Thành phần hóa học phân đoạn ethylacetat từ lá mạn Kinh tử lá đơn (Vitex rotundifolia L.f. Verbenaceae).pdf

Trong đó, nhiều loài đã được con người sử dụng làm thuốc từ rất lâu đời và được y học hiện đại nghiên cứu, chứng minh có những tác động dược lý giá trị, đặc biệt trong kháng viêm, chống

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

DÀNH CHO CÁN Bộ GIẢNG VIÊN 2016-2017

LÁ MẠN KINH TỬ LÁ ĐƠN (Vìtex rotundifolia L.f Verbenaceae)

Sổ hợp đồng:

Chú nhiệm đề tài: BÙI HOÀNG MINH

Đơn vị công tác: KHOA DƯỢC - ĐH NGUYỀN TẤT THÀNH

Thời gian thực hiện: 01/03/2017 - 01/12/2017

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHŨ VIÉT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH V ĐẶT VÁN ĐÈ 1

CHƯƠNG 1 TÓNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN cứu 2

1.1 TÔNG QUAN VÈ THỤC VẬT HỌC 2

1.1.1 Họ Verbenaceae 2

1.1.2 Chi Vitex 2

1.1.3 Loài Vitex rotundifolia L.f 3

1.2 TÓNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 7

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 13

1.3.1 Kháng viêm 13

1.3.2 ửc chế tiết prolactin 13

1.3.3 Điều trị hội chứng tiền kinh nguyệt (PMS) 14

1.3.4 Khả năng khảng khuân 14

1.3.5 Khả năng kháng virus 15

1.3.6 Chống dị ứng và hen suyễn 15

1.3.7 ửc che tế bào ung thư 16

1.3.8 Tác động lên thành mạch 17

1.3.9 Khả năng chong oxy hóa 17

1.4 CÔNG DỤNG TRONG Y HỌC CÔ TRUYỀN 17

1.4.1 Tỉnh vị, tác dụng 17

1.4.2 Công dụng 17

1.5 MỘT SÓ BÀI THUỐC VÀ CHÉ PHẨM TÙ MẠN KINH TỬ LÁ ĐƠN 18

1.5.1 Một so bài thuốc 18

1.5.2 Chế phẩm 18

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN cứu 19

2.1.1 Nguyên liệu 19

2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị 19

2.1.3 Dung môi hóa chất 19

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19

2.2.1 Xác định độ ẩm 19

2.2.2 Khảo sát hàm lượng chất chiết được 19

2.2.3 Chiết xuất và lắc phản bố 19

2.2.4 Phản lập và tinh che 20

2.2.5 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cẩu trúc chất phân lập được 20

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 NGHIÊN CỬU CHIẾTXƯÂT VÀ PHÂN LẬP 21

3.1.1 Xác định độ âm 21

3.1.2 Khảo sát hàm lượng chất chiết được 21

3.1.3 Chiết xuất 21

3.1.4 Khảo sát hệ dung môi cho phân tích 22

3.1.5 Phân lập 22

3.2 XÁC ĐỊNH Độ TINH KHIẾT VÀ CẤU TRÚC CÁC CHÁT PHÂN LẬP ĐƯỢC 29

3.2.1 Chất Vì 29

3.2.2 Chất v2 31

3.2.3 Chất Vỉ 31

3.2.4 Chất v4 35

3.2.5 Chất v5 39

CHƯƠNG 4 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

4.1 KÉT LUẬN 41

4.2 ĐỀ NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIÉT TẮT

doubletdichloromethanethyl acetatnước cấtacid formicHeteronuclear Multiple Bond CorrelationHigh Performance Liquid ChromatographyHeteronuclear Single Bond CorrelationInterferon gamma

InterleukinLipopolysaccharidemethanol

Methicillin-resistant S.aureus

Mass Spectrometry - Phổ khốin-butanol

n-hexanNuclear Magnetic Resonance - Cộng hưởng từ hạt nhân petroleum ether

Premenstrual Syndrome - hội chứng tiền kinh nguyệtPhân tử khối

5

TT vs

uv

singletthuốc tử vanilin-sulfuricultraviolet - tử ngoại

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Một số thành phần hóa học có trong các bộ phận của Vitex rotundifolia L.f 12

Bảng 3.1 Bảng thống kê độ ẩm bột dược liệu 23

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hàm lượng chất chiết được theo độ cồn 27

Bảng 3.3 Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột nhanh 24

Bảng 3.4 Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển phân đoạn 10 27

Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR của V3 32

Bảng 3.6 Bảng so sánh phổ NMR của V3 và Cynarosid 34

Bảng 3.7 Số liệu phổ NMR của V4 35

Bảng 3.8 Bảng so sánh dừ liệu phổ NMR của V4 và V3 36

Bảng 3.9 Bảng so sánh phổ NMR của V4 và Isoorientin 38

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình thái loài Vitex rotundifolia L.f [30] 4

Hình 1.2 Một số bộ phận của loài Vỉtex rotundifolia L.f 6

Hình 1.3 Vỉtex rotundifolia L.f thường mọc bên bãi biển 6

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học các flavonoid trong Vitex rotundifolia L.f 8

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học các diterpen trong Vitex rotundifolia L.f 9

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học các iridoid trong Vitex rotundifolia L.f 10

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học các lignan trong Vitex rotundifolia L.f 11

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học các glycosid trong Vitex rotundifolia L.f 12

Hình 1.9 Một số chế phẩm từ Vitex rotundifolia L.f 18

Hình 3.1 Sơ đồ và kết quả quy trình chiết xuất từ cao lá Mạn kinh tử lá đơn 22

Hình 3.2 Sắc ký đồ của phân đoạn EtOAc 22

Hình 3.3 Sắc ký đồ hệ dung môi chạy cột hệ n-Hex-EtOAc 23

Hình 3.4 Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký cột phân đoạn ethyl acetat 25

Hình 3.5 Sắc ký đồ của phân đoạn 10 26

Hình 3.6 Sắc ký đồ dung môi chạy cột hệ CHCh-MeOH 26

Hình 3.7 Sắc ký đồ các phân đoạn thu được phân đoạn 10 28

Hình 3.8 Sơ đồ kết quả phân lập, tinh khiết hóa từ phân đoạn EtOAc đã loại tạp 29

