Hóa chất, dung môi Chất chuan: cefuroxim axetil, số lô: QT126 031007, hàm lượng 98,18% tương ứng 81,82% cefuroxim Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP.HCM; natri dihydrophosphat, natri dihydro phos
TÓNG QUAN
TÓNG QUAN VỀ TÍNH CHẤT CỦA CEFUROXIME
1.1.1 Tổng quan về kháng sinh 0][2][6]
Năm 1928, nhà khoa học Alexander Flemming người Scotland lần đầu tiên thấy trong môi trường nuôi cấytụ cầuvàng nếu có lầnnấm penicilium thìkhuẩn lạc gầnnấm này sẽ không phát triển được, sau đó chất peniciline đã được chiết xuất từ nấm đe dùng trong điều trị Vào năm 1941, peniciline trở thành kháng sinh đầu tiên được tìm ra và được sản xuất để dùng trong lâm sàng Khi đó, kháng sinh được coi là những chất do vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có khả năng kìm hãm sự phát triển cùa vi sinh vật khác, từ gốc
Hy Lạplà antibiotic, nghĩa là chống lại sự sống. về sau, với sự phát triển cúa khoa học, người ta đã có thể tồng họp, bán tổng họp các kháng sinh tự nhiên và nhân tạo, do đó định nghía kháng sinh đã thay đổi: kháng sinh là nhừng chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng họp, tổng hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi khuẩn.
Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay mộtphản ứng trong quá trình phát triển củavi khuấn.
1.1.2 Phân loại các nhóm kháng sinh t6][13]
Ngày nay con người biết được khoảng 8000 chất kháng sinh, trong đó có khoảng 100 loại dùng trong Y khoa và Thú y Thuốc kháng sinh có loại dùng theo đường toàn thân (uống,tiêm) hoặc tại chồ (bôi ngoài da; nhỏ mắt, tai, mũi; đặt âm đạo ).
Tính đến năm 2010 có khoảng 17 nhóm thuốc kháng sinh với gần 500 tên thuốc (trong đó có 4 nhóm chuyên biệt là: chống nấm, chống lao, chống phong, trị ung thư; còn lại 13 nhóm là thuốc trị các bệnh nhiễm khuấn thông thường) Mồi nhóm lại có các phân nhóm hoặc các thế hệ khác nhau Ví dụ: nhóm penicillin có 7 phân nhóm, mỗi phân nhóm lại có nhiềutên thuốc gốc khác nhau, mỗi tên thuốc gốc có nhiều tên biệt dược khác nhau. Hay nhómcephalosporin có 4 thế hệ khác nhau, mồi thế hệ có nhiều tên thuốc gốc khác nhau (khoảng 40 tên) và nhiều tên biệt dược khác nhau Ngoài ra còn nhiều biệt dược phoi hợp 2 hoặc 3 kháng sinh với nhau hoặc kháng sinh với thuốcchống viêm mạnh (các loại corticoid) đe tăng tác dụng.
