Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn lâu dài của cao chiết Ngọc Nữ biển Clerodendrum inerme (L) Gaertn. bằng phương pháp tiến hóa thích nghi

Bảng 3 Kết quả PCR xác định các gen quy định kiểu hình tính kháng thuốc kháng 19 sinh trên 2 chủng phân lập được Bảng 4 So sánh khả năng kháng khuẩn của cao chiết Ngọc nữ biển và Ampicil

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Chủ nhiệm đề tài: Bùi Lê Minh

Đơn vị công tác: Viện Kỳ thuật Công nghệ cao NTT

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỪ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC CÁC BẢNG BIÉU, sơ ĐÓ, HÌNH ẢNH 5

TÓM TẤT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu 6

MỚ ĐẦU 7

CHUƠNG 1 tống quan tài liệu 8

1.1 Tiến hóa thích nghi và vai trò trong nghiên cứu khả năng kháng thuốc của vi sinh vật.8 1.2 Khả năng kháng khuân của cao chiết Ngọc nữ biên Clerodendrum inerme (L.) Gaertn 10

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHUƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 13

2.1 Thu thập và tách chiết mẫu lá 13

2.2 Phân lập, định danh và xác định đặc tính vi khuấn kháng thuốc 13

2.2.1 Phân lập và định danh vi khuẩn kháng thuốc 13

2.2.2 Xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuấn phân lập được 14

2.2.3 Xác định khả năng tán huyết của vi khuần phân lập được 14

2.2.4 Xác định hoạt tính coagulase của vi khuẩn phân lập được 14

2.3 Xác định hoạt tính kháng sinh của cao chiết 15

2.3.1 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiếu (minimum inhibitory concentration -MIC) 15

2.3.2 Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiếu (minimum bactericidal concentration - MBC) 15

2.4 Tiến hóa thích nghi trong phòng thí nghiệm của s aureus với các nhân tố kháng sinh 16

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 Phân lập, xác định các chủng vi khuấn kháng thuốc trên da người bị viêm 17

3.2 Đánh giá khả năng kháng khuấn của cao chiết Ngọc nữ biển với các chủng s aureus\9 3.3 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết Ngọc nữ biển với chủng s aureus đã tiến hóa thích nghi 20

3.4 Đánh giá mức độ ốn định của tính kháng thuốc hình thành ở chủng s aureus đã tiến hóa thích nghi 21

3.5 Đánh giá khả năng hình thành tính kháng hoặc tính nhạy cám chéo với kháng sinh của chủng s aureus đã tiến hóa thích nghi 22

3.6 Đánh giá sự bất lợi về khả năng sinh trưởng thông thường của vi khuấn thích nghi với cao chiết 23

KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu viết tắt Thuật ngữ đầy đủ

DMSO

DNAMBCMICMRSA

MDR

ODAmCmKmGm

Rp TcVmSmMcCxHI

DimethylsulfoxideDeoxyribonucleic acidMinimum bactericidal concentration - Nồng độ diệt khuấn tối thiếuMinimum inhibitory concentration - Nồng độ ức chế tối thiếuMethicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multidrug resistantOptical density - Mật độ quang họcAmpicillin

ChloramphenicolKanamycinGentamycinRifampicinTetracylinVancomycinTrimethoprim/sulfamethoxazoleMethicillin

CiprofloxacinHemolysis index

DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, so ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1 Kết quả PCR khuếch đại các gen chi thị phân loại 2 mẫu vi sinh phân lập từ 18

da người (SaL2 và SaL7)

Hình 2 Sinh trưởng của các chủng s aureus tiêu chuấn và thích nghi với 3 yếu tố 23

kháng khuấn

Bảng Danh sách các mồi được sử dụng cho PCR 13

Bảng 2 Kháng sinh đồ và kết quả xác định hoạt tính tán huyết, coagulase của hai 17

chủng vi khuẩn phân lập được

Bảng 3 Kết quả PCR xác định các gen quy định kiểu hình tính kháng thuốc kháng 19

sinh trên 2 chủng phân lập được

Bảng 4 So sánh khả năng kháng khuẩn của cao chiết Ngọc nữ biển và Ampicillin 20

Bảng 5 Khả năng kháng khuấn của cao chiết Ngọc nữ biển và kháng sinh với các 21

chủng s aureus đã thích nghi với từng yếu tổ

Bảng 6 Hoạt tính kháng khuấn của cao chiết Ngọc nữ biến và 3 loại kháng sinh với 21

các chủng 5 aureus đã thích nghi được xác định trước thời điếm lưu trừ lạnh

Bảng 7 Tính kháng/nhạy cảm chéo của các chủng s aureus thích nghi với yếu tổ 22

kháng khuấn dưới tác dụng của yểu tố khác

5

TÓM TẮT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu

Sản phẩm thực đạt được Sản phẩm đăng ký tại thuyết minh

Các bảng phân tích MIC, MBC của cao chiết

Ngọc nữ biên với các chủng s aureus chuẩn,

chủng kháng đa kháng sinh phân lập được và

chủng đã tiến hóa thích nghi

Bảng phân tích MIC, MBC của cao chiết Ngọc nữ biên với các chủng s aureus

Nộp công bố trên tạp chí quốc tế Công bố trên tạp chí khoa học trong nước

Thời gian đăng ký: từ 1/2021 đến 6/2021

Thòi gian nộp báo cáo: ngày 13/7/2021

MỞ ĐẦU

Vi khuấn kháng thuốc kháng sinh đang là một mối đe dọa với loài người nhưng vẫn đang

âm thầm phát triển và rất khó ngăn chặn Sự xuất hiện của vi khuẩn kháng thuốc ở môi trường sinh hoạt và ngay trên cơ thể người đã cho thấy hiện tượng kháng thuốc đã xảy ra ở rất nhiều nơi và là nguy cơ cao dẫn tới những yếu tố phức tạp trong quá trình điều trị Các giải pháp để thay thế hoặc bố sung cho kháng sinh đề điều trị nhiễm khuấn đang được tích cực phát triến và rất đa dạng, tuy nhiên khả năng ứng dụng rộng rãi nhất cho đến nay vẫn thuộc về các hợp chất

tự nhiên do sự thân thuộc với người dùng và nguồn cung cấp tự nhiên có khả năng tái tạo Dựa trên nền tảng y học dân tộc của nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt là các nước ở khu vực Đông Nam Á, có thế thấy tiềm năng rất cao của ứng dụng hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuấn do thói quen sử dụng các cây thuốc của người dân đã có từ hàng nghìn năm Mặc dù vậy, các cơ sở khoa học vẫn còn chưa đầy đủ để chứng minh rằng hợp chất tự nhiên có khả năng sử dụng bền vững mà khó dẫn tới tình trạng kháng thuốc lan tràn như với kháng sinh trong hơn 90 năm qua Chính vì vậy, một xu hướng mới trong đánh giá hiệu quả kháng khuấn của các hợp chất tự nhiên từ thực vật là đánh giá hoạt tính kháng khuẩn lâu dài bên cạnh hoạt tính kháng khuấn tức thời, cũng như các tác dụng chéo tới hoạt động của các yếu tố kháng khuấn khác như kháng sinh Hướng nghiên cứu này sẽ xác định chiều hướng vi khuấn có khả năng hình thành tính kháng lại yếu tố kháng khuấn hay không và nếu có thì với tốc độ như thế nào để xác định khả năng ứng dụng của những hợp chất, cao chiết xác định