Hình 3.9 Sắc ký đồ so sánh V1 với chất chuẩn casticin 30

Hình 3.10 Sắc ký đồ đối chiểu V1 với cao EtOAc và FĐ 8 30

Hình 3.11 Cấu trúc hóa học của V] 31

Hình 3.12 Sắc ký đồ V2 với 3 hệ dung môi khác nhau 31

Hình 3.13 Sắc ký đồ V3 với 3 hệ dung môi khác nhau 32

Hình 3.14 Cấu trúc hóa học và các tương tác hóa học trong V3 34

Hình 3.15 Sắc ký đồ V4 với 3 hệ dung môi khác nhau 35

Hình 3.16 Cấu trúc hóa học và các tương tác hóa học của V4 38

Hình 3.17 Sắc ký đồ so sánh V5 với chất chuẩn 39

Hình 3.18 Sắc ký đồ đối chiểu V5 với phân đoạn 10 39

Hình 3.19 Cấu trúc hóa học của V5 40

TÓM TẮT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu

Sản phẩm thực đạt được

- Xác định cấu trúc của 4 trong 5 chất

được phân lập

- 01 Báo cáo tổng kết kết quả nghiên

cứu của đề tài

- 01 Bài báo khoa học đăng trên

Sản phẩm đăng ký tại thuyết minh

- Thu được tối thiểu chất để tiến hành nghiên cứu tác dụng dược lý

- 01 Báo cáo tổng kết kết quả nghiên cứu của đề tài

- 01 Bài báo khoa học đăng trên

Thòi gian đăng ký : từ ngày 01/03 đến ngày 01/12

Thòi gian nộp báo cáo: ngày 18/01/2018

ĐẬT VÂN ĐÈ

Chi Vitex thuộc họ Verbenaceae bao gồm gần 250 loài phân bổ phổ biến cả khu vực khí hậu nhiệt đới lẫn ôn đới Trong đó, nhiều loài đã được con người sử dụng làm thuốc từ rất lâu đời và được y học hiện đại nghiên cứu, chứng minh có những tác động dược lý giá trị, đặc biệt trong kháng viêm, chống dị ứng, cân bằng nội tiết tố estrogen

ở nữ; gần đây nhất là ức chế sự phát triển các tế bào ung thư [9],

Vitex agnus-castus mọc chủ yếu ở vùng biển Địa Trung Hải, được biết đến với tên gọi

“chaste tree’’ nghĩa là “cây trong sạch”, xuất phát từ việc được các thầy tu từ thời Trung Cổ sử dụng với mục đích giảm ham muốn tình dục Loài này đã và đang được nghiên cứu, bào chế thành các thành phẩm thuốc từ những thập niên cuối của thể kỷ 20 trong điều trị nhiều bệnh như mụn trứng cá, rối loạn tiêu hóa, rối loạn kinh nguyệt, đặc biệt là hội chứng tiền kinh nguyệt (premenstrual syndrome - PMS) tại Châu Âu, Bắc

Mỹ [20]

Ở Việt Nam, Mạn kinh tử lá đơn (Vitex rotundifolia L.fỤ, được dân gian sử dụng để trị nhức đầu, quáng gà và một số bệnh ngoài da như mẩn ngứa, mụn nhọt, phát ban và đã được các nhà khoa học chứng minh có tác dụng điều trị hội chứng tiền kinh nguyệt

hiệu quả tương tự như Vitex agnus-castus [15] Bên cạnh đó, từ năm 2011-2013, nhiều

báo cáo khoa học mới cho thấy các thành phần hóa học, đặc biệt lá các flavonoid trong loài cây này có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [9, 23, 25, 32] Đây là

tín hiệu đáng mừng vì Vỉtex rotundifolia L.f mọc khá phổ biến ở nước ta, đặc biệt là

các tỉnh duyên hải Miền Trung Với nguồn nguyên liệu dồi dào, sằn có, nếu như được quan tâm nghiên cứu và phát triển thành chế phẩm thuốc thì nguồn nguyên liệu này sẽ đóng góp không nhỏ cho y học hiện đại nói riêng và nhiệm vụ chăm sóc sức khỏe cho nhân dân nói chung khi mà con người đang có xu hướng quay lại với những phương thuốc từ thảo dược thiên nhiên ít tác dụng phụ

Tuy nhiên, hiện nay còn rất ít nghiên cứu về Vitex rotundifolia L.f trong khi đây là một loài cây có tiềm năng lớn tương tự như Vitex agnus-castus ở Châu Âu, Bắc Mỹ Nhằm khai thác hiệu quả nguồn dược liệu này, đề tài này được đặt ra nhằm mục đích:

- Chiết xuất và phân lập các hợp chất có trong phân đoạn EtOAc của lá Mạn kinh tử

lá đơn, đặc biệt là các flavonoid;

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được, với mục tiêu cung cấp những hiểu biết về thành phần hóa học của loài Mạn kinh tử lá đơn mọc từ Duyên hải Miền Trung Việt Nam và làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về hóa học, kiểm nghiệm, dược lý của cây thuốc sau này

CHƯƠNG 1 TỒNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN cứu

1.1 TỐNG QUAN VÈ THỤC VẶT HỌC

1.1.1 Họ Verbenaceae

Dạng sống: Cây gồ to hay nhỏ, cây bụi có khi dây trườn hay cỏ, cành non thường có tiết diện vuông Lá: Lá mọc đối, đôi khi mọc vòng, không có lá kèm Lá đơn nguyên hay có thùy hoặc lá kép chân vịt (Vitex), gân lá hình lông chim Hoa: Hoa mọc riêng lẻ hay tụ thành chùm, gié, xim, đôi khi có dạng ngù ở ngọn cành hay nách lá Hoa thường không đều, lưỡng tính Đài dính nhau ở đáy, trên chia thành 4-5 thùy Cánh hoa dính nhau tạo thành hình ống hay hình chuông, phía trên xòe ra thành 4-5 thùy nhưng thường thành 2 môi; ống tràng thẳng hay cong Bộ nhị gồm 4 nhị, 2 trội hoặc đôi khi giảm còn 2 nhị (Stachytarpheta) hoặc hoa còn đủ 5 nhị (Tectona) Nhị đính trên ống tràng xen kẽ với cánh hoa và có thể thò ra ngoài hoa Bao phấn mở dọc hay mở bằng

lồ đỉnh Bộ nhụy: 2 lá noãn dính liền thành bầu trên, 2 ô nhưng thường bị vách giả ngăn thành 4 ô, mồi ô đựng 1 noãn, đính noãn trung trụ Đôi khi số ô trong bầu tăng

lên (Duranta) Vòi nhụy ở đỉnh bầu Quả: Quả nang hay quả hạch Hạt: Hạt thường

Dạng sống: Cây gồ, cây nhờ hay cây bụi Lá: Lá mọc đối, kép chân vịt với 3-5 đôi khi