Có nhiều cách đe phân loại kháng sinh:
❖ Dựa vào cơ chế tác dụng:
Kìm khuấn: Kháng sinh ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh Bao gồm: Clindamycin, Tetracyclin, Ethambutol, Erythromycin, Azithromycin, Cloramphenicol, Cotrimoxazol
Diệt khuẩn: kháng sinh có tác dụng phá huỷ cấu trúc vi sinh vật gây bệnh Gồm Penicillin, Cephalosporin, Aminoglycosid, Metronidazol, Rifampicin, Pyrazinamid, Ciprofloxacin, Nystatin
Tự nhiên: Gentamycin, Clindamycin, Erythromycin
Bán tổng hợp: Amikacin, Spectinomycin,
Tong họp: Azithromycin, Clarithromycin, Ọuinolon, Cephalosporin, Sulfamid
Họ Macrolid: Erythromycin, Spiramycin, Roxithromycin, Clarithromycin
Họ Aminoglycosid: Streptomycin, Amikacin, Gentamycin, Kanamycin
Họ Quinolon: Acid Nalidixid, Ciprofloxacin, Ofloxacin, Norfloxacin
HọPolypeptid: Polymycin B, Colistin, Bacitracin, Tyrothricin
Họ Polyene: Nystatin, Amphotericin B, Natamycin
Họ Azol: Metronidazol, Tinidazol, Mebendazol, Albendazol, Fluconazol
❖ Dựa vào tác nhân gây bệnh:
Nhóm kháng khuẩn: PNC, Aminosid, Cyclin
Nhóm kháng nấm: Nystatin, Griseofulvin, Ketoconazol
Nhóm kháng lao: Rifampicin, Ethambutol, Isoniazid, Pyrazinamid
Nhóm kháng phong: Rifampicin, Sulfones, Dapson, Clofazimine
Nhóm kháng virus: Amatadine, Zidovudine,Zovirac
Cefuroxime - Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Cefuroxime là một kháng sinh thuộc nhóm cephalosporinthế hệ thứ 2, có phổ kháng khuẩn rộng, được dùng nhiều trong điều trị những bệnh nhiễm trùng Cefuroxim được điều chế dưới nhiều dạng chế phẩm như viên đe uống, bột pha hồn dịch uống, dung dịch tiêm Trongđó bột pha hồn dịchuống là dạng thuốc thích hợp cho trẻ em. Đe đảmbảo chất lượng của thuốc trong suốt quá trình bảo quản, lưu thôngphân phối và sử dụng, độ on định cùa thuốc phải được công bố khi đăng ký lưu hành sản phẩm Vì vậy, mục tiêu cùa đề tài này là xây dựng qui trình định lượng và khảo sát độ ổn định của chế phẩm thuốc bột cefuroxim pha hồn dịch uống nhằm xác định tuổi thọ của thuốc và cung cấp dừ liệucho ho sơđăng ký thuốc.
Hình 1.2.1 Công thức cấu tạo của Cefuroxime.
1.2.2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu I2II4II13||5|
Thuốc bột cefuroxim (Zintat 125mg) pha hồn dịch uống hàm lượng 125 mg.
Ba lô thuốc bột được sử dụng trong nghiên cứu độ ổn định là lô 110909, lô 130708 và lô 230508.
Chất chuan: cefuroxim axetil, số lô: QT126 031007, hàm lượng98,18% tương ứng
81,82% cefuroxim (Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP.HCM); natri dihydrophosphat, natri dihydro phosphat đạt tiêu chuẩn dùng trong phân tích kiểm nghiệm (Prolabo); acetonitril và methanol đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC (Merck).
Hệ thống sắc ký lỏng hiệunăng cao (HPLC) WATERS 600E (Mỳ), máyđopH
Xây dựng qui trình định lượng cefuroxim bằng phương pháp HPLC 171181191
Cefuroxim axetil là một hồn họp hai đong phân quang học không đối quang A và B Hai đồng phân này có thời gian lưu khá gần nhau, vì vậy, điều kiện sắc ký được khảo sát sao cho hệ số phân giải giữa hai đỉnh của đồng phân A và B không nhỏ hơn 2 Do cefuroxim axetil có tính acid yếu (pKa = 4,7) và phân cực nên điều kiện sắc ký được chọn là cột pha đảo, pha động gồm acetonitril và dung dịch đệm phosphat pH 4. Phương pháp sè được thẩm định và áp dụng trong khảo sát độ on định của thuốc bột cefuroxim Mầu thuốc bột cũng được bảo quản ở nhiệt độ cao (55oC) đe tạo sản phẩm phân hủy nhằm chứng minh tính đặc hiệu của qui trình phân tích ngay khi có sự hiện diện của sản phấm phân hủy trong mầu.
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác một lượng cefuroxim axetil chuẩn tương đương
50 mg cefuroxim cho vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml methanol, lắc hòa tan, thêm dung dịch đệm phosphat pH 4 đến vạch Lắc đều.
Dung dịch chuẩn định lượng: Hút chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch đệm phosphat pH 4 đến vạch Lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 mm.
Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với 50 mg cefuroxim từ
10 gói thuốc bột đã được nghiền trộn kỹ, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 30 ml methanol siêu âm trong 3 phút, bo sung vừa đủ bằng dung dịch đệm phosphat pH 4. Lắc đều Lọc (bỏ 10 ml dung dịch đầu), hút chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bìnhđịnh mức 100 ml, bổ sung dung dịch đệm pH 4 vừa đủ Lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45pm. Bơm mầu chạysắc ký.
❖ Thẩm định phương pháp định lượng (HPLC)
Phương pháp được thẩm địnhvề tính phù họp hệ thống, độ tuyếntính, độ chính xác và độđúng theo nguyên tắc chung.
> Khảo sát độ ổn định của thuốc bột cefuroxim Đe khảo sát độ ổn định, ba lô thuốc bột cefuroxim liên tiếpđược bảo quản ở những điều kiện qui định Các chỉ tiêu chất lượng được dùng để đánh giá độ ổn định của thuốc là cảm quan, hàm lượng nước, pH, hàm lượng cefuroxim và độ hòa tan.
Tuổi thọ thực của thuốc được xác định tại thời điểm hàm lượng hoạt chất giảm đến giới hạn dưới theo qui định khi được bảo quản ở điều kiện dài hạn Trong trường họp này, tuổi thọ thực của thuốc được xác định khi hàm lượng cefuroxim giảm còn 90% so với hàm lượng nhãn dưới điều kiện bảo quản 30 ± 2 oC/ 75 ± 5% RH Tuy nhiên, đe phục vụ hồ sơ đãng ký thuốc, tuổi thọ của thuốc có thể được ước tính theo nguyên lý van’t Hoff từ kết quả nghiên cứu độ ổn định ở 40 ± 2 oC/ 75 ± 5% RH.
> Khảo sát tính tương thích của hệ thốngsắc ký:
Tiêmlặp lại 6 lần dung dịch chuẩn
- Thời gian lưutương đối cùa các pic lần lượtlà :
- 0,8 đối với Cefuroxim axetil diasteroisomer B;
- 0,9 đối với Cefuroxim axetil diasteroisomer A;
- 1,0 đối với Cefuroxim axetil delta- 3 isomer;
- Hệ số phân giải giữa Cefuroxim axetil diasteroisomer B và Cefuroxim axetil diasteroisomer A không nhỏ hơn 1,5;
- Hệ số phân giải giữaCefuroxim axetil diasteroisomer B vàCefuroxim axetil delta
- Số đĩa lýthuyết đối với Cefuroxim axetil diasteroisomer A phải lớn hơn 3000;
- % RSD các lần tiêm lặp lại không quá2,0 %.
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg Cefuroxim axetil chuẩn vào bình định mức 50 mL, hòa tan và pha loãng với methanol đenvạch.
- Lấy 5 bình định mức 50 mL: Từ dung dịch chuẩn gốc, hút chính xác lần lượt tương ứng với thể tích 2, 4, 6, 8, 10 mL vào bìnhđịnh mức 50 mL, thêm 13,8 mL methanol và sau cùng thêm dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2 M đến vạch và trộn đều, lọc qua giấy lọc milipore O =0,45 pm Các dung dịch chuẩn có nồng độ tương ứng là 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 mg/mL Mồi nồng độ tiêm 3 lần, lấy kết quảtrung bình, (vẽ đồthị)
- Khảo sát sự tương quan giữa y (diện tích đỉnh) và X (nồng độ), kết quả cho thấy hệ số tương quan r = Yêu cầu R2 > 0,99
- Phương pháp có tính chọn lọc khi trong mầu trắng không có sắc ký đo tại vị trí tươngứng vớiCefuroxim axetil có trongmẫu thử và mẫu chuấn đối chiếu.
- Tiến hành tiêm 6 lần dung dịch mẫu thử, so sánh kết quả thời gian lưu giữa dung dịch mẫu chuẩn và thử.
- Độ lệch thời gian lưu trung bình củamầu chuẩn và mầu thử không quá 1%.
