ 1 mg/ml, sau đó được pha loãng trong MeOH đe thu được dãy nồng độ giảm dần (0,25; 0,1; 0,05; 0,025 mg/ml ) đe dùng trong thử nghiệm.
Chấm lên bản mỏng silica gel F254 các mẫu thử với the tích mồi mầu chính xác 5 pl bằng mao quản có khắc vạch Sau đó nhúng với thuốc thử DPPH 1 mg/ml, đê trong tối 5 phút và ghi nhận kết quả Mầu thử có khả năng ức chế DPPH khi các vết chuyển từ màu tím sang vàng, nong độ ức chế càng loãng và sự mất màu tím càng rõ thì hoạt tính càng mạnh.
- Khảo sát dung môi: Tiến hành khảo sát mẫu thử với dung môi MeOH Neu cắn không tan hoàn toàn thì sử dụng thêm DMSO ở các nồng độ khác nhau, xác định nồng độ dung môi giúp hòa tan tối đa các mầu thử.
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa
• Mầu trắng: dung dịch MeOH + DMSO
• Chứng âm: MeOH + DMSO + DPPH
• Mầu khảo sát: MeOH + DMSO + DPPH + mầu thử
- Cách tiến hành: Trộn 2,5 ml dung dịch DPPH (4mg/dL) với các mẫu thử ở các nong độ khảo sát khác nhau Thêm dung môi cho vừa đủ 5 ml ú mẫu 30 phút trong bóng tối, sau đó tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 51 7nm.
- Tỷ lệ phần trăm hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) được tính theo công thức sau:
//TCƠ(%) = Ac ~ At X 100
Trang 24Ac : Giá trị mật độ quang cùa chứng âm
i4r : Giá trị mật độ quang của mầu thử
Tù tỷ lệ phần trăm hoạt tính chống oxy hóa và nồng độ cùa các mầu thử, xây dựng đường chuẩn bằng phần mem Microsoft Excel 2013 Dựa vào đường chuẩn xác định được IC50.
Trang 253 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật
Ket quả khảo sát sơ bộ hóa thực vật (Bảng 3.1) cho thấy, lá cây Lá Đắng (Vernonia amygdalina
Del.) có nhiều alkaloid, caroten, saponin; ngoài ra còn có các polyphenol, triterpen và có the
có flavonoid.
Bảng 3.1 Bảng kết quả khảo sát hóa thực vật vò thân cây lá Đắng
Ghi chú: (-) Âm tính, (+/-) Nghi ngờ, (+) Có ít, (++) Có nhiều, (+++) Có rât nhiêu
3.2 Nghiên cứu hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa
3.2.1 Chiêt xuất
Từ 3 kg lá khô, thông qua kỳ thuật ngấm kiệt và lắc phân bo với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu được các phân đoạn có độ phân cực khác nhau Ket quả được trình Hình 3.1.
Lá cây lá Đắng (3 kg)
Cồn 96%, ngấm kiệt, cô thu hồi
Cao cồn tổng (517 g)
Lắc phân hồ, cô thu hồi
Hình 3.1 Kết quả chiết xuất lá V amygdalina Del.
Từ các phân đoạn thu được, tiến hành đánh giá hàm lượng polyphenol toàn phần và hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình DPPH đe lựa chọn đối tượng nghiên cứu tiếp theo.
Trang 263.2.2 Đánh giá các phân đoạn hướng chống oxy hóa
Dựa vào đường chuẩn được thiết lập với chứng dương là acid gallic, kết quả đương lượng acid gallic tương ứng với các mầu cao được trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả đương lượng acid galic ciia các phân đoạn
Nhận xét: qua thử nghiệm, phân đoạn EtOAc cho hàm lượng polyphenol cao nhất
Hình 3.2 Kết quả hoạt tính chống OXH trên mô hình DPPH trên các phân đoạn
Nhận xét: chỉ có phân đoạn EtOAc có hoạt tính chống oxy hóa trên bảng mỏng ở nồng độ thử nghiệm 1000 pg/ml và 500 pg/ml.
Ket luận: qua 2 thử nghiệm trên, phân đoạn EtOAc (20 g) được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo của đề tài hướng phân lập các hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa.
3.2.3 Phân đoạn EtOAc
Sau khi khảo sát nhiều hệ dung môi khác nhau trên bản mỏng, hệ dung môi EtOAc-MeOH-EEO (100:17:13) được chọn làm hệ dung môi phân tích định tính cho các thành phần hóa học có trong phân đoạn EtOAc Ket quả được trình bày ở Hình 3.3
Trang 27Hình 3.3 Hệ phân tích phân đoạn EtOAc
Phân đoạn EtOAc được phân tách thành những phân đoạn đon giản hon bằng kỳ thuật sắc ký cột quá tải với các thông số cơ bản sau:
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước cột 8x50 cm, rửa sạch, sấy khô.