Ngọc nữ biến Clerodendrum inerme (L.) Gaertn là một dược liệu xuất hiện rải rác ở các vùng duyên hải của Việt Nam và thường được dùng làm thuốc chừa cám sốt, xoa bóp nhưng chưa được nghiên cứu nhiều về khả năng kháng khuẩn Trong nghiên cứu trước của chúng tôi nhằm mục đích so sánh một số dược liệu được biết tới với khả năng kháng khuấn cao với một

sổ dược liệu chưa được biết nhiều về hoạt tính này thì cao chiết lá, cành của Ngọc nữ biển được phát hiện là có hoạt tính khá cao so với các dược liệu khác Chúng tôi lựa chọn cao chiết này trong nghiên cứu tiếp theo như một trường hợp cụ thế để nghiên cứu khả năng ứng dụng lâu dài của hợp chất tự nhiên Việc phân lập các vi khuấn kháng kháng sinh từ bệnh phấm và tạo chủng vi khuấn thích nghi với hợp chất tự nhiên trong phòng thí nghiệm được sử dụng đề có được các nguồn vi khuấn kháng thuốc giúp đánh giá chính xác hơn hiệu quà lâu dài của dược liệu Với hướng nghiên cứu này, chúng tôi hy vọng có thể áp dụng với nhiều hợp chất tự nhiên khác để có cơ sở vừng vàng hơn và đưa ra các khuyến cáo phù hợp cho việc sử dụng hợp chất

tự nhiên trong thực tế

7

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tiến hóa thích nghi và vai trò trong nghiên cứu khả năng kháng thuốc cua vi sinh vật

Tiến hóa thích nghi (adaptive evolution) là một hiện tượng thích nghi tự nhiên xảy ra với tất cả các loài sinh vật theo tốc độ và mức độ khác nhau tùy thuộc loài, điều kiện tự nhiên và

áp lực tự nhiên Trong đó tiến hỏa định hướng (directed evolution) hay tiến hóa thích nghi với

áp lực (stress-adaptive evolution) là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm để tạo ra các vi sinh vật có kiều hình thích ứng với một hoặc một số nhân tổ áp lực xác định như kháng sinh, dung môi, các điều kiện vật lý khắc nghiệt Đây chính là sự mô phỏng quá trình tiến hóa trong tự nhiên nhưng rút ngắn thời gian do có sự kiểm soát áp lực chọn lọc trong phòng thí nghiệm (24)

Có nhiều phương thức để thực hiện quá trình tiến hóa thích nghi với đối tượng vi sinh vật trong phòng thí nghiệm, trong đó điếm căn bàn là các nhân tố chọn lọc được cung cấp thường xuyên cho vi sinh vật liên tục sau nhiều thế hệ, bằng cách liên tục đồi mới môi trường và bố sung các nhân tố này Một nghiên cứu của Leonie và cộng sự (2017) đã kết luận rằng các phương pháp tiến hóa thích nghi với vi sinh vật, cụ thể là E coli, đều dẫn tới một kiểu hình và đột biến thích nghi về căn bản là như nhau, không phụ thuộc vào tốc độ thay đổi của áp lực trong môi trường (11) Tiến hóa thích nghi chủng E coli khiếm khuyết hệ thống phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase (PTS, là hệ thống vận chuyển glucose

và phosphoryl hóa glucose) sau 120 giờ thích nghi với môi trường glucose đã dần tới sự hình thành chủng PB12 có khả năng sinh trưởng nhanh gấp 400 lần (1) Kết quả phân tích hệ gen cho thấy chủng tiến hóa thích nghi có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn căn bản là nhờ đột biến mất một vùng lớn nhiễm sắc thể 10.328 bp (gDNA) bao gồm 12 gene, trong đó việc loại bỏ các gene rppH, mutHvằ galR có vai trò quan trọng nhất: ỉsrppH làm tăng mức độ ốn định của các mRNA tham gia con đường đường phân, ỈSgalR cho phép vận chuyển glucose vào trong tế bào bằng GalP, còn ỉsmutH làm giảm tốc độ hình thành đột biến đang cao đột ngột xuống mức thấp (1)

Trong quá trình tiến hóa thích nghi, các tế bào vi sinh vật thường tăng tần sổ đột biến đế hình thành các tính trạng thích nghi, tuy nhiên tốc độ thay đôi tần số đột biến phụ thuộc vào đặc tính của loài Sừ dụng tiến hóa thích nghi với vi khuẩn Lactobacillus easel bằng cách cho

vi khuẩn liên tục tiếp xúc với 2 loại kháng sinh amoxicillin và gentamicin qua 2.000 thế hệ (10 tháng), nhóm nghiên cứu của Jicheng Wang đã nhận thấy tần suất đột biến tăng 4 lần so với tế bào nuôi trong điều kiện thường (3,5 X 10’9/bp/thế hệ) (30) Tuy nhiên, tần số đột biến này ở

L casei chì bằng 1/3 so với ở E coli (1,1 X 10’8/bp/thế hệ) Yao và đồng sự đã có thế hình

thành tính kháng ở 3 chủng Enterococcus faecalis với 7 trong 8 loại kháng sinh được nghiên

cứu thuộc 5 nhóm khác nhau (ciprofloxacin, levofloxacin, gatifloxacin, penicillin, vancomycin, chloramphenicol, gentamicin) chi sau 10 lần cay truyền trải dài 40 ngày nuôi vi khuấn liên tục trong môi trường chứa kháng sinh Nhóm nghiên cứu nhận thấy sự hình thành khả năng kháng kháng sinh đi cùng với sự suy giảm khả năng sinh trưởng trong điều kiện bình thường, đặc biệt

là chủng kháng có pha sinh trưởng logarit bị kéo dài lên tới hơn 7 giờ (27) Sự suy giảm khả năng sinh trưởng trong điều kiện bỉnh thường của chủng thích nghi cũng đã được ghi nhận trong một số nghiên cứu khác (4; 7; 15; 23; 31)

Chính vì khả năng thích ứng nhanh với các điều kiện bất lợi mà khả năng hình thành tính kháng của vi khuấn gây bệnh đối với các tác nhân diệt khuẩn là một vấn đề rất đáng lưu tâm Một nghiên cứu của Kuete và đồng sự (2010) đã cho thấy khả năng kháng nhiều loại hợp chất thiên nhiên của các chủng vi khuấn Gram âm kháng thuốc phần lớn đều liên quan tới hoạt động của các hệ thống bơm đấy trên màng (efflux pump) như AcrAB-TolC (Enterobacteriaceae) hay

MexAB-OprM (P aeruginosa) (16) Đặc biệt, s aureus (tụ cầu vàng) luôn là mô hình vi khuẩn

gây bệnh kháng thuốc được quan tâm nhiều bởi khả năng hình thành tính kháng rất nhanh với nhiều loại kháng sinh, nhất là kháng sinh nhóm p-lactam Những vi khuấn này được gọi là vi

khuấn s aureus kháng methicillin (MRSA) Methicillin được phát triên vào năm 1960 để sử

dụng cho các bệnh nhân mắc phải s aureus kháng penicillin, tuy nhiên chì sau đó 1 năm,

MRSA đã xuất hiện từ Anh quốc và Đan Mạch cho tới khắp mọi nơi trên thế giới (28) Đề thay thế Methicillin thi hiện nay vancomycin đang được sử dụng để điều trị MRSA Vancomycin là một loại glycosylated tricyclic peptide mạch nhánh thuộc nhóm kháng sinh glycopeptide có thể bám vào mạch peptide đang tống hợp và ngăn cản tương tác của peptide với enzyme transpeptidase làm ngừng quá trình sinh tống hợp lớp peptidoglycan cần thiết cho sự tổng hợp thành tế bào của s aureus (26) Mặc dù không phố biến nhưng các trường hợp s aureus kháng Vancomycin cũng đã được ghi nhận và các chủng s aureus này được gọi là VRSA Nhóm kháng Vancomycin ở mức trung bình (MIC trong khoảng 8-16 pg/ml) được gọi là VISA (Vancomycin intermediate s aureus) và nhóm này hay xuất hiện hơn, thậm chí là trong số các

vi khuẩn MRSA cũng dề xuất hiện dạng kháng Vancomycin Một số loại kháng sinh thay thế Methicillin khác như Linezolid, Streptogramin, Clindamycin cũng được sử dụng đê điều trị s

aureus nhưng cũng đều xuất hiện các chủng s aureus kháng lại từ rất sớm Duy chi có Daptomycin (một loại lipopeptide mạch vòng phụ thuộc canxi) là chưa có chủng kháng được ghi nhận, nhung do bản chất ưa lipid của loại kháng sinh này mà hiện nay Daptomycin chì có thế đưa vào phối thông qua phương pháp hoạt diện phế nang (aveolar surfactant), làm ứng dụng của nó rất giới hạn (19)

