Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật chế phẩm chứa hoạt chất nanocurcumin dạng liposom.pdf

Các phương pháp kiểm tra kích thước hạt Các phụ lục quy định về xác định kích thước hạt theo nguyên tắc tán xạ ánh sáng động trong các Dược điếm Có nhiều cách đế khắc phục hạn chế của vi

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

Tên đề tài:

Số hợp đồng: 2017.01.43 /HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Tường Vân

Đơn vị công tác: Khoa Dược

Thời gian thực hiện: 1/2017-09/2017

TP Hồ Chỉ Minh, ngày 30 thảng 9 năm 2017

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

Tên đề tài:

Số hợp đồng: 2017.01.43 /HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Nguyền Tường Vân

Đơn vị công tác: Khoa Dược

Thời gian thực hiện: 4/2017-09/2017

Khoa Dược, ĐH Y Dược Tp Hồ Chí Minh

ĐẬT VÁN ĐỀ

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 CURCUMINOID 2

1.1.1 Tác dụng và công dụng 2

1.1.2 Hấp thu - Chuyển hóa - Thải trừ 4

1.2 LIPOSOM 5

1.2.1 Giới thiệu chung về liposom 5

1.2.2 Phân loại 6

1.2.3 Cấu tạo hóa học 6

1.2.4 ứng dụng 7

1.2.5 Các phuơng pháp kiêm tra kích thuớc hạt 7

1.3 NANOCURCUMIN LIPOSOM 7

1.3.1 Vai trò 7

1.3.3 Đặc điểm hóa lý 8

1.4 THIẾT BỊ ZETASIZER NANO 8

1.4.1 Nguyên lý hoạt động của máy đo kích thuớc hạt 8

1.4.2 Câu tạo máy đo kích thuớc hạt 11

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CURCUMIN 12

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 14

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN cúư - HÓA CHÁT - TRANG THIẾT BỊ 14

2.1.1 Đoi tuợng nghiên cứu 14

2.2.2 Chất chuấn làm việc-hóa chất -dung môi-trang thiết bị 14

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cữu 15

2.3.1 Phân lập curcumin II và curcumin III từ bột nghệ 15

2.3.2 Thẩm định quy trình định luợng đồng thời các curcuminoid 16

2.3.3 ứng dụng quy trình định lượng vào chế phẩm 19

2.3.4 Đọ hoa tan

2.3.5 Đo kích thước hạt 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3 1 XÁC ĐỊNH ĐẠC TÍNH CẢM QUAN, ĐỘ TINH KHIẾT VÀ CÁU TRÚC CHÁT THU ĐƯỢC ' 22

3.1.1 Cảm quan 22

3.1.2 Xác định độ tinh khiết 22

3.1.3 Xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ .25

3.2 THÂM ĐỊNH QUY TRINH ĐỊNH LƯỢNG ĐÒNG THỜI CƯRCUMIN I, CURCUMIN il, CURCUMIN III ’ 28

3.2.1 Tính tương thích hệ thống 28

3.2.2 Tính đặc hiệu 29

3.2.3 Độ chính xác 31

3.2.4 Tính tuyến tính 32

3.4 Độ HÒA TAN 35

3.5 KÍCH THƯỚC HẠT 36

3.6 YÊU CẦU CHÁT LƯỢNG 37

3.2 BÀN LUẬN 38

3.2.1 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁU TRÚC CXI, CX2 TỪ BỘT NGHỆ 38

3.2.1.1 Phân lập : ' 38

3.2.1.2 Xác định cấu trúc 38

3.2.2 THÁM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI BA CƯRCUMIN ’ 40

3.2.3 THỬ Độ HÒA TAN CHẾ PHÁM CHỨA NANOCURCƯMIN LIPOSOM41 3.2.4 KÍCH THƯỚC HẠT NANOCURCUMIN LIPOSOM 41

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 HỢP ĐÓNG

THUYẾT MINH ĐÈ CƯƠNG

Joint FAO/WHO Expert Committee on Food AdditiveTransmission electron microscopic

Fluorescence PolarizationMass Spectrometry

Non Invasive Back ScatterNuclear magnetic resonancePDA

PDI

RSD

Photodiode Array Detector The polydispersity index Relative standar DeviationTHF

USP

TetrahydrofuranUnited States Pharmacopoeia

Hình 1.3: Các dạng liposom 6

Hình 1.4: Sự tán xạ ánh sáng khi chùm tia đi qua qua mầu đo 9

Hình 1.5: Đồ thị biểu diễn sự biến đổi cường độ chùm tia tán xạ theo thời gian 9

Hình 1.6: Sự tương quan giừa tín hiệu cường độ ánh sáng tán xạ của cùng một tiếu phân ở các thời điềm khác nhau 10

Hình 1.7: Biểu đồ thể hiện sự tương quan giừa kích thước phân tử và thời gian suy biến của dao động 10

Hình 1.8: Phân bố kích thước theo cường độ 11

Hình 1.9: Sơ đồ cấu tạo máy đo kích thước hạt 12

Hình 1.10: VỊ trí đầu dò so với chùm tia tới 12

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập curcumin I, curcumin II, curcumin III 15

Hình 3.1: Ket quả sắc ký lớp mỏng CX2 và CX3 với 3 hệ pha động 23

Hình 3.2: Phổ DSC của CX2 23

Hình 3.3: Phổ DSC của CX3 23

Hình 3.4: sắc ký đồ của CX2 23

Hình 3.5: Độ tinh khiết pic CX2 24

Hình 3.6: sắc ký đồ của CX3 24

Hình 3.7: Độ tinh khiết pic CX3 24

Hình 3.8: sắc ký đồ mầu trắng 29

Hình 3.9: sắc ký đồ dung dịch AI 29

Hình 3.10: sắc ký đồ dung dịch All 29

Hình 3.11: sắc ký đồ dung dịch Bill 30

Hình 3.12: sắc ký đồ mẫu thử 30

Hình 3.13: sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn 30

Hình 3.14: Đồ thị tương quan giữa nồng độ các dung dịch đối chiếu và diện tích pic của curcumin 1 32

