Phân lập vi nấm kháng vi sinh vật từ đất công viên ở Thành phồ Hồ Chí Minh

Chỉ có một số ít các đề tài tiến hành phân lập được các chủng vi nấm sợi có hoạt tính kháng vi sinh vật gâybệnh trên người và động vật [4].. Với mục tiêutrên, chúng tôi thực hiện đề tài

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Đơn vị chù trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

Tên đềtài:

PHÂN LẬP VI NÁM KHÁNG VI SINH VẬT

TỪ ĐẤT CÒNG VIÊN Ớ THÀNH PHÓ HỒ CHÍ MINH

Số hợp đồng: 2020.01,074/HĐ-KHCN

Chù nhiệm đe tài: ThS Lê Quang Hạnh Thư

Đơn vị công tác: Khoa Dược - Đại học Nguyễn TấtThành

Thời gian thực hiện: 03/2020 - 11/2020

TP Hồ Chí Minh, ngày 22 thảng 09 năm 2020

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC 3

DANH MỤC CHỪVIẾTTẨT iii

DANH MỤC BẢNG iv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU 2

1 TỐNG QUAN VỀ VINÁM SỢI 2

1.1 Đặc điêm cơ bản của vi nâm sợi 2

1.2 Nguồn lợi của vi nấm sợi trong đất 3

2 TỐNG QUAN VÈ HỆ VI NÁM SỢl TRONG ĐÁT 5

2.1 Nghiêncứu trên thế giới 5

2.2 Nghiêncứu trong nước 6

CHƯƠNG 2 ĐÓI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỦƯ 9

1 ĐỔI TƯỢNG NGHIÊN cúư, TRANG THIẾT BỊ, HÓACHẤT 9

1.1 Đối tượng nghiên cứu 9

1.2 Dung môi- hóa chất 9

1.3 Vi sinh vật thử nghiệm 9

1.4 Môi trường nuôi cấy 9

1.5 Trang thiết bị 10

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 10

2.1 Phân lập vi nấm từ mẫu đất 10

2.1.1 Phươngpháp thu và xử lýmẫu đất 10

2.1.2 Phân lập vi nấm 11

12. Định danhvi nấm sợi 11

2.3 Thử nghiệm khảo sát tính kháng khuẩn và kháng nấm Candida cùa chất biến dưỡng từ vi nấm 12

2.3.1 Hoạt hóa vi sinh vật thử nghiệm 12

2.3.2 Phưong pháp khảo sát tính khángkhuẩn - kháng nấm Candida 13

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 14

l KẾT QUẢ 14

1.1 Phân lập vi nấm 14

1.2 Định danhvi nấm 14

1.3 Khảo sát hoạt tính kháng visinhvật cùa chấtbiến dưỡng từ vi nấm 15

1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 21

3.1.3.2 Hoạt tính kháng nấm Candida 23

3.2 BÀN LUẬN 25

3.2.1 Phân lập và định danhvi nấm 25

3.2.2 Hoạt tính sinh họccùa chất biến dưỡng từvi nấm trong đất 27

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀNGHỊ 29

4.1 KÉT LUẬN 29

4.2 ĐÈ NGHỊ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤLỤC 1: Môitrường nuôi cấy

DANH MỤC CHỮ VIÉT TẤT

MRSA Staphylococcus aureus đề kháng methicillin

Tp.HCM Thành phố Hồ Chí Minh

DANH MỤC BANG

Trang

Bang 3.1 Ket quả định danh vi nấm phân lập từđất công viên ở Tp.HCM 14

Bảng 3.2 Vi nấm có hoạt tính kháng khuấn 21

Bảng 3.3 Vi nấm có hoạt tính kháng nấm Candida 24

Bảng 3.4 Tỷ lệ phân bốvi nấmđược phân lập từ đất công viênở Tp.HCM 26

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Một số mẫuPenicillium 15

Hình 3.2 Một số mẫuAspergillus 16

Hình 3.3 Paecilomyces sp G46 17

Hình 3.4. Tricho derma sp T411 18

Hình 3.5. Mucor sp T13 18

Hình 3.6 Fusarium H22 19

Hình 3.7 Phoma sp T23 19

Hình 3.8 Curvularia sp. G26 20

Hình 3.9. Cladosporium sp H57 20

ĐẶT • VẤN ĐÈ

Vi sinh vật sống ở khắp nơi trên Trái Đất, ngay cả trong những nơi mà điều kiện tưởng chừnghết sức khắc nghiệtvầnthấycó sự phát trien củavi sinh vật Vi sinh vậttrong đất và trong nước có vai trò rất quan trọng trong các lĩnh vực như nông nghiệp,công nghiệp,ytế Hiện nay, hiện tượng đềkháng kháng sinh ngàycàng lanrộngvàgây nhiều khó khăn cho việc điềutrị các bệnh nhiễm khuẩn Việc tìmkiếm các hoạt chất cótính kháng sinh mớicónguồngốc thiên nhiên,đặc biệtlà từ cácchùngvi sinhvật, đangđược nhiều nhà khoa học quantâm