8 lá chét [10], ít khi 1 lá chét; lá chét nguyên, ít khi có răng cưa, không cuống hay có cuống [3, 10], Hoa: Cụm hoa xim không cuống hay có cuống, tạo thành chùy hay các ngù ở ngọn hoặc nách lá; lá bắc to hay nhở, rụng sớm hay tồn tại Hoa màu trắng, vàng hay lam nhạt Đài hoa hình chuông, cụm hoặc có 5 răng ngắn, đôi khi hơi có 2 thùy Tràng nhỏ, có 2 môi; ổng dài hay ngắn; môi trên có 2 thùy; môi dưới có 3 thùy, thùy giữa dài hơn Nhị 4, 2 trội, thường hơi thò; chỉ nhị đính ở gốc của tràng, bao phấn có hai ô, thường rẽ ra và cong Bầu có 2 hoặc 4 ô, luôn luôn có 4 noãn, dạng sợi cũng dài bằng nhụy; đầu nhụy chẻ đôi Quả: Quả hạch hình cầu, hình trứng hay trứng ngược; đài rộng ra, tồn tại quanh phần dưới cuối quả; vỏ quả ngoài nạc, vỏ quả trong cứng hóa

gồ, thường có 4 ô Hạt: Hạt 4 hoặc chỉ còn 1-2, hỉnh trái xoan ngược hay thuôn, không

có phôi nhũ; lá mầm nạc, rề mầm ở dưới [3, 10]

Chi Vitex gồm 250 loài, phân bố ở các vùng nhiệt đới tới ôn đới (ít) Ớ nước ta có 15 loài, trong đó có nhiều loài được sử dụng làm thuốc như [3]:

- Bình linh (Vitexpinnata L.)

- Bình linh cánh (Vitex pinnata L var ptilota Phamh.)

- Bình linh lục lạc (Vitexsumatrana Miq var urceola King et Gamble)

- Bình linh nghệ (Vitex ajugaeflora Dop)

- Bình linh nhằn, đẹn nhằn (Vitex helogiton K Schum)

- Đẹn dài lông mịn (Vitex pierteana Dop)

- Đẹn lông (Vitex canescens Kurz)

- Mạn kinh, đẹn ba lá (Vitex trifolia L.)

- Ngũ trảo (Vitex negundo L.)

- Mạn kinh tử lá đơn (Vitex rotundifolia L.f.)

- Quan âm núi (Vitex quinata Lour.)

- San trắng, cây chân vịt (Vitex peduncularis Wall Ex Schauner)

1.1.3 Loài Vitex rotundifolia L.f.

Tên khoa học: Vitex rotundifolia L.f.

Tên đồng nghĩa [9]: Vitex trifolia var simplicifolia Cham

Vitex trifolia var ovata (Thunb.) Makina

Vitex trifolia var unifoliata Schauer

Vitex ova ta Thunb.

Tên thường gọi: Mạn kinh tử lá đơn, Màn kinh tử, Từ bi biển, Mạn kinh lá đơn, Mạn kinh lá nhỏ, Bình linh xoan [3, 5]

Tên nước ngoài: beach vitex, monk's pepper, roundleaf chastetree, single-leaf chaste tree [9, 14]

1.1.3.1 Vị trí trong bang phân loại thực vật

Theo hệ thống phân loại của Takhatajan và Phạm Hoàng Hộ, vị trí của loài Vitex

rotundifolia L.f được xếp như sau:

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Phân Lớp Hoa Môi (Lamiidae)

Bộ Hoa môi (Lamiales)

Họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae)Chi Vitex

Loài Vitex rotundifolia L.f [6]

1.1.3.2 Mô tả thực vật

Hình 1.1 Hình thái loài Vitex rotundifolia L.f. [30]

Dạng sống: Cây gồ nhở, cao từ 10-40 cm [9], mọc sà bên bờ biển tạo nên thảm dày, có khi tới 10 m tính từ gốc Thân non tiết diện vuông, màu xanh mốc, thân già tiết diện tròn, bề mặt nứt nẻ, màu vàng nâu hay nâu, có mùi therm [30, 33] Lá: Lá đon, mọc đối chéo chừ thập, có mùi thơm, kích thước 2-6,5 X 1-4,5 em, hình dạng biến thiên, thường dạng trứng ngược hoặc hình thìa với đỉnh tù, đáy thuôn, mặt trên xanh đậm và có ít lông tơ hơn mặt dưới Cuống lá ngắn gần như không có [9, 30, 33] Hoa: Hoa có màu tím xanh, lường tính, chùm xim mọc ở ngọn cành dài 3-10 em [5] Đài hoa hình chén,

5 lá đài gần đều, kích thước khoảng 0,4-0,5 em, nhiều lông mịn ở ngoài, bên trong

nhằn, tiền khai van Tràng hoa không đều, dính thành ống hẹp bên dưới dài khoảng 0,8

cm, phía trên chia làm 2 môi 2/3, có màu tím hay tím hoa cà; mặt trong và ngoài ống tràng có nhiều lông mịn, tiền khai 5 điểm Bộ nhị gồm có 4 nhị, kiểu hai trội, hai nhị trước dài hơn hai nhị sau, có kích thước khoảng 0,8-1,2 cm, chỉ nhị màu trắng hay tím nhạt, có nhiều lông ở gốc chỉ nhị Bao phấn màu tím, hình bầu dục, 2 buồng, nứt dọc, đính giữa Hạt phấn hình bầu dục có 3 rãnh dọc Bầu trên hình cầu gồm 2 lá noãn có vách giả chia làm 4 ô, mỗi ô một noãn, đính noãn trung trụ [30, 33] Quả: Quả hạch, hình cầu, đường kính 0,5-0,65 cm; khi còn non có màu xanh lá cây, khi chín màu vàng hay đỏ, quả khô màu nâu sẫm [9, 33] Đài đồng trưởng bao lấy '/3 - 2/3 phía dưới quả, màu trắng xám, khó vờ Bên trong quả chia làm 4 ô, mồi ô 1 hạt Quả có mùi đặc trưng, vị hơi nóng [26, 32] Hạt: Hạt màu trắng xám, thường 1-2 phát triển [11, 33]

Hình 1.2 Một số bộ phận cùa loài Vitex rotundifolia L.f.

