Phân lập một số hợp chất từ phân đoạn Chlorofrom của lá cây lá đắng (Vernonia amygdalina Del., Asteraceae)

Dưới đây là một số nghiên cứu ngoài nước về thành phần hóa học cũng như các tác dụng dược lí mà loài cây này mang lại... Trong nghiên cứu của Atangwho và cộng sự năm 2013, nhóm tác giả đ

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH

-0O0 -BÁO CÁO TỎNG KỂT ĐÈ TÀI CHƯƠNG TRÌNH SINH VIÊN NCKH NĂM 20

{Vernonia amydalina Del., Asteraceae)

Mã số đề tài:

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Mơ

Giảng viên hướng dẫn: Ths Ds Bùi Hoàng Minh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC BẢNG 5

DANH MỤC BIẾU ĐỒ sơ ĐỒ HÌNH ẢNH 6

CHƯƠNG 1 TÓNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 Tông quan vê thực vật học 7

1.1.1 Họ Asteraceae 7

1.1.2 Chi Vernonia 8

1.1.3 Loài Vernonia amydalinaĐei 9

1.1.4 Vị trí trong bảng phân loại thực vật 10

1.1.5 Mô tả thực vật 10

1.1.6 Sinh thái và phân bố 11

1.1.7 Bộ phận dùng 11

1.2 Tổng quan về thành phần hóa học 11

1.3 Một số nghiên cứu về Vernonia amydalina Del 14

1.3.1 Một số nghiên cứu ở nước ngoài 14

1.3.2 Một số nghiên cứu trong nước 15

1.4 Tác dụng dược lý 17

1.4.1 Điều trị viêm gan 18

1.4.2 Chống ung thư 19

1.4.3 Khả năng chông oxy hóa 20

1.4.4 Hạ đường huyết 20

1.4.5 Khả năng kháng khuân 21

1.4.6 Khả năng kháng nâm 22

1.4.7 Điều trị sốt rét 22

1.4.8 Bảo vệ thần kinh 22

1.4.9 Bảo vệ dạ dày, ngừa nhiềm độc thận 23

1.5 Công dụng trong y học cô truyên 24

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.1 Nguyên liệu 25

2.1.2 Dụng cụ trang thiết bị 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Độ ẩm 26

2.2.2 Chiết xuất dược liệu và thu các phân đoạn cao 26

2.2.3 Phận lập và tinh chế 27

2.2.4 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc chất phân lập được 28

CHƯƠNG 3 KẾT QƯẢ VÀ SẢN PHÁM ĐẠT Được 29

3.1.1 Độ am 29

3.1.2 Chiết xuất dược liệu 29

3.1.3 Phân lập và tinh chế 30

3.1.4 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc 33

3.2 Bàn luận 43

3.2.1 về đối tượng nghiên cứu 43

3.2.2 về kết quả quá trình chiết xuất 43

3.2.3 về kết quả phân lập 43

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 Kết luận 45

4.2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CÁC CHŨ VIẾT TẤT

ALP Alkalin Phosphatase

ALT Alanin amino transferace

AST Aspartate amino transferace

BHA Butylated hydroxyanisol

DMSO Dimethyl sufoxit

EtOAc Ethyl Acetat

HCOOH Acid Formic

HMBC Hetemonuclear Multiple Bond Correlation

HPLC High Performance Liquid Chromatography

MS Mass spectrometry - khôi phô

NMR Nuclear Magnetic Resonance- Cộng hưởng từ hạt nhân

PE Ether dầu hỏa

PTK Phân tử khối

TMS Tetra Methyl Silan

ưv Ưltraiolet - tử ngoại

vs Vanilin Sulfuric

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột chân không 31

Bảng 3.2 Bảng so sánh số liệu NMR của Ml và Dioctylphtalat [39] 34

Bảng 3.3 Bảng so sánh số liệu NMR của M2 và Stigmasterol 36

Bảng 3.4 Bảng số liệu phổ NMR của M3 38

Bảng 3.5 Bảng so sánh số liệu NMR của M3 và Luteolin 40

DANH MỤC BIẾU ĐỒ - sơ ĐÒ - HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hoa thức và hoa đồ 7

Hình 1.2 Hình thái loài Vernonia amydalina Del 11

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số Sesquiterpen lacton trong v.amygdalina Del [21],[27]11'11111111 1.1.111?1„11.11.11 11.111 1.1.11T 12

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học một số Saponin trong v.amygdalìna Del [27], [29]. 13 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của một số Flavonoid trong v.atnygdalina Del [25], [27] .' ' .14

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học một số hợp chất trong hoa cua v.amygdalìna Del. [26] 14

Hình 2.1 Quy trình chiết xuất và phân lập dự kiến 27

Hình 3.1 Sơ đồ và kết quả quy trình chiết xuất cao lá Lá Đắng 29

Hình 3.2 Sắc ký đồ các phân đoạn cao lá cây Lá Đắng 30

Hình 3.3 Sắc ký cao phân đoạn CHCỈ3 30

Hình 3.4 Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký cột chân không cao CHCh „ 32

Hình 3.5 Sắc ký đồ Ml với 3 hệ dung môi khác nhau 33

Hình 3.6 Công thức hóa học của Ml qua phổ ’H-NMR 34

Hình 3.7 Sắc ký đồ Mz của 3 hệ dung môi khác nhau 36

Hình 3.8 Công thức hóa học của M2 37

Hình 3.9 Sắc ký đồ M3 với 3 hệ dung môi khác nhau 38

Hình 3.10 Cấu trúc hóa học và những tương tác chính trong phổ HMBC của M3 40

Hình 3.11 Sắc ký đồ M4 với 3 hệ dung môi khác nhau 41

Hình 3.12 Sắc ký đồ so sánh V4 và M4 42

Hình 3.13 Công thức hóa học cua Apigenin 42

CHƯƠNG 1 TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về thực vật học

1.1.1 Họ Asteraceae

Dạng sống cỏ, sống một năm hay nhiều năm Thân gồ, cây bụi hay dây leo hiếm gặp

Rễ có the phù lên thành củ, nhưng chất dự trừ ở đây không phải là tinh bột mà là

inullin (Thược dược) Lá có hình dạng biến thiên, không có lá kèm, thường mọc đối hoặc tụ thành hình hoa ở gốc, có những loại lá có gai Thông thường phiến lá nguyên,

xẻ sâu, lá kép hình lông chim hay hình chân vịt hiếm gặp Cụm hoa đầu, có the mang rất nhiều hoa hay ít hoa Đầu có the đứng riêng lẻ hay tụ thành chùm, gié, xim, nhưng thông thường nhất là tụ thành ngừ Có thể xem hoa tự đầu như một gié thu ngắn, trong