- Pha tĩnh: 200 g Silica gel, cờ hạt trung bình (40-63 pm).
- Nhồi cột khô, có bơm hút chân không cho ổn định,
- Mầu: 20 g phân đoạn EtOAc, nạp mẫu khô.
- Pha động: Chạy gradient với dung môi nền là n-Hex, tăng dần tỷ lệ n-Hex-CHCh đến 1:9 rồi tăng đến 100% CHCh; sau đó dùng hệ CHCh-MeOH, tăng dần tỷ lệ MeOH, cuối cùng
Trang 28Ket quả:
Từ 20 g cao phân đoạn EtOAc, sắc ký cột quá tải thu đuợc 9 phân đoạn khác nhau Tiếp tục
để bay hơi tự nhiên có 2 phân đoạn có tủa kết tinh mà vàng nâu, 7 phân đoạn khác ở dạng dầu hoặc dạng rắn Các phân đoạn có tủa được tiếp tục phân lập để thu được các chất tinh khiết Ket quả được trình bày ở Bảng 3.3 và Hình 3.4
Bảng 3.3 Kết quả thu được từ sắc ký cột quá tải phân đoạn EtOAc
Phân đoạn Tỷ lệ dung môi Phân đoạn
Khối lượng (mg)
Trang 29254 365 VS
Hình 3.4 Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển phân đoạn EtOAc
Hình 3.5 Kết quả đánh giá hoạt tính chống OXH từ các phân đoạn từ cột sắc ký phân đoạn EtOAc
Nhận xét: Phần lớn các phân đoạn con đều có hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn so với phân đoạn EtOAc Trong đó, phân đoạn 8 và 9 có hoạt tính chống oxy hóa tốt nhất khi cho khả năng dọn gốc tự do trên bản mỏng ở nồng độ thấp nhất của thử nghiệm là 62,5 pg/ml Ngoài ra, phân đoạn 3,5,6 cũng có khả năng chống oxy hóa khá tốt.
Ket luận: Tiếp tục lựa chọn phân đoạn 8, 9 đe làm đối tượng phân lập tiếp theo
Trang 303.2.4 Phân đoạn 8
Sau khi khảo sát nhiều hệ dung môi khác nhau trên bản mỏng, hệ dung môi EtOAc-MeOH-HaO (100:17:13) được chọn làm hệ dung môi phân tích định tính cho các thành phần hóa học có trong phân đoạn EtOAc Ket quả được trình bày ở Hình 3.6
Hình 3.6 Sắc ký đồ hệ dung môi phân tích phân đoạn 8
Phân đoạn 8 được phân tách thành những phân đoạn đơn giản hơn bằng kỳ thuật sắc ký cột co dien với các thông số cơ bản sau:
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước cột 3 X 60 cm, rửa sạch, sấy khô;
- Pha tĩnh: 120 g Silica gel, cỡ hạt mịn (15-40 pm);
- Nhoi cột hồn dịch;
- Mầu: 2,2 g phân đoạn 8, nạp mầu khô;
- Pha động: Chạy isocratic với dung môi là EtOAc bão hòa nước;
- The tích hứng phân đoạn: 10 ml;
- Kiểm tra phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi EtOAc-MeOH-H2O (100:17:13), phát hiện bằng cách soi ƯV 254 nm, uv 365 nm, phun TT vs Theo dõi sắc
kỷ đo và gộp các phân đoạn hứng có sắc ký đồ giống nhau, cô quay đe thu được các phân đoạn khác nhau.
Trang 31Hình 3.7 Sắc ký đồ các phân đoạn thu được tù’ sắc ký cột cố điển phân đoạn 8
3.3 Phân lập và kiểm tra độ tinh khiết
3.3.1 Phân lập V1 từ phân đoạn 9
Từ 510,5 mg kết tủa màu vàng thu được từ phân đoạn 9, sau khi được rửa nhiều lần với n- hexan, EtOAC, MeOH lạnh trên phễu thủy tinh xốp và được tái kết tinh trong MeOH thu được
300 mg bột vi tinh thể V1 màu vàng xanh.
V 1 được kiểm tra độ tinh khiết trên bản mỏng với 3 hệ dung môi khác nhau.