Hình 3.16: Đồ thị tương quan giữa nồng độ các dung dịch đối chiếu và diện tích pic

của curcumin III 32

Hình 3.17: sắc ký đồ dung dịch mầu thử 34

Hình 3.18: sắc ký đồ dụng dịch AI 34

Hình 3.19: sắc ký đồ dụng dịch All 34

Hình 3.20: sắc ký đồ dụng dịch AIII 35

Hình 3.21: Sơ đồ kích thước hạt và phân bố kích thước hạt của chế phấm 37

Hình 3.22 Sự hồ biến ceton - enol của curcumin I, curcumin II, curcumin II 40

Bảng 2.1 Thành phần và công thức cùa viên 14

Bảng 2.2 Thông tin các chất chuẩn 14

Bảng 2.3 Danh mục nguyên liệu - hóa chất - dung môi 14

Bảng 2.4 Danh mục trang thiết bị sử dụng 14

Bảng 2.5 Cách chuẩn bị các dung dịch xây dựng đường tuyến tính 17

Bảng 3.1: Kết quả độ tinh khiết sắc ký lỏng của CX2 và CX3 25

Bảng 3.2: Các nhóm chức của CX2 và CX3 suy ra từ pho IR 25

Bảng 3.3: So sánh phổ khối ESI (MS+) của CX2, CX3 với tài liệu tham khảo 25

Bảng 3.4: Phổ 'H-NMR (DMSO, 500 MHz) của CX2 so với tài liệu tham khảo 26

Bảng 3.5: Phổ 13C-NMR (DMSO, 125 MHz) của CX2 so với tài liệu tham khảo 26

Bảng 3.6: Phổ 'H-NMR (DMSO, 500 MHz) của CX3 so với tài liệu tham khảo 27

Bảng 3.7: Phổ 1’C-NMR (DMSO, 125 MHz) của CX3 so với tài liệu tham khảo 27

Bảng 3.8: Kết quả thẩm định tính tương thích hệ thống của dung dịch B I 28

Bảng 3.9: Ket quả thấm định tính tương thích hệ thống cùa dung dịch B II 28

Bảng 3.10: Kết quả thẩm định tính tương thích hệ thống của dung dịch B III 28

Bảng 3.11: Ket quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng 31

Bảng 3.12: Ket quả xây dựng đường tuyến tính của 3 curcumin 32

Bảng 3.13: Độ phục hồi cùa curcumin I 33

Bảng 3.13: Độ phục hồi của curcumin II 33

Bảng 3.15: Độ phục hồi của curcumin III 33

Bảng 3.16: Hàm lượng curcumin trong chế phẩm 35

Bảng 3.17: Ket quả định lượng curcumin hòa tan ở 30 phút, 45 phút, 60 phút 35

Bảng 3.18: Ket quả định lượng độ hòa tan của chế phâm 35

Bảng 3.19: Bảng kết quả đo kích thước hạt của chế phẩm 36

phẩm chứa hoạt chất nanocurcumin dạng

liposom

2 Bài báo tóm tắt kết quả (đã nộp - đăng

ký đăng trên tạp chí nhà trường)

phẩm chứa hoạt chất nanocurcumin dạng liposom

2 Bài báo tóm tẳt kết quả (đăng ký đăng trên tạp chí nhà trường)

Thời gian thực hiện : 9 Tháng Từ tháng 1 năm 2017 đến tháng 9 năm 2017Thời gian nộp đề tài: 15/11/2017

1 Đặt vấn đề.

Curcumin là thành phần chính của hợp chất curcuminoid có trong cù nghệ Curcuma

longa L Zingiberaceae Curcuminoid có nhiều công dụng chừa bệnh nhưng các bằng chứng lâm sàng trên người khỏe và người bệnh đều cho thấy nanocurcumin có sinh khả dụng đường uống cao hơn curcumin Các chế phàm chứa nanocurcumin lưu hành ngày càng nhiều trên thị trường Hiện nay dược dien Việt Nam chưa có chuyên luận quy định về che phấm chứa nanocurcumin Do đó, đề tài được thực

hiện nhằm mục tiêu 'Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang mềm chứa

nanocurcumin”.

2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu.

pháp sắc ký cột Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho viên nang mềm chứa nanocurcumin

3 Ket quả và bàn luận.

Phân lập được curcumin II, curcumin III tinh khiết trên 98 % từ bột nghệ

Xác định sự phù hợp cấu trúc bằng các phương pháp pho như IR, MS và NMR.Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phàm chứa nanocurcumin

4 Ket luận.

Tiêu chuẩn cơ sở cho chế phàm chứa nanocurcumin gồm các chỉ tiêu: tính chất, độ đong đều khối lượng, độ hòa tan, định tính và định lượng

Nguyễn Tường VânSupevisor: Assoc Prof Dr Vĩnh Định

1 Introduction.

Curcuminoids are the main components of turmeric, Curcuma longa L

Zingiberaceae Curcuminoids have numerous therapeutic activities However, extensive research in many health conditions proves that nano curcumin has oral bioavailability better than that of curcumin Softgel containing nano curcumin known as supplementary food is widely sold in the pharmaceutical market The Vietnamese Pharmacopoiea has no monograph relating to nanocurcumin Therefore, the thesis is carried out to establish in-house specifications for softgel capsules containing nano curcumin

2 Materials and method.

Objects Softgel CLINOVA containing nano curcumin

Methods Isolate demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin from turmeric by

traditional column chromatography Establish in-house specifications for softgel capsules containing nano curcumin

3 Results and discussion.

Demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin are successfully isolated from turmeric Their purity is above 98 % The structures of the two substances are determined by spectrometric methods as IR, MS and NMR

In-house specifications are proposed with totally five requirements

4 Conclusion.

The in-house specifications for softgel capsules containing nano curcumin have been established, including: form, uniformity of weight, solubility test, identification and assay

ĐẶT VẤN ĐÈ

Curcuminoid, thành phần trong cù nghệ, tạo nên màu vàng đặc trưng của củ nghệ, làm gia vị thức ăn, được chiết từ phần rề củ cùa của Curcuma longa L Zingiberaceae Danh từ curcuminoid thường được dùng đại diện cho curcumin I, curcumin II, curcumin III tìm trong dịch chiết nghệ Curcuminoid có nhiều công dụng chữa bệnh, vị thuốc trong các bài thuốc cổ truyền của người Án Độ Curcumin, chiếm từ 2 - 5 %, là chất có hoạt tính sinh học nhiều nhất trong các curcuminoid Tuy nhiên, các bằng chứng lâm sàng trên người khỏe và người bệnh đều cho thấy sinh khả dụng đường uống của các curcuminoid thấp Gần đây có nhiều nghiên cứu dược động học ở người, thực hiện trên đối tượng nanocurcumin, dạng bào chế hạt nano của curcumin, có kích thước hạt từ 1 - 100 nm Khi so sánh sinh khả dụng của nanocurcumin và dịch chiết curcumin (chứa 95 % curcuminoid), cho thấy khi được bảo vệ trong lớp acid béo, và bao bọc bên ngoài là một lớp chất nhũ hóa thân nước, giúp tăng khả năng phân bố của curcumin trong cơ thế, đặc biệt

là curcumin bị giải phóng chậm hơn, không bị chuyến hóa ở dạ dày và gan, do đó giúp tăng sinh khả dụng

Các che phẩm chứa curcumin lưu hành ngày càng nhiều trên thị trường Đe phát huy những ưu điếm của dạng bào chế đặc biệt này, các chế phấm cần phải đảm bảo kích thước hạt phù họp (1 - 100 nm), on định trong quá trình bảo quản Hiện nay dược điển chưa có chuyên luận quy định về chế phẩm chứa hoạt chất dưới dạng tiểu phân nano nói chung và hoạt chất nanocurcumin nói riêng Do đó, trong phạm vi đề tài tôt nghiệp cao học này, “Xây dựng tiêu chuấn cơ sớ viên nang mềm chứa nanocurcumin” là mục tiêu cần đạt được Đong thời có áp dụng đe kiếm tra chế phẩm lưu hành trên thị trường hiện nay