Trên thế giới, các nhà khoa học đang tập trung theo hướng tìm kiếm các hoạt chất thiên nhiên mới có tác dụng kháng khuấn, kháng nấm là các chất biến dưỡng từ vi sinh vật Trongnước cómột số đề tàitương tựđãđược thực hiện ở các vùng như Tp Cần Thơ,huyệncần Giờ Tuy nhiên, hầu hếtcác nghiên cứu thường được ứng dụng

để bảo vệ cây trồng [3,9] Chỉ có một số ít các đề tài tiến hành phân lập được các chủng vi nấm sợi có hoạt tính kháng vi sinh vật gâybệnh trên người và động vật [4] Việc nghiên cứu và sàng lọc vi nấm có hoạt tính sinh học từ đất mang ý nghĩa khoa học thiết thực nhằmkhai thác nguồn lợi thiên nhiên một cách hợp lý Với mục tiêutrên, chúng tôi thực hiện đề tài “PHÂN LẬP VI NẤM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG

VI SINH VẬT TÙ NGUỒN ĐẤT Ở CÔNG VIÊN THUỘC TP HỒ CHÍ MINH”

Mục tiêu đề tài gồm:

- Phân lập vi nấm từ đất vườn ởmột so vùng thuộc Tp.HCM

- Định danh vi nấmđã phân lập và thuần chủng

- Khảo sát hoạt tính kháng khuấn và kháng Candida củachất biến dưỡng do vi nấm sản xuất

CHƯƠNG 1 TÓNG QUAN TÀI LIỆU

1 TÓNG QUAN VÈ VI NÁM SỢI

1.1 Đặc điểm CO’ bản của vi nấm sợi

Vi nấm được xếp loại trong giới Nam (Fungi) Vi nấm là nhóm nấmcó kích thước hiển vi và thuộc nhóm sinh vật nhân thật (Eukaryote)

Vi nấmlà sinh vật dịdường, có đờisống hoại sinh hoặckýsinh Te bào vi nấmkhông

có diệp lục nên không tự quang họp nhưng có hệ thống enzym dồi dào (cellulase,protease, catalase ) tham gia chuyển hóa chất Chúng tiết các enzym này ra môi trường giúp phân giải các hợp chất phức tạp thành những họp chất đơn giản đe hấpthu Tùy theo cấutạo, có thể chia vi nấm thành hainhóm gồm dạng nấm men (yeast)

có cấu trúc đơn bào và nấm sợi (hyphae) có cấu trúc đa bào

Dựa vào vai trò, nấm ở đất có the đượcchia thành ba nhóm: [ 18]

- Decomposers - nấm hoại sinh: nhóm nấm này giúp biến đoi vật liệu hữu cơ chết thành sinh khối nấm, carbon dioxide (CO2) và các phân tử nhỏ như acid hữu

cơ Những loại nấm này thường sừ dụng cácchấtnền phức tạp như cellulose và lignin.Chúng rất cần thiết trong việc phân hủy cấu trúc vòng carbon trong một số chất gây

ô nhiễm Giong như vi khuấn, chúng đóng vai trò quan trọng giúp giữ lại các chất dinh dưỡng trong đất

- Mutualists - nấm mycorrhizal: đây lànhóm nấmcộng sinh ở rễ các loài cây Đẻ đồilấy chất dinh dưỡng từ cây, các vi nấm này giúp hòa tan và chuyển hóa các chất như phot pho, nitơ, chất vi lượng có trong đất và không khí cho cây sử dụng

- Pathogens hayParasites - nấm ký sinh gây bệnh: nhóm nấm này thường gây giảm năng suất cây trồng, gâybệnh hoặc gây chết sinh vậtkhi chúng xâm chiếm rễ câyvàtấn công các sinh vật khác Các vi nấm thuộc nhóm này thường gặp

như Verticillium, Pythium và Rhizoctonia Chúng gâythiệthạikinh tếlớn trong nông nghiệp mồi năm Tuy nhiên, nhiều loài nấm giúp kiểm soát bệnh trên cây trong vìchúng là thiên địch đối với một sốloài sâu hại hoặc vi nấm gây bệnh khác