9

Trước thực trạng kháng thuốc của s aureus, việc tìm kiếm các giãi pháp kháng sinh từ các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học trở nên quan trọng như một nguồn bồ sung cho các kháng sinh đang được dùng hiện nay Có rất nhiều các dịch chiết từ thực vật đã được chứng minh là có khả năng kháng s. aureus và MRSA, tuy nhiên mới chi có một số ít các nghiên cứu

đã xác định được chính xác cấu trúc cùa các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính này (12) Trong

sổ đó có thế kể đến p-asarone từ thân ngầm của cây Thủy xương bồ (Acorus calamus),

mansonone F từ cây du Nhật (Ultnus davidiana var japonica), galloylated flavonol

rhamnosides từ lá cây hoa Kiều hùng (Calliandra tergemina), prenylated flavonoids từ rễ cây thóc lép đuôi (Desmodium caudatum), eupomatenoid-5 từ lá cây hồ tiêu Piper regnellii là những chất có hoạt tính kháng MRSA mạnh (12) Mặc dù vậy, một giới hạn chung của các nghiên cứu này là việc đánh giá hoạt tính kháng MRSA hầu như chì dựa trên hiệu quả thời gian ngắn mà không có nghiên cứu về tác dụng ức chế, diệt khuẩn khi MRSA tiếp xúc với các tác nhân này qua thời gian dài Chính vì vậy, việc ứng dụng tiến hóa thích nghi là một phương pháp phù hợp và có giá trị để nghiên cứu sâu hơn hiệu quả thực tế của các tác nhân kháng s

aureus kháng thuốc

1.2 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết Ngọc nữ biển Clerodendrum inernie (L.) Gaertn

Ngọc nữ biển (hay tên gọi khác là trùm gọng, vạng hôi, mò biển) - Clerodendrum inerme (L.) Gaertn., hoặc tên khác là Volkameria ỉnermis L - là một loài thực vật có hoa thuộc họ cỏ roi ngựa (Verbenaceae) được tìm thấy ở úc, Châu Á và các đảo trên biến Thái Bình Dương

clerodendrum inerme (L.) Gaertn

c inerme có thành phần họp chất thiên nhiên đa dạng, bao gồm nhiều nhóm họp chất có dược tính quan trọng như glycoside tim, anthraquinones, các họp chat phenol, flavonoid, saponin, tannin, iridoid, diterpene, triterpene, sterol, steroid, carbohydrate, tinh dầu và lignin (2) Ở Việt Nam, Ngọc nữ biển phân bố rải rác dọc bờ biến từ Bắc tới Nam và được sử dụng như một dược liệu cố truyền với công dụng chữa cảm sốt, đau dạ dày, có thề làm thuốc xoa bóp chữa đau lưng và các tôn thương chấn thương

Mặc dù kháng khuẩn không phải hoạt tính được biết đến nhiều nhất đối với c inerme nhưng cũng đã có một số công bố khoa học tập trung vào hoạt tính này Một nghiên cứu của Prasad và đồng sự cho thấy cao chiết isoamyl alcohol của c inerme có hoạt tính kháng

Staphylococcus typhi, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Proteus sp., Bacillus subtilỉs, cao chiết propanol ức chế tat cả các chủng vi khuấn trên trừ Proteus sp., cao chiết ethanol, methanol và chloroform chì có khả năng kháng Proteus sp và s aureus (21) Một nghiên cứu khác xác định khả năng kháng khuấn của c inerme chống lại 7 chủng vi sinh vật sau: Shigella sonnei, K pneumoniae, B subtilis, s typhi, p aeruginosa, Pseudomonas solanacerum và Xanthomonas citri. và ghi nhận khá năng kháng vi khuẩn tốt nhất ở cao chiết cồn ethanol (3) Các dịch chiết từ lá c inerme sử dụng nước, dầu hòa, benzene, ethyl acetate,

methanol đều có tác dụng ức chế tối thiểu 11-15 chủng (bao gồm cả Gram âm và Gram dương) trong số 18 chủng vi khuấn gây bệnh cho người (14) Củng sừ dụng dịch chiết từ lá của

c inerme, một nhóm nghiên cứu khác đã phát hiện cao chiết ethanol có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất so với cao chiết nước và chloroform, trong đó cao chiết cồn còn thế hiện khả năng kháng nấm Aspergillus niger (10) Thí nghiệm định lượng của Gupta và Roy với các mẫu thực vật thu thập được từ vùng Sundarban (Ấn Độ) đã xác định cao chiết hexane từ lá c inerme có

MIC kháng B subtilis là 1,95 mg/ml và MBC kháng B subtilis ở mức 3.91 mg/ml, còn cao

chiết methanol từ rề hoặc cao chiết chloroform từ gồ thân hay cao chiết hexane từ vỏ cây có MIC và MBC cùng ở mức thấp hơn đáng kể là 0,49 mg/ml (9) Những kết quả này cho thấy cao chiết từ lá c inerme dường như có hoạt tính ức chế sinh trưởng vi khuấn cao hơn khả năng diệt khuẩn khi so với cao chiết từ các phần khác của cây Tuy nhiên trong cùng báo cáo này, cao chiết lá c inerme lại bền với nhiệt độ hơn so với các cao chiết còn lại (9).

Nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc, đa kháng thuốc của cao chiết c

inerme cho tới nay là rất ít, trong đó có thể kể tới một nghiên cứu ở Thái Lan của Chayanin và đồng sự Bên cạnh một số chủng vi khuẩn gây bệnh da liễu thông thường như E coll, s

epidermidis, s aureus, nhóm nghiên cứu đã xác định cao chiết cồn từ lá c inerme cũng có khả

năng kháng 2 chủng vi khuấn s aureus kháng methicillin (MRSA) DMST 4798 và DMST

20651 ở mức MIC là 4 mg/ml (22) Khả năng kháng MRSA của cao chiết này không có khác biệt so với khả năng kháng chủng s aureus thông thường và tương tự như nghiên cứu của Gupta và Roy (2012), cao chiết thề hiện khả năng ức chế hơn là diệt khuẩn Công bố của Pallab

và đồng sự (2020) đã xác định được 2 hợp chất có tiềm năng kháng khuẩn từ cao chiết methanol

lá c inerme là squalene và linolenic acid methyl ester Hai hợp chất này thế hiện khả năng

kháng 2 chủng Gram âm (£ coli, p aeruginosa) và 2 chủng Gram dương (S aureus và B

11

siỉbtĩlis') ở nồng độ 10 mg/ml với mức độ tương đương penicillin và streptomycin ở nồng độ

10 đơn vị/ml và 10 pg/ml (13)

Như vậy cho tới nay các nghiên cứu trên thế giới cũng phần lớn mới chi dừng lại ở đánh giá định tính khả năng kháng khuấn của cao chiết từ c inerme, có một số ít đánh giá định tính

về khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc và xác định nhóm hợp chất tiềm năng trong cao chiết

có khả năng kháng khuấn cao Hiện nay chưa có đánh giá nào về tác dụng lâu dài hay khả năng hình thành tính kháng của cao chiết c inerme lên vi khuẩn kháng thuốc

Ngọc nữ biển ở Việt Nam chủ yếu dùng làm bài thuốc dân gian, chưa có nhiều nghiên cứu sâu về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học Các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuấn của c. inerme ở Việt Nam còn rất hạn chế cả về số lượng và chất lượng Nhóm nghiên cứu của