đó các hoa đính theo một đường xoắn ốc liên tục, hoa già ở bìa, hoa non ở giữa Dạng thông thường của hoa tự đầu là hình nón, nhưng cũng có the phăng hoặc có khi lõm hình chén Đầu mang hai loại lá bắc: Lá bắc ngoài bất thụ, tạo thành một tổng bao Các

lá bắc này có thế dính thành một hàng (Senecio, Tagetes) hoặc đính trên nhiều hàng

kết lọp Hình dạng và kích thước của lá bắc ngoài rất biến thiên Lá bắc thật có mang hoa ở nách Chúng là những phiến mỏng hẹp, đôi khi có lông Lá bắc thật có the phang hay cong xung quanh hoa; hoặc có the không có Hoa lưỡng tính, mẫu 5, bầu dưới, không có lá bắc con Hoa thức theo kiểu:

Đài có thế biến mất, đôi khi chỉ còn một gờ nhỏ, nguyên hay có thùy; gờ có thế mang những vấy hay một vòng lông tơ Sau khi thụ tinh, đài có thề phát trien thành một mào lông, có thể láng hay có gai, có nhiệm vụ trong sự phát tán cùa quả Tràng do cánh hoa dính, có the đều hình ống (trường hợp hoa giữa của các đầu dị giao) hoặc không đều

có dạng lưỡi nhỏ có 3 răng hay 5 răng hoặc hình môi 2/3 hoặc hình ống dài hơi cong

Bộ nhị 5 nhị bằng nhau, đính trên ống tràng và xen kè với cánh hoa Chỉ nhị rời nhau trừ tông Cynareae Bao phấn mở dọc, hướng trong, dính nhau thành một ống bao quanh vòi Trung đới thường kéo dài trên bao phấn thành phụ bộ Ngoài ra bao phấn còn mang ở gốc nhừng phụ bộ choãi ra tạo thành những tai nhỏ, che chở cho mật hoa ở gốc vòi khởi bị nước mưa Bộ nhụy 2 lá noãn ở vị trí trước-sau, tạo thành bầu dưới 1

ô, đựng 1 noãn, đính đáy Đĩa mật ở trên bầu Ớ hoa lưỡng tính và hoa cái, vòi xuyên qua đìa mật và chia thành 2 nhánh đầu nhụy (vòi không chia nhánh ở hoa bất thụ) Các nhánh đầu nhụy mang ở mặt dưới những lông đe quét hạt phấn khi vòi mọc xuyên qua ống cấu tạo bởi các bao phấn Hoa được thụ phấn nhờ côn trùng Quă bế, thường mang một mào lông do đài biến đổi, có khi mào lông được mang bởi một cuống dài hay ngắn Đôi khi quả trần hoặc có móc hay có gai Hạt không có nội nhũ; lá mầm to, nhiều khi chứa đầy dầu (hạt Hướng dương)

ớ Việt Nam, Asteraceae có khoảng 125 chi và trên 350 loài [8]

1.1.2 Chi Vernonia

Dạng sống cỏ, cây bụi hay cây gồ đôi khi là dạng dây leo sống một năm hay lâu năm

Lá mọc cách, hiếm khi mọc đối, có the có cuống lá hoặc không nhưng thường khó xác định; lá nguyên hay có răng cưa, gân lá hình lông chim Bao hoa tong bao phía trên có hình bát thu hẹp dần thành hình trụ, gồm nhiều lá bắc lợp lại với nhau, gom 6 hàng, lá bắc ở ngoài ngắn, phía trong hay rụng sớm Đe hoa phang hay có gờ nhỏ, thường nhằn hoặc có lông tơ ngắn Hoa cụm hoa tạo thành chùy hay các ngừ ở ngọn hoặc nách lá, hoặc là cụm hoa đơn Hoa có màu hồng, tía, hiếm khi màu trắng; cụm hoa có từ (l-)3- 100+ hoa đơn, hình ống nhỏ, lá đài thường hình chuông hay hình phễu, có 5 thùy Bao phấn có hình mác Quả be hình trụ hay hình nón ngược, thường có 7 - 10 gờ noi rõ, ít khi là 4-5, có tuyến, giữa các gờ thường có hoặc không có lông ngắn Mào lông hai lớp, lóp ngoài là những lông ngắn, đôi khi tiêu biến, lóp trong có nhiều lông tơ hình lông chim, có gai, rụng hoặc ton tại, thường có màu [44]

Chi Vernonia thuộc họ Asteraceae, là chi lớn nhất trong tông Vemoniae với khoảng

1000 loài Các loài trong chi Vernonia phân bo rộng rãi ở nhiều nơi với nhiều điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau: rừng nhiệt đới, đầm lầy, các khu vực ấm ướt, hoang mạc hay sa mạc thậm chí là những khu vực hàn đới ở Bắc Mỳ [41]

Song, tại Việt Nam có khoảng 28 loài, trong đó có một số loài được sử dụng làm thuốc [9], [6]

- Bạch đầu ông, Bạch đầu tro, Dạ hương ngưu (Vernonia cinerea (L.) Less.)

- Bạch đầu sát trùng, Ban cưu cúc sát trùng (Vernonia anthelminthica (L.) Willd)

- Bông bạc, bạch đầu đại mộc (Vernonia arborea Buch.-Ham NZX.javanica El.)

- Dây chè, Rau ráu, đỏ ngọn (Vernonia cuntingiana Benth Var andersoni C.B Clarke)

- Bạch đầu bao gai, Bạch đầu cứng (Vernonia squarrosa (D.Don) Less Var teres

Wall Ex DC.)

- Bạch đầu lá liều (Vernonia saligna (Wall.) D.C)

- Bạch đầu lông (Vernonia parỉshii Hook f.)

- Bạch đầu nhám (Vernonia aspera Buch - Ham.)

- Bạch đầu nhỏ, Cúc bạc đầu (Vernonia patula (Dryand.) Merr.)

- Bạch đầu rau, Ban cưu cúc (Vernonia esculenta Hemsl.)

- Bạch đầu Spire (Vernonia spirei Gandog.)

- Dây dọi tên, bạch đầu bầu dục (Vernonia elỉiptica DC var Qlaeagnifolia DC.)

- Cúc bung, Bạch đầu to (Vernonia macrachaenia Gag-nep.)