Theo Elizabeth Tootyll (1984), nấm mốc có khoảng 5.100 giốngvà50.000 loài được

mô tả, tuynhiên, ước tính có trên 100.000 đen 250.000 loài nấm hiện diện trên Trảiđất

1.2 Nguồn lọi của vi nấm sọi trong đất

Nấm mốc có ảnh hưởng xấu đến cuộc sốngconngười một cách trực tiếp như làm hư hỏng, giảm chất lượng thực phấm trước và sau thu hoạch, trong chế biến hoặc bảoquản Nấm mốc còn gây hư hại vật dụng, quần áo hoặc gây bệnh cho người, độngvật và cây trồng

Nhưng bên cạnh đó, vi nấm còn giữ vai trò quan trọng trong việc phân giải chất hữu

co trả lại độ màu mỡ cho đất trồng Các quy trình chế biến thực phẩm có liên quanđến lên men đều cần đến sự có mặt của vi sinh vật, trong đó có nấm moc Nấm menđược sử dụng để sản xuất rượu vang hay bia Chúng được thêm vào bột để làm bánh

mì có độ nở nhất định, một số được sử dụng để sản xuấtpho mát ở châu Á, một số

vi nấm đượcthêm vào đậu nành để tạo ra một số thực phẩm như nước tương được ủ băng nâmmôc Aspergillus (A.oryzae, A.soyae, A.niger, A.terrỉol ) [2]

Nấm có lợi cùng với một so vi khuẩn cũng có the hình thành các mạng lưới bảo vệxung quanh rễvà lá đe bảo vệ cây chủ Nấm Trichoderma bảovệ rề cây khỏi sự tấncông của các vi sinh vật có hại Nấm còn cung cấpmột lớp vỏ bảo vệ đế cung cấp cảnước và phot pho cho rề cây trong hạn hán Bên cạnh đó, Trichoderma có khả năng sinh tổng hợp các enzymengoạibào như amylase, protease cókhả năng khángmột

số bệnh hại ở cây trồng [5, 23, 24, 26, 28]

Hợp chất cytosporone được chiết tách từ nước dùng lên men của nấm Trichoderma

sp FKI-6626 Cấu trúchóa học được xác định chủ yếubằngquang phố NMR và khốiphổ Hợp chất này thể hiệnhoạttínhkhángkhuẩn chống lại một số loàivi khuẩn như

s.aureus, E.coli, p.aeruginosa và vi nâm gây bệnh như Candida albicans,

Aspergillus oryzae, Mucor racemosu ■■ [ 19]

Trichoderma viride được phân lập từ đất trồng dưa leo tại trang trại Omar Makram (Beheara Governorate, Ai Cập) vào mùa thuhoạch và mùa đông năm 2012/2013 đã được thửnghiệm như một chất kháng khuẩn, chất chống oxy hoá và chống ung thư

T viride từ đất trồng dưa chuột gây ức chế sự phát triển của nấm Fusarium solanỉ,

Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii Ngoài ra, cao chiết sinh khối nấm bằng con

đă được chứng minh có tỉnh kháng khuấn mạnh chống lại Bacillus subtilis, E.coli và

Pseudomonas fluorescens [13].

Nấm mốc cũng giúp tổng hợp những loại kháng sinh (penicillin, griseofulvin),vitamin (nhóm B, riboflavin), enzyme và một số hoạt chất khác dùng trong côngnghiệp thực phẩm và y dược đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới Các loài nấm song cộng sinh hoặc nội sinhtrongtếbào thực vật(endophytes) có khả năngsảnxuấtcác chất biến dưỡng hữu ích cho cây và được chiết xuất để sử dụng trong sản xuất dược phẩm và hóa chất nông nghiệp [12]

“Thời kỳ vàng son" của kháng sinh bắt đầu từ khi Alexandre Fleming lần đầu pháthiện ra chất ức chế vi khuẩn penicillin từ vi nấm Penicillium notation và được Emst Boris Chain và Howard Walter Florey tinh khiết hóa thành chế pham đe dùng trong điều trị (1941) Khi đó người ta định nghĩa "Kháng sinh là chất do vỉ nấm hoặc vi khuẩn tạo ra, hoặc do bán tổng hợp, tổng hợp, có tác dụng điều trị đặc hiệu với liều thấp do ức chế một so quá trình song của vi sinh vật và đơn bào mà không ảnh hưởng

tới vật chủ ” (Turpin, Velu 1857)