Tiến hành tiêm 6 lần dung dịch mầu thử, sử dụng kết quả sau khi tiêm dung dịch chuẩn ởtrên:
6 Độ lệch chuản (Standard Deviation) :
> Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) hay hệ số phân tản
RSD = CV = -ỉ xioo% Độ lệch chuẩn tương đối cho hàm lượng hoạt chất phải không quá 2,0% Hệ số này càng nhỏ chứng tỏ quy trình định lượngcàng chính xác.
Chuẩn bị 15 mầu thử (theoquy trình định lượng), thêm chính xác khoảng 60%, 80%, 100%, 120%, 140% tương ứng Cefuroxim axetil chuẩn vào mầu thử, mồi nồng độ thêm thực hiện với 3 mầu và tiếnhành định lượng.
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg Cefuroxim axetil chuẩn vào bình định mức 50 mL, hòa tan và pha loăng với methanol cho vừa đủ thể tích Dung dịch chuẩn có nồng độ 0,5 mg/mL.
Dung dịch thử: Cân chính xác 1 lượng placebo tá dược đã nghiền mịn tương ứng với 50 mg Cefuroxim vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng 25 mL methanol, lắc siêu âm 10phút, bồ sung methanol vừa đù Lắc đều và lọc.
Mầu thử 1: Hút chính xác 5 mL dung dịch thử và 6 mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 mL, thêm 13,8 mL methanol và sau cùng thêm dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2 M đến vạch và trộn đều Lọc qua giấy lọc milipore o = 0,45 pm.
Mầu thử 2: Hút chính xác 5 mL dung dịch thử và 8 mL dung dịch chuấn gốc cho vào bình định mức 50 mL, thêm 13,8 mL methanol và sau cùng thêm dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2 M đến vạch và trộn đều Lọc qua giấy lọc milipore o = 0,45 pm.
Mẩu thử 3: Hút chính xác 5 mL dung dịch thử và 10 mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 mL, thêm 13,8 mL methanol và sau cùng thêm dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2 M đến vạch và trộn đều Lọc qua giấy lọc milipore
Mẩu thử 4: Hút chính xác 5 mL dung dịch thử và 12 mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 mL, thêm 13,8 mL methanol và sau cùng thêm dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2 M đến vạch và trộn đều Lọc qua giấy lọc milipore o = 0,45 pm.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sac ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiếu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đà được biến đối bằng liên
7 kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, traođổi lon hay phân loại theo kích cỡ(râyphân tử).
1.3.1.2 Nguyên tắc của quá trình sắc kýtrong cột
Pha tĩnh là mộtyếu tố quan trọng quyết định bản chất củaquá trình sắc kỷ và lọai sắc ký Neu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo Neu pha tĩnh là chất trao đoi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion Neu pha tĩnh là chất lỏng thì tacó sắc ký phân bố hay sắc ký chiết.
Theo cơchế tách sắc ký người ta phân loạinhư sau:
Sắc ký hấp phụ: Quátrinh sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh, yếu khác nhau của pha tình đối với các chất tan và sựrửa giải (phản hấp phụ) của pha động đe kéo chất tan ra khỏi cột Sự tách một hồn hợp phụ thuộc vào tính chất động học cùa chất hấp phụ Trong trường loại này có 02 loại hấp phụ:
- Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP- HPLC): Pha tình phân cực, pha động khôngphân cực.
- Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực.
Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công đe tách các hồn họp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, thuốc hạ nhiệt giảm đau
Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP) Trong dược điển USPcột có giátrị tương ứng như sau:
- L1: RP 18 Kíchthước hạt tương ứng từ 5 - 10 pm
- L7: RP 8 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 pm
- L3: Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 pm
- Và một số loại cột khác như cột Diol, CộtNH2 ,CN vv.
Các đại lượng đăc trưng
1.4.1 Thời gian lưuthực (ÍR - Retention time)
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mầu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại Thời gian lưu của mồi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhautrên cùngmột điều kiện sắc ký đã chọn Vì vậy thời gian lưu là đại lượng đe phát hiện định tính các chất.
- ír: Thời gian mà hợp chất bị giữ lại trên cột.