Cúc lá cà, Cúc hồng leo (Vernonia solanifolia Benth.)

1.1.3 Loài Vernonia amydalina Del.

Tên khoa học: Vernonia amygdalina Delile

Tên đồng nghĩa: Gymnanthemum amygdalinum (Delile) Sch Bip ex Walp [19]

Tên thường gọi: cây Mật gấu nam, Lá đắng

Tên nước ngoài: African bitter leaf [19], bitter leaf [27], [33]

1.1.4 Vị trí trong bảng phân loại thực vật

Theo hệ thống phân bố của Takhatajan vị trí của loài Vernonia amygdalina Del được sắp xếp như sau:

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)Phân lớp Cúc (Asteridae)

Bộ Cúc (Asterales)

Họ Cúc (Asteraceae) Chi VernoniaLoài Vernonia amygdalỉna Del [40].

1.1.5 Mô tả thực vật

Dạng sống cây bụi hay cây gồ nhỏ, cao từ 1,5-3 m, thân cây phân nhiều nhánh, thân non hơi góc cạnh, có nhiều lông bao phủ nhưng gần như nhằn ở phía dưới Lá mọc cách, hình dạng và kích thước đa dạng, lá hình mũi mác hay hình trứng có kích thước khoảng 3-17 X 1,3-7 cm, đỉnh lá nhọn, mép lá có hình răng cưa, mặt trên nhằn, mặt dưới nhạt màu hơn và có gân lá noi rõ; có cuống hoặc không có, cuống lá dài 1-4 cm

Hoa cụm hoa dạng ngù ở đầu cành, cuống ngắn, có nhiều lá bắc con dài 0,1-0,2 cm, có mùi thơm [5], [19] Mồi cụm hoa có 11-35 hoa, hình chuông rộng 0,2-0,5 cm, cuống dài 0,2-0,5 cm, màu trang kem Tong bao mang 25-30 lá bắc, xếp thành 4-5 hàng, hình trứng hay hình chừ nhật, dài 0,4-0,6 cm, màu xanh đậm ở đỉnh, vòng trong dài hơn vòng ngoài Tràng hoa màu trắng, thu hẹp dần về phía dưới Bộ nhị: dài 4,5-5 cm, gồm 5 chỉ nhị, dài 11-14,5 mm; bao phấn dính nhau thành ong dài 3-4 mm, hình trứng, kích thước 2-2,5 X 0,5-0,9 mm Bộ nhụy: Vòi nhụy dài 8-9,5 mm, mang 2 đầu nhụy

Quả: Quả bế hình trứng thuôn dài 3-4 X 0,5-1 mm, có 10 gân, túm lông với những sợi lông cứng mọc loe ở đầu [5] Quả và hoa ra vào tháng 12 và tháng 3 năm sau [19]

Hình 1.2 Hình thái loài Vernonia amydalina Del.

a: Thân b: Hoa c: Lá

1.1.6 Sinh thải và phân bổ

Vernonia amygdalỉna Del có nguồn gốc từ Châu Phi, đuợc trồng phổ biến ở một số nước như Yemen, Ethiopia, Nam Uganda, Kenya và Tanxania, Brazil; một số nơi ở Châu Á: phía đông Án Độ, Trung Quốc, Malaysia [19], [45] V amygdalina Del di thực vào Việt Nam trong những năm gần đây, với khả năng thích nghi tốt ở nhiều điều kiện khí hậu khác nhau, loài cây này đã được trong phổ biến trên nước ta, nhiều nhất là các tỉnh thuộc khu vực miền Trung [5]

1.1 7 Bộ phận dùng

Bộ phận thường được sử dụng của cây Lá Đắng là phần lá, lá sẽ được thu hái và

sử dụng quanh năm bằng cách dùng tươi hay phơi khô hãm như trà Bên cạnh đó

lá cây Lá Đắng còn được dùng làm thức ăn và còn được sử dụng để làm thuốc trong việc phòng và điều trị một số bệnh [22], [41]

Rễ cây được dùng làm que ngậm giúp làm sạch răng miệng, làm thức uống như rượu,

có tác dụng trên các bệnh về dạ dày - ruột [13]

1.2 Tổng quan về thành phần hóa học

Chi Vernonia có khoảng 1000 loài, trong đó V Amygdalina là loài đã được các nhà

khoa học nghiên cứu nhiều nhất, theo ghi nhận từ các công trình nghiên cứu trước cho

độ đắng, kích thước lá, độ phát triển [38] Theo các báo cáo, trong lá cây chứa các hợp chất có tác dụng sinh học chính như: saponin, flavonoid, tannin, glycosid, terpen, steroid, coumarin, alkaloids, acid phenolic, lignan, xanthon, anthraquinon, sesquiterpen (hợp chat có tác dụng kháng ung thư) Ngoài nhừng thành phần trên, lá còn chứa các chất khoáng: magnesium, mangan, selenium, sắt, đồng, kẽm, chromium, Vitamin A, Bl, B2, c, E và các acid amin quan trọng, rat can thiet cho co the như: Leucin, Isoleucin, Methionin, Phenyl alanin, Threonin, Lysin, Valin, Histidin, Tyrosin [27], [41]

Hau het các loài trong chi Vernonia nói chung và trong loài Venonia amygdaỉina Del nói riêng đều chứa một lượng lớn các Sesquiterpen lacton, những họp chất này đã được chứng minh có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn, chống lại độc tế bào, trị côn trùng cắn [19], [21] Các báo cáo trước đây đã cho thấy rằng các nhà khoa học đã phân lập ra một số hợp chất Sesquiterpen lacton như Vemolid, vemolepin, vemodalin, vemodalol và hydroxyvemolid [21], [27]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số Sesquiterpen lacton trong v.amygdalina Del.

1211,127]

Bên cạnh đó, là các Saponin có trong Vernonia amygdalina Del Các Saponin này

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học một số Saponin trong v.amygdalina Del [27], [29].

Một thành phần không thể không nhắc đến với khả năng chống lại các gốc tự do, đóng vai trò là chất chống oxy hóa, đó là sự hiện diện của các flavonoid nhóm flavon như Luteolin và các dần xuất glycosid của nó: luteolin 7-ỡ-/?-glucoronisid, luteolin '1-O-/Ỉ- glucosid; trong đó luteolin 7-ơ-^-glucoronisid chiếm nhiều nhất [25], [27]

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của một số Flavonoid trong v.amygdalina Del |25], (27J

Trong một nghiên cứu gần đây về hoa của v.amygdalina của hai nhà khoa học Yadessa Melaku và Abere Habtamu đà phân lập được 2 flavonoid là luteolin và isorhamnetin ngoài ra còn tìm thấy vemolid và tricosan, hợp chất này cho đến nay vẫn chưa từng được đề cập trong chi Vernonia [26]

Tricosan

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học một số hợp chất trong hoa của v.amygdalina Del |26| 1.3 Một số nghiên cứu về Vernonia antydalina Del.