Trong các chủng Penicillium được phân lập từ đất nông nghiệp ở Bắc Iran thì

p.aurantiogriseum là mộttrong những loài có hoạttính mạnh nhất Bên cạnh đó, các chủng khác bao gom p.virỉdỉcatum, p.citrinum và p.waksmanii cũng cho thấy hoạt động kháng vi sinh vật đángke đốivới Candida albicans, Bacillus subtilỉs, s aureus,

Salmonella typhi và E.coli [17]

Một số loại nấm thuộc chiAspergillus cũng được biết đếnvới khả năngsản xuất các chấtchuyển hóa cóhoạt tính sinh học khác nhau cho ngành công nghiệp dược phẩm, chẳng hạn như acid terrecyclic A thể hiện hoạt tính chống ung thư và kháng khuẩn[15, 29]; lovastatin có tác dụng giảm cholesterol được sản xuất bởi nấmAspergillus terreus [14]; echinocandin B được sản xuất bởi A.nidulans có tác dụng kháng nấm[l1]; fumagillin là chất chuyển hóa củaA.fumigatus thể hiệntính kháng ký sinhtrùng [26] Một số chủng Aspergillus cũng thể hoạt tính kháng khuẩn chống lại

Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), E.coli, Enterococcus faecalis

kháng vancomycinvà Candida albicans [27]

Nghiêncứu phân lập và sàng lọc vi nấm từ đất của các vùngkhác nhau ở Punjab, Àn

Độ thu được hợp chất mới

7-methoxy-2,2-dimethyl-4-octa-4',6'-dienyl-2//-napthalene-l-one từ Penicillỉum sp thể hiện tác dụng kháng vi sinh vật đáng kể trên cácchủng Staphylococcus aureus, S.epidermidis, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa và

Candida albicans [21]

Sự gia tăng đáng ke hiện tượng đe kháng kháng sinh đã dần đến việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh mới từ vi sinh vật Đất được coi là một trong những môi trườngthích hợp nhất cho sựphát triển của vi sinh vật [16] Vì vậy, các nhàkhoa học đà tậndụng đất là một nguồn đe phân lập ra các vi sinh vật hữuích

2 TÓNG QUAN VỀ HỆ VI NẤM SỢI TRONG ĐẤT

2.1 Nghiên cứu trên thế giói

Khoa học về các vi sinh vậtcó trong đất đã nghiên cứu và phân loại vi sinh vật dựa trên khả năng cố định đạm và các phản ứng sinh hóa Trong quá trình nghiên cứu,các loại vi khuan, nấm men và nấm mốcđã được phân lập và mô tả

Admetz (1886) là người tiên phong trong việc nghiên cứu vi nấm cótrong đất ông

đã phân lập và đặt tên cho 04 loài nấm men và 11 loài nấm mốc bao gồm cả

Aspergillus glaucus, Penicilỉium glaucus và Mucor stolonifer.

Có 19 loài được tìm thấy trong đất nông nghiệp và 28 loài trong đất vườn ở Bẳc 24Parganas, Tây Bengal Trong đất nông nghiệp, vi nấm chủ yếu là Aspergillus niger,

Rhizopus oryzae và Penicillium expansum. Vi nấm chủ yếu trong đất vườn là

Aspergillus nigervàFusarium moniliforme Nghiên cứu của Simpson chỉ ra rằng đấtvườn có nhiều vi nấm hơn so với đất nông nghiệp [25] Tại Hà Lan, Oudermans vàKoning phân lập được 45 loài vi nấm bao gồm cả Trichoderma koningi và Mucor

racemosus [30]

Mahmood Khalid và cộng sự phân lập được 42 loài nấmthuộc 16 chi từmầu đất của

22 địa phương thuộc PakistangômPenicỉllium, Aspergillus, Monocillium, Fusarium,

Mucor, Rhizopus, Cladosporium, Verticillium, Acremonium, Alternaria, Botrytis, Curvularia, Drechslera, Monacrosporium, Monilia và Trichoderma. Điêuđặc biệt là tất cả cácđịa phương trong nghiên cửu thuộc hai loại điều kiện khí hậu làđồi núi thấp (với nhiệt độ toi thiếu là -06°C) vàvùng đong bằng ấm (với nhiệt độ tối đa là 46°C) [22].