1 Cây mọc sà trên bờ biển; 2 Thân; 3 Lá;

4 Cụm hoa; 5 Hoa; 6 Quá non; 7 Quả chín

1.1.3.3 Sinh thải và phản bố

Mạn kinh tử lá đơn (V rotundifolia L.f.> có tên tiếng Anh là “beach vitex” vì loài này mọc chủ yếu ở đụn cát, dải đá gần bờ biển Loài này phân bố khá rộng nhưng chủ yếu tập trung ở khu vực khí hậu nhiệt đới hay cận nhiệt như Nhật Bản, Hàn Quốc, Ẩn Độ, Trung Quốc, khu vực Đông Nam Á, úc cũng như ở các đảo và quần đảo thuộc biển Thái Bình Dương như Ha-oai [5, 9, 14, 16, 33]

Tại Việt Nam, Mạn kinh tử lá đơn mọc trên các đồi cát gần bờ biển các tỉnh ven biển miền trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Đà Nằng, Quy Nhơn, Phú Yên, Khánh Hòa, [l, 3, 5], cây ra hoa tháng 7, có quả tháng 9 [5]

Hình 1.3 Vitex rotundifolia L.f thường mọc bên bãi biển

1.2 TONG QUAN VÈ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Trong những năm gần đây, Vitex rotundifolia L.f được nghiên cứu và phân lập ra chủ yếu 4 nhóm họp chất chính: flavonoid, terpenoid, irrioid và lignan Ngoài ra trong cây còn có các ecdysteroid, glucosid, phenolic acid [5, 9, 38]

Flavonoid trong Vitex rotundifolia L.f chủ yếu thuộc nhóm euflavonoid, thường là các

polymethoxyflavonoid mà tiêu biểu là các flavonol với vòng B có 2 nhóm thế như: casticin, artemin, quercetagenin Trong đó, casticin là flavonoid có hàm lượng cao nhất trong cây, đặc biệt là ở lá và quả Dược điển Trung Quốc 2005 quy định casticin là chất chuẩn trong Vitex rotundifolia L.f với hàm lượng không nhỏ hơn 0,3% [32] Casticin đang ngày càng được nhiều nhà khoa học quan tâm vì khả năng tác động kiểu estrogen hay ức chế các tế bào ung thư bằng cơ chế cảm ứng quá trình apoptosis [9,

15, 25, 39] Ngoài flavonol, trong cây còn có các flavon như luteolin và các dẫn xuất glycosid của nó: luteolin 6-C-/?-glucopyranosid (isoorientin), luteolin 1-0- P- glucuronid, luteolin 7-ớ-/?-glucopyranosid (cynarosid), luteolin 3-0- /?-glucuronid và apigenin-6-C-/?-glucosid (isovitexin) [35]

3’,5-dihydroxy-4’,6,7-trimethoxyflavanon

1 Luteolin

2 Quercetin

1 Vitexicarpin (casticin) OMe OH

R|

H OH

Luteolin 6-C-/?-glucopyranosid (isoorientin)

Luteolin 7-ơ-/?-glucopyranosid (cynarosid)

Luteolin 7-ơ-/?-glucuconid

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học các flavonoid trong Vitex rotundifolia L.f.

Terpenoid trong Vitex rotundifolia L.f chủ yếu là các diterpen có cấu trúc khung

labdan-diterpen chiếm hàm lượng cao trong thành phần hóa học của quả và lá Vitex

rotundifolia L.f Tính đến nay, đã có khoảng gần 30 diterpen được phân lập trong đó đặc biệt rotundifuran và trisnor-y-lacton có khả năng kháng ung thư nhờ tác động cảm ứng quá trình apoptosis [9]

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học các diterpen trong Vitex rotundifolia L.f.

Irioid trong Vỉtex rotundifolia nói riêng và chi Vitex nói chung thường là các monoterpen cấu trúc đơn giản, đôi khi có trường hợp bị mở vòng lacton như 1-OXO- eucommiol hoặc tạo liên kết -ơ-glycosid với a-D-glucose như trong agnusid

l-oxo-eucommiol

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học các iridoid trong Vitex rotundifolia L.f.

Lignan có chủ yếu trong rễ của Vitex rotundifolia với cấu trúc chính là lignan Trong đó, vitrofolan c và D đà được nghiên cứu và chứng minh có khả năng kháng khuẩn cao, đặc biệt là có hiệu quả với MRSA [9, 19],

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học các lignan trong Vitex rotundifolia L.f.

Ngoài ra, một số glycosid của Vitex rotundifolia L.f được phân lập và chứng minh có

tác dụng giảm đau, dãn cơ trơn mạch máu Chúng thường là các ơ-glucosid [9, 31]

Dihydrodehydrodiconiferylalcohol-/?-Đ-(2’-ơ-p hydroxybenzoyl) glucosid

Vanilloyl-/?-D-(2’-ơ-p hydroxybenzoyl) glucosid

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học các glycosid trong Vitex rotundifolia L.f.

Bang 1 Một số thành phần hóa học có trong các bộ phận của Vitex rotundifolia L.f [9]

Diterpen

rotundifuran, ferruginol, previtexilacton, trisnor-y-lactone, viteosid A, vitetrifolin A

prerotundifuran, rotundifuran

Flavonoid

luteolin, casticin, artemetin, quercetin tetramethyl ether, fisetin, fisetin tetramethyl ether,

3’,5-dihydroxy-4’,6,7- trimethoxyflavanon, isovitexin

casticin, isoorientin, isovitexin, luteolin, luteolin 7-ơ-glucuronid, luteolin 7-O-glucosid, luteolin 3-ơ-glucuronid

artemetin

Iridoid

iridolacton, perdicularis-lacton, agnusid, eucommiol, 1-OXO- eucommiol, viteoid I, viteoid II

agnusid, cis eurostosid

Phenolic acid

acid vanillic, methyl vanillat, metyl 4-hydroxybenzoat, 4-

hydroxybenzaldehyd, acid 4- hydroxy benzoic, acid ferulic

Lignan

vitex lignan 7, vitex lignan 8, vitrofolal A-F

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ

1.3.1 Kháng viêm

Công trình được họp tác nghiên cứu của các nhà khoa học đến từ các trường đại học tại Seoul, Hàn Quốc đã phân lập thêm được 3 diterpen (vitextrifolin H, viterotulin A, viterotulin B) và 2 neolignan (viterolignan A, viterolignan B) từ quả của Vitex

rotundifolia L.f Các chất này được thử nghiệm về khả năng ức chế sản xuất NO ở dòng tế bào bạch cầu RAW264,7 Kết quả ở ICso= 11,3-24,5 pM cả 5 chất trên cho tác động ức chế sản xuất NO đáng kể , tương tự như những thành phần đã được phân lập trước đó như viteagnusin I, vitextrifolin D, viteagnusin F [27]

Vitex rotundifolia L.f từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền Hàn Quốc để điều trị đau đầu, chóng mặt, sốt Một nghiên cứu được thiết kế bởi các nhà khoa học Hàn Quốc để nghiên cứu cơ chế kháng viêm của loài này thông qua tác động ức chế sản xuất NO của đại thực bào màng bụng chuột được kích thích bởi IFN-Ỵ và LPS Ban đầu, các tế bào sẽ được chia làm 2 nhóm: có hoặc không tác động bởi dịch chiết