1.3.1 Một số nghiên cứu ở nước ngoài

Vernonia amygdalina là loài cây được rất nhiều nhà khoa học quan tâm, chú ý đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về loài cây này Điển hình trong số đó là những nghiên cứu về thành phần hóa học, vai trò trong phòng và điều trị bệnh để thay thế các loại thuốc cũ nhằm tăng hiệu quả điều trị Dưới đây là một số nghiên cứu ngoài nước

về thành phần hóa học cũng như các tác dụng dược lí mà loài cây này mang lại

Năm 1992, Mitsuo Jisaka và cộng sự phân lập được 3 họp chất từ Vernonia

amygdalina gồm vemoniosid Al, vemoniosid A2, vemoniosid A3, là các hợp chất góp phần tạo lên vị đắng của lá cây Jisaka và cộng sự cũng đã phân lập được 3 họp chất mới: vemoniosid A4 và aglycon của nó, cũng như 2 glucosid không liên quan đen vị đắng, vernoniosid B3 Năm 2006, Erasto cùng cộng sự đà phân lập được 2 hợp chất sesquiterpen mới là vemolid, vemodalol Cả hai hợp chất đều có hoạt tính đối kháng với các chủng B.cereus, S.epidermidus, s aureus, M.kristinae và s.pyrogens [21] Trong nghiên cứu của Atangwho và cộng sự năm 2013, nhóm tác giả đã phát hiện ra hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết được đánh giá bằng khả năng quét gốc tự do 2,20-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulphonic acid) (ABTS) hay còn gọi là khả năng chống oxy hóa tương đương Trolox (TEAC), khả năng chống oxy hóa khử sắt (FRAP), khả năng quét gốc tự do 1,1 -Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) [17], Năm

2016, Ọuasie và cộng sự đã phân lập được 4 saponin steroid loại D7 mới từ lá của

Vernonia amygdalina thu được tại Châu Phi Các hợp chất này có hoạt tính chống viêm thông qua tác dụng ức chế sản xuất NO được kích hoạt bởi lipopolysacarid trong các tế bào RAW-264,7 [37]

Năm 2010 Ijeh và Ejike đã tiến hành một nghiên cứu về tiềm năng dược liệu của loài

Lá Đắng Năm 2013 Toyang và cộng sự cùa ông là Verpoorte đã tiến hành đánh giá tiềm năng y học của các loài thực vật thuộc chi Vernonia Nghiên cứu của Bhattacharjee, Lakshminarasimhan và cộng sự vào năm 2013 về loài Vernonia

amygdalina. Ket quả cùa các nghiên cứu này cho thấy các hợp chất có trong dịch chiết

lá cây Lá Đắng bao gồm các saponin, flavonoid, alkaloid, vitamin, khoáng chat, Có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, làm giảm sự phát triển của các tế bào ung thư, gia tăng khả năng điều trị đối với các bệnh nhân mắc bệnh ung thư ở giai đoạn cuối Ngoài

ra nó còn có tác dụng trong việc làm giảm đường huyết, điều hòa lipid huyết, bảo vệ gan và thận, và giảm tình trạng loét dạ dày tá tràng [21], [27], [41],

1.3.2 Một sổ nghiên cứu trong nước

Mặc dù trên the giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về cây Lá Đắng và đã xác đinh được một số cấu trúc có trong cây cũng như những tác dụng dược lí có lợi Tuy nhiên hiện nay, trong nước các công trình nghiên cứu và loài cây này rất ít và vần còn nhiều hạn chế, đặc biệt là các nghiên cứu về thành phần hóa học và các tác dụng có lợi

trong phòng và điều tri bệnh Dưới đây là một số nghiên cứu trong nước về loài cây này.

Năm 2017-2019, Phạm Việt Cường và cộng sự đã nghiên cứu cây dược liệu mới

Vernonia amygdaỉina Del (cây Lá Đắng) tại tỉnh Thừa Thiên Huế và định hướng ứng dụng Đe tài được tiến hành tại Viện Khoa Học Miền Trung và đã thu được một số kết quả tích cực [4]

- Trồng thực nghiệm cây Vernonia atnygdaỉina tại Thừa Thiên Huế: Sau khi trồng thử nghiệm cây Lá Đắng ở Phong Điền, Phú Vang và Phú Lộc thấy rằng

cả 3 vùng sinh thái cây Lá Đắng đều sinh trưởng và phát triền được

- Nghiên cứu thành phần hóa học của mẫu dược liệu

Từ lá loài Vernonia amygdalina đã phân lập và xác định cấu trúc 6 hợp chất thuộc lớp chất C29-steroid và xây dựng tiêu chấn cơ sở cho các hoạt chất chính, là những họp chất đặc trưng của loài Vernonia amygdalina Trong đó:

- Một hợp chất mới hoàn toàn là (22R, 23R, 24R, 28S)-3/?- glucosyl-28-methoxy- 7,8,9,11 -tetradehydro-21,24-dihydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5«-stigmastan (VA7) Hợp chất này được đặt tên là: vemomyosid E

- Hai hợp chất đầu tiên phân lập được từ tự nhiên là (22R,23S,24R,28S)-28- methoxy-7,8,9,11 -tetradehydro-3/?-16«,21,24-trihydroxy-21,23:22,28-diepoxy- 5a-stigmastan (VA4) được đặt tên là vemomyosit c và (23S,24R,28S)-3/?,22a- dihydroxy-7,8,9,11 -tetradehydro-24,28-epoxy-5a-stigmastan-21,23carbolacton (VAI 1) và được đặt tên là vemomyosid c 1

- Ba họp chất đã biết khác là vemoniacum B (VA5), vemoniosid Bl (VA9), vemoniosid B2 (VA 10)

• Định lượng và so sánh hàm lượng hoạt chất trong các mẫu dược liệu được trồng ở các địa điểm khác nhau Thông qua sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, kết quả cho thấy hàm lượng các chất tham chiếu ở Phú Vang là cao nhất VA5 là 0,56 pg/mL; VA 10 là 0,27 pg/mL