- tm: Thời gian của họp chất không bị cột giữ lại (dung môi)
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
- Bản chất sắc ký của phatĩnh
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động
- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
- Trongmột số trường họp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.
Trong một phép phân tích, nếu tRnhở quá thì sựtách kém, còn nếu tR quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của peakrất kém, thời gian phân tíchrất dài đồngthời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, độ chính xác của phép phântích kém.
1.4.2 Hệ số dung lượng k’: CapacityFactor
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố làtỷ số giữa lượng chất tan trongphatĩnh và lượng chất tan trongpha động tại thời điếm cân bằng. k = vm tữ
- vs: Thể tích pha tình
- vm: Thể tích pha động
Neu k’ nhỏ thì ÍR cũng nhỏ và sự tách kém Neu k’ lớn thì Peak bị doăng Trong thực tế k’ từ 1- 5 là tối ưu
1.4.3 Độ chọn lọc a Độ chọn lọc acho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi 2 chat A, B có k’A và k’e khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểuthị ởđộ chọn lọc a.
B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a >1 Đetách riêng2 chất thường chọn 1,05 < oc< 2,0
Số đìa lýthuyết là đại lượng biếu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định Mồi đìa lý thuyết trong cột sắc ký giống như là một lóp pha tình có chiều cao là H Tất nhiên lóp này có tính chất động tức làmột khu vực cùa hệ phân tách màtrong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trongpha tĩnh và pha động Be dày H phụ thuộcvào nhiều yeu tố:
- Đườngkính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh
- Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động
- Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũnghằngđịnh đối với một chấtphân tích và số đìa lýthuyết của cột cũng được xác định, số đìa lýthuyết N được tính theo công thức sau:
- tR : Thời gianlưu của chất phân tích.
- Wo,5: Độ rộng tại điểm 1/2 của Peak.
Trong thực tế N nằm trongkhoảng 2500 đến 5500là vừa đủ
1.4.5 Độ phân giải (Rs - Resolution) Độ phân giải là đại lượngbiếu thị độ tách của các chất ra khỏi nhautrên mộtđiều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của 2 peak cạnh nhau phải được tính theo công thức sau:
- tRB, íra: Thời gian lưucủa 2 peak liềnkềnhau (B và A)
- Wb, Wa: Độrộng picđo ởcác đáy peak
Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiếu đế 2 peak tách là R =1.0 Trong phép định lượng R=l,5 là phù họp.
Neu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích peak sẽkhông chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo 3 cách sau:
- Làm thay đổi k’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động (thay đổi độ phân cực nếu là RP - HPLC, thay đoi cường độ ion nếu là IE - HPLC ).
- Làm tăng số đìa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có kích thước nhỏ hơn.
1.4.6 Hệsố không đối xứng (T - Tailing factor)
W: Chiềurộng pic đo ở 1/20 chiều caopic a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
Khi F < 1.5 thì phép định lượng được chấp nhận, khi T>1.5 thì điếm cuối của peak rất khó xác định Vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho peak cân đoi hơn theo các cách sau:
- Làm giảm thế tích chết tức là đầunối từ cột đến đầu dò
- Thay đốithành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên
- Giảmbớt lượng mầu đưa vào cột bằngcách pha loãng mầuhay giảm thể tích tiêm mầu.
Hệ thống H PLC
1.5.1 Các bộ phận cơ bản của hệthống HPLC.
Hệ thống máy sắc ký lỏng gom các bộ phận như sau:
> Bìnhchứa dung môi pha động
> Bộ phận tiêm mầu (bằng tay hay tự động)
> Cột sắc ký (pha tình )
> Hệ thống máytính gắn phầnmềm nhận, tín hiệu và Xửlý dữ liệu và điều khiến hệ thống HPLC.
Bình đựng dung môi: Hiện tại máy HPLC thường có 04 đường dung môi vào đầu bơm cao áp Cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mongmuốn và tong tỷ lệ dung môi của 04 đường là 100 % Tuynhiên ítkhi sử dụng 04 đường dung môi cùng một lúcmà chủng ta chi sử dụng tối đa là 03 và 02 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhấthơn.