MeOH của Vitex rotundifolia L.f ở 3 mức nồng độ (0,01; 0,1 và 1 mg/ml) Sau đó cả 2

nhóm sẽ được kích thích bởi rIFN-y (20 u/ml) và LPS (10 pg/ml) Lượng NO sinh ra

sẽ được xác định thông qua nồng độ NO trong tế bào sau 48 giờ Thông thưòng nếu không bị kích thích, lưọng NO trong tế bào dao động trong khoảng 3,62 ± 0,4 pM Ô nhóm chứng, nồng độ NO tăng lên gấp 10 lần giá trị bình thường, trong khi đó, các tế bào được tác động trước bởi dịch chiết MeOH của Vỉtex rotundifolia L.f., nồng độ NO tăng lên ít hon, đặc biệt là với nồng độ 1 mg/ml Vitex rotundifolia L.f cho kết quả ức chế việc sản xuất NO trên 64% Đồng thời không có ảnh hưởng cũng như độc tính nào đáng kể tới hoạt động của tế bào ngay cả ở nồng độ sử dụng cao nhất (1 mg/ml) Do

đó, Vitex rotundifolia L.f có khả năng ức chế sản xuất NO nhưng không gây độc tính

tế bào Bên cạnh đó, thử nghiệm Western blotting cũng được tiến hành nhằm làm rõ cơ chế của khả năng ức chế sản xuất NO của Vitex rotundifolia L.f Kết quả thu được cho

thấy cơ chế chính là do Vitex rotundifolia L.f làm giảm biểu hiện của cyclooxygenase (COX-2) và yếu tố sản xuất enzym NO synthase từ L-arginine (ĨNOS); tác động trên phụ thuộc vào liều [11]

1.3.2 ức chế tiết prolactin

Một nghiên cứu đà thừ nghiệm tác động của casticin được phân lập từ loài Vitex

rotunfifolia L.f lên chuột Sprague Dawley và tế bào tuyến yên từ những con chuột

trên Cả hai nhóm đổi tượng này đều được gây cường prolactin máu bởi metoclopramid dihydroclorid (50 mg/kg, tid, ip, 10 ngày) Casticin (10, 20 và 40 mg/kg, ip, 7 ngày) làm giảm nồng độ prolactin lần lượt 33,9%, 54,3%, và 64,7% Trong khi đó bromocriptine lmg/kg làm giảm nồng độ prolactin ở nhóm chuột cường

prolactin máu khoảng 44,9% 17/?-estradiol làm tăng đáng kể sự phát triển tế bào tuyến yên, từ đó làm tăng sự tiết prolactin và casticin (1 và 10 pmol/L) làm suy giảm đáng

kể tác động đó theo thứ tự 27,7% và 42,1 % Casticin (1 và 10 pmol/L) ức chế có ý nghĩa trên thụ thể ERa mRNA ở các tế bào tuyến yên được kích thích bởi 17/?- estradiol nhưng lại gia tăng tác động trên thụ thể ERp mRNA ở nồng độ 10 pmol/L Tuy nhiên, casticin không có tác động nào đáng kể trong sự phát triển cũng như tiết prolactin của các tế bào tuyến yên không được kích thích bởi 17/?-estradiol in vitro Như vậy, casticin có khả năng ức chế sự tiết prolactin từ các tế bào tuyến yên đã được

kích thích bởi 17/?-estradiol của chuột Sprague Dawley in vivo và in vitro Nguyên

nhân có thể liên quan tới khả năng ức chế những biểu hiên trên ERa mRNA và gia tăng biểu hiện trên ERp mRNA [37]

1.3.3 Điều trị hội chứng tiền kinh nguyệt (PMS)

PMS là hội chứng liên quan tới sự rối loạn nội tiết tố nữ bao gồm một số triệu chứng như lo âu, căng thẳng, trầm cảm, nóng nảy, nhức đầu, đau ngực, chướng bụng, buồn nôn và nôn trước khi bắt đầu chu kỳ kinh nguyệt Các nguyên nhân của PMS vần còn chưa rõ ràng, nhưng phần đông ý kiến đều cho rằng steroid sinh dục sản xuất bởi hoàng thể của buồng trứng là nguyên nhân chính Các nhà khoa học của Trung Quốc

và Anh đà họp tác trong nghiên cứu về đánh giá tác động tương tự estrogen của Vitex

rotundifolia L.f. cũng như vai trò của nó trong điều trị PMS, cụ thể là 4 thành phần chủ yếu trong dịch chiết cồn của quả loài cây này, bao gồm: casticin, luteolin, rotundifuran

và agnusid thông qua ảnh hưởng của chúng đến phát triển của tế bào cũng như trên receptor estrogen (ER), receptor progesteron (PR) và biểu hiện của pS2 mRNA trên dòng tế bào MCF-7 Kết quả cho thấy, chỉ rotundifuran và agnusid có khả năng kích thích sự phát triển của các tế bào MCF-7 Tác động này phụ thuộc vào liều (từ 100 nM tới 10 pM) ER, PR và mức biểu hiện pS2 mRNA tăng khi sử dụng rotundifuran và agnusid trong vòng 24 giờ Tóm lại, dịch chiết của Vitex rotundifolia L.f và các chất chủ yếu trong đó như rotundifuran và agnusid cho tác động tương tự estrogen thông qua tương tác với ER, PR và pS2 Điều này sẽ rất ý nghía trong điều hòa những thay đổi ở cơ quan sinh sản và trong điều trị một số bệnh liên quan tới hormone như ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, đồng thời điều hòa tỉ lệ estrogen và progesteron trong hội chứng tiền kinh nguyệt [15]

1.3.4 Khả năng kháng khuẩn

Kết quả trong thử nghiệm về khả năng ức chế Helicobacter pylori (H.P) của Vitex rotundifolia L.f. cho thấy dịch chiết nước của loài này có khả năng ức chế sự phát triển của H.p ở nồng độ rất nhỏ MIC 1-2 mg/ml Tuy nhiên cơ chế vẫn chưa được làm rõ [7]

Vitex rotundifolia L.f còn được chứng minh có khả năng diệt khuẩn đáng kể, trong đó

có Staphyỉlococus aureus Dịch chiết MeOH của rề Vitex rotundifolia L.f cho khả

năng ức chế MRSA mà đóng vai trò chính là các dần chết của phenylnaphatalen [19]

1.3.5 Khả năng kháng virus

Một nghiên cứu tại Hàn Quốc cho thấy dịch chiết quả của Vitex rotundifolia L.f trong cồn 96° cho khả năng ức chế rotavirus - là nguyên nhân gây nên 50% các trường họp tiêu chảy ở trẻ em trên thế giới Trong đó, quả của cây này cho khả năng chống lại sự lây nhiễm của rotavirus tới 25% [21]

Dịch chiết nước của Vitex rotundifolia L.f ức chế mức độ trung bình Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) và tế bào phôi thai người Thử nghiệm được tiến hành bằng cách cho

tế bào nhiễm HSV-1 trong 1 giờ trước khi thêm vào dịch chiết Vitex rotundifolia L.f Tuy nhiên nồng độ để có được tác động ức chế cao, 10 mg/ml Kết quả thử nghiệm với HSV-2 của cùng tác giả năm tiếp theo cũng cho kết quả tương tự [40, 41],