Trang 32254 365 VS 254 365 vs 254 365 vs
Hình 3.8 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của V1 trên 3 hệ dung môi khác nhau3.3.2 Phân lập Vỉ từ phân đoạn 5
Từ 256,8 mg kết tủa màu vàng nâu từ phân đoạn 5, sau khi tinh chế qua cột Sephadex LH-20 kết hợp với kết tinh phân đoạn với MeOH, thu được 30 mg bột vi tinh the Vz màu vàng tươi V2 được kiêm tra độ tinh khiết trên bản mỏng với 3 hệ dung môi khác nhau.
- CHCh-MeOH-HCOOH (8:2:0,1)
- EtOAc-MeOH-H2O (100:17:13)
- CHCl3 -MeOH-H2O (65:35:10, lớp dưới)
Ket quả v 2 đạt tinh khiết trên bản mỏng khi cho 1 vết duy nhất trên sắc ký đồ.
Hình 3.9 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của v2 trên 3 hệ dung môi khác nhau
Trang 333.3.3 Phân lập V3 từ phân đoạn 8.2
Từ phân đoạn 8.2, sau khi tinh chế qua cột Sephadex LH-20 kết họp với kết tinh phân đoạn với MeOH, thu được 41,3 mg bột vi tinh thể V3 màu vàng tươi
V 3 được kiêm tra độ tinh khiết trên bản mỏng với 3 hệ dung môi khác nhau.
- CHCh-MeOH-HCOOH (8:2:0,1)
- EtOAc-MeOH-H2O (100:17:13)
- CHCl3 -MeOH-H2O (65:35:10, lớp dưới)
Ket quả V3 đạt tinh khiết trên bản mỏng khi cho 1 vết duy nhất trên sắc ký đồ.
Hình 3.10 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của v 3 trên 3 hệ dung môi khác nhau
3.4 Xác định cấu trúc các chất phân lập được
3.4.1 ChấtVi
Vi (300 mg) thu được dưới dạng bột vi tinh the màu vàng xanh, ít tan trong MeOH, khó tan trong EtOAC, không tan trong n-Hexan, CHCI3 Vi tắt quang ở ƯV 254 nm, 365 nm, phản ứng với thuốc thừ FeCh, vết cho màu vàng khi phun thuốc thừ Vanilin - sulfuric.
Trang 34-Trên phổ 13 c NMR xuất hiện 21 tín hiệu Carbon, trong đó có 15 tín hiệu Carbon cộng huởng
ở vùng từ trường thấp (ôc 99,5-181,9) đặc trưng cho 1 ílavon với 4 nhóm the -OR và 6 tín hiệu Carbon còn lại cộng hưởng trong vùng ỗc 60,6 - 94,7 đặc trưng của 1 đường hexose Trong vùng 60 -80 ppm có sự cộng hưởng của 5 carbon (77,2 ppm\ 76,4 ppm\ 73,1 ppnr, 69,6 ppnr,
Trang 3560,6 ppm\ đồng thời có 1 tín hiệu carbon ở ỗc 99,9 ủa carbon anomer nên đây có thế là O-
glycosid.
Cấu trúc flavon của V1 được xác nhận bởi chuyến dịch hóa học của carbon carbonyl với ôc 181,9 và sự hiện diện cùa carbon =CH-được gán cho C3 với ôc 103,2 vàôh6,73 (1H, 5) Trong
4 nhóm thế oxy của V1, 2 nhóm được dành cho C5 và C7 - 2 vị trí thường gặp trong flavonoid;
2 nhóm còn lại là của vòng B và được cho là ở vị trí C3' và C4' Sự hiện diện của nhóm thế oxy
ở C3 ’ và C4' còn được chứng minh bởi không có các tín hiệu cùa carbon đối xứng trong phổ
13 c NMR của Vi, trong khi đó lại có 2 proton của 2 carbon thơm =CH- [ỗc 115,9, ôh6,91 (1H, í7)]; ôc 119,1, Ôu7,44 (1H, dd)) có J= 7,5 Hz của ghép ortho và 2 proton thơm =CH- [ôc 119,1,ôh7,44(1H, ddỵ ôc 113,5, Ôn7,41 (1H, 5)] có J= 2 Hzđặc trưng cho ghép meta cùa các proton thơm Hằng số ghép còn lại khoảng 2 Hz đặc trưng cho ghép meta thuộc về 2 proton của Có [ỏc 99,5, ÔH 6,44 (1H, í7)] và Cs [Ôc94,7, ÔH 6,78 (1H, íZ)] Như vậy phần aglycon của Vi được xác định là luteolin.