Waksman định danh đượchơn 200 loài nấm từ 25 nơi của nước Mỹ Trong số đó, có

4chiphobiếnlàAspergillus, Mucor, Penỉcilliumand Trichodermasống rải rác nhiều nơi Đặc biệt, Mucorvà Penicillium thường xuất hiện trong đất ở vùng ôn đới hayvùngcókhí hậumát mẻ, Aspergilluscótrongđất ở vùngnhiệt đới, Trichodertna xuất hiện trong đấtcó tính chất ẩm ướt hay có tính acid [30]

Penicillium, Aspergillus, Trichoderma và Fusarium là các chủng nâm đượctìm thây nhiều nhất từ các độ cao khác nhau của vùng lyidere-Ikizdere ở Rize, Thố Nhĩ Kỳ.Các chủng vi nấmnàyđược phân lập từ 40 mẫuđất ở độ sâu 25 cm bằng kỳthuậtphaloãngmầu đất [20]

Có 61 chủng nâm sợi bao gôm Alternaria, Aspergillus clavatus, A.fumigates, A.flavus, A.glaucus, A.niger, A.terrus, Fusarium, Mucor, Paecỉlomyces crustaceus,

Penỉcillum, Phoma glomerata, Phoma, Rhizopus, Trichoderma được phân lập tại vùngđất trầmtích của một dòng sôngtại Ấn Độ [27]

2.2 Nghiên cứu trong nước

Vi nấm phân bố rộng rãi trên nhiều loại cơ chất tự nhiên, pho biến ở khắp nơi trên trái đất Các nghiên cứu về hệ vinấmtrongđất tại Việt Nam nói chung và tại Tp.HCM nói riêng còn tương đối ít, chủ yếu tập trung ở các vùng đất thuộc rừng ngập mặn Bên cạnh đó, lợi ích từ vi nấm phân lập từ đất cùacác nghiên cứu trong nước chù yếu

về khả năng the hiện hoạt tính sinh học chống lại bệnh hại ở cây trồng

Theo nghiêncứucủaTrần Thị Minh Địnhvà Trần Thị Thanh Thủy phân lậpđược 58chủng nấm sợi từ đất rừng ngập mặn cầnGiờ Trong đó, tuyển chọn được 01 chủng

Aspergillus terreus the hiện hoạt tính kháng mạnh trên vi khuẩn thử nghiệm gom

Bacillus subtilis và Escherichia coỉi Đồng thời, nhóm tác giả cũng tiến hành khảosát điềukiện nuôi cấy toiưu đethuđược hợp chất có tính kháng sinh từ A.terreus [3]

Cũngtại rừng ngập mặn cần Giờ,theonghiên cứu của VõThị Bích Viên,476 chủng

vi nấm sợi được phân lập từ các mầu lá vàng trên cành, lá mục, cành khô, cành mục, đất mặt, đất sâu 05-10 cm; trong đó, có 98 chúng Aspergillus và 168 chủng

Penicillium Ketquảnghiên cứu cho thấy vi nấmsợi có mặtởhầuhết các cơ chất củarừngngập mặn nhưngđất mặt là cơ chấtcónhiều chủng nấmnhất Các chủng vi nấm thể hiện hoạttính kháng Bacillus subtilis tốtchủ yếu thuộc chiPenicillium [10] Một nghiên cứu khác từ đấtrừng ngập mặn cần Giờ củatác giả NguyễnThiện Phú và VũThị Phương phân lập được 120 chủng vi nấm sợi Nhóm tác giả tuyển chọn được 6chủng vi nấm sợi có khả năng sản xuấtlovastatin Chủng có hoạt tính tốt nhất đượcđịnh danh bằngcáchgiảitrinh tự 28S rRNAchokếtquả thuộc loài Aspergillus terreus

[8]

Báo cáo của PhạmThị Ngọc Lan và Hoàng Dương Thu Hương có đề cập đến nhóm

vi nấm sợi hòa tan phosphate vô cơ đượcphân lập từđất rừng ngập mặn Thừa Thiên

- Huế nhằm cải thiện công tác ươm trồng phục hồi và phát triến hệ sinh thái rừng ngập mặn Từ 18 mầu đất đã phân lập được 164 chủng vi nấm sợi có khả năng hòatan phosphate vô cơ, trong đó 02 chủng có khả năng hòa tan phosphate vô cơ mạnhnhất được định danh đến tên loài đó là Aspergillus oryzae và Aspergillus japonicus

[6]

Có 18 dòng nấm Trichodermađược phân lập từ 26mẫuđất trồng câylương thực, câycông nghiệp và cây ăn quả thuộc các tỉnh Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, TâyNinh, Bà Rịa - Vũng Tàu và Tp.HCM Đây là các chủng nấm có khả năng sản xuất các enzyme ngoại bào nhưamylase, protease và có the khai thác tiềm năng như mộttác nhân sinh học phòng trừbệnh hại cây trồng tại địa phương [5]

Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của tác giảNguyền Thị Hà cho kết quả phân lập được

11 chủng nấm sợi từ đất thuộc quận Ninh Kiều, thành phố cần Thơ cho hoạt tínhkháng E.coli và B.subtilis Các chủng vi nấm này gồm Penicillium, Aspergillus,