1.3.6 Chống dị ứng và hen suyễn

Trong thí nghiệm trên bạch cầu ưa kiềm của chuột (RBL-2H3), Kataoka và Takagaki tiến hành chiết 2,5 g bột quả với 50 ml nước cất trong 10 phút, sau đó ly tâm trong 5 phút để lấy dịch và lọc qua màng lọc 0,45 pm Kết quả cho thấy dịch chiết nước từ quả Vitex rotundifolia L.f khả năng ức chế tới 30,8% sự tiết P-hexosaminidase của RBL-2H3 [18],

Dịch chiết nước quả Vỉtex rotundifolia L.f cho tác động trên shock phản vệ in vivo và

in vitro. Với nồng độ (10“4-1,0 g/kg), khả năng ức chế phản ứng dị ứng phụ thuộc liều theo mức độ lần lượt 48% và 80% Dịch chiết làm giảm nồng độ histamine đồng thời làm ức chế thụ động phản ứng phản vệ trên da do IgE kháng DNP (dinitrophenyl) Các tác động này đều phụ thuộc vào liều Hơn nữa, dịch chiết từ quả Vitex rotundifolia L.f (10’3mg/ml) cho tác động đáng kể trên IgE kháng DNP gây ra bởi sự phân hủy các nhân tố a của tể bào ung thư từ đại thực bào màng bụng chuột [8]

lH,8H-Pyrano[3,4-c]pyran-l,8-dione (PPY), phân lập từ Vitex rotundifolia L.f cho tác động chống lại hen suyễn in vitro Thí nghiệm được thiết kế trên tế bào biểu mô phổi (A549) được kích thích bởi TNF-alpha, IL-4 và IL-1 beta nhằm gây ra hóa ứng động

và kết dính với bạch cầu ưa kiềm PPY với nồng độ 50 pM không gây độc tế bào, lại làm giảm đáng kể biểu hiện của eotaxin, IL-8, IL-16 và VCAM-1 mRNA PPY giảm tiết eotaxin phụ thuộc liều và ức chế hóa ứng động tới A549 Đồng thời, PPY ức chế

rõ rệt quá trình phosphryl hóa của p65 và ERK1/2, có nghĩa nó có khả năng ức chế

kênh MAPK/NF-KB Để làm rõ khả năng kháng viêm và hen suyễn của PPY in vivo,

các tác giả đã thử nghiệm ảnh hưởng của PPY trên sự phát triển bệnh viêm phổi trong

mô hình chuột hen suyễn bởi ovanbumin (OVA) và sau đó kiểm tra những dấu hiệu

đặc trưng của hen suyễn: sự gia tăng bạch cầu ưa acid ở BALF; hiện diện của Th2 cytokines như IL-4 và IL-5 ở BALF; nồng độ IgE trong huyết tương; và sự gia tăng của tế bào viêm phổi Kết quả cho thấy PPY ức chế rõ rệt sự tập trung của bạch cầu ái toan tại khí đạo thông qua việc giảm IL-4, IL-5, và IL-13 ở BALF với liều sừ dụng là 10mg/kg, khả năng kháng viêm của liều PPY sử dụng tương đương với lmg/kg dexamethason [28].

1.3.7 ức chế tế bào ung thư

Các polymethoxyflavonoid bao gồm: casticin, armentin và 3’,5-dihydroxy-4’,6,7- trimethoxyflavanon được phân lập từ dịch chiết MeOH của Vitex rotundifolia L.f được báo cáo có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bạch cầu dòng tủy HL-60 thông qua việc cảm ứng chu trình chết tế bào (apoptosis) Sau đó 1 năm, những tác giả trên đã phân lập thêm một labdan-diterpen: rotundifuran từ quả của Vitex

rotundifolia L.f cũng có khả năng ức chế tế bào ung thư dòng HL-60 với cơ chế tương tự như polymethoxyflavonoid Năm 2002, cũng từ quả của loài cây này, luteolin được phân lập và được cho là có khả năng tiềm ẩn trong phòng ngừa và hóa trị ung thư

ở dòng tế bào ung thư bạch cầu tủy cũng thông qua cơ chế cảm ứng quá trình apoptosis [23, 24, 25]

Casticin phân lập từ quả Vitex rotundifolia L.f cho tác động ức chế sự phát tế bào lympho ở chuột Bằng cách sừ dụng 4 dòng tế bào EL-4, P815,9 và L929, casticin ở nồng độ lớn hơn 0,1 pM thể hiện khả năng ức chế sự tạo thành concanavaline A và lipopolysaccaride - yếu tố cần thiết trong sự phát triển của tế bào lympho Khả năng

ức chế sự phát triển tế bào của flavonoid nói chung phụ thuộc vào liên kết đôi tại vị trí C2, C3 và phụ thuộc vào vị trí và số lượng của các nhóm -OH có trong công thức Khác với các flavonoid khác, casticin không những ức chế sự phát triển tế bào ở pha sớm mà con ở pha muộn Điều này rất có ý nghĩa trong điều trị bệnh liên qua đến hệ thống miễn dịch, ví dụ như viêm khóp dạng thấp bới lẽ các tế bào lympho đã được kích hoạt và phát triển trước khi xuất hiện các triệu chứng và được chuẩn đoán [39], Dịch chiết DCM lá Vitex rotundifolia L.f., ở nồng độ 2-5 pM có khả năng ức chế MAPK (Mitogen-activated phosphoryl kinase) trong phosphoryl hóa của chất nền MBP (Myelin basic protein) cho thấy tiềm năng lớn trong hóa trị liệu bởi lè hoạt động của MAPK đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển của tế bào Khi được kích hoạt, MAPK vào nhân góp phần trong điều hòa quá trình phiên mã gen Ở các tế bào ung thư, sự phát triển liên quan chủ yếu đến sự kích hoạt của các chất qua các kênh tín hiệu

mà phần lớn liên quan đến kênh MAPK [9]

Trong Journal of Drug Discovery and Therapeutics tập 1, số 6 xuất bản năm 2013 có

đề cập đến Vitex rotundifolia L.f., với các thành phần chính bao gồm: pinene,

terpineol, texicarpin, vitricine, casticin, orientin, isovitexin có hiệu quả trong điều trị ung thư phổi nhưng không trình bày rõ cơ chế [34].