• Đánh giá hoạt tính sinh học của dịch triết cây Lá Đẳng Quá trinh đánh giá được tiến hành trên hai dòng tế bào Hep3B và MCF-7 (IC50 = 114,82 ±2,13 pg/mL) và tế bào ung thư vú người MCF-7 (IC50 = 123,03 ± 1,27 pg/mL)

• Cao MeOH Lá Đắng thể hiện hoạt tính kháng viêm thông qua thử nghiệm ức chế sản sinh NO trên dòng tế bào đại thực bào chuột RAW-264,7; ở nồng độ

100 pg/mL với % ức chế là 61,56 ± 0,66%

• Cao MeOH Lá Đẳng có hoạt tính ức chế enzym a-amylase và enzyme a- glucosidase với giá trị lần lượt là 0,64 ± 0,12 mg/mL và 1,78 ± 0,31 mg/mL

• Đánh giá hoạt tính in vitro của chất phân lập được

• Ba chất sạch phân lập được gồm VA5, VA7, VA 10 đã được thử nghiệm hoạt tính ức chế ot-amylase và enzyme a-glucosidase Hợp chat VA7 thể hiện hoạt tính ức chế enzyme ot-glucosidase mạnh hơn cả chất chuẩn dương acarbose, đồng thời cũng có hoạt tính ức chế enzym a-amylase tương đối rõ rệt Hợp chat VA5 và VA 10 có hoạt động ức chế enzym a-amylase trung bình với giá trị IC50 được xác định lần lượt là 83,17 pg/mL và 87,09 pg/mL

• Với động vật thực nghiệm là chuột, cao chiết MeOH mô hình Phú Vang ở mức liều 400 mg/kg the trọng/ngày đã làm giảm mức đường huyết

Ngoài đề tài trên còn có 2 đề tài nghiên cứu về loài Vernonia atnygdalina vào năm

2018 được tiến hành tại khoa Dược, trường đại học Nguyễn Tất Thành, dưới sự hướng dần của ThS Ds Bùi Hoàng Minh [2],[3],

- Đe tài Nghiên cứu thành phần hóa học cây Lá Đắng (Vernonia amygdalina Del., Asteraceae) do sinh viên Huỳnh Thùy Thanh Ngọc thực hiện

- Đe tài khảo sát hoạt tính chống oxy hóa các chất phân lập được từ cao phân đọan Etyl acetat của lá cây Lá Đắng do sinh viên Dương Thị Ngọc Hà thực hiện

Ket quả của đề tài đã xác định được 2 hoạt chất nhóm flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao

1.4 Tác dụng dược lý

Chi Vernonia có rất nhiều loài được dùng làm thuốc đặc biệt là ở các quốc gia Châu Phi, trong đó loài Vernonia amygdaỉina là một trong năm loài hay được sử dụng nhất [41]; theo thống kê của N.J.Toyang và R.Verpoorte đăng trên tạp chí Joural of Ethnopharmacology và các nghiên cứu khác, Vernonia amygdaỉina Del được dùng trong điều trị một số bệnh: sốt rét, tiêu chảy, viêm gan, bệnh trì, đái tháo đường, kháng khuẩn, kháng nấm, [19], [27], [41]

1.4.1 Điều trị viêm gan

Một trong những vấn đề phổ biến nhất trên thế giới là các bệnh về gan, hầu như các thuốc được dùng đe điều trị trong thời gian kéo dài sẽ gây ra những tác dụng phụ nghiêm trọng Vì vậy cần tìm ra những thuốc thay thế khác để phục vụ cho việc điều trị Trong một thừ nghiệm về khả năng bảo vệ gan từ V amygdalina do Arhoghro, E

M và các cộng sự nghiên cứu vào năm 2009 cho thấy rằng, dịch chiết nước từ lá loài cây này cho hiệu quả phục hoi đáng kể các chỉ số của gan Các nhà nghiên cứu đã thử nghiệm đồng thời trên 6 nhóm chuột, trong đó có 3 nhóm được gây bệnh viêm gan cấp bằng CCỈ4 và được điều trị bằng 5%, 10%, 15% dịch chiết nước V amygdalina', trong khoảng thời gian 7, 14, 21 ngày, sau đó đo các chỉ so ALT, AST, ALP nhận thấy những chỉ số này giảm đáng ke khi phụ thuộc vào liều và thời gian điều trị [16]

Một thử nghiệm khác cũng được tiến hành đe tìm kiếm loại thuốc thay thế trong ngăn ngừa và chống nhiễm độc gan thông qua việc sàng lọc các chất chiết xuất từ dịch nước

và dịch chiết ethanol của lá khô cây Lá Đắng cho các chất hóa thực vật và các đặc tính chống oxy hóa in vitro Một số con chuột đã được cho uống dịch chiết và sau đó được

sử dụng liều đơn acetaminophen 2 g/kg trọng lượng cơ the và tác dụng bảo vệ gan của chiết xuất được xác định bằng cách đánh giá chức năng gan, hoạt động của enzym chống oxy hóa và tình trạng gan, sử dụng các phương pháp sinh hóa tiêu chuẩn Các chất chiết xuất được, phần lớn là các họp chất có hoạt tính sinh học Hoạt tính sinh học

sẽ phụ thuộc vào nồng độ và hoạt động thu dọn gốc tự do (DPPH) trong ống nghiệm

400 mg/kg trọng lượng cơ thể mồi ngày của dịch chiết xuất các chất có tác dụng bảo

vệ gan ở chuột Điều này đã được chứng minh trong việc giảm 92% hoạt động của alanin aminotransferase (ALT) trong dịch chiết nước của Vernonia amygdalina Del

và tăng rõ rệt nồng độ albumin huyết thanh Dịch nước chiết xuất của cây Lá Đắng làm tăng hoạt tính GPx nhất so với đối chứng âm Ngoài ra cấu trúc tiểu thùy của gan cũng được bảo ton Từ kết quả trên cho thấy Lá Đắng có vai trò quan trọng trong y học

vì chứa các chất có tác dụng bảo vệ cấu trúc gan trong trường họp nhiễm độc gan do acetaminophen [20]