MỤC TIÊU NGHIÊN cửu

1 Phân lập curcumin II, III từ bột nghệ

2 Thấm định quy trình định lượng đong thời curcumin I, curcumin II, curcumin III

3 Xây dựng tiêu chuẩn kỳ thuật cho Viên nang mềm chứa nanocurcumin

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CURCUMINOID

1.1.1 Tác dụng và công dụng [4]

Theo Ayurveda (quyến sách viết về truyền thống chăm sóc sức khỏe của người Án Độ), đề cập đến nghệ với nhiều công dụng liên quan đến viêm như trị bong gân, sưng đau do chấn thương, làm lành vết thương, đau bụng [4]

Trong sách dược cổ truyền của Trung Hoa, nghệ được dùng đe chừa đau bụng và nhiều công dụng khác liên quan đen tác dụng kháng viêm Năm 1949, công bố khả năng kháng khuẩn của curcumin, tiếp theo đó curcumin được chứng minh có công dụng kháng viêm, chống oxy hóa, ngăn hoại tử, ngừa ung thư, tác nhân trong hóa trị liệu, chống tăng sinh tế bào, làm lành vết thương, giảm đau, kháng ký sinh trùng, chong sốt rét [4]

Trong Dược Điển Việt Nam IV có chuyên luận Khương hoàng (Uất kim), là thân rễ nghệ có tác dụng hành khí, phá huyết, chỉ thống, sinh cơ Nghệ được dùng để chừa kinh nguyệt không đều, bế kinh, đau tức sườn ngực, khó thở Phụ nữ đau bụng sau

đẻ do máu xấu không sạch, kết hòn cục, hoặc ứ huyết do sang chấn, viêm loét dạ dày, vet thương lâu liền miệng [4]

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu lâm sàng của curcumin và dịch chiết nghệ [4]

Bệnh & Số bệnh nhân Liêu và tân sô r 1 xổ- -í Kết quả nghiên cứu

10 bệnh nhân 500 mg/ngày X 7 ngày

Giảm lipid peroxyd 33

%, cholesterol toàn phần 12 % và tăng HDL cholesterol 29 %

40 bệnh nhân

625 mg X 4 lẩn/ngày X

56 ngày Dung nạp tốtChức năng túi mật

12 bệnh nhân 20 mg, liều duy nhất

Gảm thê tích túi mật 29%

Chức năng túi mật 20 - 80 mg, liều duy Gảm thê tích túi mật

Bệnh & Số bệnh nhân Liêu và tân sô I sì., -.1 -á Kết quả nghiên cứu

Vảy nến

40 bệnh nhân Gel curcumin 1%

Giảm diện tích tôn thương

Ung thư đại trực tràng

15 bệnh nhân

450 - 3600 mg/ngày X

Hội chứng viêm đại tràng co

thắt

207 bệnh nhân

72-144 mg/ngày X 56

Ưng thư gan di căn

12 bệnh nhân

450-3600 mg/ngày X 7 ngày Sinh khả dụng thấpGhép thận

43 bệnh nhân

480 mg X 1 -2 lần /ngày X 30 ngày

Cải thiện chức năng thận, giảm độc thần kinh

Viêm tụy

20 bệnh nhân

500 mg/ngày X 42

Viêm ruột thăng

Giảm tái phát, cải thiện triệu chứng

Việc sử dụng nghệ, dịch chiết từ nghệ và nhựa dầu nghệ trong thực phẩm con người được chứng nhận an toàn GRAS bởi Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa

Kỳ FDA Theo ủy ban chuyên về phụ gia thực phẩm JECFA và Co quan an toàn thực phẩm Châu Âu EFSA đã xác định, lượng curcumin tiêu thụ vào cơ thể mồi ngày tối đa [4]

Curcumin

CTPT: C2lH20O6

KLPT: 368,39

Demethoxycurcumin CTPT: C20H18O5 KLPT: 338,35

Bisdemethoxycurcumin CTPT: C19H16O4 KLPT: 308,33Hình 1.1: cấu trúc hóa học của curcumin I, curcumin II, curcumin III

1.1.2 Hấp thu - Chuyển hóa - Thải trừ

Hấp thu Curcumin được hấp thu rất ít vào máu Trong một nghiên cứu về liều

curcumin, với sự tham gia cùa 15 bệnh nhân ung thư trực tràng, uống dịch chiết nghệ (18 mg curcumin và 2 mg dần chất demetoxy curcumin phân tán trong 200 mg tinh dầu) mồi ngày trong 4 tháng Curcurmin và cả các chất chuyển hóa của curcumin (curcumin liên hợp glucuronid hoặc sulfat, hoặc hexahydrocurcumin hoặc hexahydrocurcuminol) được tìm thấy trong nước tiểu hoặc trong máu, nhưng curcumin được tìm thấy trong phân Điều này giúp rút ra kết luận rằng, curcumin

có sinh khả dụng đường uống thấp do bị chuyển hóa trong ruột Trong một nghiên cứu lâm sàng khác, cho 25 bệnh nhân có nguy cơ ung thư uống curcumin liều tăng dần trong 3 tháng cho thấy liều lặp lại của curcumin không làm thay đổi dược động học của chất này và cũng không xảy ra sự tích tụ [3]

Chuyển hóa Trong một thừ nghiệm trên 10 người, uống liều duy nhất 2g

curcumin, nong độ trong huyết thanh không the đo được hoặc rất thấp Tuy nhiên, nếu uống curcumin chung với 20 mg piperin, chất ức chế quá trình liên hợp glucuronic ở gan và ruột, làm nồng độ curcumin trong huyết thanh tăng cao 15-60 phút sau khi uống, và sinh khả dụng curcumin tăng 2000 % Kanai et al (2012) đánh giá dược động học của của một dạng bào chế mới của curcumin, nanocurcumin, với độ tan tăng cao trong nước Trong nghiên cứu này, 6 người tình nguyện khởe mạnh (5 người nam và một người nữ từ 38 - 51 tuoi, trung bình là 44 tuổi, chỉ số khối cơ thể từ 20,2 - 27,8, trung bình 24,4, uống 150 mg nanocurcumin liều duy nhất Sau khoảng thời gian 2 tuần, những cá the này uống 210 mg nanocurcumin liều duy nhất Nồng độ curcumin trong huyết tương được đo tại 0, 1,

2, 4, 6, và 24 giờ sau khi uổng curcumin Nồng độ tối đa của liều 150 mg là 189 ng/ml và liều 210 mg là 275 ng/ml, và diện tích dưới đường cong đo được sau 24 giờ lần lượt là 2649 ng/ml X giờ và 3649 ng/ml X giờ Thời gian bán thải của liều