1.3.8 Tác động lên thành mạch

Dịch chiết MeOH từ quả Vitex rotundifolia L.f được đánh giá có tác dụng giảm đau và giãn động mạch chủ của chuột Thử nghiệm giảm đau được tiến hành trên đối tượng là chuột bị bỏng do acid acetic với liều sử dụng là 2 g/kg và 3 g/kg Kết quả có sự giảm đau rõ rệt, mức độ giảm đau không khác nhau rõ rệt giữa 2 liều Nghiên cứu còn cho thấy: dịch chiết Vitex rotundifolia L.f 0,2 mg/ml có khả năng làm giãn mạch tốt nhất ở đối tượng là chuột bị gây co thắt mạch bởi norepinephrin 0,1 pM Các tác giả chỉ ra rằng: vitexfolin A, 10-ơ-vanilloylaucubin, agnusid, dihydrodehydrodiconiferylalcohol -/LD-(2’-O-p hydroxybenzoyl) glucosid và vanilloyl-/?-jD-(2 ’-O-p hydroxybenzoyl) glucosid có trong dịch chiết đóng vai trò chính gây nên tác dụng trên [31]

1.3.9 Khả năng chống oxy hóa

Khả năng chổng oxy hóa của Vitex rotundifolia L.f được đánh giá thông qua độ hấp thu ở bước sóng 520 nm, so sánh với DPPH (2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl) Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết Vitex rotundifolia L.f 1 pM xấp xỉ bằng so với khả năng chống oxy hóa của acid ascobic ở cùng nồng độ [11]

Vitex rotundifolia L.f còn có khả năng ức chế sự tạo thành formazan - kết quả của

phản ứng của NBT (nitro blue tetrazolium) với các gốc oxi hóa được tạo ra bởi hệ thống enzym xanthine oxidase Tác động này phụ thuộc vào liều, tốt nhất ở 1 pM, tương đương với acid ascobic thử nghiệm với cùng nồng độ [11]

NO cũng đóng vai trò chính trong sự hình thành các gốc oxy hóa Khi phản ứng với các gốc oxy hóa, NO sẽ bị chuyển hóa thành ONOO’ (peroxynitrit)-một tác nhân oxy hóa rất mạnh Vitex rotundifolia L.f có khả năng loại các gốc oxy hóa cũng như làm giảm lượng NO, do đó sẽ góp phần làm giảm mạnh sự tạo thành peroxynitrit [11],

1.4 CÔNG DỤNG TRONG Y HỌC CÓ TRUYỀN

Lá dùng chừa đòn ngà tổn thương, giã ra ngâm vào rượu, lấy nước uống, bã đắp [5]

Lá của Vitex rotundifolia L.f là một trong những phương thuốc truyền thống của

người dân Ha-oai Họ dùng lá tươi để trị các bệnh liên quan đến viêm nhiễm trên da, ngứa, nổi mẩn, phát ban [9] Một sổ nơi người ta dùng lá làm thuốc lợi tiêu hóa, long đờm [5, 9], Ngoài ra, do trong thành phần có rotundial nên lá của Vỉtex rotundifolia L.f còn được sử dụng để xua đuổi côn trùng , đặc biệt là muồi Aedes aegypti [9, 36].

Ớ một số nước thuộc khu vực Đông Á, hạt của Vitex rotunfolia L.f được sắc uống trị đau nửa đầu, cảm lạnh, quáng gà, đau cơ và đau dây thần kinh [9],

Tại Thái Lan, rễ được dùng để trị bệnh gan [5],

1.5 MỘT SÓ BÀI THUỐC VÀ CHÉ PHẨM TỪ MẠN KINH TỦ LÁ ĐƠN

1.5.1 Một số bài thuốc

Cảm sốt, nhức đầu, mắt sưng đỏ: Mạn kinh tử 15 g, Cúc hoa, Chi tử, Bạc hà, mồi vị 12

g, Xuyên khung 4 g, đổ nước, bịt kín ấm, sắc rồi xông đầu, mắt cho ra mồ hôi và uống thuốc khi còn nóng [2]

Đau mắt sưng đỏ, có màng che, chảy dử, quáng mắt: Mạn kinh tử, hạt Muồng (sao), hạt Mào gà trắng, hạt Mã đề, hạt ích mầu, các vị bằng nhau, tán bột làm viên, uống với nước chè, hoặc dùng mồi vị 12 g sắc uống [2]

Viêm xoang mũi dị ứng: dề hắt hơi sổ mũi, nghẹt mũi, nhức đầu, mỏi gáy khi thời tiết thay đổi: toàn cây viễn chí 100 g, lá Màng tang , lá Ngải cứu 60 g đều dùng tươi, nấu với nước pha âm ấm, tắm toàn thân và gội đầu mỗi sáng sớm 1 lần, làm 7 ngày liên tiếp Nếu thấy diễn tiến tốt, sau đó dùng cách ngày 1 lần Đồng thời có thể dùng bài thuốc sau đây: toàn cây Viễn chí 12 g, lá hoặc quả Từ bi biển, lá cây Chỉ thiên mỗi loại

10 g Nấu với 600 ml nước còn 200 ml chia 2 lần uống/ ngày Đơn thuốc này dùng liên tục 7-10 ngày, nghỉ 7 ngày rồi tiếp tục liệu trình [2]

1.5.2 Chế phẩm

Hình 1.9 Một số chế phẩm từ Vitex rotundifolia L.f.

CHƯƠNG 2 NỌI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN cứu

2.1.2.1 Các thiết bị trong nghiên cứu thực vật, hóa học

- Máy sấy chân không (Jeiotech, model OV-12)

- Bếp cách thủy (Memmert, model WB-14 LO, 2006, Đức)

- Đèn ƯV 2 bước sóng CN-15-LC (Vilber Loumart)

- Bể siêu âm Sonorex RK-1028H (Bandelin)

- Cân phân tích BP-221S (Sartorius)

- Cân kỳ thuật hiện số EW-600-2M (Kem)

- Máy quang phổ tử ngoại PharmaSpec UV-1700 (Shimadzu)

- Tủ sấy ULM-500 (Memmert)

- Máy cô quay R-200 (Buchi)

2.1.3 Dung môi hóa chất

- Dung môi dùng trong phân tích hóa học, sắc ký lóp mỏng, sắc ký cột: đạt chuẩn phân tích

- Các dung môi dùng cho chiết xuất và sắc ký cột thay đổi tủy theo các thực nghiệm

cụ thể và được cất lại, làm khan trước khi dùng

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.2.1 Xác định độ ẩm

Được tiến hành dựatheo Phụ Lục 9.6 DượcĐiển Việt Nam IV.