1.4.2 Chổng ung thư

Vernonia amygdalina Del còn được chứng minh là một loài cây có khả năng ức chế

sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau Một nghiên cứu được thực hiện trên dòng tế bào ung thư đại trực tràng WiDr cho thấy rằng dịch chiết EtOAc của loài này có khả năng gây độc tế bào mạnh nhất trong tất cả các dịch chiết được thử nghiệm với IC50 9,086 ± 0,431pg/ml Tuy nhiên vần chưa biết được chính xác cơ chế của quá trình này [18] Trong một công trình khác của Wong và cộng sự đà làm rõ được cơ chế tác động cùa v.amygdalina lên dòng tế bào ung thư vú MCF-7, bằng cách ức chế quá trình nhân đôi của các tế bào MCF-7 tại pha Gl/S Quá trình này có liên quan đến sự tăng nồng độ cùa p53, p21 cùng với sự giảm các cyclin D, E theo một con đường độc lập Một phát hiện quan trọng khác, v.amygdalina còn ức chế sự biểu hiện của ER-a (70% ung thư vú được chuẩn đoán bộc lộ ER-ot) Hơn nữa v.amygdalina còn thể hiện tác dụng hiệp đồng rất tốt với Doxorubicin, gợi ý rằng v.amygdalina có the được sử dụng vào quá trình hóa trị liệu [43]

Ngoài khả năng ức chế dòng tế bào ung thư đại trực tràng, dịch chiết Lá Đắng còn được chứng minh là có tác dụng trên bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt Bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt được chẩn đoán phát hiện vào giai đoạn cuối thường bị hạn chế lựa chọn điều trị, do cơ thế kém dung nạp thuốc và đã đề kháng với hầu hết các phương pháp điều trị bằng thuốc hiện nay Vì vậy, điều quan trọng là phải tìm kiếm một loại thuốc điều trị thay thế mới có thể ngăn ngừa hiệu quả căn bệnh và thậm chí tiêu diệt sự tiến triến và di căn của tế bào ung thư tuyến tiền liệt Chính vì vậy, một nghiên cứu đã được tiến hành với mục đích đánh giá các hoạt động chống ung thư của dịch chiết xuất methanol Vernonia amygdalina Del trong phòng ngừa và điều trị ung thư tuyến tiền liệt không phụ thuộc vào androgen ở người (PC-3) làm mô hình thử nghiệm Đe đạt được mục tiêu, các tế bào PC-3 được xử lý bằng các liều dịch chiết cồn khác nhau trong 48 giờ Dữ liệu được tạo từ trypan thử nghiệm màu xanh lam và thử nghiệm MTT chứng minh rằng các chất chiết xuất từ cây Lá Đắng thể hiện sự ức chế tăng trưởng đáng kể, ảnh hưởng đến các tế bào PC-3 Tác dụng chống tăng sinh cùa

Vernonia amygdalina Del trên tế bào PC-3 với giá trị IC50 khoảng 196,6 pg/mL Các thử nghiệm khác, bao gồm hình thái học, quá trình peroxy hóa và phân tích apoptosis cho thấy Lá Đắng gây ra tác dụng ức chế tăng trưởng trên tế bào PC-3 thông qua việc

nghiệm có thể bảo vệ khởi các bệnh do stress, oxy hóa nhờ các chất chống oxy hóa có hàm lượng cao trong cây [30].

1.4.3 Khả năng chong oxy hóa

Trong một thử nghiệm so sánh về khả năng chống oxy hóa của dịch chiết ethanol và

dịch nước từ lá V amygdalina với BHT và BHA trên cùng chất thử là DPPH Ket quả

nghiên cứu chỉ ra rằng, dịch chiết ethanol có phần trăm chống hoạt tính oxy hóa cao hơn BHA 90,23% và 88,23% ở nồng đồ 0,8 mg/ml Trong khi dịch chiết nước và BHT đạt %HTCO tối đa là 73,93% và 68,66% ở nồng độ 2,0 mg/ml Từ kết quả nghiên cứu cho thấy rằng dịch chiết ethanol và nước từ lá của loài v.amygdalina có tiềm năng thay thế cho những chất chống oxy hóa như BHT, BHA, những chất gây độc tính hoặc ung thư trên người [31],

Một nghiên cứu khác bang dịch chiết nước nóng và lạnh của lá V amygdalina Del đà

sử dụng phương pháp đánh bắt gốc tự do với thuốc thử là DPPH và đo độ hấp thu của mầu ở bước sóng 517 nm Ket quả nghiên cứu cho thấy rằng dịch chiết nước nóng và

lạnh của lá v.amygdalina ở nong độ 0,2 mg/mL có phần trăm hoạt tính chống oxy hóa

lần lượt là 26,4% và 36,2% [28]

1.4.4 Hạ đường huyết

Thử nghiệm của Atangwho và cộng sự đã tiến hành mô hình thử nghiệm trên in vivo gồm 21 chuột được chia thành 3 nhóm khác nhau: nhóm sinh lý, nhóm bệnh lý và nhóm thử nghiệm được chữa trị bằng dịch chiết EtOH từ lá V amygdalina với nồng độ

400 mg/kg, cuộc thử nghiệm diễn ra trong 14 ngày Ket quả cho thấy rằng các nhóm sinh lý, bệnh lý, nhóm thử nghiệm có giá trị glucose trong máu lần lượt: 73,51 ±18,98 mg/dL; 247,25±4,83 mg/dL; 144,14±25,83 mg/dL Từ kết quả thử nghiệm có thể chỉ

ra rằng dịch chiết từ lá của loài này cũng cho tác dụng hạ đường huyết trên chuột [17], [27]

Một nghiên cứu khác về khả năng hạ đường huyết của dịch chiết cây Lá Đắng cũng được tiến hành trên chuột do Akawa, Gazuwa và các cộng sự thực hiện, nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của Vernonia amygdalina trên một so thông số sinh hóa như đường huyết

lúc đói, lipid huyết thanh, hoạt động của transaminase và phosphat kiềm ở chuột mắc

điều trị, chuột bị tiểu đường được điều trị bằng dịch chiết Lá Đắng (400 mg/kg) và chuột bình thường được cho ăn dịch chiết Lá Đắng (400 mg/kg) hằng ngày tương ứng Tất cả chuột ngoại trừ chuột đối chứng và chuột bình thường được cho uống dịch chiết

Lá Đắng (400 mg/kg) đều được gây tê trong phúc mạc với một liều lượng duy nhất

150 mg/kg alloxon Nước chiết xuất từ Vernonia amygdalìna có tác dụng hạ đường huyết khi được theo dõi vì có sự gia tăng đáng kể ở nhóm kiểm soát bệnh tiểu đường (5,07 ±0,15 mmol/L) khi so sánh với nhóm điều trị tiểu đường Ngoài ra, tác động của