150 mg là 9,7 giờ và của liều 210 mg là 13 giờ Ket quả cho thấy nồng độ curcumin huyết tương tăng lên một cách an toàn đến liều 210 mg mà không làm bão hòa đường hấp thu [3]

1.2 LIPOSOM

1.2.1 Giói thiệu chung về liposom

Liposom là nhừng nang kín có hai lớp màng cấu tạo bởi phospholipid Trong cấu trúc phospholipid, hạt liposom có hai phần riêng biệt: một lõi thân nước bao quanh bởi một hoặc nhiều lớp màng kép sap xếp dày đặc Lõi thân nước có đường kính từ 0,03 - 10 pm [6]

PHOSPHOLIPID

LIPOSOM

Hình 1.2: cấu tạo hạt liposomLớp màng kép có thể cấu tạo bởi phân tử lipid tự nhiên hay tổng hợp Phospholipid thường được dùng đe bào chế liposom Phospholipid có thế giữ các hoạt chất thân dầu và thân nước bên trong lõi và lóp lipid kép, đóng vai trò như hệ thống phân phoi thuốc Tuy nhiên, liposom có the bào chế ở nhiều kích thước với một hoặc nhiều lóp màng kép Liposom được ứng dụng rộng rãi trong lâm sàng |6|

Bảng 1.2: Một số ứng dụng lâm sàng của dạng bào chế liposom [6]

Doxurubicin Phosphatidylcholine, cholesterol 150- 190 nm Ungthư buông trứng,

vú

Cytabarin

Dioleoylphosphatidylcholin

(trứng), cholesterol,triolein, và dipalmitoylphosphatidylglycerol

<100 nm Các bệnh do nấm

Vaccin viêm

gan A

Phosphatidylcholin (khángnguyên bê mặt của virus cúm)

and phosphatidylethanolamin

150 nm Ngừa viêmgan A

Verteporin Dimyristoyl phosphatidylcholin

và phosphatidylglycerol (trứng)

Chữa thoái hóa diêm

vàng

1.2.2 Phân loại •

Liposom được phân loại theo kích thước và số lóp màng kép, hai yếu tố quan trọng kiểm soát sự phân phối thuốc Xét về kích thước, kích thước hạt nhỏ thay đoi từ 0,02 - 0,2 pm, còn nhóm có kích thước lớn thì đường kính > 0,2 pm

Phân loại liposom theo hình thái và kích thước [6]

Màng kép Màng đơn - kích thước Màng đơn - kích thước

Hình 1.3: Các dạng liposomHình dạng hạt liposom được xác định bằng kính hiến vi điện tử truyền qua TEM Là một thiết bị nghiên cứu cấu trúc vật rắn không thể nhìn thấy bằng mắt thường Thiết

bị này sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mầu vật rắn mỏng

và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỳ thuật số [6]

1.2.3 Cấu tạo hóa học

Liposom có the được cấu tạo bởi ba thành phần (1) nhiều loại phospholipid, chủ yếu

là các phospholipid trung tính (phosphatidylcholin, 1 -monostearoyl-rac-glycerol, 1.2-dipalmitoylsnglycerol, tripalmitin) (2) cholesterol (40-50 %) đê tăng độ ôn định trong dịch sinh học (3) các họp chất tích điện (5-20 %) đe ngừa sự kết tụ (ví dụ: các lipid có tính acid như phosphatidylserin, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, acid phosphatidic và cardiolipin) |6]

Phospholipid của liposom có tính lưỡng cực (có đầu phân cực và đuôi kém phân cực) và có tính chất tương tự như chất hoạt động bề mặt (the hydrophil—lipophil balance) Đuôi kém phân cực là các acid béo, có từ 10-24 carbon, và đầu phân cực chứa acid phosphoric gắn với phần thân nước Dựa trên nguyên tắc này, phosphatidylcholin (lecithin) là một lipid được sử dụng phố biến trong bào chế dạng liposom |6]

Khi những phospholipid này được phân tán trong dung môi phân cực (ví dụ: nước), các đuôi acid béo liên kết với nhau như pha dầu, và đầu phân cực quay về hướng có pha nước Vì vậy, hoạt chất, nếu phân cực sè bị giữ bên trong các hạt thân nước, nếu kém phân cực sè bị giữ bên trong các lóp màng kép thân dầu [6|

1.2.4 Úng dụng

Liposom được nghiên cứu đế điều chỉnh và kiểm soát sự phân phối hoạt chất khi hấp thu qua nhiều đường khác nhau như đường tiêm, da-niêm mạc và đường hô hấp Hoạt chất được bảo vệ khi đóng trong hạt liposom, phân phối đến nhiều khu vực khác nhau trong cơ the và được giải phóng khi cấu trúc liposom bị phá vỡ Hạt liposom được hấp thu một cách chọn lọc bởi các tế bào của lới nội mô như gan, lách

và tùy xương Đặc tính này giúp bảo vệ các cơ quan khác không bị tích tụ thuốc cũng như giảm độc tính thuốc [6]

Thuốc thân dầu hay thân nước cũng có the bào chế dạng liposom mà không cần thay đổi cấu trúc của chất mang Tuy nhiên, tùy vào hoạt chất và mục tiêu sử dụng thuốc có the thay đổi điện tích, kích thước và nhừng đặc tính khác của liposom Ngày nay, liposom cấu thành các chất mang dạng túi đe phân phối thuốc, giúp cải thiện kích thước, thành phần và độ on định [6]

1.2.5 Các phương pháp kiểm tra kích thước hạt

Các phụ lục quy định về xác định kích thước hạt theo nguyên tắc tán xạ ánh sáng động trong các Dược điếm

Có nhiều cách đế khắc phục hạn chế của việc sử dụng curcumin, như tạo phức với phospholipid và cyclodextrin, tạo hạt liposom - cấu trúc của những hạt này phân hủy trong môi trường sinh học, tạo hydrogel, nanopolymer, nanolipid Trong đó,

nanoliposom là hệ phân phối thuốc giúp cải thiện khả năng chừa trị và độ an toàn của thuốc Đưa thuốc đến nơi có tác dụng và duy trì tác dụng Thành phần chính của liposom là phospholipid, là những chất tương tự như chất diện hoạt, một đầu thân nước và một đuôi thân dầu Liposom có the bảo vệ hoạt chất không biến tính trong

hệ tiêu hóa và tăng khả năng hấp thuu qua dạ dày - ruột [5]

Lecithin là hợp chất tự nhiên gồm có phospholipid và lipid trung tính Phospholipid

có đầu thân nước mang điện tích dương hoặc âm, và chuồi hydrocarbon dài chưa no

ở đuôi ngoại trừ phosphatidylcholin và phosphatidylethanolamin, chất này có tính diện hoạt ở pH sinh lý Phosphatidylethanolamin là phospholipid lưỡng tính thân dầu và thân nước, có tính tương thích sinh học cao [5]