Fusarium, Trỉchoderma và Alternaria', trong đó, chủng nấm cho hoạt tính kháng khuân tôt nhât làPenicillỉum pinophilum và Fusarium solani [4]

Một nghiên cứu tại Bình Dương của tác giả Đồ Lương Ngọc Châu và Nguyền AnhDũng thu thập được các chủng Trichodermatừcác mầu thân, lá cành mụcvà đất mặt tại cácvùngnông nghiệp Thử nghiệm khả năng đối kháng của 08 chủngTrichoderma

spp với 02 chủngnấmSclerotium spp gây bệnh thối thân, thối látrên lanMokaravà

Dendrobiutn đều cho kết quả tốt [1]

Trong số 120 chủng vi nấm sợi phân lập từ đất ở 15 địa điếm khác nhau thuộc các huyện Phú Vang, Hương Trà và thành phố Huế, tác giả Phạm Thị Ngọc Lan và VõThị Thanh Nhàn đã tuyển chọn được 02 chủng vi nấm sợi có khảnăng sinh tồng họp chitinase gômAspergillus fumigatus và Aspergillus oryzae [7].

Nhưvậy, đa phần các nghiêncứu trong nước về vi nấm từ đất đều phân lập được các chủng vi nấm sợi chủ yếu thuộc các chi gom Aspergillus, Penỉcillium và

Trichodermci.Các chủngnấm này đềuthể hiện hoạt tính sinh học như khả năng kháng

vi khuẩn và vi nấm gâybệnhhại ở cây trồng hoặc có khảnăng sản xuất các chất biến dưỡng có hoạttínhsinh học tốt

CHƯƠNG 2 ĐÓI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

1 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN củu, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT

1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vi nấm sợi phân lập từ đất thuộc Tp.HCM Loại đất được chọn là đất trongcây cothụ ở công viên,nơi cóbóng râm mát

- Thời gian lấy mẫu: Tháng 07/2018

- Địa điểm lấy mẫu:

+ Côngviên Tao Đàn, 55C Nguyễn Thị Minh Khai, P.Bến Thành, Quận 1;

+ Côngviên Gia Định, đường Hoàng Minh Giám, P.9, Quận Phú Nhuận;

+ Công viên Hoàng Văn Thụ, đường Hoàng Văn Thụ, P.2, Quận TânBình

1.2 Dung môi - hóa chất

Dungmôi, hóa chất, thuốc thử đạtđộ tinh khiết phùhợp vớimục đích sử dụng:

- Hóa chat: acid lactic, phenol (tinh the), glycerol do Trung Quốc sản xuất

1.3 Vi sinh vật thử nghiệm

Vi sinh vật thử nghiệm bao gom:

- Vi khuân: Escherichia coliATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Streptococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213,

Staphylococcus aureus khángmethicillin (MRSA) ATCC 43300

- Vi nâm: Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata PK12B, Candida

tropicalis PK12C

Nơi cung cap chủng vi sinh vật: Khoa Dược, trường Đại học Y Dược Tp.HCM (41 Đinh Tiên Hoàng, P.BếnNghé, Quận 1, Tp.HCM)

1.4 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường Sabouraud (SDA)

- Môi trường Potato DextroseAgar (PDA)

- Môi trườngTryptic Soy Agar (TSA)

- Môi trường Czapeck Dox

- Môi trường Mueller Hinton Agar (MHA)

- Môi trường Potato Carrot Agar (PCA)

- Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) vàChloramphenicol 0,1%

- Môi trường cao nấm men

- Môi trường hồn họp nước chiết ngô và cao nấm men

- Nướcchiết ngô [33]

1.5 Trang thiết bị

- Lò hấp vô trùng Hiyayma HV-110

- Tủcấy vôtrùng ESCO AVC - 4D1

- Máy lắc ổn nhiệt IKA KS 4000Ĩ control

- Máysiêu âm Elmasonic SI20

- Kínhhiểnvi quang học Carl Zeiss microsopy Gmbtt

- Tủ ấm MemmertINB - 5000

- Tủ sấy Memmert unB - 5000

- Tủ âm SANYO SR-U19JN

- Tủ lạnh SANYO SR - U19JN

- Cânkỳ thuật Sartorius TE412

- Máy vortex Labnet SO200 - 23V - EU

Các thí nghiệm được thực hiệntại Bộ môn Vi sinh - Ký sinh trùng, Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành, 300ANguyễn Tất Thành, p.13 Q.4, Tp.HCM