VỊ trí gắn của phần đường vào aglycon được xác định ở C7 dựa vào tương tác quan sát được trong phổ HMBC giữa proton anomer [ỗc 5,07 (1H; 7,5 Hz)] và carbon của aglycon (ôc 162,9) cũng như thông qua so sánh với các giá trị tương ứng của các chất được đã công bố, phần đường của V1 được xác định là glucose (Bảng 3.4) Như vậy, cấu trúc của V1 được xác định
là luteolin-7-ơ-yổ-glucopyranosid (cynarosid).
Trang 36COSY:"* - >
CTPT: C21H20OH PTK: 448 đvC
Hình 3.11 Cấu trúc hóa học và những tương tác hóa học trong V|
Cấu trúc này được khắng định khi so sánh với pho 13c NMR và 'H NMR với Cynarosid được công bố trước đây, kết quả so sánh được trình bày trong Bảng 3.5:
Bảng 3.5 Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của V1 và Cynarosid
STT v> (500 MHz, DMSO-dó) Cynarosid (300 MHz, DMSO-dô)
13C (Ồpp/H)
‘ H (Ỏpp/M)
Trang 37-Trên phỗ 13 c NMR xuất hiện 15 tín hiệu Carbon đặc trưng cho 1 flavonoid với 4 nhóm thế -
OR Cấu trúc flavon cùa V2 được xác nhận bởi chuyến dịch hóa học của carbon carbonyl với
Trang 38thông qua tương tác quan sát thấy trên phố HMBC của H3 nhìn thấy C4 Trong 4 nhóm thế oxy của V2, 2 nhóm được dành cho C5 và C7 - 2 vị trí thường gặp trong flavonoid; 2 nhóm còn lại
là cùa vòng B và được cho là ở vị trí C3- và C4’ Sự hiện diện của nhóm thế oxy ở C3 ’ và C4 ’ còn được chứng minh bởi không có các tín hiệu của carbon đối xứng trong pho 13 c NMR của V2, trong khi đó lại có 2 proton cùa 2 carbon thơm =CH- [ôc 115,9, ôhó,89 (1H, í/)]; ôc 118,9, Ôh7,39 (1H, dd)] có J= 7,5 Hz của ghép ortho và 2 proton thơm =CH- [ỏc 118,9, ỎH 7,39 (1H,
dd); ỗc 113,3, ÔH 7,42 (1H, í/] có J= 2,0 Hz đặc trưng cho ghép meta của các proton thơm Hằng số ghép còn lại khoảng 2,0 Hz đặc trưng cho ghép meta thuộc về 2 proton của Có [ôc 98,8, 5h6,19 (1H, í/)] và Cs [Ôc93,8, ôh6,44 (1H, í/)] Như vậy V2được xác định là luteolin.
Hình 3.12 Cấu trúc hóa học và những tương tác chính trong phổ HMBC của v2
Cấu trúc này được khẳng định khi so sánh với pho 13 c NMR và 'H NMR của Luteolin được
Bảng 3.7 Bảng so sánh dữ liệu NMR của v 2 và Luteolin
công bố trước đây [12], kết quả so sánh được trình bày trong Bảng 3.7
Trang 40Cấu trúc flavon của V3 được xác định dựa vào tín hiệu carbon carbonyl ôc 182,0 cùng với sự hiện diện của carbon =CH- được gán cho C3 ôc 103,1 và ỗH 6,86 (1H, 5) Ngoài ra trên phổ
13 C-NMR, còn cho 2 tín hiệu cao bất thường ôc 116,0 và ôc 128,6 đặc trưng cho cấu trúc vòng
B đối xứng 1 nhóm thế ở vị trí C4’ Trong 3 nhóm thế oxy, 2 nhóm được gán cho C5 và C7 - 2
vị trí thường gặp của flavonoid, nhóm thế còn lại được gán cho vòng B ở vị trí C4’ Hằng số ghép còn lại với J = 2 đặc trưng cho ghép meta thuộc về 2 proton của Có [ôc 99,5, Ôh 6,44
(1H, d, 2,0 Hz)] và Cs [ ôc 94,8, Ỗh 6,83 (1H, d, 2,5 Hz)] Vị trí gắn của phần đường vào aglycon được xác định ở C7 dựa vào tương tác quan sát được trong pho HMBC giữa proton anomer [ôc 5,06 (1H; d; 7,5 Hz)] và carbon của aglycon ôc 162,9 cũng như thông qua so sảnh với các giá trị tương ứng cùa các chất được đã công bố, phần đường của V3 được xác định là glucose.
Như vậy, cấu trúc V3 được xác định là Apigenin-7-ơ-/?-D-glucose (Cosmosiin)