TS Lý Hải Triều tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp Hồ Chí Minh đã xác định được nhiều hợp chất thứ cấp xuất hiện trong dịch chiết từ lá của c inerme như phenol, tannin, triterpenoid, saponin, steroid, alkaloid và coumarin (29) Tuy nhiên nghiên cứu này lại tập trung vào khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư MCF-7 và HepG2 chứ không xác định khả năng kháng khuấn của các cao chiết Luận án của TS Trần Thị Minh (ĐH Bách khoa Hà Nội) đã phân lập

và xác định được cấu trúc hóa học 5 hợp chất từ dịch chiết ethyl acetate của lá c inerme, bao gồm 20(29)-lupen-3p-ơ-yl hexacosanoat (CE1), stigmat-5-en-3p-ol (CE2), apigenin (CE4), acacetin (CE3), andrographolid (CE5), đồng thời nhận thấy dịch chiết cồn của lá cây c inerme

có thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với hầu hết các chủng vi khuẩn thử nghiệm (S aureus, E

coli, p aeruginosa, B subtilis ở mức MIC là 128 mg/ml, đặc biệt là với 2 chủng B subtilis và

s aureus thì cao chiết còn thể hiện tác dụng diệt khuẩn với mức MBC bàng MIC (20)

CHƯƠNG 2 NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Thu thập và tách chiết mẫu lá

Mầu lá và cành c inerme được thu thập đảo Phú Quốc, Kiên Giang vào tháng 1/2019 (kế thừa từ đề tài cấp cơ sở Mã số 2019.01.04) Lá và cành tươi sau khi thu thập được rửa 2 lần bằng nước cất và phơi khô trong phòng ở nhiệt độ 40 °C trong 1 tuần và nghiền thành bột mịn trước khi tiến hành ly trích 100 g bột lá và cành được ngâm trong diethyl ether (Xilong Scientific, Trung Quốc) ở 25 °C trong vòng 1 ngày và dịch chiết được cô đặc bằng cô quay chân không Dịch chiết cô đặc được đông khô và làm tan trở lại trong DMSO (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ) đề đạt nồng độ 50 mg/mL Mầu dịch chiết được bảo quàn ở -20 °C cho tới khi sử dụng

2.2 Phân lập, định danh và xác định đặc tính vi khuẩn kháng thuốc

2.2.1 Phân lập và định danh vi khuẩn kháng thuốc

Vi khuấn so sánh chuấn được dùng trong nghiên cứu là chủng Staphylococcus aureus ATCC 25923 Hai chủng vi khuẩn kháng thuốc sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi

TS Nguyễn Hữu Hùng (Khoa Công nghệ Sinh học, ĐH Nguyền Tất Thành) từ kết quà đề tài cấp cơ sở “Phân lập các chủng Staphylococcus aureus từ mẫu da bệnh nhân bị nhiễm trùng: định hướng ứng dụng chế tạo kháng thề trị liệu ứng dụng trong ngành da liều và thẩm mỹ” Các bước đánh giá ban đầu đã được thực hiện cho thấy hai chủng vi khuấn này (SaL2 và SaL7)

là vi khuấn Gram dương, giống s aureus và có khả năng kháng một số loại kháng sinh Trong phạm vi đề tài này, 2 chủng SaL2 và Sal7 tiếp tục được định danh phân tử bằng các chì thị khác

và xác định khả năng kháng kháng sinh bằng các chì thị phân tử cùng kháng sinh đồ

Bảng 1 Danh sách các mồi được sử dụng cho PCR

Chu trình luân nhiệt sử dụng cho các phản ứng được thực hiện như sau:

Mồi xuôi (5'- 3') Mồi ngược (5'- 3')

1 spa ATAACGCTGCACCTAAGG GGTGATACAGTAAATGACATTGC

2 tuf CGTGTTGAACGTGGTCAA AGTATGTGGTGTAATTGAACC

3 16S TGGGGAGCGAACAGGATT CATGCTCCACCGCTTGTG

4 tetK ATTTCAAGAGTTTCTAACCCTT CCTTTTCTATCCACTAAAAAACC

5 tetM AGTGCACTGTTGCAAGAA TCCAAGAGAAACCGAGCT

6 mecA GCGACTTCACATCTATTAGGT GCCATCTTTTTTCTTTTTCTCT

7 blaZ CATTACACTCTTGGCGGT CGGAGATACTTTAATTAAAGATGG

8 vanA CGCAGACCTTTCAGCAGAG TTCGGGAAGTGCAATACCTG

13

Các bước Nhiệt độ Thòi gian (giây)

2.2.2 Xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập được

Trước khi tiến hành các xét nghiệm xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh, các chủng

vi khuấn được phục hồi từ mầu trừ đông -80 °C bằng cách cấy ria lên đĩa thạch agar Mueller Hinton (MHA, Himedia, Ấn Độ) và ủ đĩa ở 37 °C trong 24 giờ Một khuấn lạc riêng lẻ được chọn bằng tăm vô trùng và ủ ở môi trường Mueller Hinton lỏng (MHB, Himedia, Ấn Độ) tại

37 °C trong vòng 24 giờ Thí nghiệm xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuấn được thực hiện bằng phương pháp tiêu chuẩn khuếch tán trên đìa thạch theo hướng dần của Viện Tiêu chuấn Lâm sàng và Tiêu chuấn Phòng xét nghiệm CLSI (6)

2.2.3 Xác định khả năng tán huyết của vi khuẩn phân lập được

Khả năng tán huyết của vi khuấn được xác định thông qua xét nghiệm sử dụng thạch máu

BA (Nam Khoa Biotek) có chứa 5% máu cừu Vi khuấn được nuôi qua đêm trong môi trường TSB đế đạt tới mật độ ODó00= 0,7 (tương đương 107 cfu/ml) 10 pl môi trường chứa vi khuẩn được nhỏ lên bề mặt thạch máu và đĩa thạch được ủ ở 37 °C qua đêm trước khi phân tích Hoạt tính tán huyết được xác định thông qua đường kính của vòng tròn trống sáng màu hình thành quanh vị trí khuẩn lạc, do hệ quả của hoạt tính tán huyết Chi số tán huyết (hemolysis index, HI) được tính bằng tỷ lệ của đường kính khuẩn lạc so với tổng đường kính của vòng tán huyết, bao gồm cả đường kính của khuẩn lạc bên trong Các mức xác định khá năng tán huyết như sau: rất mạnh: HI < 0.69; mạnh: HI = 0.70 - 0.79; trung bình: HI = 0.80 - 0.89; nhẹ: HI = 0.90

- 0.99; không có hoạt tính: HI = 1

2.2.4 Xác định hoạt tính coagulase ciía vi khuẩn phân lập được

Xét nghiệm coagulase được tiến hành với huyết tương coagulase của thỏ (TCS Biosciences, Anh quốc) Xét nghiệm được tiến hành là loại xét nghiệm trên lam kính Môi trường TSB nuôi tế bào qua đêm ở 37 °C được ly tâm để thu tế bào, sau đó tế bào được cô đặc trong môi trường TSB mới và một giọt môi trường cô đặc lên huyết tương thỏ đã nhỏ sằn lên

lam kính và quan sát sự hình thành các vết ngưng kết trên lam kính Sự hình thành ngưng kết cho thấy vi khuẩn dương tính với coagulase.