2.2.2 Khảo sát hàm lượng chất chiết được

Khảo sát hàm lượng chất chiết được với 3 độ cồn khác nhau: 96%, 70% và 50% theoPhụ lục 10.12 , DĐVN IV để tìm ra độ cồn cho hiệu suất chiết cao nhất

2.2.3 Chiết xuất và lắc phân bố

- Chiết xuất: ngấm kiệt với độ cồn lựa chọn

- Lắc phân bố: lắc phân bố lần lượt với CHCh, EtOAc, n-BuOH sau đó cô thành cao dưới áp suất giảm để thu được các cao phân đoạn Chọn EtOAc là phân đoạn khảo sát

2.2.5 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc chất phân lập được

2.2.5.1 Kiểm tra độ tỉnh khiết

Phương pháp sắc ký lớp mỏng:

Chất phân lập được sắc ký trên 3 bản mỏng với 3 hệ dung môi khác nhau Chất cần xác định độ tinh khiết được phát hiện trên ƯV 254 nm, uv 365 nm và hiện màu với thuốc thử vanillin-sulfuric Chất được xem là tinh khiết khi chỉ cho 1 vết gọn với Rf trong khoảng từ 0,25- 0,75

2.2.5.2 Xác định cấu trúc chất phân lập được

Các chất phân lập được xác định cấu trúc dựa trên các dừ liệu phổ MS và NMR, kết họp với các dừ liệu trong tài liệu tham khảo Trong đó:

- Phổ MS được đo ở chế độ ion âm (ESI )

- Phổ NMR được đo với các kỳ thuật 1-D, 2-D (1H-, 13C-, DEPT, HSQC, HMBC, COSY) Mầu được hòa tan trong dung môi thích họp như MeOD, DMSO với chất chuẩn nội là TMS; thực hiện trên máy ADVANCE 500 (Bruker) tại phòng cấu trúc, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội Độ dời hóa học tính theo thang ỗ {ppm) với ỖTMS = 0,00

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUÁT VÀ PHÂN LẬP

3.1.1 Xác định độ ẩm

Bảng 3.1 Bàng thông kê độ ẩm bột dược liệu

3.1.2 Khảo sát hàm lượng chất chiết được

Bảng 3.2 Bảng kết quả hàm lượng chất chiết được theo độ cồn

(%)

Hàm lượng chất chiết được (%)

Trung bình (%)

19,07

19.09

19,23 18,97

25.56

24.79

24.15 24.67

21.57

21.72

21.02 22.58

Vậy với độ Cồn 70% cho hàm lượng chât chiết được cao nhât Do đó chọn cồn 70% làdung môi để tiến hành ngấm kiệt lá Mạn kinh tử lá đơn

3.1.3 Chiết xuất

Lá Mạn kinh tử lá đon được ngấm kiệt với cồn 70%, sau đó lắc phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần: CHCh, EtOAc thu được các cao phân đoạn Kết quả quy trình chiết xuất được tóm tắt theo Hình 3.1:

Hình 3.1 Sơ đồ và kết quả quy trinh chiết xuất từ cao lá Mạn kinh từ lá đơn

Như vậy, từ 5 kg lá Mạn kinh tử lá đơn thu được 39,30 g phân đoạn EtOAc

3.1.4 Khảo sát hệ dung môi cho phân tích

Sau khi khảo sát nhiều hệ dung môi trên sắc ký lóp mỏng, EtOAc-MeOH-HCOOH (8:2:0,5) được chọn làm hệ dung môi phân tích định tính các thành phần phân đoạn EtOAc Kết quả được trình bày trong Hình 3.2:

Hình 3.2 Sắc kỷ đồ của phân đoạn EtOAc

3.1.5 Phân lập

Kểt quả phân tích thành phần phân đoạn EtOAc đà loại tạp cho thấy có ít nhất 12 vết trên sắc ký đồ Vì vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký cột nhanh để tách thành những phân đoạn đon giản hơn

3.1.5.1 Thăm dò hệ dung môi cho sắc ký cột

Sau khi tiến hành thăm dò nhiều hệ dung môi với tỷ lệ khác nhau, chúng tôi chọn n-Hex-EtOAc(5:5) làm hệ chạy sắc ký cột với kỳ thuật cột quá tải

n-Hex-EtOAc(7:3) n-Hex-EtOAc(5:5) n-Hex-EtOAc(3:7)

Hình 3.3 Sắc ký đồ hệ dung môi chạy cột hệ n-Hex-EtOAc

3.1.5.2 Tiến hành sắc ký cột nhanh

- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước cột 7 X 50 cm, rửa sạch, sấy khô;

- Pha tĩnh: 250 g silicagel, cỡ hạt trung bình (40-63 pm), được giảm hoạt với 10% nước cất trong 1 giờ ở 110 °C ;

- Nhồi cột khô, có bơm hút chân không cho ổn định;

- Mầu: 35 g phân đoạn EtOAc, nạp mẫu khô;

- Pha động: chạy gradient với dung môi nền là n-Hex, tăng dần tỷ lệ n-Hex-EtOAc đến 3:7 rồi tăng đến 100% EtOAc; sau đó dùng hệ EtOAc-MeOH, tăng dần tỷ lệ MeOH;

Bảng 3.3 Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột nhanh Phân

đoạn Tỹ lệ dung môi Phân đoạn hứng

3.1.3.4 Phân lập Vì từ phân đoạn 13

Từ 43,20 mg kết tủa màu vàng thu được từ phân đoạn 13, sau khi rửa nhiều lần bằng MeOH lạnh trên phều thủy tinh xốp và tiến hành kết tinh lại trong MeOH thu được 30

mg bột vi tinh thể V3 màu vàng nhạt

3 ỉ 3.5 Phân lập V4 từ phân đoạn 14

Từ 132,07 mg kết tủa màu vàng thu được từ phân đoạn 14, sau khi rửa nhiều lần bằng MeOH lạnh trên phều thủy tinh xốp và tiến hành kết tinh lại trong MeOH thu được 46,29 mg bột vi tinh thể V4 màu vàng tươi

3.1.3.6 Tiến hành sắc ký cột cổ điển với phán đoạn 10

Thăm dò hệ dung môi phân tích:

Sau khi khảo sát nhiều hệ dung môi trên sắc ký lớp mỏng, CHCh-MeOH (9:1) được chọn làm hệ dung môi phân tích định tính các thành phần phân đoạn 10.

Hình 3.5 Sắc ký đồ của phân đoạn 10

Thăm dò hệ dung môi chạy cột:

Sau khi tiến hành thăm dò nhiều hệ dung môi với tỷ lệ khác nhau, CHCh-MeOH (95:5) được chọn làm hệ chạy sắc ký cột cổ điển phân đoạn 10

CHCh-MeOH (97:3) CHCh-MeOH (95:5) CHCh-MeOH (93:7)

FĐ 10

Hình 3.6 Sắc ký đồ dung môi chạy cột hệ CHClj-MeOH

Tiến hành sắc ký cột cổ điển:

- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước cột 1,5 X 80 cm, rửa sạch, sấy khô;

- Pha tình: 70 g silicagel Merck, cỡ hạt mịn (15-40 pm), được giảm hoạt với 10% nước cất trong 1 giờ ở 110 °C ;

- Nhồi cột ướt, cho dung môi nền CHCh chạy tới khi ổn định;

- Mầu: phân đoạn 10 (929, 56 mg), nạp mẫu khô;