Lá Đắng trên hoạt động của trasaminase và phosphat kiềm cho thấy sự gia tăng đáng

kể ở nhóm kiểm soát bệnh tiểu đường so với nhóm được điều trị tiểu đường Từ kết quả nghiên cứu cho thấy Lá Đắng có tác dụng hạ đường huyết bằng cách làm giảm đáng kể đường huyết ở chuột được điều trị bằng dịch chiết Lá Đắng [14]

1.4.5 Khả năng khảng khuẩn

Hai sesquiterpen lacton: vernolid, vernodalol được phân lập từ loài v.amygdalina có

khả năng chống lại các vi khuan gram dương, đặc biệt là Micrococcus kristỉnae với giá trị MIC 0,25 mg/mL; cả hai hợp chất trên đều không tác động lên các vi khuẩn gram

âm ngoại trừ Salmonella pooni với MIC 0,5 mg/mL [21], [27],

Một công trình nghiên cứu mới được công bố gần đây vào năm 2019, về hoạt tính kháng khuấn và khả năng chống lại độc te bào Hoạt chất kháng khuẩn cùa các chất chiết xuất từ lá được xác định bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch anh chống lại các phân lập lâm sàng của Salmonella typhi và Salmonella paratyphi Thử ghiệm độc

tính được thực hiện với chuột bạch bằng phương pháp tiêu chuẩn Các chất chuyển hóa được tìm thấy trong dịch chiết cây Lá Đắng có vùng ức chế cao nhất là 10,0 mm và 20,0 mm đã được ghi nhận đối với các chất chiết xuất từ nước và ethanol cùa

Sallmonella typhi và Sallmonella paratyphi tương ứng của lá Nồng độ ức chế tối

thiểu (MIC) 100 mg/ml của dịch chiết được ghi nhận với khả năng chống lại

Sallmonella typhi và Sallmonella paratyphi Các thử nghiệm độc cấp tính cho thấy

không có trường hợp tử vong nào trong hai tuần sử dụng 5000 mg/kg trọng lượng cơ the của các chất chiết xuất cho chuột bạch Ket quả cho thấy Lá Đang có những tiềm năng đầy hứa hẹn trong điều trị các bệnh truyền nhiễm do độc tính thấp [23]

1.4.6 Khả năng khảng nấm

Ngoài khả năng kháng khuấn các Sesquiterpen lacton còn được chứng minh là có khả năng kháng nấm mạnh, trong nghiên cứu của p Erasto và cộng sự đã cho thấy

vemolid có ức chế mạnh Penicillium notatum và Aspergillus flavus với giá trị LC50 0,2

và 0,3 mg/mL hay Aspergillus niger và Mucor hiemalis là 0,4 mg/mL; vemonalol có

tính kháng nấm kém hơn so với vemolid, tuy nhiên cũng có tác dụng đáng kể trên

Aspergillus flavus, Penicillium notatum và Aspergillus niger với giá trị LC50 lân lượt

0,3; 0,4 và 0,5 mg/mL [21], [27],

1.4.7 Điều trị sốt rét

Sốt rét - một trong những căn bệnh khiến nhiều người tử vong nhất trên thế giới đặc biệt là trẻ em, thêm vào đó những loại thuốc được sử dụng đe chừa trị đang dần bị đề kháng [27] Với mục đích tìm kiếm một loại thuốc khác có thể thay thế các loại thuốc đang dùng, các nhà nghiên cứu tiến hành một số thử nghiệm bằng cách dùng dịch chiết EtOH và dịch nước từ lá của loài V amygdaỉina trên các thử nhiệm in vivo cũng như

in vitro đoi với loài Plasmodium bergheỉ Ket quả thử nghiệm trên in vivo cho thấy

rằng: dịch chiết nước có khả năng diệt giao bào cái đến 50%, dịch EtOH còn ức chế gần như hoàn toàn (> 90%) quá trình tạo thoa trùng trong in vitro với nồng độ 50 pg/mL [10]

minh được rằng BLAE thế hiện các đặc tính chống oxy hóa và ức chế các hoạt động của AchE, BchE, MAO, ACE, ATPdase và ADPdase in vitro Hon nữa những con ruồi chuyển gen được xử lý bằng BLAE có biểu hiện đáng kể mức độ cải thiện tỷ lệ sống sót và các hoạt động của BACE-1, AchE, GST và catalase, ơ những con chuột được điều trị bằng scopolamin, các hoạt động của AchE, BchE, MAO, NTPase và tình trạng chống oxy hóa được cải thiện trong chuột đã được xử lý trước bằng BLAE Nghiên cứu này đã tiết lộ đặc tính bảo vệ thần kinh của BLAE có the liên quan đến thành phần alkaloid cùa nó, do đó BLAE trở thành một tác nhân dinh dưỡng chừa bệnh do suy giảm nhận thức và các bệnh liên quan [32],

1.4.9 Bảo vệ dạ dày, ngừa nhiễm độc thận

Loét dạ dày tá tràng hiện đang là căn bệnh khá phổ biến hiện nay, loét dạ dày có thể làm xuất hiện các ton thương ở dạ dày gây ảnh hưởng không hề nhỏ trên hệ thống tiêu hóa Tuy nhiên một so thuốc đang được sử dụng hiện nay có the gây ra một vài tác dụng không mong muốn Chính vì vậy, ngày nay các nhà khoa học đang tích cực nghiên cứu để tìm ra các hoạt chất mới có nguồn từ tự nhiên nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiếu những tác dụng không mong muốn của các thuốc đang được sử dụng Năm 2017, Adefisayo và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ dạ dày từ cao

chiết methanol của lá Vernonia amygdalina đối với dạ dày bị loét do aspirin gây ra ở

chuột Nghiên cứu đã chỉ ra rang aspirin làm tăng đáng ke diem và chỉ số loét dạ dày, giảm pH dạ dày, giảm hoạt động superoxide dismutase (SOD) và mức glutathione (GSH), đồng thời làm tăng mức lipid peroxidation (LPO), từ đó gây ra hoại tử các mô

dạ dày Trong khi đó cao chiết methanol của Lá Đắng có tác dụng làm tăng pH dạ dày, giảm bài tiết axit dạ dày và thay đoi các thông số huyết học Ngoài ra, cao chiết methanol của cây Lá Đắng cũng làm tăng đáng kể hoạt động SOD và mức GSH, trong khi đó làm giảm mức LPO Các kết quả nghiên cứu này cho thấy V amygdalina có tác dụng bảo vệ dạ dày chống lại bệnh loét dạ dày do Aspirin gây ra [12]