2.3 Xác định hoạt tính kháng sinh cua cao chiết

2.3.1 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory concentration - MIC)

Nồng độ ức chế tối thiểu MIC được xác định bằng phương pháp pha loãng trên đĩa xét nghiệm 96 giếng với chi thị màu resazurin (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ) Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Ngọc nữ biển và các loại kháng sinh (Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenicol, Streptomycin) với các chủng s aureus được khảo sát theo quy trình chuấn của CLSI (6) Theo

đó, cao chiết hoặc kháng sinh được pha loãng trong môi trường MHB ở các nồng độ khác nhau

và dùng đề ức chế vi khuẩn trên đĩa xét nghiệm 96 giếng Tế bào nuôi qua đêm trong mòi trường MHB được bồ sung vào các giếng xét nghiệm ở mật độ 5xl06 CFU/mL Kháng sinh được sử dụng trong dái nồng độ 100, 50, 25, 12.5, 6.25 và 3,125 gg/mL đế làm mẫu đối chứng dương hoặc đề so sánh hiệu quả kháng khuẩn với cao chiết Mầu đối chứng âm chỉ có vi khuẩn được phân tán trong DM so, còn mẫu “trắng” dùng đế cân bằng quang phố kế bao gồm môi trường MHB hoặc MHB cùng cao chiết Sau khi trộn lần tế bào vi khuẩn và tác nhân kháng khuấn (cao chiết hoặc kháng sinh), hồn hợp được ủ ở 37 °C trong 24 tiếng trước khi phân tích Vào ngày hôm sau, 0,1% resazurin được bố sung vào từng giếng và đĩa xét nghiệm được ủ thêm 1-4 tiếng ở 37 °C đê quan sát sự thay đối của màu hồn hợp Resazurin sẽ chuyển từ màu xanh dương sang màu hồng khi bị khừ, là tín hiệu cho thấy vi khuẩn còn sống Giá trị MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của tác nhân kháng khuấn có hiệu quá ức chế sinh trưởng của vi khuấn trong môi trường lòng thế hiện qua sự đối màu của resazurin

2.3.2 Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (minimum bactericidal concentration - MBC)

Để xác định nồng độ diệt khuấn tối thiểu MBC, một dải nồng độ yếu tố kháng khuấn (cao chiết hoặc kháng sinh) được sử dụng đế đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng của vi khuấn, dựa theo giá trị MIC đã xác định trước đó (MIC, 2xMlC, 4xMIC và 8xMIC) Ớ mồi nồng độ này, yếu tố kháng khuấn được trộn với vi khuẩn và ủ ở 37 °C trong 25 - 28 tiếng, sau đó cấy trải lên đĩa thạch MHA và tiếp tục ủ đĩa ở 37°c trong 24 tiếng MBC được xác định là nồng độ thấp nhất của yếu tố kháng khuấn có thế tiêu diệt vi khuẩn hoàn toàn, thể hiện qua việc vi khuẩn không thể mọc trở lại trên đĩa thạch MHA Sau đó có giá trị MBC, tỷ số R = MBC/MIC cũng được xác định với từng yếu tố kháng khuẩn, trong đó giá trị R < 4 thể hiện yếu tố kháng khuẩn

15

có hoạt tính diệt khuẩn (bactericidal), còn nếu R > 4 thì hoạt tính kháng khuẩn được xác định

là kìm hãm, ức chế sinh trưởng (bacteriostatic) (18)

2.4 Tiến hóa thích nghi của 5 aureus vói các nhân tố kháng sinh

Trong quá trình tiến hóa thích nghi in vitro tại phòng thí nghiệm, vi khuấn lựa chọn (5

aureus ATCC 25923) sẽ liên tục được tiếp xúc với yếu tố kháng khuẩn với nồng độ tăng dần trong khoảng thời gian 30 ngày hay tương đương với 30 lần chuyến môi trường (passage) Đầu tiên, vi khuẩn được nuôi trong môi trường MHB tới mật độ 5x 106 CFU/mL và bồ sung yếu tố kháng khuẩn ở nồng độ dưới ngưỡng ức chế ('AxMIC, 'ẨxMIC, and 1/8XMIC) Sau 24 tiếng, MIC của chính yểu tố kháng khuẩn đó với các vi khuấn thu từ các ổng môi trường chọn lọc được xác định Nếu như giá trị MIC mới không thay đồi, vi khuẩn ở ống có nồng độ yếu tố kháng khuấn ở mức '/2xMIC được dùng làm quần thể ban đầu của vòng thích nghi thứ hai Tế bào được cấy chuyển sang môi trường MHB lỏng và tiếp tục được chọn lọc bằng 4 nồng độ 'AxMIC, 'ẨxMIC và 1/8XMIC Nếu như giá trị MIC ở ngày hôm sau cao hơn giá trị MIC của ngày hôm trước thì tế bào từ ống có khả năng chống chịu tốt nhất được tiếp tục cấy chuyền sang môi trường lỏng chứa 4 nồng độ dưới ngưỡng ức chế theo giá trị MIC mới thay vì giá trị MIC cũ Quá trình này được lặp lại liên tục trong 30 ngày để thu được s aureus thích nghi với cao chiết Ngọc nữ biển hoặc kháng sinh (Chloramphenicol, Kanamycin)

Sau quá trình tiến hóa thích nghi, tế bào vi khuân phát triển trong môi trường chứa nồng

độ yếu tố kháng khuấn cao nhất được cấy trải lên đĩa thạch muối Mannitol (MSA, Himedia,

Ần Độ) đê thu được khuấn lạc đơn Khuấn lạc đơn được nuôi lỏng trở lại trong môi trường MHB, sau đó trừ trong 20% glycerol ở -80 °C trong 30 ngày Xu hướng hình thành tính kháng yếu tố kháng khuẩn của vi khuẩn được đánh giá thông qua thay đối ở các giá trị MIC và MBC

so với thời điểm trước khi tiến hành tiến hóa thích nghi Thay đối của MIC, MBC trước và sau quá trình lun trù’ cũng được xác định đê loại bỏ vai trò của quá trình thích ứng tạm thời mà không liên quan tới biến đối di truyền của vi khuẩn Tính kháng hoặc nhạy cảm chéo của vi khuấn thích nghi với các yếu tố kháng khuẩn không tham gia vào quá trình thích nghi (collateral resistance and sensitivity) được đánh giá thông qua MIC, MBC của các kháng sinh, cũng như

sự bất lợi do thích nghi (cost of fitness) của các vi khuấn vi khuẩn cũng được quan sát qua khả năng sinh trưởng trong điều kiện không có yếu tố kháng khuẩn

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập, định danh các chủng vi khuẩn kháng thuốc

Hai trong số những vi khuấn kháng kháng sinh phân lập được từ đề tài nghiên cứu của TS Nguyền Hữu Hùng (xem phần Phân lập và định danh vi khuấn kháng thuốc) tiếp tục được nghiên cứu bằng các chì thị phân tử và đánh giá khả năng kháng kháng sinh theo tiêu chuấn CLS1, sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Kết quả cho thấy hai chùng vi khuấn phân lập được (SaL2 và SaL7) có khả năng kháng đa kháng sinh (multidrug-resistant hay MDR) với toàn bộ 9 loại kháng sinh sử dụng (ampicillin, methicillin, gentamicin, rifampicin, tetracycline, vancomycin, trimethoprim/sulfamethoxazole, chloramphenicol, ciprofloxacin, streptomycin) với mức độ kháng khác nhau (Bảng 2) Trong đó đáng lưu ý là hai chủng này cùng kháng cà vancomycin và methicillin là hai loại kháng sinh đặc trị s aureus kháng thuốc Độc tính của 2 vi khuẩn này được thể hiện qua chi sổ tán huyết cao (0,74 và 0,62 với SaL2 và SaL7) Ngoài ra, khả năng lây truyền của hai chủng này còn được thế hiện qua sự có mặt của

coagulase là một loại enzyme giúp các vi khuẩn Staphylococcus trốn khòi sự tấn công của hệ

miền dịch nhờ “ngụy trang” dưới vỏ bọc của vết thương đông máu

Bảng 2 Kháng sinh đồ và kết quả xác định hoạt tính tán huyết, coagulase cua hai chủng vi khuẩn phân lập được Mức độ kháng kháng sinh được thề hiện tỷ lệ nghịch với đường kính vòng tròn ức chế hình thành quanh đĩa giấy chứa kháng sinh đặt trên bề mặt đìa thạch: (-) nhạy cảm, (+) kháng mức trung bình, (++) kháng mạnh Am: ampicillin, Mc: methicillin, Gm: gentamicin, Rp: rifampicin, Tc: tetracycline, Vm: vancomycin, Sm: trimethoprim/sulfamethoxazole, Cm: chloramphenicol, Cx: ciprofloxacin, Sm: streptomycin Mức độ tán huyết được chia ra theo các cấp độ: rất mạnh: HI < 0.69; mạnh: HI = 0.70 - 0.79; trung bình: HI = 0.80 - 0.89; nhẹ: HI = 0.90 - 0.99; không có hoạt tính: HI = 1 Hoạt tính coagulase thể hiện qua khả năng ngưng kết (+) huyết tương thỏ của vi khuấn