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỦƯ

2.1 Phân lập vi nấm từ mẫu đất

2.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu đất

Đấtđược lấyởđộ sâu 05-10cm bằng dụng cụ sạch và đặt trong petri vô trùng Đấtđược râyqua lướikích thước lồ 01 mm để loại bỏ đá sỏi Mầu được xửlý ngayhoặcđược bảo quản ở4°c không quá 48h

Pha loãng mẫu đất với dung dịchNaCl 0,9% đến nồngđộ đạt yêu cầu:

- Cần 05 ống nghiệm, mồi ống 09 ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, đánh số từ 01 đến 05

- Cho 1,0 g đất vào ốngnghiệm 01, lắc kỳ (độ pha loãng 01/10), đe lắng các phân tửlớn và nặng

- Hút 1,0 ml dung dịch 01 chovào ốngnghiệm số 02.

- Lặp lại bước trên cho đến ống 05 để có độ pha loãng từ 10‘2 đen 10‘5 (lắc kỳ mồi ống trước khi chuyển dịch pha loãng vào ống mới và thay pipet ở mồi độpha loãng)

- Hút 0,1 ml dung dịch ở mồi độ pha loàng, cho lên mặt thạch PDA chứa chloramphenicol 0,1% để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Dùng que tam giác

vô trùng trải dịchđều khắp mặtthạch

- Ú ởnhiệt độ phòng

2.1.2 Phân lập vi nấm

Các đĩa thạch đãtrải mầu đất được ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triến của

vi nấm trong 03 - 07 ngày Thời gian theo dõi cóthế lâu hơn nếu tốc độ sinh trưởngcủa vi nấm chậm

Thu sợi khuẩn ty và cấychuyển sang các môitrường chứachất dinh dường thích họp như môi trường thạch khoai tây đường (PDA), thạch Sabouraud (SDA) Thực hiện cấy chuyền vi nấm nhiều lần đề tinh sạch chủng Tùytheo tốc độ phát triển của vi nấm, tiến hành ù mẫu ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát trien của vi nấm trongkhoảng 01-02 tuần hoặc lâu hơn Kiểm tra độ tinh sạch của chủng bằng cách quansát sựphát triển đồng nhấtcủa khóm nấm và đặc điểm hiển vi Đánh giá tốc độpháttriển của vi nấm trên các loại môi trường khác nhau đế sơ bộ xác định môi trường nuôi cấy thích họp

Cácchủng nấmthu được từ các mầu đất, được kí hiệu dựa trênnơi lấy mẫu (T: côngviên Tao Đàn, G: công viên Gia Định, H: công viên Hoàng Văn Thụ),số mẫu (1,2,

3 )

2.2 Định danh vi nấm sợi

Tên khoahọc của vi nấmđượcxácđịnhđếnchi Vi nấm sợi được tiến hành định danhdựa trênhình thái khóm nấm và đặc điếmhiến vi Quá trình định danh được thực hiện với cácbước cơ bản sau:

Bước 1: Nuôi cấyvi nấm

- Cấytrênđĩa peptriđe đo đường kính và các đặc điểmhình thái của khóm nấm,theo dõi sựpháttriển, sự thay đổi màu sắc, hình dạng của khóm nấm theo thời gian

- cấy lên lame để quan sáthình thể hiển vi như đặc điểm sợi nấm, bào tử

Bước 2: Quansát khómnấm Thời gian tiếnhànhtrungbìnhtừ 03 - 15 ngày Đối với

số chủng nấm phát triến chậm hoặc có cơ quan sinh sản hữu tính, thời gian quan sát

có the kéo dài hơn Quan sát các đặc diemsau:

- Đường kính khóm nấm đế đánh giátốc độ phát triển

- Màu sắc và sự thay đối màu sắc của khóm nấm

- Đặc diem sắc tố được tiếtvào môi trường nuôi cấy

- Đặc điếm giọttiết trên bề mặt khóm nấm

- Các đặc điểm khác: mùi, cấu tử đặc biệt

Bước 3: Quan sát đặc điểm vi nấm dưới kính hiểnvi quang học

Khi nấm trưởng thành, tiến hành nhuộm với thuốc nhuộm Lactophenol cotton blue (LPCB)để quan sátđặc điếm sợinấm, bàotử, cơ quan sinh sản Hoặc tiếnhànhcấytrực tiếp trên lame đế quan sát

Bước 4: Dựavào các khóa phân loại vi nấmđe định danhchủngnấm phân lập được

2.3 Thử nghiệm khảo sát tính kháng khuẩn và kháng nấm Candida của chất biến dưỡng từ vi nấm

2.3.1 Hoạt hóa vi sinh vật thử nghiệm

Vi khuẩn thử nghiệm được cấyhoạthóatrên môi trường TSA 24htrước khitiếnhànhthử nghiệm Sau đó, vi khuẩn được chuyển sang môi trường TSB để tăng sinh trong vòng4h Phaloãngmôi trường TSB bằngnước muối sinhlý đến mật độ tương đương