Vai trò của dịch chiết V amygdalina cũng được tìm thấy trong tác dụng phòng ngừa

nhiễm độc thận gây ra bởi chế độ ăn uống ô nhiễm dầu thô ở chuột được Achuba và cộng sự nghiên cứu Ket quả cho thấy dịch chiết methanol từ lá V amygdalina có the bảo vệ, chống lại các tác động tiêu cực gây ra bởi dầu thô, cải thiện và khôi phục các chức năng thận bị mất bằng cách bảo vệ cấu trúc siêu mô [11]

1.5 Công dụng trong y học cổ truyền

Tại một so quốc gia ở Châu Phi lá của loài V amygdalina được sử dụng như một loại rau xanh hoặc được dùng như một gia vị trong các món ăn, đặc biệt là món soup Lá đắng (loại thức ăn nổi tiếng tại đây) Sau khi thu hoạch, có thể loại bỏ vị đắng của loài cây này bằng cách ngâm dầm với nước nóng hay lạnh, dịch chiết nước có thể dùng làm thuốc bo tiêu hóa và giúp ngăn ngừa một số bệnh tật

Ngoài ra ở Ethiopia lá loài cây này còn được sử dụng trong việc ủ bia Phần lá được sử dụng phổ biến trong điều trị sốt; ngoài ra loài cây này còn được biết đến như một chất thay thế Ọuinin ở Nigieria và một số quốc gia Châu Phi khác Lá non được sử dụng trong y học dân gian như thuốc chống trầm cảm, thuốc chống sốt rét, thuốc long dòm, thuốc XO, thuốc nhuận tràng, và làm tăng khả năng thụ thai ở phụ nừ vô sinh Nhiều bác sĩ đông y đà đề nghị sử dụng dịch chiết nước của loại cây này cho bệnh nhân đe điều trị các chửng bệnh: mệt mỏi, tiếu đường, buồn nôn, ăn mất ngon do ăn kiêng, kiết

lị và các vấn đề đường tiêu hóa khác [22]

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Be siêu âm Hwashin Technology Power sonic 410 (Hàn Quốc)

- Cân xác định độ ẩm Ohaus Model MB45 (Mỹ)

- Cân kỳ thuật Electronic Scale G&G

- Cân phân tích Sartorius (Đức)

- Bep cách thủy Memmert (Đức)

- Đèn ƯV spectroline Model CM-10A (Mỹ)

- Cân phân tích Sartorius (Đức)

- Cân kỳ thuật Electronic Scale G&G

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Máy hút chân không Rocker 300 (Đài Loan)

- Máy cô quay chân không Heidolph Hei-VAP Advantage (Đức)

- Bình sắc ký, cột sắc ký bằng thủy tinh cùng các dụng cụ phòng thí nghiệm

2.1.2.2 Các thiết bị sắc ký

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters 2695 - 2996, Detecter PDA Waters 2996 với phần mem Empower, cột sắc ký Symmetry 150x4,5 mm, 5 pm

2.1.2.3 Dung môi hóa chat

- Thuốc thử định tính thường quy trong phòng thí nghiệm

- Silica gel (Merck), cỡ hạt mịn (15-40 pm)

- Silica gel (Trung Quốc), cỡ hạt trung bình (40 - 63 pm);

- sắc ký lóp mỏng pha thuận dùng bản Silica gel F254 tráng sằn trên đế nhôm (Merck).

- Dung môi dùng trong phân tích hóa học, sắc ký lóp mỏng, sắc ký cột: đạt chuẩn tinh khiết phân tích

- Các dung môi dùng cho chiết xuất và sắc ký cột thay đổi theo các thực nghiệm

cụ thể và được cất lại, làm khan trước khi dùng

- Dung môi dùng cho HPLC đạt độ tinh khiết: MeOH (Merck), nước cất 2 lần

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Độ ẩm

Tiến hành theo quy trình đạt tiêu chuẩn DĐVN IV, bao gồm các thao tác sau

Độ ẩm bột dược liệu được tiến hành bằng máy xác định hàm ẩm Ohaus Model MB45

- Cân trọng lượng bì

- Lượng bột cho vào máy trên 0,5 g, và được trải đều

- Sấy ở áp suất thường, 105°C cho tới khi khối lượng bột dược liệu không đối

- Độ ẩm cùa bột dược liệu được máy đo độ ẩm xác định và hiển thị kết quả

- Thực hiện ba lần, lấy giá trị trung bình

2.2.2 Chiết xuất dược liệu và thu các phân đoạn cao

2.2.2.1 Chiết xuất cao toàn phần

Chiết và thu cao toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi là EtOH 96% Bột lá cây Lá Đắng cho vào bình ngấm kiệt đã được lót bông và giấy lọc ở dưới đáy bình, nén dược liệu đã được làm ẩm trước đó một cách vừa phải Châm dung môi vào bình ngấm kiệt phải cao hơn mặt dược liệu Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ đe dung môi thấm vào cấu trúc tế bào Vừa thu dịch chiết vừa tiếp tục châm dung môi mới vào bình, luôn đảm bảo dung môi phải ngập và cao hơn bột dược liệu Tiến hành ngấm kiệt cho đến khi dịch chiết mới nhất không còn hiện màu với thuốc thử vs

trên bản mỏng hoặc khối lượng cắn còn lại tối thiểu Gộp dịch chiết, cô quay giảm áp

để thu được cao toàn phần và thu hồi dung môi

2.2.2.2 Tách các cao phân đoạn từ cao toàn phần

Cao toàn phần ban đầu được phân tán vào MeOH 20% và tiến hành chiết lỏng - lỏng với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần lần lượt là PE, CHCh Gộp dịch từ

phương pháp này có thế chiết tách hồn họp nhiều chất trong cao chiết thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau.

Quy trình chiết xuất và phân lập dự kiến được trình bày trong

- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước cột 8 X 60 cm, rửa sạch, sấy khô

- Pha tĩnh: silica gel, cờ hạt trung bình (40-63 pm)

- Nhồi cột khô, có bơm hút chân không cho ổn định

- Mầu: phân đoạn cao khảo sát, nạp mầu khô

- Pha động: chạy gradient với dung môi nền là PE-EtOAc (9:1), tăng dần lên tỷ lệ PE-EtOAc (8 :2), đến 1:9 rồi tăng đến 100% EtOAc; sau đó dùng hệ EtOAc- MeOH, tăng dần tỷ lệ MeOH, cuối cùng là 100% MeOH

- The tích hứng phân đoạn: 500 ml

- Kiếm tra phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCh-MeOH (9:1), phát hiện bằng cách soi uv 254 nm, uv 365 nm, nhúng thuốc thử vs