Chủng Mức độ kháng thuốc kháng sinh _ Chỉ số tán

Mc huyết (HI)

Hoạt tính coagulase

nghiên cứu, chúng tôi sử dụng thêm phân đoạn gen 16S rRNA vi khuẩn và tuf (mã hóa yếu tố kéo dài phiên mã EF-Tu của Staphylococcus) Các kết quà khuếch đại gen thành công (Hình

1) cho thấy các chủng phân lập được khả năng cao là Staphylococcus aureus, tương tự như kết quả trước

Hình 1 Kết quả PCR khuếch đại các gen chỉ thị phân loại 2 mẫu vi sinh phân lập từ

da người (SaL2 và SaL7) M: thang đo kích thước DNA 1 Kb Hyperladder (New England Biolab), 1: sản phẩm khuếch đại gen spa của s aureus, 2: sản phẩm khuếch đại gen tuf của Staphylococcus, 3: sản phẩm khuếch đại phân đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn

Các gen có liên quan tới cơ chế kháng kháng sinh (blaZ, mecA, tetM, tetK, vanA) cũng được chọn làm gen đích đê xác định khả năng kháng kháng sinh của các chủng phân lập được

là do đột biến nội tại hay do hiện tượng chuyển gen ngang (horizontal gene transfer) do vi khuần nhận được gen kháng thuốc từ các vi khuẩn khác Kết quá ở Bảng 3 cho thấy chỉ với kiểu hình kháng tetracyclin và vancomycin có thề phát hiện ra các chi thị phân tử tương ứng, nhưng vanA không được phát hiện ở SaL2 Điều này thể hiện SaL7 có thế đã nhận được gen kháng tetracyclin và vancomycin từ vi sinh vật khác (chuyển gen ngang) còn kiểu hỉnh kháng các loại kháng sinh còn lại (ampicillin, methicillin) liên quan tới đột biến trong hệ gen của vi khuấn SaL2 cũng có thề nhận gen kháng tetracyclin từ bên ngoài, còn với kiếu hình kháng vancomycin thì có thể do mang gen vanB (chưa thể xác định trong nghiên cứu này)

Bảng 3 Kết quả PCR xác định các gen quy định kiểu hình tính kháng thuốc kháng sinh trên 2 chủng phân lập được Kết quả dương tính là khi sản phâm PCR có kính thước trông đợi được phát hiện trên gel agarose 1% sau khi điện di, kết quả âm tính là không có sản phẩm PCR hoặc sản phấm có kích thước khác kích thước trông đợi.

Gen đích Kiểu hình Kích thước SaL2 SaL7

3.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết Ngọc nữ biển vói các chủng 5 aureus

Sau khi xác định hai chủng SaL2 và SaL7 là s aureus, chủng tiêu chuẩn ATCC 25923 được sử dụng để so sánh khả năng kháng kháng sinh và cao chiết với hai chủng phân lập Các giá trị MIC và MBC khi dùng cao chiết Ngọc nữ biến để ức chế các chủng s aureus được xác định và so sánh với một loại kháng sinh phố biến là ampicillin Kết quả ở Bảng 4 cho thấy cao chiết Ngọc nữ biến có mức MIC cao hơn 62,5 lần và MBC cao hơn 25 lần so với ampicillin Tuy vậy, tỷ lệ R=2 cho thấy cao chiết có hoạt tính diệt khuẩn mạnh, trong khi ampicillin hoạt động theo cơ chế ức chế vi khuân (R=5) Kết quả này phù hợp với các báo cáo trước đây về hoạt tính ức chế vi khuẩn cùa ampicillin với các chủng Enterococcus (25) hay Lactobacillus (5) Đối với 2 chủng MDR, mối tương quan này lại bị thay đối do khả năng kháng SaL7 của cao chiết vần giữ nguyên so với chủng tiêu chuấn, với SaL2 thì cả MIC và MBC đều tăng 2 lần, nhưng với ampicillin thì MIC đã tăng lên 100-200 lần còn MBC tăng 80 lần (Bảng 4) Nói cách khác thì với 2 chủng kháng đa kháng sinh thì cao chiết có hiệu quả kháng khuấn cao hơn kháng sinh ampicillin Bên cạnh đó, việc tăng nhẹ mức độ kháng của 2 chủng MDR với cao chiết không làm thay đối tỷ số R, nhưng tỷ lệ này đã giảm xuống mức 2-4 với ampicillin, làm kháng sinh diệt vi khuấn mạnh hơn so với chủng tiêu chuẩn ATCC 25923

19

Bảng 4 So sánh khả năng kháng khuẩn cua cao chiết Ngọc nữ biển và Ampicillin trên

3 chủng s aureus (ATCC 25923 và hai chủng kháng đa kháng sinh) thông qua các giá trị MIC,

MBC R là tỷ số MBC/MIC, thể hiện hoạt tính kháng khuấn mang tính chất ức chế, kìm hãm nếu R >4, thể hiện hoạt tính diệt khuấn nếu R < 4

MBC (pg/mL) R

MIC (pg/mL)

MBC (pg/mL) R

MIC (pg/mL)

MBC (pg/mL) RCao chiết 312,5 625 2 625 1.250 2 312,5 625 2Ampicillin 5 25 5 500 2.000 4 1.000 2.000 2

3.3 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết Ngọc nữ biển vói chung 5 aureus đã tiến hóa thích nghi

Sau 30 ngày tiến hóa thích nghi trong môi trường chứa nồng độ tăng dần của yếu tố kháng khuấn (cao chiết Ngọc nữ biên hoặc kháng sinh), các tế bào vi khuẩn được lưu trù' ở -80 °C trong 30 ngày, sau đó nuôi trở lại môi trường lỏng không có áp lực kháng khuấn đế đảm bảo loại trừ các yếu tố thích nghi sinh lý của tế bào mà không liên quan đến các yếu tố di truyền Khi so sánh với 3 loại kháng sinh là chloramphenicol, streptomycin và kanamycin, chủng 5

aureus ATCC 25923 chỉ bị ức chế khi dùng nồng độ cao chiết cao hơn 50 lần nồng độ kháng sinh (312,5 pg/mL so với 6,25 pg/mL) Tuy nhiên sau quá trình thích nghi, chủng s aureus này đã nhanh chóng tăng mức MIC lên 16 lần (với chloramphenicol và streptomycin) cho tới

400 lần (kanamycin), nhưng chì tăng 2 lần giá trị MIC khi dùng cao chiết Ngọc nữ biến (Bảng

5) Như vậy, quá trình thích nghi với kháng sinh xảy ra nhanh hơn quá trình thích nghi với cao chiết từ 8 tới 200 lần trong khoảng thời gian 30 ngày Đáng lưu ý là với cả 4 chủng tiến hóa thích nghi này, tỷ số R củng có xu hướng tăng, có nghĩa là yếu tố kháng khuẩn có xu hướng chuyến từ diệt khuấn sang ức chế, vi khuấn càng khó bị tiêu diệt bởi các yếu tố này hơn Trong

sổ các kháng sinh thì tốc độ thích nghi với kanamycin đạt mức rất cao (MIC tăng 400 lần, MBC tăng 800 lần), trong khi tốc độ thích nghi của s aureus với chloramphenicol thấp hơn khá nhiều (cả MIC và MBC tăng 16 lần) Tốc độ thích ứng với kanamycin trong trường hợp này nhanh hơn trường hợp của Lactobacillus plantarum trong một nghiên cứu tiến hóa thích nghi vào năm 2019 (tăng MIC lên 64 lần sau 35 ngày chọn lọc) (8)

Bảng 5 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết Ngọc nữ biển và kháng sinh vói các chủng 5 aureus đã thích nghi vói từng yếu tố R là tỷ số MBC/MIC, thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mang tính chất ức chế, kìm hãm nếu R >4, thế hiện hoạt tính diệt khuẩn nếu R < 4 AMIC

và AMBC là mức độ thay đổi của MIC và MBC khi sử dụng chùng thích nghi, so với chủng gốc, tính bằng tỷ lệ giá trị MIC, MBC mới trên giá trị MIC, MBC cũ.