108 tế bào/ml (so độ đục với ong Me Farland 0,5)

Vi nấm Candida thử nghiệm được cấy hoạt hóa trên môi trường SDA 48h trước khitiến hành thừ nghiệm Pha loãngvi nấmvào nước muối sinh lý và điều chỉnhđến mật

độ tươngđương 106 tế bào/ml (so độ đục với ống Me Farland 0,5)

Vi nấm đã phân lập được hoạt hỏa trênmôi trườngdinh dưỡng phù hợp Sau 03 - 07 ngày, sử dụngdụng cụ để lấy một diệntích khóm nấm nhất định và chuyển sang 02 môi trường dinh dưỡng gồm:

- Môi trường 1: cao chiết nấm men

- Môi trường 2: hồn hợp nước chiết ngô vàcao chiết nấm men

Sauthời gian nuôi cấy 10 ngày, tiến hành siêu âm dịch nuôi có chứa vi nấm 30 phút

và thu dịch đe thực hiện khảo sát hoạttính kháng vi sinh vật

2.3.2 Phương pháp khảo sát tính kháng khuẩn - kháng nấm Candida

Nguyên tắc

Những chất biến dường được vi nấm sản xuất và tiết vào môi trường nuôi cấy Cáchợp chất có tính kháng khuấn/kháng nấm sè lấn át sự pháttriền của vi sinh vật thử nghiệm

Phương pháp đục lỗ

Môi trường thừ nghiệm là thạch đìa MHA dày 04 mm Sử dụng tăm bông vô trùng

để thấm huyền trọc vi sinh vật đã pha loãng và trải đều lên bề mặt thạch Sử dụng dụng cụ đục lồ đe tạo giếng có đường kính 06 mm Nhỏ 70 |11 dịch nuôi vi nấm vàogiếng Đặt đĩa thử nghiệm vào ngăn mát tủ lạnh 2h để chất biến dưỡng của vi nấm khuếch tán vào môi trường thạch Sau đó, đặt đĩa thử nghiệmvào tủ ấm 37°c Tiếnhành đọc kếtquả sau 24hđối với vi khuẩn và sau 48h đối vớivi nấm Candida.

Thực hiện tương tựvới mẫu chứng âm là môi trường nuôi cấy vi nấm gom:

- Môi trường 1: cao chiết nấm men

- Môi trường 2: hồnhợp nước chiết ngô vàcao chiết nấm men

Thử nghiệm được lặp lại 3 lần

Ket quả

Hoạt tính kháng khuấn/kháng nấmđược xác định theo đường kính vòng ức chế (mm)

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1 KẾT QUẢ

1.1 Phân lập vi nấm

Từ các mẫu đất thuộc Tp.HCM phân lập được 103 chủng vi nấm gom 34 chủng từcông viên Tao Đàn, 38 chủng từ công viênGia Định và31 chủng từ công viên Hoàng Văn Thụ

G32, G41, G48, G55, G57, G58;

H12, H16, H23, H31, H35, H42, H43,H44, H54, H55, H56, H59

2 Aspergillus 17 T14,T111,T24, T217, T218;

G13, G21, G24, G31, G33, G42, G43,G51,G52, G53, G54;

H14, H17, H18, H19, H21, H24, H34,H36, H37, H38, H51, H52, H53, H510

Từ 15 mầu đất công viên ở Tp.HCMphân lậpđược 103 mầu vi nấm sợi Dựavào đặc điểmkhómnấm và đặc điểm hiềnvi điểnhình, 69/103 chủngđược định danh đến tênchi - thuộc 09 chi gồm: Penicillium (37 chủng), Aspergillus (17 chủng), Trichoderma

(06 chùng), Mucor (03 chủng), Fusarium (02 chủng), Phoma(01 chủng), Curvularia

(01 chủng), Paecilomyces (01 chùng) và Cladosporỉum (01 chủng) và 34/103 chủng không đủcơ sở để định danh

Hình 3.1 Một số mẫu Penicilliutn

Các mầuPenicỉllium có đặc điểm khóm nấm khá đa dạng Trên môi trường PDA,đaphần các mẫu cho khóm có màu xanh lục xám hoặc xanh lục đậm, rìa khóm màu trắng thường gặp ở Penicilliunv, T22, T25, T28, T36, T37, T38, T39, T310, T314,