Bộ khử khí Degasse: Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhở còn sót lại trong dung môi pha động Neu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một sốhiện tượng sau đây sè xảy ra:
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy khôngđúng sè làm cho thời gian lưu của peak thayđối.
- Trong trườnghợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể bơm sè không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích không chính xác.
Bơm Cao áp: Mục đích đe bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm phải tạo được áp suấtcao khoảng 3000 - 6000 PSIhoặc 250 atđến - 500 at (lat
=0.98 Bar) và pump phải tạo dòng liêntục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến9.999 ml/phút Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện naythường có áp suất toi đa 412 Bar Hiện tại bơm có2 Pistone để thay phiênnhau đẩy dung môi liên tục.
Bộ phận tiêm mẫu (injection): Đe đưa mầu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy Với dung tích của loop là 5 - lOOpl Có 02 cách lấy mầu vào trong cột: tiêmmầu bằng tay và tiêm mầu tự động.
Cột sắc ký: Cộtchứa pha tĩnh được coi là trái timcủa hệ thống sắc ký long hiệu năng cao Cột pha tình thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 - 30cm, đường kính trong 1-10 mm, hạt chất nhồi cỡộ = 5 - 10 pm.
Với chất nhồi cột cỡ ộ = 1.8-5 pm có thể dùng cột ngắn (3-10 cm) và nhô (đường kính trong 1 - 4.6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo) Ngoài ra, người ta còn dùng các loại hạt khác như: Nhôm Oxit, Polyme xốp, chất trao đổi ion Đối với một số phươngpháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộphận điều nhiệt (Ovencolumn).
Detector: Là bộ phận Pháthiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất cùa các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại đầu dò thích họp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhấtđịnh củachấtphân tích:
- c Nồng độ chất phân tích
- k là hằng số thực nghiệm của đầu dò đà chọn
Tín hiệu này cóthe là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dần điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất Trên cơ sở đó, người ta chế tạo các lọai đầu dò sau:
- Đầudò quang phổ tửngoại 200 - 380 nm để phát hiện uv.
- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (ƯV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chấthấp thụ quang Đây đầu dò là loại thôngdụng nhất.
- Đầu dò huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dần chất có huỳnh quang Đầu dòcó độ chọn lọccao nhất.
- Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod Array, ELSD (Detector tán xạ bay hơi) các đầu dò này có khả năng quét chồng phổđể định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất.
- Đầudò điệnhóa: Đo dòng, cực phổ, độ dần, điện lượng )
- Đầu dò chiết suất vi sai : Đầu dò khúc xạ (thông thường dùng cho đo các chất đường)
- Đầudò đo độdần nhiệt,hiệu ứng nhiệt.
Bộ phận ghi tín hiệu: Đe ghi tín hiệu phát hiện do đầu dò truyền sang Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vè sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máytính nó có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của Peak như tính đối xứng,hệ số phân giải trongquá trình phân tích đồng thời xử lý, tínhtoán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: Nồng độ, RSD, In kết quả: Sau khi đã phân tích xong các mầu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ.
1.5.2 Một số thôngsố sắc ký đặc trưng cho HPLC [9][8]
*Thời gian lưu tR: thời gian lưucủa một cấu tử từ khi vào cột đến khitách ra ngoi cột. tm: thời gian đế cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từđầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết. tR': thời gian lưu thậtcủa một cấu tử. tR’ = tR - tm
Hình 1.5.1 Cách xác định thời gian lưu
Neu k’~ 0, tR~ tO: chat ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại Neu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù.
Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hồn hợp phức tạp, k’ có the chấp nhận trongkhoảng rộng 1-20.
Hiệulực cột đo bằng so đĩalý thuyết Ncủa cột
Hình 1.5.2 Xác định hiệu lực cột
H là chiều cao đĩa lý thuyêt
Wb là chiêu rộng cùa pic w 1/2 là chiêu rộng ở một nứa chiêu cao của pic
Là đại lượngđặc trưng cho tốc độ di chuyến tương đối của hai chat A, B a = „
Theo quy ướcthì B lưu giữ mạnh hơn A (KB> KA) nên a luôn > 1.