Yếu tố kháng

khuẩn

Chủng gốc ATCC 25923 Chủng thích nghi (30 ngày)

AMIC (lần)

AMBC (lần)MIC

(pg/mL)

MBC (pg/mL) R

MIC (pg/mL)

MBC (pg/mL) RCao chiết 312,5 625 2 625 2.000 3,2 2 3.2Chloramphenicol 6,25 25 4 100 400 4 16 16Streptomycin 6,25 25 4 100 2.500 25 16 100Kanamycin 6,25 12,5 2 2.500 10.000 4 400 800

3.4 Đánh giá mức độ ổn định của tính kháng thuốc hình thành ở chủng s aureus đã tiến hóa thích nghi

Kiểu hình kháng kháng sinh có thể là do các thích nghi không liên quan tới di truyền (17)

Đe xác định phần kiếu hình tính kháng liên quan tới di truyền, vi khuẩn thích nghi đuợc nuôi trong môi trường không có yếu tố kháng khuẩn và trừ lạnh với 20% glycerol trong 30 ngày Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết và kháng sinh với vi khuần thu được trước bảo quản và sau thời gian bảo quản được so sánh với nhau (Bảng 6) Từ kết quả của Bảng 6 có thế thấy là các kiểu hình tính kháng đều có phần đóng góp của các cơ chế thích nghi không liên quan tới

di truyền Sự thay đồi các giá trị MIC và MBC (AMIC và AMBC) cho thấy tất cả 4 chủng vi khuấn thích nghi đều bị giảm khả năng kháng thuốc sau thời gian lưu trừ lạnh và nuôi ở môi trường không có yếu tố kháng khuấn So với 3 chủng vi khuấn thích nghi với 3 loại kháng sinh thì thay đối ở chủng thích nghi với cao chiết là ít nhất (MIC tăng 2 lần, MBC tăng 1,25 lần) Ngoài ra cũng có thể thấy mức giảm của MBC sau giai đoạn lưu trừ chi bằng hoặc ít hơn MIC, điều này có thề gợi ý rằng các biến đối không di truyền của vi khuấn trong giai đoạn thích nghi chủ yếu giúp vi khuấn chỉ bị ức chế và kéo dài thời gian tồn tại hơn thay vì bị tiêu diệt

Bảng 6 Hoạt tính kháng khuẩn cua cao chiết Ngọc nữ biển và 3 loại kháng sinh vói các chủng 5 aureus đã thích nghi được xác định trước thời điểm lưu trữ lạnh AMIC và

AMBC thể hiện mức độ thay đồi của MIC và MBC ở thời điếm mới hoàn thành quá trình thích nghi so với sau giai đoạn lun trữ và nuôi tế bào ở môi trường không có yếu tố kháng khuấn

Yếu tố kháng khuẩn MIC

(pg/mL)

MBC (pg/mL)

AMIC (lần)

AMBC (lần)

3.5 Đánh giá khả năng hình thành tính kháng hoặc tính nhạy cảm chéo với kháng sinh của chủng 5 aureus đã tiến hóa thích nghi

Có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng kháng các yếu tố kháng sinh có thề liên quan tới nhau theo chiều hướng kháng chéo (collateral resistance) hoặc nhạy cảm chéo (collateral sensitivity), trong đó vi khuẩn đạt được khả năng kháng một yểu tố do chọn lọc tự nhiên cũng

có thể hình thành tính kháng với một số yếu tố khác vốn không phải áp lực chọn lọc, hoặc ngược lại là trở nên nhạy cảm hơn với một số yếu tố khác Đế nghiên cứu khả năng này, chúng tôi đã đánh giá khả năng kháng khuấn của cao chiết Ngọc nữ biến và kháng sinh (chloramphenicol, kanamycin, streptomycin) với chủng s aureus đã thích nghi với cao chiết Ngọc nữ biển (CI-A), thích nghi với chloramphenicol (Cm-A) hoặc kanamycin (Km-R) (Bảng

so với chủng gốc, tính bằng tỷ lệ giá trị MIC, MBC, R mới trên giá trị MIC, MBC, R cũ

Cao chiết Chloramphenicol Kanamycin Streptomycin

CI-A 2,0 3,2 1,6 1,0 1,0 1,0 1,0 0,5 0,5 1,0 0,5 0,5Cm-A 2,0 8,0 4,0 16,0 16,0 1,0 100,0 200,0 2,0 20,0 20,0 1,0Km-A 4,0 4,0 1,0 8,0 8,0 1,0 400,0 800,0 2,0 16,0 4,0 0,3

Mức độ thay đối các giá trị MIC, MBC và tỷ số R được thế hiện ra tỷ lệ của các giá trị này khi so giữa chủng thích nghi và chủng ban đầu (ATCC 25923) Theo kết quả này, quá trình thích nghi s aureus với cao chiết Nở ngày đất mặc dù làm cho MIC, MBC với cao chiết tăng

từ 2 tới 3,2 lần, nhưng không dẫn tới kiểu hỉnh kháng chéo với chloramphenicol Không nhũng thế, quá trình thích nghi còn làm cho vi khuẩn nhạy cảm hơn (tính nhạy chéo) với kanamycin

và streptomycin (giảm Vi giá trị MBC và giá trị R).

Tuy nhiên, chủng s aureus thích nghi với một trong hai loại kháng sinh chloramphenicol hoặc kanamycin lại thề hiện chiều hướng ngược lại: quá trình thích nghi với kháng sinh đều làm tăng khả năng kháng cao chiết Ngọc nữ biển (2 tới 4 lần) và có thế làm hình thành tính kháng chéo loại kháng sinh khác, thậm chí còn mạnh hơn: chủng thích nghi với chloramphenicol làm tăng MIC, MBC với chloramphenicol khoảng 16 lần nhưng đồng thời làm tăng MIC, MBC với streptomycin và kanamycin lên 20 và 100-200 lần; chủng thích nghi

với kanamycin làm tăng MIC và MBC với kanamycin lên 400 và 800 lần, đồng thời kéo theo tính kháng chéo với cả 2 loại kháng sinh còn lại và cao chiết, mặc dù với tốc độ tăng chậm hơn

so với chủng thích nghi với chloramphenicol (Bảng 7) Chì có một trường hợp duy nhất vi khuẩn thích nghi với kháng sinh làm giảm tỷ số R khi bị một kháng sinh khác ức chế là trường hợp của chủng thích nghi với kanamycin nhưng bị ức chế bởi streptomycin (chi số R giảm còn 1/3 so với ban đầu) Với mầu vi khuẩn này, streptomycin thể hiện tính kháng khuấn chéo mạnh hơn mặc dù nồng độ cần thiết đề diệt khuẩn đã tăng 4 lần so với chủng gốc ATCC