1.3.3 Đặc điểm hóa lý

Kích thước hạt, Phân bố kích thước hạt Kích thước hạt trung bình, phân bố kích

thước hạt và the zeta được đo bằng một thiết bị hoạt động theo nguyên tắc tán xạ ánh sáng động DLS Kích thước hạt phụ thuộc vào (1) Thông số vật lý trong bào chế (2) thành phần acid béo (3) tính chất diện hoạt của lecithin Bên cạnh đó, có sự tương tác giừa curcumin và lecithin giúp cho lõi hạt thêm ben vững [5]

Quét nhiệt vi sai (DSC) Tính chất vật lý của mầu được phân tích bằng kỳ thuật

quét nhiệt vi sai Mồi nguyên liệu lấy 2 mg curcumin, 2 mg acid palmitic, 2 mg smoothex Trên bieu đồ nhiệt của acid palmitic và Smoothex có đỉnh lần lượt là 63°C và 58 °C, tương ứng với nhiệt độ nóng chảy của những thành phần này Biểu

đồ nhiệt của nanocurcumin phân tích ở lúc mới bào che và 60 ngày sau đó, không

có đỉnh thu nhiệt nào của curcumin, vì curcumin đã được bọc trong tiểu phân nano Đỉnh thu nhiệt của acid palmitic và Smoothex có chút thay đổi trong tiều phân nanocurcumin, vì lipid đã chuyển thành dạng hạt và do sự ảnh hưởng của chất diện hoạt, curcumin và tá dược [5]

1.4 THIẾT BỊ ZETASIZER NANO

1.4.1 Nguyên lý hoạt động của máy đo kích thước hạt

Sự liên quan giữa kích thước tiểu phân và tốc độ di chuyển trong chuyển động

Brown được xác định thông qua phương trình Stokes - Einstein Khi các tiếu phân

di chuyến, pha hình thành và suy biến của ánh sáng tán xạ tạo vùng sáng và vùng

tối, cường độ dao động thay đổi Đo kích thước hạt bằng cách đo mức độ thay đổi cường độ [7]

Đo kích thước hạt dựa vào hiện tượng tán xạ ánh sáng động DLS là đo dao động phụ thuộc thời gian của cường độ tia sáng tán xạ, để xác định Hệ số khuếch tán tịnh (Translational diffusion coefficient-D), sau đó xác định đường kính thủy động lực học (Hydrodynamic diameter - Dh) từ phương trình Stokes - Einstein [7]

Chùm tia laser

Đầu dó

Hình 1.4: Sự tán xạ ánh sáng khi chùm tia đi qua qua mẫu đo

Khi mầu bị chiếu sáng bởi chùm tia laser, sự thay đổi của ánh sáng tán xạ thể hiện qua góc tán xạ 0, được phát hiện bởi một đầu dò photon Tiều phân với các kích thước khác nhau làm làm tán xạ ánh sáng với cường độ khác nhau và phụ thuộc vào góc tán xạ Đo cường độ chùm tia tán xạ ở một góc tán xạ cố định giúp xác định được kích thước phân tử trung bình Nếu đo được nhiều góc tán xạ, có thể xác định được sự phân bố kích thước hạt của hệ phân tán [7]

Dựa vào nguyên tắc này người ta có thể xác định kích thước hạt nhỏ đến 1 nm ở các dạng nhũ tương, micell, poymer, protein, tiêu phân nano, hệ keo [7]

‘ ÌTĩ.rỊ.Dh

D là kích thước hạtk: hang so BoltzmannT: nhiệt độ tuyệt đôi

g: độ nhớtDh: đường kính thủy động lực học

Thôi gian

Hình 1.5: Đồ thị biểu diễn sự biến đổi cường độ chùm tia tán xạ theo thời gian

Cường độ dao động và sự tương quan với phân bố kích thước hạt

Trong dụng cụ đo kích thước hạt có một bộ phận gọi là bộ tương quan số (Digital correlator) Thiết bị này đo lường mức độ giống nhau giữa hai tín hiệu trong một khoảng thời gian Neu so sánh tín hiệu cường độ của pho giao thoa ở thời diem t với tín hiệu cường độ ở thời điểm rất ngắn sau đó t + ôt thì thấy hai tín hiệu này tương

tự nhau - tương quan mạnh Neu so sánh tín hiệu ban đầu với tín hiệu sau đó lâu hơn, ở thời điềm t + 2ôt, thấy hai tín hiệu này cũng tương quan nhau, nhưng không tốt so với tín hiệu ở thời điểm t + ôt Tương tự, nếu so sánh tín hiệu cường độ ở thời điểm t với thời điểm rất lâu sau đó sè thông thấy sự tương quan bởi vì tiểu phân luôn đi chuyển ngẫu nhiên do chuyển động Brown Khi đo kích thước hạt dựa vào hiện tượng tán xạ ánh sáng động DLS, khoảng cách giữa hai lần khảo sát là nano giây- [7]

Hình 1.6: Sự tương quan giữa tín hiệu cường độ ánh sáng tán xạ của cùng một tiểu

phân ở các thời điềm khác nhau

Tốc độ dao động của tiếu phân liên quan đến kích thước phân từ (phương trình Stokes - Einstein) Phân tử lớn, di chuyển chậm, cường độ thay đổi chậm Tương

tự, phân tử nhỏ, di chuyển nhanh, cường độ thay đổi nhanh [7]

Hình 1.7: Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa kích thước phân tử và thời gian suy

biên của dao động

Sử dụng kết quả đánh giá sự tương quan để đo kích thước hạt Phần mềm số học để

đo mức độ suy biến của những phân tử có cùng kích thước, sau đó thu được sự phân

1.4.2 Cấu tạo máy đo kích thước hạt

Một mảy đo kích thước hạt dựa vào hiện tượng tán xạ ánh sáng động DLS gồm 6 bộ phận chính: [7]

Chùm tia laser là nguồn cung cấp ánh sáng đến mầu nằm trong tế bào đo - cuvet

(2) Hầu hết chùm sáng đi xuyên qua mẫu và một số tia sáng tán xạ khi đi qua mầu (3) Đầu dò được dùng đế đo cường độ ánh sáng tán xạ Ánh sáng tán xạ theo nhiều

hướng và đến đầu dò Đầu dò có the ở vị trí 90° hay 173° so với đường đi của chùm tia tới Đầu dò chỉ có thể đo cường độ của chùm tia tán xạ nếu cường độ của chúng nằm trong giới hạn Vì vậy, cần có một (4) bộ lọc đe làm giảm cường độ chùm tia laser Cường độ tia tán xạ giảm theo Khi mầu làm ánh sáng tán xạ rất ít do có nồng