Khiđưa hệ số dung lượngk’ vào ta có công thức sau a _ k'g _ a ~ kA - *m Đe táchriêng 2 chất A và B cần ơ> 1 Thường oc nằm trong khoảng 1,05 4- 2.
Neu ơ lớn quá thìthời gianphân tích kéo dài.
*Hệ bấtđối xứng pic AF
THỤC NGHIỆM
Dụng cụ, thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu
- Cột sắc ký: HiQ Sil CisHS 4.6 mm I.D X 250 mm.L củaAgilent
- Cânphân tích Meller Toledo 0,01 mg
- Màng lọc Sartorius RC (regenerated cellulose) 0,45 pm
- Hệ thống lọc áp suất chân không
Hoá chất
- Chất chuẩn: Cefuroxime axetil (hàm lượng 94.7% nguyên trạng của viện kiếm nghiệm thuốc.
- Dung môi: Đạt tiêu chuẩn tinh khiết (Merk-Đức)
Nội dung nghiên cứu
- Cột: HiQ Sil CisHS 4.6 mm I.D X250 mm.L
- Tốc độ dòng: 1,5 ml.phúr'
- Pha động: methanol - dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2M theo tỉ lệ (38:62; v:v)
Cách pha dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2 M: Hoà tan 23 g amoni dihydrogen phosphat vào nước thành 1000 mL.
- Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 25 mg Cefuroxim axetil chuẩn (a mg) vào bình định mức 50 ml, hoà tan và pha loãng với methanol tới vạch Hút chính xác 5 ml dung dịch vào bình định mức 50 ml, thêm 13,8 ml mathanol và pha loãng với dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2M cho vừa đủ 50 ml Trộn đềuvà lọc qua giấy lọc 0,45 pm.
- Dung dịch thử: Lấy 10 gói thuốc, cân tính trọng lượng trung bình gói, nghiền mịn, trộn đều Cân chính xác 1 lượng bột chế phẩm đà nghiền mịn tươngứngvới
25 mg Cefuroxim (khoảng 1/5 gói) vào bìnhđịnh mức 50 ml, thêmkhoảng 25 mL methanol, lắc siêu âm 10 phút, bo sung methanol vừa đủ Lắc đều, lọc Hút chính xác 5 ml dung dịch vào bình định mức 50 ml, thêm 13,8 ml mathanol và pha loãng với dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2M cho vừa đủ 50 mL Trộn đềuvà lọc qua giấy lọc 0,45 pm.
- Lần luợttiêm dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký và ghi nhận sắc kýđo.
Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký
Tiêm lặp lại 6 lân dung dịch chuân
Thời gianlưu tươngđối của các pic lần lượt là :
- 1,0 đối với Cefuroximaxetil delta - 3 isomer;
- Hệ số phân giải giữa Cefuroxim axetil diasteroisomer B và Cefuroxim axetil diasteroisomer A không nhỏ hơn 1,5;
- Hệsố phân giải giữa Cefuroxim axetil diasteroisomer B và Cefuroxim axetil delta
- Số đĩa lý thuyết đối với Cefuroxim axetil diasteroisomer A phải lớn hơn 3000;
- % RSD các lần tiêm lặp lại không quá2,0 %.
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg Cefuroxim axetil chuẩn vào bình địnhmức 50 mL, hòa tan vàpha loãng với methanol đến vạch.
- Lấy 5 bình định mức 50 mL: Từ dung dịch chuẩn gốc, hút chính xác lần lượt tương ứng với thểtích 2, 4, 6, 8, 10 mL vào bìnhđịnh mức 50 mL, thêm 13,8 mL methanol và sau cùng thêm dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2 M đến vạch và trộn đều, lọc qua giấy lọc milipore = 0,45 pm Các dung dịch chuẩn có nồng độ tương ứng là 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 mg/mL Mồi nồng độ tiêm 3 lần, lấy kết quảtrung bình, (vè đồthị)
- Khảo sát sự tương quan giừa y (diện tích đỉnh) và X (nong độ), kết quả cho thấy hệ số tương quan r = Yêu cầu R2 > 0,99
- Phương pháp có tính chọn lọc khi trong mẫu trắng không có sắc ký đồ tại vị trí tương ứng vớiCefuroxim axetil có trongmẫu thử và mầu chuẩn đối chiếu.