3.6 Đánh giá sự bất lọi về khả năng sinh trưởng thông thường của vi khuẩn thích nghi vói cao chiết

Các vi sinh vật hình thành tính trạng kháng, đa kháng thuốc đều dẫn tới những bất lợi ở khả năng phát triển trong điều kiện thông thường không có mặt các yếu tố kháng khuấn Vì vậy, để đánh giá mức độ bất lợi của vi khuấn khi không còn yếu tố kháng khuẩn, chúng tôi nuôi các vi khuấn đã thích nghi với cao chiết hoặc kháng sinh trong môi trường MHA đề so sánh tốc độ sinh trưởng với vi khuẩn tiêu chuấn ATCC bằng cách đo mật độ vi khuấn ở các mốc thời điếm 4, 8 và 12 giờ (Hình 2)

Sinh trường của các chủng £ aureus trong môi trường MHA

Hình 2 Sinh trưởng của các chủng s aureus tiêu chuẩn và thích nghi vói 3 yếu tố kháng khuẩn CI-A: chủng thích nghi với cao chiết Ngọc nữ biển, Cm-A: chủng thích nghi với chloramphenicol, Km-A: chủng thích nghi với Kanamycin Các chủng thích nghi đều được tiếp xúc với yếu tố kháng khuấn qua 30 ngày và được trừ lạnh ở -80 °C trong 30 ngày trước khi thực hiện thí nghiệm Thí nghiệm được lặp lại 2 lần, thanh sai số thể hiện độ lệch chuấn (Standard deviation)

23

Theo kết quả này, cả 3 chủng thích nghi với cao chiết và 2 loại kháng sinh đều thê hiện bất lợi

về khả năng phát triển trong điều kiện không có yếu tổ kháng khuấn, trong đó vi khuần thích nghi với cao chiết Ngọc nữ biến thể hiện mức giảm khả năng sinh trưởng ít hơn vi khuấn thích nghi với kháng sinh, còn vi khuấn thích nghi với chloramphenicol có tốc độ phát triên chậm nhất, đặc biệt trong giai đoạn 4 giờ đầu Điều này có thể thể hiện cơ chế thích nghi với cao chiết Ngọc nữ biển không tiêu tốn năng lượng cao hoặc không ảnh hưởng tới các quá trình trao đối chất căn bàn của vi khuấn, trong khi đó việc thích ứng với thuốc kháng sinh dẫn tới nhũng thay đối đáng kể ở khả năng phát triển bình thường của vi khuấn Một cách giái thích khác là

do hoạt tính của kháng sinh có thời gian tác dụng nhanh với vi khuẩn nên áp lực chọn lọc cao trong thời gian ngắn làm tốc độ xuất hiện các đột biến có hại cho khả năng sinh trưởng bình thường của vi khuẩn là cao hơn khi sừ dụng hợp chất tự nhiên Tuy nhiên cần bằng chứng phân

từ về những thay đối này đế làm rõ cơ chế thích nghi trong các nghiên cún sau

Trong nghiên cứu này, cao chiết lá và cành của Ngọc nữ biến c inerme đã được sừ dụng như một yếu tố kháng khuẩn để tạo áp lực chọn lọc lên quá trình tiến hóa thích nghi của vi

khuấn s aureus Hiệu quả kháng khuấn của cao chiết Ngọc nữ biến đã được đánh giá trong

mối tương quan giữa vi khuấn tiêu chuấn và các biến thể của nó, bao gồm vi khuấn kháng đa kháng sinh được phân lập từ mầu da người bị viêm là những vi khuẩn đã thích nghi với kháng sinh ngoài tự nhiên, cùng với vi khuấn 5 aureus được chọn lọc thích nghi trong phòng thí nghiệm với cao chiết Ngọc nữ biến và một số loại kháng sinh thông dụng Kết quà so sánh cho thấy cao chiết Ngọc nữ biển mặc dù không đạt mức nồng độ ức chế và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu thấp như kháng sinh, nhưng có khả năng duy tri hoạt tính qua thời gian cao hơn nhiều lần

so với kanamycin, chloramphenicol, streptomycin và chì phái tăng nồng độ lên 2 lần đề diệt vi khuấn kháng thuốc phân lập được từ tự nhiên Sau 30 ngày chọn lọc thích nghi trong môi trường lỏng với nồng độ yếu tố kháng khuấn tăng dần, vi khuấn s aureus dề dàng thích nghi với các loại kháng sinh được sử dụng, tăng mức MIC và MBC lên 16 tới 800 lần so với chủng

vi khuẩn ban đầu, trong khi đó MIC và MBC khi sử dụng cao chiết Ngọc nữ biển chì tăng 2 tới 3.2 lần và có khả năng diệt khuẩn đã thích nghi ở nồng độ thấp hơn kháng sinh Không những thế, việc tiếp xúc liên tục với cao chiết Ngọc nữ biển thậm chí còn làm tăng mức độ nhạy cảm kháng sinh của s aureus với kanamycin và streptomycin, trong khi vi khuấn thích nghi với kháng sinh lại làm tăng mức độ kháng của vi khuấn với các loại kháng sinh khác và cả hợp chất tự nhiên Đây là kết quà rất khích lệ cho việc sử dụng hợp chất tự nhiên lâu dài không những là giải pháp thay thế cho kháng sinh mà còn có thế bố trợ cho việc điều trị bằng kháng sinh

Đây chỉ là một trường họp nghiên cứu cụ thế về hoạt tính kháng khuẩn lâu dài của một loại dược liệu, nên cần thêm các nghiên cứu tương tự ở nhiều nhóm dược liệu khác đề hình thành cơ sở dừ liệu có giá trị sử dụng tốt hơn Bên cạnh đó, các cơ sở phân tử của quá trình thích nghi như biến đối di truyền và trao đối chất của vi khuấn thích nghi cũng cần được làm

rõ để xác định các đối tượng để thiết kế thuốc và kết hợp hoạt tính của hợp chất tự nhiên và kháng sinh trong tương lai

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Aguilar c, Escalante A, Flores N, de Anda R, Riveros-McKay F, et al 2012 Genetic changes during a laboratory adaptive evolution process that allowed fast growth in

glucose to an Escherichia coli strain lacking the major glucose transport system BMC Genomics 13:385

2 Al-Snafi AE 2016 Chemical constituents and pharmacological effects of Clerodendrum

inerme - A review SMU Medical Journal 3:129-53

3 Anandhi K, Ushadevi TJL 2013 Analysis of phytochemical constituents and antibacterial activities of Clerodendrum inerme L against some selected pathogens 1:387-93

4 Babiker HA 2009 Seasonal fluctuation of drug-resistant malaria parasites: a sign of fitness cost Trends in parasitology 25:351-2

5 Bayer AS, Chow AW, Concepcion N, Guze LB 1978 Susceptibility of 40 Lactobacilli

to Six Antimicrobial Agents with Broad Gram-Positive Anaerobic Spectra 14:720-2

6 CaLSL 2017 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing In CLSI

supplement Ml00: Clinical and Laboratory Standards Institute Wayne, PA

7 Cowen LE, Kohn LM, Anderson JB 2001 Divergence in Fitness and Evolution of Drug Resistance in Experimental Populations of Candida albicans 183:2971-8

8 Feng c, Zhang F, Wang B, Gao J, Wang Y, Shao Y 2019 Evaluation of kanamycin and neomycin resistance in Lactobacillus plantarum using experimental evolution and whole­genome sequencing Food Control 98:262-7

9 Gupta VK, Roy A 2012 Comparative study of antimicrobial activities of some

mangrove plants from Sundarban Estuarine Regions of India Journal of Medicinal Plants Research 6:5480-8

10 Hamid s, Patil Y, Patil J, Borse L, Pawar s, Pardesi GS 2008 Antibacterial and antifungal potential of Clerodendrum inerme crude extracts against some human pathogenic microorganism Pharmacology 2:75-9

25