độ thấp hoặc hạt có kích thước nhỏ, bộ lọc cho phép nhiều ánh sáng đi qua Và khi mầu có the làm tán xạ nhiều ánh sáng hơn nhờ kích thước hạt lớn hoặc nồng độ cao,

bộ lọc làm giúp làm giảm cường độ chùm tia laser chiếu đến Cường độ ánh sáng tán xạ đo được từ đầu dò được gửi đến (5) bộ phận xử lý tín hiệu Bộ phận này so sánh cường độ ánh sáng tán xạ ở những thời điểm liên tiếp để so sánh về sự thay đổi cường độ Thông tin từ bộ phận xử lý tín hiệu được chuyển đến (6) máy tính để phần mềm có thể phân tích dừ liệu và cho kết quả về kích thước hạt

Đầu dò: nguyên tắc tán xạ ngược không xâm lấn NIBS Bộ phận phát hiện của thiết

bị DLS hiện đại phát hiện ánh sáng tán xạ ở góc 173 ° giúp đo được dung dịch có

nồng độ thấp và kích thước hạt nhỏ Khi đo cường độ ánh sáng tán xạ ngược, quãng đường tia tới cần phải đi không xuyên qua toàn bộ khối tiểu phân trong cuvet, giúp giảm hiệu ứng đa tán xạ (ánh sáng tán xạ bởi tiểu phân này lại bị tán xạ bởi tiểu phân khác) Quãng đường đi của ánh sáng giảm xuống giúp đo được mầu có nồng

độ lớn horn Hơn nữa, tạp chất trong hệ phân tán thường là những tiểu phân có kích thước lớn, làm tán xạ ánh sáng về phía trước (góc tán xạ nhỏ), NIBS giúp giảm nhiều trong trường họp này

Hình 1.9: Sơ đồ cấu tạo máy đo kích thước hạt

Hình 1.10: Vị trí đầu dò so vói chùm tia tóil.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CURCUMIN

Pha động: acetonitril và acetic 2% /nước (gradient)

Thể tích tiêm: 50 pLTốc độ dòng:l mL/phútNhiệt độ cột: nhiệt độ phòng

• Phương pháp 4 [5]

Đầu dò: PDA, X = 420 nmCột: ZORBAX Eclipse Plus Cl8, 2,lx

50 mm, 1,8 pmPha động: acetonitril-acid phosphoric 1%/nước (40:60)

The tích tiêm: 1 pL

• Phương pháp 6 [11]

Đầu dò: PDA, X = 420 nmCột: C18 Intersil, 250 X 4.6 mmPha động: methanol - acetonitril - đệm phosphat pH 5 (42,5 - 42,5 - 15), đẳng dòng và gradient

Thể tích tiêm: 10 pLTốc độ dòng:l mL/phútNhiệt độ cột: 35 °C

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN cúu - HÓA CHẤT - TRANG THIÉT BỊ 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Sản phâm nghiên cứu là viên nang mêm CLINOVA chứa nanocurcumin liposom

Bảng 2.1 Thành phần và công thức cùa viên

Bâng 2.2 Thông tin các chất chuẩn

Curcumin II 99,45 %, tinh khiêt DSC Tự phân lập

Curcumin III 98,30%, tinh khiết DSC Tự phân lập

2.2.2.2 Hóa chất - Dung môi

_ Bảng 2.3 Danh mục nguyên liệu - hóa chất - dung môi

Acetonitril J.T BAKER"

Tinh khiết, dùng cho sắc ký lỏng

Methanol J.T BAKER*

Nước cat 2 lân

Acid acetic băng MERK

Tinh khiết trong phân tích hóa học

1 Máy sẳcký lỏng Waters Alliance 2695, Đẩu dò PDA 2998

Phan mềm điều khiến và xữ lý dữ liệu EmPower 2

2 Cân phân tích SARTORIUS ABS220-4 (Kem)

Max = 220 g, Min = 0,1 mg, e = I mg,d = 0,1 mg

3 Bê siêu âm Elma

4 Máy đo pH WTW7110

5 Dụng cụ thủy tinh đạt yêu cẩu độ chính xác dùng trong phân tích

6 Máy quang phố Hồng ngoại Thermo scientific ĨS50

7 Máy DSC

8 Máy NMR BRUKER 500 MHz, Viện Hàn lâm Khoa học và Còng nghệ Hà Nội

STT Tên thiểt bị

10 Silica gel 60 (0,015- 0,040 mm)

11 Bảng mỏng Silicagel F254

12 Máy đo khôi phô 910 TQ- FTMS

13 Máy thử độ hòa tan ERWEKA GmbH

Bộ môn Công Nghiệp Dược, khoa Dược, ĐH Y dược Tp HôChí Minh

2.3 NỘI DƯNG VA PHƯƠNG PHAP NGHIÊN cuu

2.3.1 Phân lập curcumin II và curcumin III từ bột nghệ

2.3.1.1 Phân lập các curcumin từ nguyên liệu bằng sắc ký cột

Nguyên liệu là bột nghệ theo chuyên luận curcuminnoid trong ƯSP 38, chứa 95 % curcuminoid Trong đó, hàm lượng curcumin I (70-80%), curcumin II (15-25%), curcumin III (2,5-6,5%) [1] Dùng 1,5 g bột nguyên liệu được hòa tan trong lượng tối thiểu methanol và trộn với 2g silicagel, trôn đến khô, nạp lên cột 2,5 X 80 cm The tích hứng mồi phân đoạn là 15 ml Kiếm tra thành phần các phân đoạn bằng sắc

ký lóp mỏng với hệ cloroform- methanol (95:5) Gộp các phân đoạn có thành phần giống nhau Cô quay thu hồi dung môi (không gia nhiệt) hai phân đoạn curcumin II

và curcumin III, cạo cắn và cân [1] Sau đó xác định độ tinh khiết (sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng, DSC) và xác định cấu trúc (phương pháp quang phổ hồng ngoại, phổ khối, pho cộng hưởng từ hạt nhân)

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập curcumin I, curcumin II, curcumin III

2.3.1.2 Xác định các đặc tính, độ tinh khiết và cấu trúc chất thu được

J Độ tinh khiết DSC: xác định nhiệt độ nóng chảy và độ tinh khiết của curcumin II

và curcumin III bằng phương pháp quét nhiệt vi sai

J Độ tinh khiết sắc ký lỏng: tiến hành sắc ký lỏng curcumin II và curcumin III, đánh giá độ tinh khiết sắc ký lỏng theo phần trăm diện tích pic

Xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ [1]

J Phổ hồng ngoại: đo phổ hồng ngoại của curcumin II và curcumin III, xác định các nhóm chức bằng cách so sánh với vùng dấu vân tay của phổ chuẩn

■S Pho khối: dựa phổ khối xác định khối lượng phân tử khối của curcumin II, III

J Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: đo phổ 'H-NMR và 13C-NMR (DMSO, máy 500 MHz) của curcumin II và curcumin III

2.3.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thòi các curcumỉnoid

2.3.2.1 Quy trình định lượng

Chế phẩm

Viên nang mềm chứa hoạt chất là các curcuminoid dạng nanoliposom

Mồi viên nang mềm có chứa 250 mg nanocurcumin 6 % (kl/kl) (tương ứng 15 mg curcuminoid dạng nano) và một so tá dược: sáp ong trắng, dầu cọ, lecithin, dầu đậu nành