- Tiến hành tiêm 6 lần dung dịch mầu thử, so sánh kết quả thời gian lưu giữa dung dịch mẫu chuẩn và thử.
- Độ lệch thời gian lưu trung bình củamầuchuẩn và mầu thử không quá 1%.
Tien hành tiêm 6 lần dung dịch mầu thử, sử dụng kết quả sau khi tiêm dung dịch chuân ở trên:
6 Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) :
> Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) hay hệ số phân tản
RSD = CV = ■£ xioo% Độ lệch chuẩn tương đối cho hàm lượng hoạt chất phải không quá 2,0% Hệ số này càng nhỏ chứng tỏ quy trình định lượngcàng chính xác.
Chuẩn bị 15 mầu thử (theoquy trình định lượng), thêm chính xác khoảng 60%, 80%, 100%, 120%, 140% tương ứng Cefuroxim axetil chuẩn vào mầu thử, mồi nồng độ thêm thực hiện với 3 mầu và tiếnhành định lượng.
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg Cefuroxim axetil chuẩn vào bình định mức 50 mL, hòa tan và pha loãng với methanol cho vừa đủ the tích Dung dịch chuẩncó nồng độ 0,5 mg/mL.
Dung dịch thử: Cân chính xác 1 lượng placebo tá dược đã nghiền mịn tương ứng với 50 mg Cefuroxim vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng 25 mL methanol, lắc siêu âm 10phút, bo sung methanol vừa đủ Lắc đều và lọc.
Mầu thử 1: Hút chính xác 5 mL dung dịch thử và 6 mL dung dịch chuấn gốc cho vào bình định mức 50 mL, thêm 13,8 mL methanol và sau cùng thêm dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2 M đến vạch và trộn đều Lọc qua giấy lọc milipore o = 0,45 pm.
Mầu thử 2: Hút chính xác 5 mL dung dịch thử và 8 mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 mL, thêm 13,8 mL methanol và sau cùng thêm dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2 M đến vạch và trộn đều Lọc qua giấy lọc milipore
Mẩu thử 3: Hút chính xác 5 mL dung dịch thử và 10 mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 mL, thêm 13,8 mL methanol và sau cùng thêm dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2 M đến vạch và trộn đều Lọc qua giấy lọc milipore o = 0,45 pm.
Mẩu thử 4: Hút chính xác 5 mL dung dịch thử và 12 mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 mL, thêm 13,8 mL methanol và sau cùng thêm dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2 M đến vạch và trộn đều Lọc qua giấy lọc milipore o = 0,45 Lim.
Mẩu thử 5: Hút chính xác 5 mL dung dịch thử và 14 mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 mL, thêm 13,8 mL methanol và sau cùng thêm dung dịch amoni dihydrogen phosphat 0,2 M đến vạch và trộn đều Lọc qua giấy lọc milipore o = 0,45 pm.
+ Tiêm20 pL các dung dịch mẫu thử vào hệthống sắc ký, mồi mẫu tiêm 3 lần
+ Từ diện tích pic cùa Cefuroxim axetil thu được từ dung dịch chuẩn ở tính tương thích hệ thống và dung dịch thử, hàm lượng cùa các chat chuẩn, tính hàm lượng của Cefuroxim có trong mầu thử
- Lượng thêm vào là niT (suy từ khối lượng cân và hàm lượng trên nhãn của chất đối chiếu).
- Ketquả định lượng hồn hợp trên là M
- Hiệu suất thu hồi được tính theo côngthức :
+ Trong định lượngtỳ lệ phục hồi phải trong khoảng từ 98,0% đến 102,0%.