Điều kiện sắc ký lỏng [2]

Đầu dò: PDA2998, À = 420 nm Thể tích tiêm: 10 pL

Cột: Luna® 5 pm C18, 100 A° Tốc độ dòng:l mL/phútPha động: Acid acetic 2 % - Acetonitril (55:45) Nhiệt độ cột: 25 °C

3.3.2.2 Chuẩn bị mẫu

Mầu trắng: Methanol

Dung dịch AI: Cân chính xác khoảng 5 mg curcumin I vào bình định mức 10 ml,

thêm 4 ml Methanol, siêu âm 5 phút, để nguội Cho methanol đến vạch, lắc đều Dung dịch AI có nồng độ curcumin I khoảng 500 pg/ml Thực hiên tưong tự với curcumin II và curcumin III, lần lượt được dung dich All, AIII

Dung dịch BI: Tiếp tục pha loãng dung dịch AI 25 lần đe được dung dịch BI Tiến

hành tương tự với BIIII và B III để có dung dịch BII, Bill lần lượt có nồng độ 20 pg/ml của curcumin II và curcumin III

Dung dịch C: Cân chính xác khoảng 5 mg mỗi curcumin vào bình định mức 10 ml,

thêm 4 ml Methanol, siêu âm 5 phút Đe nguội, cho methanol đến vạch Dung dịch

c có nong độ khoảng 500 pg/ml cho mồi curcumin.

Dung dịch D: Hút chính xác 1 ml mồi dung dịch AI, All, AIII (có nồng độ 500

Ị-ig/ml của curcumin I, curcumin II, curcumin III) cho vào bình định mức 25 ml, thêm methanol đến vạch, lắc đều Dung dịch D có nong độ khoảng 20 pg/ml cho mồi curcumin

Pha loãng dung dịch c và D thành các dung dịch E, F, G, H, I, J lần lượt có nồng độ mồi curcumin là 5, 10, 20, 25, 100 và 200 pg/ml

Bảng 2.5 Cách chuẩn bị các dung dịch xây dựng đường tuyến tính

Dung dich D (20 ụg/ml) Dung dichc (500

Mẩu thử: cân chính xác khôi lượng tương đương một viên thuôc (khoảng 0,4885g)

cho vào bình định mức 100 mL Thêm Methanol đến vạch, lắc đều

Mẩu thử thêm chuẩn: cân chính xác 0,1 g nguyên liệu nanocurcumin cho vào bình

định mức 100 mL, hút chính xác 10 mL dung dịch c cho vào bình định mức này Thêm methanol đến vạch, lắc đều

(k’), số đĩa lý thuyết (N) của 6 lần tiêm để tính kết quả phân tích tính tương thích hệ thống.

Yêu cầu: kết quả phân tích sắc ký đo cùa curcumin, các thông số thời gian lưu tR diện tích pic s, hệ số bất đối As, hệ số dung lượng k’ phải đạt yêu cầu quy định của DĐVN IV RSD (tR, S) < 2 %; 0,8 < As < 1,5; 1 < k’ < 8, N > 3000

Tính đặc hiệu

Là khảo sát khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích

mà không bị ảnh hưởng bởi các chất khác có mặt trong mầu thử

Tiêm các dung dịch mẫu Trang, BI (curcumin I 20 pg/ml), BII (curcumin II 20 pg/ml), Bill (curcumin III 20 pg/ml), D (20 pg/ml của mồi curcumin), mầu Thử và mầu Thử thêm chuẩn

Yêu cầu: quy trình đạt tính đặc hiệu khi

V Mầu trắng không cho pic tại thời gian lưu của curcumin I, curcumin II, curcumin III

V Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thòi gian lưu và pho ƯV trùng với các pic của curcumin trong D và dung dịch BI, BII, Bill

V Diện tích của các pic trên sắc ký đồ của dung dịch thử thêm chuẩn tăng lên so với các pic tương ứng trên sắc ký đo của dd thử Đồng thời các pic phải đạt độ tinh khiết săc ký

Độ chính xác

Chuẩn bị 6 dung dịch mầu thử khác nhau nhưng có nong độ giống nhau Tiêm dung dịch thử vào hệ thống Dựa vào kết quả phân tích, ghi nhận các thông số cho mồi curcumin: thời gian lưu (tR), diện tích pic (S)

Yêu cầu: quy trình đạt tính chính xác khi RSD của hàm lượng mồi curcumin < 2 %

Tính tuyến tính

Là khảo sát sự tuyến tính giữa độ đáp ứng và nồng độ khảo sát

Tiêm các dung dịch E, F, G, H, I, J Ghi nhận diện tích pic Vè đường biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic theo nồng độ Đánh giá độ tuyến tính, xác định phương trình hoi quy và hệ số tương quan Đánh giá tính thích họp của phương trình hoi quy và ý nghĩa các thông số bằng công cụ Data analysis trong chương trình Microsoft Excel Yêu cầu: R2 > 0,995

Độ đúng

Chuân bị mầu thử

J Dung dịch A (Pha loãng 100 lần): hút chính xác 1 mL mầu thử cho vào bình định mức 500 mL Thêm Methanol đến vạch, lắc đều Hút 10 mL dung dịch A cho vào các bình 1, 2 và 3

J Dung dịch B (Pha loãng 200 lần): hút chính xác 5 mL dung dịch A cho vào bình định mức 10 mL Thêm Methanol đến vạch, lắc đều

Chuẩn bị mầu chuẩn: pha các dung dịch chuẩn chung của các curcumin có nong độ curcumin I, curcumin II, curcuminll I lần luợt là 500 pg/mL, 50 pg/mL, 20 pg/mL Tiến hành phân tích độ đúng trên nền mẫu thử: định lượng mẫu thử, suy ra nồng độ mồi curcumin sẵn có trong mẫu thử Từ đó thêm chuẩn của 3 curcumin vào mẫu ở

ba mức nồng độ 100 %, 120 %, 150 % lượng curcumin trong thừ Mồi mức nồng

độ, pha loãng để nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính

Tính độ phục hồi: tỉ lệ phần trăm lượng chuẩn phát hiện được so với lượng thực thế cho vào

2.3.3 Úng dụng quy trình định lượng vào chế phẩm

Chuẩn bị mẫu

Cân chính xác một lượng thuốc tương đương với KLTB viên cho vào bình định mức 100 mL Thêm 30 mL Methanol, siêu âm 2 phút Sau đó thêm methanol đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 pm Điều kiện sắc ký lỏng như sau:

Đầu dò: PDA2998, À = 420 nm Thể tích tiêm: 10 pL

Cột: Luna® 5 pm C18, 100 A° Tốc độ dòng:l mL/phútPha động: Acid acetic 2 % - Acetonitril (55:45) Nhiệt độ cột: 25 °C

3.3.3.1 Định tính

Áp dụng điều kiện sắc ký lỏng như trên, định tính ba curcumin trong mẫu dựa vào thời gian lưu cùa chuẩn curcumin I, curcumin II, curcumin III và 3 pic curcumin trong mầu thử

2.3.3.2 Định lượng

Áp dụng điều kiện sắc ký lỏng như trên, định lượng ba curcumin trong mẫu dựa bằng cách so sánh trực tiếp diện tích pic của curcumin I, curcumin II, curcumin III trong mầu với diện tích pic của của curcumin I, curcumin II, curcumin III

Công thức tính hàm lượng mồi curcumin trong viên

St: Diện tích pic của curcumin

Sc: Diện tích píc cùa chuẩn curcumin tương ứng

Cc: Nồng độ curcumin chuẩn tương ứng

mưin: khối lượng thuốc cân

KLTB: khối lượng trung bình viên

Thời diem lay mầu: 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút Lọc mầu qua màng lọc 0,45

pm ở 36,5 - 37,5 °C và định lượng curcumin được hoà tan bằng phương pháp sắc ký lỏng

Điều kiện sắc ký lỏng như phương pháp định lượng đã được thẩm định ở mục 3.3.2 Không tiến hành thấm định lại quy trình thử độ hòa tan vì, sau khi thử độ hòa tan, thể tích dịch hòa tan tiêm vào hệ thống sắc ký là 10 pL, không ảnh hưởng quá trình sắc ký

Công thức tính độ hòa tan của mồi viên

St 100

HL X (mg) = —X Ccx ——

St: Diện tích pic của curcumin trong viên

Sc: Diện tích píc của chuẩn curcumin tương ứng

Cc: Nồng độ curcumin chuẩn tương ứng

mcân: khối lượng thuốc cân

KLTB: khối lượng trung bình viên

So sánh độ hòa tan ở các thời điểm Xác định thời điếm sớm nhất viên có the giải phóng trên 70 % curcumin toàn phần, ở tại thời điềm này, thử trên 6 viên

Yêu cầu: lượng hoạt chất được hoà tan của mồi viên trong số sáu viên đem thử không được ít hơn 70% lượng hoạt chất ghi trên nhãn Neu có một viên không đạt yêu cầu, thử lại với sáu viên khác và tất cả đều phải đạt (Theo DĐVN IV, Phụ lục 11.4)

Thiết bị: máy Zetasizer nano zs NSX: Malvern - Anh Quốc

Điều kiện đo:

Nhiệt độ môi trường là 25 °C

Tốc độ đếm: 93,9

Cốc đo thủy tinh

Thời gian quét: 100 giây

VỊ trí đo: 0,45 mm

Đo ít nhất 3 lần, lấy giá trị trung bình

Địa điểm đo: Khoa Hóa học ứng dụng - Trung tâm Phân tích Kiếm nghiệm TVU (CPE) Đại học Trà Vinh Địa chỉ: 126 - Nguyền Thiện Thành, Phường 5, TP Trà Vinh.

3 1 XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CẢM QUAN, ĐỘ TINH KHIÉT VÀ CÁU TRÚC CHẤT THU ĐƯỢC

Sản phàm phân lập được là 30 mg curcumin II (2,0 % so với nguyên liệu) và 25 mg curcumin III (1,67 % so với nguyên liệu) Lặp lại quy trình phân lập 2 lần Gộp và trộn đều sản phẩm phân lập, thu được tổng cộng curcumin II (60 mg), curcumin III (50 mg) Mồi lần cân nguyên liệu, chỉ tiến hành sắc ký một lần, không có giai đoạn tinh chế các phân đoạn chưa tinh khiết Hàm lượng curcumin thu được không giống với tỉ lệ các curcumin trong nguyên liệu vì phần lớn curcumin II bị lần với curcumin I và không được sắc ký lại

Hình 3.1: Ket quả sắc ký lớp mỏng CX2 và CX3 với 3 hệ pha động

CX2 và CX3 cho một vết trên bản mỏng khi khai triển với ba hệ dung môi có độ phân cực khác nhau Vậy chất phân lập được đạt độ tinh khiết sắc ký lóp mỏng

Độ tinh khiết DSC

Curcumin II và Curcumin III có nhiệt độ nóng chảy lần lượt là 172 °C và 222 °C [9] Dựa vào đó, bằng kỳ thuật DSC xác định nhiệt độ nóng chảy cùa CX2 và CX3 lần lượt là 169,71 °C và 219,08 °C, với độ tinh khiết lần lượt là 99,45 % và 98,30

Hình 3.5: Độ tinh khiết pic CX2

Bảng 3.1: Kết quả độ tinh khiết sắc ký lỏng cùa CX2 và CX3

CX2 99,53 % 99,66 % 99,66 % 99,65% 99,65 % 99,33 % 99,58 %

CX3 99,23 % 98,79 % 98,70 % 98,71 % 98,75 % 98,90 % 98,84 %Các chât curcumin II và curcumin III đạt độ tinh khiêt săc ký lỏng trên 98 % tính theo 100 % diện tích pic Mặt khác, pic của curcumin tinh khiết không lần pic của tạp chất khác

Phố IR của hai chất CX2 và CX3 tương tự nhau vì có các nhóm chức giống nhau CX3 không cho đình hấp thu của liên kết C-H alkan trong vùng 3000-2800 cm

Phổ khối

Bảng 3.3: So sánh phổ khối ESI (MS+) của CX2, CX3 với tài liệu tham khảo [14]

Curcumin II (C20H18O5) CX2 Curcumin III (C19H16O4) CX3

Phố cộng hưởng từ hạt nhân

• Phổ 'H-NMR cùa CX2:

*: giá trị ô có thê hoán đôi cho nhau (do hiện tượng tautomer: keto-enol)

Bảng 3.4: Phổ ‘H-NMR (DMSO, 500 MHz) của CX2 so với tài liệu tham khảo [9]

*, **, ***: giá trị □ có thề hoán đôi cho nhau

Bảng 3.5: Phổ l3C-NMR (DMSO, 125 MHz) của CX2 so với tài liệu tham khảo [9]

Phổ l3C-NMR của CX3 cho thấy mất tín hiệu cộng hưởng ở □ = 55,69 ppm cùa c

Methoxy Dừ liệu phổ ƯV, IR và NMR chứng tỏ CX3 tương ứng với curcumin III

có công thức phân tử C19H16O4

Công thức cấu tạo của curcumin III như sau:

3.2 THẤM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐÒNG THỜI CURCUMIN I, CURCUMIN II, CURCƯMIN III

Hình 3.8: sắc ký đồ mầu trắng [Tham khảo phụ lục -21]

Hình 3.9: sắc ký đồ dung dịch AI [Tham khảo phụ lục -22]

nm

Hình 3.10: sắc ký đồ dung dịch All [Tham khảo phụ lục -23]